JP2007312617A - Ｈｉｖ複製阻害薬およびｈｉｖ複製阻害薬のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、薬剤耐性を生じさせないＨＩＶ複製阻害剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞を試験化合物の存在下にＨＩＶでチャレンジし、ついで前記細胞のＨＩＶ複製能に対する試験化合物の阻害作用を検定することを特徴とするＨＩＶ複製阻害薬のスクリーニング方法。
【選択図】なし

Description

本発明はヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）複製阻害薬のスクリーニング方法に関し、さらに詳しくはＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞を用いるＨＩＶ複製阻害薬のスクリーニング方法に関する。

従来の抗ＨＩＶ薬は、ＨＩＶに固有の酵素をターゲットとして、ウイルスのライフスタイルの異なる地点に作用するもので、その主なものは逆転写酵素阻害剤（例えば、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、ラミブジン、サニルブジン、アバカビルなど）とプロテアーゼ剤(例えば、インジナビル、サキナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビルなど)がある。
しかしながら、従来の抗ＨＩＶ薬はＨＩＶに起因する酵素に作用するものであるため、薬剤耐性が生じやすく、治療効果が十分得られないという難点があった。
このため、ＨＩＶ側に起因しない宿主のＨＩＶ複製促進因子を同定し、この因子を抑制する物質を見出すことができれば、薬剤耐性の問題を生ずることなくＨＩＶの複製を抑えることができるので、エイズ患者にとって大きな福音となるが、細胞因子を標的とした抗ＨＩＶ薬はウイルス侵入時における細胞膜表面に存在するＨＩＶ−１コレセプターを標的とした薬剤のみが開発・実用化され、ウイルス複製メカニズムをベースに細胞内因子を標的にしてかかる薬剤をスクリーニングするための方法は知られていなかった。

一方、ＮＦ−ＩＬ６はＣ／ＥＢＰｂとも表示され、転写因子の1つであり、ノックアウトマウスの解析からマクロファージにおける細胞内規制菌の感染の排除に必須の役割を果たしていることが明らかにされている。ヒトＮＦ−１Ｌ６はアミノ酸３４５個からなる蛋白質であり、そのアミノ酸配列は既知である（非特許文献１）。
また、ＮＦ−ＩＬ６のドミナントネガティブとしてＬＩＰ[ＮＦ−ＩＬ６ｍＲＮＡから第３インフレームＡＴＧを用いて翻訳されたもの]やＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）[ＮＦ−ＩＬ６の２８８番目セリンがアラニンに置き換わった部位特異的変異体]が知られている(非特許文献２、３)。
さらに、ＮＦ−ＩＬ６とＨＩＶとの関連について、ＮＦ−ＩＬ６がマクロファージや単球においてＨＩＶ−１の転写活性を活性化するという報告はいくつか存在している（非特許文献４、５、６、７）が、ＮＦ−ＩＬ６がＨＩＶ複製にどの程度関与するかについては明らかにされていない。

Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．６，ｐ１８９７−１９０６，１９９０ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６７，ｐ５６９−５７９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，ｐ１０１９３−１０１９７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，ｐ７２９８−７３０２，Ａｕｇｕｓｔ １９９３ Ｊｕｏｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔ．１９９５，ｐ５３３７−５３４４ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２９９，ｐ２５６−２６５，２００２ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１９８，Ｎｏ．３，Ａｕｇｕｓｔ ４，２００３，ｐ４４３−４５３

