ES2313727T3 - Expresion embebida de proteinas heterologas. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA LA EXPRESION DE UNA PROTEINA HETEROLOGA EN UNA CELULA HUESPED PROCARIOTA, QUE COMPRENDE LOS PASOS DE: (A) PROPORCIONAR UN DNA VECTOR QUE TIENE: (1) UNA REGION DE CONTROL LIGADA OPERACIONALMENTE A UN PRIMER ELEMENTO GENETICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA VEHICULO CAPAZ DE EXPRESARSE EN LA CELULA HUESPED, Y (2) UN SEGUNDO ELEMENTO GENETICO QUE CODIFICA LA PROTEINA HETEROLOGA, ESTANDO EL SEGUNDO ELEMENTO INCRUSTADO DENTRO DEL PRIMER ELEMENTO DE FORMA QUE EL PRIMER Y EL SEGUNDO ELEMENTOS ESTAN CONTIGUOS Y EN EL MISMO MARCO DE LECTURA; (B) TRANSFORMAR LA CELULA HUESPED CON EL DNA VECTOR; Y (C) EXPRESAR UNA PROTEINA DE FUSION DE LA PROTEINA HETEROLOGA Y LA PROTEINA VEHICULO, EN QUE LA PROTEINA HETEROLOGA ESTA UNIDA POR SU NTERMINAL A UN PRIMER DOMINIO DE LA PROTEINA VEHICULO Y POR SU CTERMINAL A UN SEGUNDO DOMINIO DE LA PROTEINA VEHICULO, Y TAMBIEN UN METODO PARA CONFIRMAR LA EXPRESION INTACTA DE PROTEINAS HETEROLOGAS, ASI COMO PROTEINAS DE FUSION, ESTRUCTURAS DE DNA, VECTORES PLASMIDICOS Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS RELACIONADOS CON LOS METODOS DESCRITOS MAS ARRIBA.

Description

Expresión embebida de proteínas heterólogas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para la producción, mediante células hospedadoras microbianas, de proteínas heterólogas. Más particularmente, la invención se refiere a la expresión de dichas proteínas en forma de proteínas de fusión en las que las proteínas de interés están embebidas, y también a construcciones de ADN, vectores plasmídicos y células hospedadoras transformadas útiles para generarlas.

Antecedentes de la invención

Aunque se conoce bien la expresión de proteínas no nativas ("heterólogas") tanto procariotas como eucariotas en hospedadores microbianos, existen varias dificultades técnicas que deben superarse en la expresión de una proteína; éstas incluyen (i) lograr un nivel de expresión suficiente, (ii) obtener la proteína en una forma que se aísle y purifique fácilmente y (iii) asegurar que la proteína se exprese en su totalidad y no truncada como por una traducción incompleta o por una degradación posterior. Una estrategia ha sido coexpresar la proteína de interés con otra proteína "transportadora" por unión de los genes para cada una; habitualmente, las proteínas de fusión resultante contienen los dos productos génicos unidos covalentemente entre sí, directamente o a través de un segmento enlazador corto.

Se ha descrito un sistema de expresión particularmente favorable en la Patente de Estados Unidos Nº 5.124.255, incorporándose expresamente dicha patente en la presente memoria como referencia. En esa patente, se describen proteínas de fusión que utilizan como una proteína transportadora la enzima CKS de Escherichia coli (CMP-KDO sintetasa o CTP:CMP-3-desoxi-D-mano-octulosonato citidilil transferasa). Esa transportadora permite la expresión a niveles elevados de las proteínas de fusión deseadas, en las que la proteína de interés está codificada por un ADN que se sitúa en el extremo 3' del gen transportador. Sin embargo, puede ocurrir en éste y en otros sistemas de expresión que el producto de fusión no se separe fácilmente de los productos de expresión estrechamente relacionados o contaminantes celulares de peso molecular similar. Además, puede ocurrir que la proteína de interés, que típicamente está en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, esté truncada en lugar de ser de longitud completa.

El documento EPA-0 355 737 describe métodos para generar proteínas de fusión que comprenden una proteína heteróloga del virus de la influenza A, el virus de la glosopeda y la bacteria Staphylococcus aureus. La proteína de fusión comprende una proteína transportadora (OmpA) en la que está embebida la proteína heteróloga. El ADN que codifica la proteína transportadora está unido a un elemento de control. Se describen también construcciones de ADN, plásmidos y bacterias E. coli transformadas para expresar dichas proteínas de fusión. Puesto que OmpA es una proteína de la membrana externa, el sistema de expresión de esta referencia da como resultado la expresión de una proteína de fusión unida a membrana de una pureza y solubilidad cuestionables.

El documento WO-A-92 13955 describe una proteína similar a tiorredoxina (proteína transportadora) fusionada con la secuencia de ADN que codifica un péptido o proteína heteróloga seleccionada. La proteína heteróloga puede fusionarse en el interior de la proteína similar a tiorredoxina. Se concibe el uso de dicha proteína transportadora para la expresión de una proteína soluble. No obstante, la purificación de una proteína soluble implica problemas.

Estas dificultades deben superarse cuando, por ejemplo, la proteína de interés es un epítopo o combinación de epítopos que se van usar en un inmunoensayo de diagnóstico y, por consiguiente, debe expresarse en su totalidad y poder purificarse. Por lo tanto, continúa siendo un objeto de la presente invención desarrollar sistemas de expresión mejorados que permitan la expresión fiable de una amplia diversidad de proteínas heterólogas completas y, además, que faciliten la purificación de dichas proteínas.