本発明は、ＨＩＶ側に起因しない細胞内因子を抑制することによりＨＩＶの複製を抑える薬剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。また、本発明は、薬剤耐性を生じないＨＩＶ複製阻害剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＦ−ＩＬ６がＣＤ４^＋Ｔ細胞中におけるＨＩＶ複製の初期段階で関与していることを見出すと共に、抗ＨＩＶ薬の開発にとって重要なターゲットとなり得るとの知見を得た。この知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞をＨＩＶでチャレンジする際に、系内に試験化合物を存在させておき、チャレンジ後にＨＩＶ複製能を測定すれば、ＨＩＶ複製能に対する試験化合物の阻害作用を検定できることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
［１］ ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞を試験化合物の存在下にＨＩＶでチャレンジし、ついで前記細胞のＨＩＶ複製能に対する試験化合物の阻害作用を検定することを特徴とするＨＩＶ複製阻害薬のスクリーニング方法、
［２］ 試験化合物の阻害作用の検定を、試験化合物の非存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量と試験化合物の存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量を比較することにより行う前記［１］に記載のスクリーニング方法、
［３］ ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞が、ヒト免疫細胞にＮＦ−ＩＬ６の遺伝子を導入した細胞である前記［１］または［２］に記載のスクリーニング方法、
［４］ ヒト免疫細胞が、ヒトＣＤ４^＋細胞である前記［１］〜［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［５］ ヒトＣＤ４^＋細胞がＣＤ４陽性のヒトＴ細胞、ヒトマクロファージ、ヒト単球またはヒト樹状細胞である前記［４］記載のスクリーニング方法、
［６］ ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞が、マイトジェンで刺激したプライマリーＴ細胞にＮＦ−ＩＬ６の遺伝子を導入した細胞である前記［１］または［２］に記載のスクリーニング方法、
［７］ マイトジェンがフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）である前記［６］に記載のスクリーニング方法、
［８］ ＨＩＶがＨＩＶ−１である前記［１］〜［７］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［９］ ＨＩＶ複製量をｐ２４ＥＬＩＳＡ法により測定する前記［２］に記載のスクリーニング方法、
［１０］ 試験化合物が低分子化合物である前記［１］〜［９］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［１１］ 試験化合物が蛋白質またはペプチドであり、該蛋白質またはペプチドをＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞に強制発現させることにより存在させるか、または培養液に添加することにより存在させる前記［１］または［２］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［１２］ ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞がヒトＣＤ４^＋細胞である前記［１１］に記載のスクリーニング方法、および
［１３］ 前記［１］〜［１２］のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定されたＨＩＶ複製阻害薬、
に関する。

本発明の方法によれば、薬剤耐性を生じないＨＩＶ複製阻害剤を簡便にスクリーニングすることができる。

本発明のＨＩＶ複製阻害薬のスクリーニング方法は、ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞を試験化合物の存在下にＨＩＶでチャレンジし、ついで前記細胞のＨＩＶ複製能に対する試験化合物の阻害作用を検定することを特徴とする。

[ＮＦ−ＩＬ６がＨＩＶ複製阻害薬の標的分子となり得ることの確認]
まず、本発明者は、ＮＦ−ＩＬ６がＨＩＶ複製阻害薬の標的分子となり得ることを次の手法で確認した。すなわち、レトロウイルス・ジャーカットＴ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーでＣＤ４^＋Ｔ細胞を感染させ、感染したＣＤ４^＋Ｔ細胞をＨＸＢ−ＣＤ５（ＨＩＶ組換実験株ＨＸＢ２のｎｅｆ領域にマウスＣＤ５を挿入したＨＩＶ−１構築物）でチャレンジしたのち、ＣＤ５陽性細胞（ＨＩＶ−１複製が起こっている細胞）を集めた。ついで、該細胞から全ＤＮＡを調製し、プライマーを用いてＤＮＡに対してＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片をレトロウイルスベクターにサブクローニングし、プラスミッドＤＮＡを調製した。このプラスミッドＤＮＡをレトロウイルスパッケージング細胞（Ｐｈｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞）にトランスフェクションし、組み換えレトロウイルスを調製した。この組み換えレトロウイルスをプライマリーＣＤ４^＋Ｔ細胞に形質導入し、クローン３１がＨＩＶ−１複製を強く誘導することを認めた。このクローン３１は、ＤＮＡ配列決定により、ＮＦ−ＩＬ６であることを確認した。

ＮＦ−ＩＬ６の遺伝子をプライマリーＣＤ４^＋Ｔ細胞に形質導入し、ＮＦ−ＩＬ６を発現する細胞を選択した。この細胞とコントロールのＣＤ４^＋Ｔ細胞（すなわち、コントロールベクターを導入したＣＤ４^＋Ｔ細胞）をそれぞれＨＩＶ−１Ｔ−トロピック株ＮＬ４−３でそれぞれチャレンジし、ＨＩＶ−１複製量をｐ２４に対する抗体を用いてエライザ法により測定した。コントロールのＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＨＩＶ複製は検出されなかったが、ＮＦ−ＩＬ６発現ＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＨＩＶ複製が顕著に誘導された（図１参照）。

つぎに、ＰＨＡで刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＰＨＡで刺激していないＣＤ４^＋Ｔ細胞、ジャーカットＴ細胞およびＳｕｐＴ１細胞から核抽出物を調製し、ＮＦ−ＩＬ６の発現状態をウエスタンブロッティング法で調べた。その結果、刺激していないＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＮＦ−ＩＬ６の発現は認められなかったが、ＰＨＡで刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞、ジャーカットＴ細胞およびＳｕｐＴ１細胞では、ＮＦ−ＩＬ６の発現が認められた（図２参照）。

また、ＮＦ−ＩＬ６のドミナントネガティブであるＬＩＰもしくはＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を過剰発現するＳｕｐＴ１細胞、ベクターのみを導入したコントロールのＳｕｐＴ１細胞、ならびに野生型のＳｕｐＴ１細胞を用い、これらの細胞をＨＩＶでチャレンジした後１２日間にわたってＨＩＶ複製を調べた。その結果、ＬＩＰおよびＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を過剰発現したＳｕｐＴ１細胞では、野生型ＳｕｐＴ１細胞およびコントロールのＳｕｐＴ１細胞に較べて、ＨＩＶ複製が顕著に抑制されていた（図４参照）。
また、本発明者は、別の試験で、ＮＦ−ＩＬ６がＨＩＶライフサイクルのうち逆転写の初期段階で関与していることを確認した（図３参照）。
上記の試験結果から、ＮＦ−ＩＬ６がＨＩＶ複製阻害剤の標的分子となり得ることが確認できた。

[スクリーニング方法]
（ヒト免疫細胞の調製）
本発明の方法に使用されるヒト免疫細胞はヒトＣＤ４^＋細胞であるのが好ましい。かかるヒトＣＤ４^＋細胞としては、ヒト由来のＣＤ４陽性のＴ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞などが挙げられる。これらの細胞は常法によって調製することができる。たとえば、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を調製する場合は、健常人より末梢血を採取し、フィコール勾配法により末梢血単核球を分画する。この分画をプラスチックシャーレに入れ、単球を吸着させて除き、さらにバイオマグネットビーズを用いてＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ１９^＋Ｂ細胞を除くことにより、ヒトＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分画を取得することができる。このヒトＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分画をヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞として使用できる。

（ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞の調製）
ヒト免疫細胞からＮＦ−ＩＬ６を発現する細胞を調製する方法は常法により行うことができる。たとえば、上記で得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＰＨＡ（２μｇ／ｍｌ）で刺激し、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのインターロイキン−２の存在下に、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養する。この細胞にＮＦ−ＩＬ６の遺伝子をレトロウイルス遺伝子導入法で導入し、発現マーカーであるＬｙｔ２を指標にしてＮＦ−ＩＬ６を発現する細胞をセルソーターで回収することによりＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を調製することができる。

（スクリーニング）

上記で調製されたＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を試験化合物の存在下にＨＩＶでチャレンジする。これにより前記細胞はＨＩＶに感染する。ＨＩＶとしては、ＨＩＶ−１やＨＩＶ−２を挙げることができるが、ＨＩＶ−１が好ましい。チャレンジするＨＩＶの量は１００〜１０００ＴＣＩＤ^５０／１０^５ｃｅｌｌｓ程度であるのが好ましい。試験化合物は、ＨＩＶでチャレンジする前にスクリーニング系（培養液）に添加しておいてもよく、チャレンジした直後に添加してもよく、さらに、チャレンジの前後に添加してもよい。上記チャレンジは“ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞”が生育できる条件下で実施され、通常、適当な培地（例えば、牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）中で実施され、チャレンジ後ヒト免疫細胞は３０〜４０℃、好ましくは３７℃で培養される。
なお、試験化合物は低分子化合物が好ましいが、蛋白質やペプチドなどでもよい。試験化合物が細胞膜を通過しない蛋白質やペプチドである場合は、ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞として、ＣＤ４^＋細胞（たとえば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のセルラインであるＳｕｐＴ１細胞）を用いるのが好ましく、該細胞に該蛋白質またはペプチドの遺伝子を導入し、該蛋白質またはペプチドを強制発現させることによって、系内に蛋白質またはペプチドを存在させることができる。