Sumario de la invención

Se ha descubierto ahora que proteínas heterólogas intactas pueden expresarse fácilmente como proteínas de fusión en las que la proteína heteróloga está embebida en, y no anexada a, un transportador especifico que actúe como compañero de fusión. Esta estrategia simplifica la purificación de la proteína de las proteínas celulares hospedadoras contaminantes y de los productos de truncamiento de proteínas recombinantes contaminantes.

Por consiguiente, en un aspecto de la invención, se describe un método para expresar una proteína heteróloga en una célula hospedadora procariota, que comprende las etapas de (a) proporcionar un vector de ADN que tiene (1) una región de control unida operativamente a un primer elemento genético que codifica una proteína transportadora capaz de la expresión en la célula hospedadora y (2) un segundo elemento genético que codifica la proteína heteróloga, estando el segundo elemento embebido dentro del primer elemento, de tal modo que el primer y el segundo elemento están contiguos y en la misma fase de lectura abierta; (b) transformar la célula hospedadora con el vector de ADN y (c) expresar una proteína de fusión de la proteína heteróloga y la proteína transportadora, en la que la proteína heteróloga está unida en su extremo N-terminal a un primer dominio de la proteína transportadora y en su extremo C-terminal a un segundo dominio de la proteína transportadora, donde dicha proteína transportadora es una proteína
CKS.

En un segundo aspecto de la presente invención se describen proteínas de fusión que comprenden una proteína heteróloga, que se han generado de acuerdo con el método anterior y se describen de forma similar.

En otro aspecto de la presente invención se describe un método para confirmar la expresión intacta de una proteína heteróloga, que comprende las etapas de (a) expresar la proteína heteróloga como una proteína de fusión de acuerdo con el método de expresión de la invención; (b) aislar la proteína de fusión; y (c) exponer la proteína de fusión a medios para detectar la presencia de una porción del segundo dominio de la proteína transportadora.

En un aspecto adicional de la presente invención se describen construcciones de ADN para la inserción en un vector plasmídico, que comprenden (a) una región de control unida operativamente a un primer elemento genético que codifica una proteína transportadora capaz de la expresión en una célula hospedadora y (b) un segundo elemento genético que codifica una proteína heteróloga, estando el segundo elemento embebido dentro del primer elemento, de tal modo que el primer y el segundo elemento están contiguos y en la misma fase de lectura abierta, donde dicha proteína transportadora es una proteína CKS.

En otro aspecto más de la presente invención se describen vectores plasmídicos que comprende una construcción de ADN de la invención, así como células hospedadoras transformadas con los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción de la presente invención se comprenderá más fácilmente en relación con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es una representación esquemática de la construcción de los plásmidos pJO210 y JO215 y la eliminación de los sitios de restricción de EcoRI y BamHI;

la Figura 2 es una representación esquemática de la construcción de plásmidos pMC200;

la Figura 3 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pJO200;

la Figura 4 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pMB28:lacZ-A1C2;

la Figura 5 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pMB34:lacZ-A1C2F3;

la Figura 6 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pMB38:lacZ-pp38(106-373aa);

la Figura 7 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pCMV-1A:CKS-A1C2F3-CKS;

la Figura 8 es una representación esquemática de (A) la preparación de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de ADN de A1C2F3 y H10; (B) la preparación de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de ADN de pp65(aa 297-510) y pp38(aa 117-373) y (C) la construcción del plásmido pCMV-3A:CKS-A1C2F3, del plásmido pCMV-3B:CKS-H10, del plásmido pCMV-4:CKS-A1C2F3-H10, del plásmido pCMV-9:CKS-pp65(297-510aa) y del plásmido pCMV-26:CKS-pp38 (117-373aa);

la Figura 9 es una representación esquemática de (A) la construcción del plásmido pJO200-\DeltaMIul; (B) la secuencia de nucleótidos del plásmido pJO200, incluyendo el sitio de modificación deseado en los restos del plásmido 151 a 180 (5'-3'); (C) la estructura bicatenaria del oligonucleótido mutagénico, 5' CGCGACGT 3', sintetizado para ligación en el plásmido pJO200/MIul/CIAP; y (D) la secuencia de nucleótidos del plásmido pJO200-\DeltaMIul, que incluye los restos modificados 151 a 180 (5'-3');

la Figura 10 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pEE1;

la Figura 11 es una representación esquemática de (A) la preparación de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de ADN de A1C2F3-H10, pp65(aa 297-510) y pp38(aa 117-373); y (B) la construcción del plásmido pCMV-27:CKS-A1C2F3-H10-CKS, del plásmido pCMV-28:CKS-pp65(297-510aa)-CKS, del plásmido pCMV-28STOP:CKS-pp65(297-510aa)-STOP-CKS y del plásmido pCMV-29:CKS-pp38(117-373aa)-CKS; y

la Figura 12 es la secuencia de ADN [SEC ID Nº:5] de los nucleótidos 1-920 y la secuencia de aminoácidos correspondiente de los aminoácidos 1-260 del plásmido pJO200.

Descripción detallada de la invención

Por consiguiente, en un aspecto de la invención se describe un método para expresar una proteína heteróloga a una célula hospedadora procariota, que comprende las etapas de (a) proporcionar un vector de ADN que tiene (1) una región de control unida operativamente a un primer elemento genético que codifica una proteína transportadora capaz de la expresión en la célula hospedadora y (2) un segundo elemento genético que codifica la proteína heteróloga, estando el segundo elemento embebido dentro del primer elemento, de tal modo que el primer y el segundo elemento están contiguos y en la misma fase de lectura abierta; (b) transformar la célula hospedadora con el vector de ADN y (c) expresar una proteína de fusión de la proteína heteróloga y la proteína transportadora, en la que la proteína heteróloga está unida en su extremo N-terminal a un primer dominio de la proteína transportadora y en su extremo C-terminal a un segundo dominio de la proteína transportadora, donde dicha proteína transportadora es una proteína CKS.

En el método de expresión de la presente invención, la proteína heteróloga puede ser cualquier proteína capaz de la expresión en la célula hospedadora y suficientemente benigna para que la expresión no perjudique significativamente ni inhiba el crecimiento del hospedador. Pueden ser proteínas heterólogas adecuadas de origen bacteriano, fúngico, de levaduras, viral, protozoario u otra fuente (incluyendo organismos causantes de zoonosis tales como Trypanosoma cruzi o Toxoplasma gondii), aunque se prefieren proteínas bacterianas y virales.

Se prefieren especialmente proteínas virales y, en particular, proteínas que proceden del citomegalovirus humano (HCMV), un patógeno de una importancia clínica considerable; dichas proteínas son importantes en el diagnóstico de la infección por HCMV mediante su uso como dianas de ensayo en la determinación de la presencia o ausencia de inmunoglobulinas específicas de HCMV. Se incluyen entre las proteínas de HCMV representativas que pueden expresarse por el método de la presente invención, y que contienen epítopos fácilmente identificados por inmunoglobulinas humanas, pp38 (una proteína de ensamblaje de 38 kD), pp65 (una proteína principal de la matriz de 65 kD), pp52 (una proteína de unión ADN no estructural de 52 kD), pp150 (una fosfoproteína estructural de 150 kD); de éstas, se prefieren las proteínas de HCMV pp38 y pp65. También se prefieren proteínas heterólogas que comprenden una porción inmunogénica de un epítopo seleccionado de entre los epítopos de HCMV H10, F3 y A1C2; se ha descubierto que estos epítopos proporcionan un medio sensible y específico de ensayo para inmunoglobulinas dirigidas contra HCMV.

Las regiones de control representativas adecuadas para el uso en el método anterior incluyen las que comprenden un promotor procariota y un sitio de unión al ribosoma procariota y, especialmente, aquellas en las que la región de control comprende un operón lac. Sin embargo, dependiendo de la célula hospedadora usada, también pueden emplearse otras regiones de control bien conocidas en la técnica.

La proteína transportadora que se reivindica (compañero de fusión con el que se fusiona y coexpresa el gen heterólogo) es una procedente de una proteína CKS, aunque se espera que el método de expresión embebida de la presente invención encontrará una amplia aplicación también con otras proteínas transportadoras, incluyendo, pero sin limitación, beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa y proteína de unión a maltosa. Cuando se usa CKS, una realización particularmente preferida del vector de ADN usado en el método anterior es una en la que la proteína heteróloga se sitúa entre un primer dominio de la proteína transportadora, que comprende una porción de los aminoácidos 1 a 171 de CKS, y un segundo dominio de la proteína transportadora, que comprende una porción de los aminoácidos 171 a 260 de CKS. (Como se describe a continuación, lo que se denomina proteína CKS puede incluir tanto los primeros 240 aminoácidos del gen kdsB original seguido de 20 aminoácidos adicionales en el extremo del gen de CKS, codificados por una secuencia de ADN polienlazadora).

Por consiguiente, las proteínas de fusión preferidas de la presente invención incluyen las que tienen la secuencia CKS*-CMV*-Thr-Arg-CKS**, en la que (a) CKS* es una porción de los aminoácidos 1 a 171 de CKS; (b) CMV* es una porción de una proteína de HCMV; y (c) CKS** es una porción de los aminoácidos 171 a 260 de CKS. De éstas, son proteínas de fusión especialmente preferidas en las que CMV* se selecciona de entre porciones de las proteínas de HCMV pp38, pp52, pp65 y pp150 y, particularmente, de entre las porciones inmunogénicas de las proteínas de HCMV pp38 o pp65 o las porciones inmunogénicas de los epítopos de HCMV H10, F3 y A1C2. Son ejemplos particulares de dichas proteínas de fusión aquellos en los que CMV* se selecciona de entre (a) A1C2F3-Leu-Gln-H10; (b) pp65(aa 297-510); (c) pp65(aa 297-510)-STOP, donde STOP es un codón de terminación; y (d) pp38(aa 117-373).