チャレンジ(感染)後、細胞のＨＩＶ複製能に対する試験化合物の阻害作用を検定する。この検定は、チャレンジしてから数日〜１０日後に、試験化合物の非存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量と試験化合物の存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量を測定し、それを比較することにより実施される。ＨＩＶ複製量の測定は、ＨＩＶのコア蛋白質（ＨＩＶ−１：ｐ２４、ＨＩＶ−２：ｐ２６）に対する抗体（抗ｐ２４抗体、抗ｐ２６抗体）を用い、エライザ（ＥＬＩＺＡ）法により行うことができる。
試験化合物の存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量が、試験化合物の非存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量に較べて低下しておれば、当該試験化合物はＨＩＶ複製阻害作用を有していると評価することができる。

（実験例１）
レトロウイルス・ジャーカットＴ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーでＣＤ４^＋Ｔ細胞を感染させ、感染したＣＤ４^＋Ｔ細胞をＨＸＢ−ＣＤ５（ＨＩＶ組換実験株ＨＸＢ２から誘導されるＨＩＶ−１構築物）でチャレンジし、ＣＤ５陽性細胞を集め、該細胞から全ＤＮＡを調製し、プライマーを用いてＤＮＡに対してＰＣＲを行った。
プライマー：
フォワード：
５’−ａｃｇｔｇａａｇｇｃｔｇｃｃｇａ−３’ （配列番号１）
リバース：
５’−ｔａｇｃｔｔｇｃｃａａａｃｃｔａｃａｇｇｔ−３’（配列番号２）
ＰＣＲ断片をレトロウイルスベクターｐＢＭＮにサブクローニングし、プラスミッドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡをレトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞にトランスフェクションして組み換えレトロウイルス上清を調製し、このレトロウイルス上清をプライマリーＣＤ４^＋Ｔ細胞に形質導入した。ＨＩＶ−１複製に対して強い誘導を与えるクローンを選択し、クローン３１と命名した。このクローン３１は、ＤＮＡ配列決定により、ＮＦ−ＩＬ６であることを確認した。

ＮＦ−ＩＬ６の遺伝子を、後記実施例１と同様にレトロウイルス遺伝子導入法によって、プライマリーＣＤ４^＋Ｔ細胞に導入し、ＮＦ−ＩＬ６を発現する細胞を選択した。この細胞とコントロールのＣＤ４^＋Ｔ細胞（すなわち、コントロールベクターを導入したＣＤ４^＋Ｔ細胞）をそれぞれＨＩＶ−１Ｔ−トロピック株ＮＬ４−３でチャレンジ（チャレンジ量：４００ＴＣＩＤ^５０／１０^５ｃｅｌｌ）した。チャレンジ後３日毎に１８日後まで、ＨＩＶ−１複製量をｐ２４に対する抗体を用いてエライザ法により測定した。結果は図１の通りである。
図１から分かるように、コントロールのＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＨＩＶ複製は検出されなかったが、ＮＦ−ＩＬ６発現ＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＨＩＶ複製が顕著に誘導された。このことから、ＨＩＶの複製にＮＦ−ＩＬ６が重要な働きをしていることが分かる。

（実験例２）
ＰＨＡで刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＰＨＡで刺激していないＣＤ４^＋Ｔ細胞、ジャーカットＴ細胞およびＳｕｐＴ１細胞のそれぞれから核抽出物を常法により調製し、ＮＦ−ＩＬ６の発現状態をウエスタンブロッティング法で調べた。結果は図２の通りである。
図２から分かるように、ＨＩＶ−１複製が起こらない無刺激ＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＮＦ−ＩＬ６の発現は認められなかったが、ＨＩＶ−１複製が誘導されるＰＨＡで刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞、ジャーカットＴ細胞およびＳｕｐＴ１細胞では、ＮＦ−ＩＬ６の発現が認められた。このことから、ＮＦ−ＩＬ６の発現がＨＩＶ−１複製に必要であることが示唆され、また無刺激のプライマリーＣＤ４^＋Ｔ細胞にＮＦ−ＩＬ６を発現させるためには、ＰＨＡなどでの刺激が必要であることが分かる。