En el método de la presente invención, por el que se confirma la expresión intacta de una proteína heteróloga, el aislamiento de la proteína de fusión puede llevarse a cabo por métodos de separación conocidos tales como migración diferencial en un gel de electroforesis de la proteína de fusión con respecto a otros productos de expresión (tales como productos de fusión incompletos o truncados) o componentes celulares. (Debe señalarse que por "aislamiento" se entiende solamente que diversas especies moleculares se separan o resuelven, y no que la proteína de fusión deseada se aísla en forma pura). Después del aislamiento, puede usarse cualquier medio de detección adecuado para determinar la presencia de algunos o de todos los dominios de la proteína transportadora que flanquean la proteína heteróloga. Los medios de detección preferidos comprenden una inmunoglobulina que es inmunorreactiva con un epítopo contenido en el primer o segundo dominio de la proteína transportadora. Un método particularmente útil, tanto para el aislamiento de la proteína de fusión como para la exposición de la proteína a dicho medio de detección, es el procedimiento de transferencia de Western.

Las construcciones de ADN de la presente invención son las que se corresponden con el método y la proteína de fusión anteriores. Por consiguiente, son construcciones preferidas las que comprenden secuencias que codifican las proteínas heterólogas preferidas, epítopos, regiones de control, proteínas transportadoras y la yuxtaposición de elementos proteicos de fusión descritos anteriormente. Cuando se incorporan en los vectores plasmídicos de la invención, los vectores preferidos incluyen los seleccionados de entre (a) pCMV-27; (b) pCMV-28; (c) pCMV-28STOP; y (d) pCMV-29.

La presente invención en sus diversos aspectos puede llevarse a cabo usando metodología recombinante bien conocida en la técnica. Por ejemplo, se describe la expresión convencional de proteína heterólogas usando la proteína CKS como una transportadora en la Patente de Estados Unidos Nº 5.124.255 mencionada anteriormente. También se describen procedimientos relacionados en detalle en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.312.737 y 5.322.769 y en las referencias que se citan en las mismas.

Los métodos de expresión, métodos de confirmación, proteínas de fusión, construcciones de ADN, vectores plasmídicos y células hospedadoras transformadas de la presente invención se entenderán mejor en relación con los siguientes ejemplos, que tienen por objeto una ilustración de y no una limitación del alcance de la invención. Tanto a continuación como por toda la memoria descriptiva, se pretende que las citas bibliográficas se incorporen expresamente como referencia.

Ejemplo 1 Metodología general Materiales y fuentes

Se adquirieron enzimas de restricción, ADN ligasa T4, fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP), polinucleótido quinasa y el fragmento Klenow de la ADN Polimerasa I de New England Biolabs, Inc. (Beyerly, MA) o de Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN). Se adquirieron ADNasa I y aprotinina de Boehringer Mannheim Corp.

Se obtuvieron patrones de peso molecular de ADN y proteínas, geles de poliacrilamida en gradiente premoldeados Daiichi y sistema de transferencia semiseca con tampones de Integrated Separation Systems, Inc. (Natick, MA).

Se adquirieron isopropil-6-\beta-tiogalactosida (IPTG), acrilamida, N-N'-metilen-bis-acrilamida, N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED), 4-cloro-1-naftol, azul brillante de Coomassie^{TM} R250, Triton X-100^{TM} y dodecilsulfato sódico (SDS) de BioRad Laboratories (Richmond, CA).

Se adquirieron anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano rusticano (HRPO) de Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD). Se obtuvieron células E. coli supercompetentes EPICURIAN Coli^{TM} XL-1 BLUE (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 reIA1 lac [F proAB lacI^{q} Z\DeltaM15 Tn10 (Tet^{r})]), kit de aislamiento de ADN, kit de aislamiento de ARN y kit de síntesis de ADNc ZAP^{TM} de Stratagene Cloning Systems, Inc. (La Jolla, CA).

Se adquirieron kit reactivo de GeneAmp^{TM} y ADN Polimerasa AmpliTaq^{TM} de Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT). Los desoxinucleótidos trifosfato usados en los procedimientos generales eran del kit reactivo de GeneAmp^{TM}.

La membrana de nitrocelulosa soportada se adquirió de Schleicher & Schuell (Keene, NH).

El kit de nucleótidos para la secuenciación de ADN con Sequenase^{TM} y 7-deaza-dGTP y ADN polimerasa de Sequenase^{TM} versión 2.0 se obtuvo de U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, OH).

Se adquirió un kit de purificación de ARNm poliA+ de Pharmacia LKB Biotechnology, Inc. (Piscataway, NJ).

Se adquirieron placas de caldo de Luria con ampicilina (LBamp plates) de Micro Diagnostics, Inc. (Lombard, IL).

Se adquirieron medio OPTI-MEM^{TM}, suero fetal de ternero, solución salina tamponada con fosfato, E. coli DH5\alpha competentes (F-\diameter80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 phoA hsdR17(^{r}K^{-}, m_{K}^{+}) supE44 \lambda-thi-1 gyrA96 reIA1) y agarosa ultraPURE^{TM} de GIBCO BRL, Inc. (Gry Island, NY).

Se obtuvieron Bacto-Triptona, Bacto-Extracto de Levadura y Bacto-Agar de Difco Laboratories (Detroit, Ml).

Se adquirió caldo NZY^{TM} de Becton Dickinson Microbiology Systems (Cockeysville, MD).

Se adquirió ADN de esperma de salmón, lisozima, ampicilina, N-lauroil sarcosina, timerosal, tampones, caseína ácida hidrolisada, TWEEN 20^{TM} (monolaurato de polioxietilensorbitán), dietilpirocarbonato (DEPC), fenilmetisulfonilfluoruro (PMSF), albúmina de suero bovino (BSA), urea, glicerol, EDTA, desoxicolato sódico y sales inorgánicas de Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO).