(実験例３)
野生株ＳｕｐＴ１細胞、コントロールのＳｕｐＴ１細胞（すなわち、コントロールベクターを導入したＳｕｐＴ１細胞）、ＬＩＰを発現するＳｕｐＴ１細胞、およびＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を発現するＳｕｐＴ１細胞の各々に４００ＴＣＩＤ^５０／５×１０^４ｃｅｌｌでＨＩＶ−１Ｔトロピック株ＮＬ４−３を４時間感染させた。ＨＩＶ−１感染後細胞を３回洗い、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養し、３×１０^６培養細胞からそれぞれの細胞ＤＮＡをＱｉＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って調整した。プライマーペアーＲ／Ｕ５、Ｕ３／５ＮＣおよびＲ／５ＮＣ（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９５，５９５−６０４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２５，１９９８参照）を特異的プライマー（下記参照）として使い、３５サイクルのＰＣＲを行った（９４℃ ３０ｓ；５５℃ ３０ｓ；７２℃ ６０ｓ）。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルによる電気泳動により調べた。その結果は、図３の通りである。
特異的プライマー
５ＮＣ：５’−ｃｃｇａｇｔｃｃｔｇｃｇｔｃｇａｇａｇａｔｃ−３’
（配列番号３）
Ｕ３： ５’−ｃａｃａｃａｃａａｇｇｃｔａｃｔｔｃｃｃｔ−３’
（配列番号４）
Ｒ ： ５’−ｇｇｃｔａａｃｔａｇｇｇａａｃｃｃａｃｔｇｃｔｔ−３’
（配列番号５）
Ｕ５： ５’−ｃｔｇｃｔａｇａｇａｔｔｔｔｃｃａｃａｃｔｇａｃ−３’
（配列番号６）

図３から分かるように、野生株ＳｕｐＴ１細胞、コントロールのＳｕｐＴ１細胞およびＬＩＰ発現するＳｕｐＴ１細胞では、Ｒ／Ｕ５による逆転写産物（最も初期の逆転写物）に対する強いバンドが認められたが、ＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を発現するＳｕｐＴ１細胞では特異的なＰＣＲバンドは認められなかった。また、野生株ＳｕｐＴ１細胞およびコントロールＳｕｐＴ１細胞では、完全長２本鎖ウイルスＤＮＡのみを検出するＵ３／５ＮＣおよびＲ／５ＮＣのプライマーペアーによる強い逆転写産物のバンドが認められたが、ＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を発現するＳｕｐＴ１細胞では非常に弱いＰＣＲバンドしか認められなかった。なお、ＬＩＰを発現するＳｕｐＴ１細胞でのバンドは野生株ＳｕｐＴ１細胞およびコントロールＳｕｐＴ１細胞のそれに較べると弱かった。これらのことから、ＮＦ−ＩＬ６は、ＨＩＶ−１逆転写段階における初期産物であるストロングストップＤＮＡの産生に関与していることが分かる。

(実施例１)
ＨＩＶ−１非感染健常人より末梢血を採血しフィコール勾配法により末梢血単核球を分画する。プラスティックシャーレへの吸着（３７℃、４時間インキュベーション）によって単球を除き、さらにバイオマグネットビーズを使ってＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ１９^＋Ｂ細胞を除きＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分画を準備した（Ｃｅｌｌ−ＳＫ）。この細胞を２μｇ／ｍｌのＰＨＡで細胞を刺激し、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのインターロイキン−２存在下で１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
この細胞にＮＦ−ＩＬ６の遺伝子をレトロウイルス遺伝子導入法によって導入し、発現マーカーであるＬｙｔ２を指標にＮＦ−ＩＬ６を発現する細胞をセルソーターで回収した。
すなわち、レトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｏｅｎｉｘ Ａｍｐｈｏ細胞にレトロウイルスベクター（ｐＢＭＮ−ＮＦ−ＩＬ６−ＩＲＥＳ−Ｌｙｔ２）をリン酸カルシウム法により導入し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養後に培養液を交換し、さらに４８時間、３２℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養後にウイルス液を回収した。回収したウイルス液は、０．４５μｍｌのフィルターで濾過し、５μｇ／ｍｌのポリプレンを加え、ＰＨＡ刺激２〜３日後のＣＤ４^＋Ｔ細胞にスピンインフェクション（２５００ｒｐｍ、３２℃、９０分）により感染させた。３２℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養後、細胞を洗い、２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのインターロイキン−２存在下で１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地でさらに培養を続け、感染後４日目の細胞を発現マーカーであるＬｙｔ２を指標にＮＦ−ＩＬ６を発現する細胞をセルソーターで回収した。