Se adquirieron micropartículas de poliestireno de Polysciences, Inc. (Warrington, PA).

Se adquirió peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) de Mallinkrodt (Paris, KY). Se adquirió metanol de EM Science (Gibbstown, NJ).

Medios, tampones y reactivos generales

El "Superbroth II" contenía triptona 11,25 g/l, extracto de levadura 22,5 g/l, fosfato potásico dibásico 11,4 g/l, fosfato potásico monobásico 1,7 g/l, glicerol 10 ml/l, ajustado a pH 7,2 con hidróxido de sodio.

La "solución salina tamponada con Tris" o "TBS" consistía en Tris 20 mM, NaCl 500 mM a pH 7,5.

La "solución salina tamponada con Tris con TWEEN 20^{TM}" o "TBST" consistía en TBS más TWEEN 20^{TM} al 0,05%.

La "solución de bloqueo de membrana" consistía en albúmina de suero bovino al 1% (BSA), caseína ácida hidrolisada al 1% y TWEEN 20^{TM} al 0,05% en TBS.

El "tampón de dilución de muestra de Rubazyme" o "SDB de Rubazyme" consistía en Tris 100 mM a pH 7,5 con NaCl 135 mM, EDTA 10 mM, TWEEN 20^{TM}al 0,2%, timerosal al 0,01% y suero bovino de ternero al 4%.

El "tampón de dilución de diluyente de conjugado de Rubazyme" consistía en Tris 100 mM a pH 7,5 con NaCl 135 mM, timerosal al 0,01% y suero bovino de ternero al 10%.

La "solución de desarrollo de color de HRPO" consistía en 4-cloro-1-naftol al 0,06%, H_{2}O_{2} al 0,02% y metanol al 0,2% en TBS.

El "tampón de carga de SDS-PAGE " consistía en Tris 62 mM a pH 6,8 con SDS al 2%, glicerol al 10%, \beta-mercaptoetanol al 5% y azul bromofenol al 0,1%.

El "tampón TE" consistía en Tris 10 mM y EDTA 1 mM a pH 8,0.

El "tampón de lisis TEM" consistía en Tris 50 mM, EDTA 10 mM y cloruro de magnesio 20 mM a pH 8,5.

El "tampón PTE" consistía en Tris 50 mM y EDTA 10 mM a pH 8,5.

Propagación de virus y preparación de ADNc

La cepa AD 169 o la cepa Towne de HCMV se usaron de forma intercambiable y se propagaron en fibroblastos humanos cultivados en medio OPTI-MEM^{TM} suplementado con suero fetal de ternero al 5%. El HCMV AD169 y el genoma de HCMV se describen en las publicaciones de Chee et al., Curr. Top. Microbiol. Immuno. 154: 125 (1990) y Bankier et al., DNA Seq. 2: 1 (1991), cuyas descripciones se incorporan en la presente memoria como
referencia.

Seis (6) días post-infección, las células fibroblásticas infectadas con CMV se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS y se homogeneizaron con un homogeneizador de vidrio-Teflon^{TM}. Se aisló el ADN viral total como se describe en Mocarski et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 1266 (1985). Se aisló el ARN total a partir de las células homogeneizadas usando el kit de aislamiento de ARN (Stratagene Cloning Systems) y se aisló el ARN poliA^{+} usando un kit de aislamiento de ARNm (Pharmacia Biotech). Se sintetizó el ADNc de HCMV a partir del ARNm viral purificado usando un kit de síntesis ZAP-cDNA^{TM} (Stratagene Cloning Systems).

Métodos generales

Todas las digestiones enzimáticas de ADN se realizaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se usaron al menos 5 unidades de enzima por microgramo de ADN y se permitió un tiempo de incubación suficiente para una digestión completa del ADN. Se siguieron los protocolos del proveedor para los diversos kit usados en la manipulación de ADN y ARN, para la síntesis de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para la secuenciación de ADN. Se usaron procedimientos convencionales para minipreparaciones y preparaciones a gran escala de ADN plasmídico de E. coli, preparación de ADN de lisado de fagos de células E. coli infectadas con fago \lambda, preparación de lisados de E. coli para la absorción de anticuerpos anti-E. coli, extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol de ADN, análisis de restricción de ADN en geles de agarosa, purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y poliacrilamida, rellenado de los extremos 3' terminales con huecos generados por la digestión de ADN con enzimas de restricción usando el fragmento Klenow de la ADN Polimerasa, ligación de fragmentos de ADN con ADN ligasa T4 y para la preparación de células TB1 competentes (F^{-} ara d(lac-proAB) rpsL \diameter8OdlacZ\DeltaM 15 hsdR17) (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989).

Los fragmentos de ADN para clonación en plásmidos que se generaron mediante amplificación por PCR se extrajeron con fenol-cloroformo y se precipitaron con etanol antes de la digestión con enzimas de restricción de la mezcla de reacción de PCR. Se sintetizaron oligonucleótidos para PCR y secuenciación de ADN en un sintetizador de oligonucleótidos de Applied Biosystems, modelo 380B o 394, por el protocolo del fabricante.

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra las proteínas de HCMV A1C2F3 (del gen viral UL32), H10 (UL44) y pp65 (UL83) por inmunización de ratones con rpMB34 (lacZ-A1C2F3) purificado, rpROSH10 (lacZ-H10) purificado y rpCMV-9 (CKS-pp65(297-510aa)) purificado, respectivamente. Se obtuvieron anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra la proteína CKS por inmunización de ratones con rpHCV-23 (CKS-BCD) purificado, descrito en la Solicitud Internacional Publicada Nº WO93/0408 por Dailey et al. Las proteínas usadas para la inmunización tenían una pureza de aproximadamente el 90%, como se determinó por SDS-PAGE. El procedimiento para la inmunización de ratones, fusión de células, exploración y clonación de anticuerpos monoclonales y caracterización de anticuerpos monoclonales fue como se describe en la Solicitud Internacional Publicada Nº WO92/08738 por Mehta et al.

Ejemplo 2 Construcción de vector de expresión de CKS de pJO200

Como se representa en las Figuras 1-3, el vector pJO200 se construyó en tres etapas que comienzan con el plásmido pTB201, descrito en Bolling y Mandecki, Bio/Techniques 8: 488 (1990). La construcción del vector de expresión de CKS pJO200 permitió la fusión de proteínas recombinantes con la proteína CMP-KDO sintetasa (CKS) de E. coli. Las secuencia génica de ADN que codifica la proteína CKS estructural (también conocida como el gen kdsB) está publicada en Goldman et al., J. Biol. Chem. 261: 15831 (1986). La secuencia de aminoácidos de CKS incluye 248 restos aminoacídicos (aa) y se describe en el mismo artículo.

El plan de construcción para el plásmido pJO200 implicaba la eliminación de dos sitios de enzimas de restricción (EcoRI y BamHI) y la adición de un sitio de multiclonación en el extremo 3' del gen de CKS. Esto se realizó para facilitar la clonación posterior de genes de CMV que codifican los antígenos proteicos de CMV en el extremo 3' de CKS. El vector terminado contenía ADN que codificaba la secuencia de los primeros 240 aminoácidos del gen kdsB original seguido de 20 aminoácidos adicionales codificados por la secuencia de ADN polienlazadora, para un total de 260 aminoácidos.

Etapa A

Construcción de pJO210

El plásmido pJO210 es un derivado del vector de expresión de CKS, pTB201 (Figura 1). Este plásmido se construyó por eliminación de un solo sitio EcoRI presente en pTB201 localizado cadena arriba del promotor para el gen de CKS. Se aisló ADN plasmídico a gran escala (pTB201) a partir de células TB 1 usando método generales. El ADN se digirió completamente con EcoRI y se purificó con un gel de poliacrilamida. El fragmento de pTB201/EcoRI purificado se trató después con el fragmento Klenow de la ADN Polimerasa I en presencia de desoxinucleótidos trifosfato. Esta enzima rellenaba los extremos 3' terminales con huecos producidos después de la digestión con EcoRI, dejando extremos romos. El ADN se extrajo con fenol/cloroformo después del tratamiento con el fragmento Klenow, se precipitó con etanol y se resuspendió en tampón de ADN ligasa T4 y, por último, se ligó a temperatura ambiente con ADN ligasa T4 durante 4 horas. La mezcla de ligación se transformó en células TB1 competentes. Se preparó una minipreparación de ADN a partir de los transformantes y el ADN se exploró para determinar la pérdida del sitio EcoRI. Se aisló el plásmido pJO210, que había perdido el sitio EcoRI del plásmido pTB201.

Etapa B

Construcción de pJO215

El plásmido pJO215 es un derivado del plásmido pJ0210 (Figura 1). Este plásmido se construyó por eliminación de un solo sitio BamHI de pJ0210, localizado en el promotor para el gen de CKS, mediante el uso del procedimiento de mutagénesis puente de Mandecki, Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 7177 (1986). El ADN plasmídico (pJO210) de células TB1 se aisló usando métodos generales. El ADN se digirió con BamHI completamente y se purificó en un gen de acrilamida. El fragmento de pJO210/BamHI purificado se mezcló después con un oligonucleótido mutagénico que era complementario a una de las cadenas de ADN del pJ0210 en la región del plásmido que abarca el sitio BamHI y tenía la secuencia [SEC ID Nº: 1]

5'GGATAACAAT TGGGCATCCA GTAAGGAGGT 3'

Este oligonucleótido contenía un solo cambio de base G por C (en el nucleótido nº 15, subrayado anteriormente) que eliminaba el sitio BamHI cuando se incorporaba en un plásmido pJO210.

Después de la mezcla del oligonucleótido mutagénico con pJO210/BamHI, la mezcla se llevó a ebullición durante 3 minutos, se enfrió a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se transformó en células TB1 competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la pérdida del sitio BamHI. Se aisló el plásmido pJO215, que había perdido el sitio BamHI del plásmido pJO210.

Etapa C

Construcción de pMC200

El plásmido pMC200 (Figura 2) es un derivado del plásmido pMW507, descrito en Mandecki y Bolling, Gene 68: 101 (1988). Este plásmido se construyó por clonación de un oligonucleótido sintético que contenía un sitio de multiclonación en pMW507 usando el método FokI de síntesis de genes descrito por Mandecki y Bolling.