回収した細胞は２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのインターロイキン−２存在下で１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地でさらに８日間培養を続け、ＨＩＶ−１Ｔトロピック株ＮＬ４−３を４００ＴＣＩＤ^５０／１０^５ｃｅｌｌで４時間感染させる。試験化合物（ＨＩＶ−１複製阻害剤の候補化合物）はＨＩＶ−１感染前または感染直後に添加して作用させる。ＨＩＶ−１感染後細胞を３回洗い２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのインターロイキン−２存在下で１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養し、ＨＩＶ−１複製能は培養上清中に放出されたウイルス量をｐ２４エライザキットによって調べる（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９５，ｐ５９５−６０４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２５，１９９８参照）。
無刺激状態のプライマリーＴ細胞ではＨＩＶ−１複製は起こらないが、ＮＦ−ＩＬ６を細胞内に強制発現させることでプライマリーＴ細胞にＨＩＶ−１複製を誘導させることができるので、試験化合物の存在によりＨＩＶ−１複製能がどれだけ抑えられたかを調べることにより、当該試験化合物のＨＩＶ−１複製阻害活性を検定できる。

（実施例２）
ＮＦ−ＩＬ６を恒常的に発現するヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞株ＳｕｐＴ１細胞にＮＦ−ＩＬ６のドミナントネガティブであるＬＩＰとＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）をレトロウイルス遺伝子導入法によってＳｕｐＴ１細胞に強制発現させた。
レトロウイルス遺伝子導入法は前記と同様に行った。すなわち、レトロウイルスパッケージング細胞であるＰｈｏｅｎｉｘ Ａｍｐｈｏ細胞にレトロウイルスベクター（ｐＢＭＮ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＲＥＳ−Ｌｙｔ２、ｐＢＭＮ−ＬＩＰ−ＩＲＥＳ−Ｌｙｔ２、またはｐＢＭＮ−ＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）−ＩＲＥＳ−Ｌｙｔ２）をリン酸カルシウム法により導入し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養後に培養液を交換し、さらに４８時間、３２℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養後にウイルス液を回収した。回収したウイルス液は、０．４５μｍｌのフィルターで濾過し、５μｇ／ｍｌのポリプレンを加えＳｕｐＴ１細胞にスピンインフェクション（２５００ｒｐｍ、３２℃、９０分）によって感染させた。３２℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養後、細胞を洗い、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、感染後４日目の細胞を発現マーカーであるＬｙｔ２を指標に、コントロールの細胞（すなわち、コントロールベクターを導入した細胞）、ＬＩＰを発現する細胞、およびＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を発現する細胞をそれぞれセルソーターで回収した。

野生株ＳｕｐＴ１細胞、コントロールのＳｕｐＴ１細胞、ＬＩＰを発現するＳｕｐＴ１細胞、およびＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を発現するＳｕｐＴ１細胞の各々に４００ＴＣＩＤ^５０／５×１０^４ｃｅｌｌでＨＩＶ−１Ｔトロピック株ＮＬ４−３を４時間感染させた。ＨＩＶ−１感染後細胞を３回洗い、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養した。培養上清中に放出されたウイルス量をｐ２４エライザキットによって測定することによって、ＨＩＶ−１複製能を調べた。その結果は図４の通りである。