Se aisló ADN del plásmido pMW507 a gran escala a partir de células TB1 usando métodos generales. El ADN se digirió completamente con SmaI y después se mezcló con un oligonucleótido que tenía la secuencia [SEC ID Nº: 2]

5' AGGATGCGGA TCCCCGATCT CGACCCGTCG ACGAATTCGA GCTCGGTACC CGGGGATCCT CTA
{}\hskip0.85cm GACTGCA GGCATGCTAA GTAAGTAGAT CGGGAATTCA CATCCG 3'

que contenía brazos FokI en el extremo y varios sitios de enzimas de restricción.

Los nucleótidos del sitio de multiclonación incluían los siguientes sitios y secuencias de restricción: 5'-brazo FokI-extremo cohesivo BglII-SalI/AccI/HincII-EcoRI-SstI-KpnI-SmaI/XmaI-BamHI-XbaI-PstI-SphI-codones de terminación-extremo cohesivo BglII-brazo FokI-3'. El oligonucleótido se mezcló con pMW507/SmaI y la mezcla se llevó a ebullición durante 3 minutos, se enfrió a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se transformó en células TB1 competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del sitio de multiclonación. El plásmido pMC200 contenía la inserción del sitio de multiclonación en el pMW507, como se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Etapa D

Construcción de pJO200

El plásmido pJO200 es un derivado del plásmido pJO215 (Figura 3). El plásmido pJO200 se construyó por eliminación del sitio de multiclonación de pMC200 y clonación de este sitio en el extremo 3' del gen de CKS en pJO215.

Se aisló ADN plasmídico a gran escala (tanto de pMC200 como de pJO215) de células TB1 usando métodos generales. Se digirió el ADN del plásmido pJO215 completamente con BglII y después se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP) para evitar la recircularización del plásmido durante la reacción de ligación. El ADN del plásmido pMC200 se digirió con FokI. La digestión del plásmido pMC200 con FokI liberó el ADN del sitio de multiclonación del plásmido. Este ADN contenía extremos BglII cohesivos que podían ligarse fácilmente en el ADN de pJO215 después de digerirse con BglII. El plásmido pJO215/BglII/CIAP y el sitio de multiclonación liberado de pMC200/FokI (106 pares de bases) se purificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

El plásmido pJO215/BglII/CIAP y el sitio de multiclonación liberado de pMC200/FokI se mezclaron y se ligaron a 16ºC con ADN ligasa T4 durante una noche. El día siguiente, la mezcla de ligación se transformó en células TB1 competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del sitio de multiclonación en la orientación correcta en el sitio BglII. El plásmido pJO200 contenía el sitio de multiclonación en la orientación correcta. La secuencia de ADN del sitio de multiclonación en pJO200 en el sitio BglII se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión de lacZ-A1C2F3 pMB34

El plásmido pMB34 contenía secuencias de HCMV y era un derivado del vector de expresión de lacZ pROS, descrito en Ellinger et al., J. Clin. Micro. 27: 971 (1989). El vector pROS contenía una forma truncada del gen lacZ (aa 1-375) con un sitio de clonación polienlazador localizado cadena abajo del gen lacZ. El plásmido pMB34 se construyó en dos etapas. La primera etapa requería la unión de dos regiones de ppUL32, que codifica una fosfoproteína básica de HCMV de 150 kD (pp150) y después la unión de esta fusión de HCMV con el extremo 3' del gen lacZ en pROS.

Etapa A

Construcción de pMB28:lacZ-A1C2

El plásmido pMB28, un derivado del plásmido pROS (Figura 4), se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-A1C2 en la región polienlazadora de pROS. Se obtuvo HCMV-A1C2 mediante amplificación por PCR de ADN genómico de HCMV de la región del gen ppUL32 que codifica los aminoácidos 595-614 de pp150 (nucleótidos 1783-1842 de ppUL32, donde los nucleótidos 1 y 3144 se corresponden con los nucleótidos 42993 y 39850, respectivamente, de la cadena complementaria de la secuencia de ADN de AD169, como se describe en Chee et al. (1990) y Bankier et. al. (1991).

Se aisló ADN plasmídico a gran escala (pROS) a partir de células DH5\alpha usando métodos generales. El plásmido pROS se digirió con SalI y HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 que contenía un sitio SalI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1842 de ppUL32 que contenía un sitio HindIII, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN genómico de HCMV. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SalI y HindIII y el fragmento de 60 pares de bases que contenía el epítopo conocido como A1C2 (nucleótidos 1783-1842 de ppUL32) se purificó en un gel de agarosa. Este fragmento purificado se ligó después con pROS/SalI/HindIII purificado por incubación durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó el día siguiente en células DH5\alpha competentes. Se preparó el ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y los transformantes se exploraron para determinar la presencia del fragmento de 60 pares de bases en pROS en el extremo del gen lacZ. El plásmido pMB28 contenía el fragmento A1C2. La secuencia de ADN de A1C2 en pMB28 se confirmó mediante secuenciación de ADN y la región codificante de A1C2 se determinó que estaba en la fase de lectura abierta con la secuencia codificante de lacZ.