図４から分かるように、２種類のＮＦ−ＩＬ６のドミナントネガティブを発現させた細胞ではＨＩＶ−１複製が抑制された。特にＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を発現させた細胞では、野生株ＳｕｐＴ１細胞およびコントロールのＳｕｐＴ１細胞に比べて、１０００倍以上ＨＩＶ−１複製を阻害した。このように、細胞内に強制発現させた物質によりＮＦ−ＩＬ６を阻害し、それによりＨＩＶ−１複製を阻害することが可能であった。
したがって、ＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）やＬＩＰの代わりに、これら以外の蛋白質やペプチド（試験化合物）を、ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞に強制発現させることによって、当該蛋白質やペプチドのスクリーニングを行うことが可能である。なお、試験化合物が細胞膜を貫通するペプチドや低分子化合物の場合は、実施例１に示したように、ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞を含む系に該試験化合物を添加することによって、スクリーニングすることが可能である。

本発明の方法によれば、薬剤耐性を起こさないＨＩＶ複製阻害薬をスクリーニングすることができるので、医療の分野や医薬の分野に利用することができる。

ＮＦ−ＩＬ６を発現するプライマリーＣＤ４^＋Ｔ細胞またはコントロールのＣＤ４^＋Ｔ細胞をＨＩＶ−１Ｔ−トロピック株ＮＬ４−３でそれぞれチャレンジしたときのＨＩＶ−１複製量を示す図である。 ＰＨＡで刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＰＨＡで刺激していないＣＤ４^＋Ｔ細胞、ジャーカットＴ細胞およびＳｕｐＴ１細胞におけるＮＦ−ＩＬ６の発現を示す図である。 ＬＩＰを過剰発現するＳｕｐＴ１細胞、ＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を過剰発現するＳｕｐＴ１細胞、ベクターのみを導入したコントロールのＳｕｐＴ１細胞、ならびに野生型のＳｕｐＴ１細胞をＨＩＶ感染させたのち、各細胞から得たＤＮＡに対しＰＣＲを行ったときの産物をアガロース電気泳動法で解析した図である。 ＬＩＰを過剰発現するＳｕｐＴ１細胞、ＮＦ−ＩＬ６（Ｓ２８８Ａ）を過剰発現するＳｕｐＴ１細胞、ベクターのみを導入したコントロールのＳｕｐＴ１細胞、ならびに野生型のＳｕｐＴ１細胞を用い、ＨＩＶでチャレンジしたときのＨＩＶ複製量を示す図である。

Claims (13)

1. ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞を試験化合物の存在下にヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）でチャレンジし、ついで前記細胞のＨＩＶ複製能に対する試験化合物の阻害作用を検定することを特徴とするＨＩＶ複製阻害薬のスクリーニング方法。
2. 試験化合物の阻害作用の検定を、試験化合物の非存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量と試験化合物の存在下にチャレンジしたときのＨＩＶ複製量を比較することにより行う請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞が、ヒト免疫細胞にＮＦ−ＩＬ６の遺伝子を導入した細胞である請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
4. ヒト免疫細胞が、ヒトＣＤ４^＋細胞である請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
5. ヒトＣＤ４^＋細胞がＣＤ４陽性のヒトＴ細胞、ヒトマクロファージ、ヒト単球またはヒト樹状細胞である請求項４記載のスクリーニング方法。
6. ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞が、マイトジェンで刺激したプライマリーＴ細胞にＮＦ−ＩＬ６の遺伝子を導入した細胞である請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
7. マイトジェンがフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）である請求項６に記載のスクリーニング方法。
8. ＨＩＶがＨＩＶ−１である請求項１〜７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
9. ＨＩＶ複製量をｐ２４ＥＬＩＳＡ法により測定する請求項２に記載のスクリーニング方法。
10. 試験化合物が低分子化合物である請求項１〜９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
11. 試験化合物が蛋白質またはペプチドであり、該蛋白質またはペプチドをＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞に強制発現させることにより存在させるか、または培養液に添加することにより存在させる請求項1または２に記載のスクリーニング方法。
12. ＮＦ−ＩＬ６を発現するヒト免疫細胞がヒトＣＤ４^＋細胞である請求項１１に記載のスクリーニング方法。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定されたＨＩＶ複製阻害薬。