Etapa B

Construcción de pMB34:lacZ-A1C2F3

El plásmido pMB34, un derivado del plásmido pMB28 (Figura 5), se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía el epítopo HCMV-F3 en la región polienlazadora de pMB28, justo cadena debajo de la secuencia de ADN de A1C2. El fragmento de ADN que contenía el epítopo HCMV-F3 se obtuvo de un subclón \lambdagt11 de ppUL32 que codifica los aminoácidos 1006-1048 de pp150 (nucleótidos 3016-3144) y era de la biblioteca \lambdagt11 descrita por Mocarski et al. en Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 1266(1985).

Se aisló ADN plasmídico a gran escala (pMB28) a partir de células DH5\alpha usando métodos generales. Se preparó ADN lisado de fagos a partir del clon \lambda-F3 de fago \lambdagt11 usando métodos generales. Se digirió el plásmido pMB28 con StuI y la cadena principal del vector con extremos romos se purificó en un gel de agarosa. El ADN del fago \lambda-F3 se digirió con EcoRI y los extremos 3' terminales con huecos se rellenaron con el fragmento Klenow de la ADN Polimerasa I, dejando extremos romos. El fragmento de \lambda-F3 de 129 pares de bases y extremos romos se purificó en un gel de agarosa y después se ligó con extremos romos de pMB28/StuI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células DH5\alpha competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y los transformantes se exploraron para determinar la presencia del fragmento de 129 pares de bases en pMB28 en el extremo del gen lacZ en la orientación correcta. El plásmido pMB34 contenía el fragmento F3 en la orientación correcta. La secuencia de ADN de F3 en el plásmido pMB34 se confirmó por secuenciación de ADN. La región codificante de F3 estaba en la fase de lectura abierta con la secuencia codificante de lacZ-A1C2. La región codificante de la construcción de lacZ-A1C2F3 en pMB34 contenía un puente de 5 aminoácidos que tenía la secuencia [SEC ID Nº: 3]

Lys-Leu-Gln-Glu-Phe

(o K-L-Q-E-F) entre A1C2 y F3, dando como resultado una construcción que se denominó "lacZ(aa 1-375)-A1C2(aa 595-614, pp150)-K-L-Q-E-F-F3(aa 1006-1048, pp150)". La construcción completa, incluyendo el inserto pentapeptídico, se denomina en la presente memoria "A1C2F3".

Ejemplo 4 Construcción de vector de expresión de lacZ-pp38(aa 106-373) de pMB38

El plásmido pMB38, un derivado del vector de expresión de lacZ pROS (Figura 6), se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-pp38(aa 106-373) en la región polienlazadora de pROS. El fragmento de ADN que contenía HCMV-pp38(aa 106-373) se obtuvo por amplificación por PCR de ADN genómico de HCMV de la región del gen ppUL80a que codifica los aminoácidos 106-373 de la fosfoproteína pp38 (nucleótidos 316-1119 de ppUL80a, donde los nucleótidos 1 y 1119 se corresponden con los nucleótidos 116203 y 117321, respectivamente, de la secuencia de ADN de AD169).

El plásmido pROS se digirió con SalI y HindIII y la cadena principal del vector resultante se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 316 de ppUL80a y que contenía un sitio SalI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1119 de ppUL80a y que contenía un sitio HindIII y ambos cebadores se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN genómico de HCMV. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SalI y HindIII y el fragmento de 804 pares de bases que contenía pp38 (aa 106-373) se purificó en un gel de agarosa. Después, este fragmento purificado se ligó con pROS/SalI/HindIII purificado durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células DH5\alpha competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y los transformantes se exploraron para determinar la presencia del fragmento de pp38 (aa 106-373) de 804 pares de bases en pROS en el extremo del gen lacZ. El plásmido pMB38 contenía el fragmento de pp38 (aa 106-373). La secuencia de ADN de pp38 (aa 106-373) en pMB38 se confirmó mediante secuenciación de ADN y la región codificante de pp38 (aa 106-373) estaba en la fase de lectura abierta con la secuencia codificante de lacZ.

Ejemplo 5 Construcción de vectores de expresión de CKS-CMV basados en pJO200

Se utilizó el vector de expresión de CKS pJO200 como el punto de partida para una serie de seis construcciones de fusión de genes de CKS-CMV. Se construyeron dos tipos de plásmidos de fusión de genes de CKS-CMV. El primero, denominado en la presente memoria embebedor de epítopo, se construyó de tal modo que la secuencia de ADN del gen de CMV se insertaba dentro del gen de CKS en el nucleótido 638 de pJO200 (que se corresponde con el aminoácido 171 de CKS). Esta construcción se denominó "CKS(1-171aa)-CMV-CKS (171-260aa)". Las proteínas de fusión expresadas en E. coli a partir de este tipo de construcción contienen los epítopos del antígeno embebido completamente dentro de la secuencia de aminoácidos de CKS. Se construyó el plásmido pCMV-1A (descrito a continuación) de esta forma.

El segundo tipo de plásmido de fusión de genes de CKS-CMV se construyó con la secuencia de ADN del gen de CMV ligada al extremo 3' del gen de CKS en la posición que se corresponde con el aminoácido 248 de CKS. Esta construcción se denominó "CKS(1-248aa)-CMV". Los plásmidos pCMV-3A, pCMV-3B, pCMV-4, pCMV-9 y pCMV-26 (descritos a continuación) se construyeron de esta forma. Se aisló ADN plasmídico a gran escala (pJO200) por métodos generales y se usó para las construcciones descritas a continuación.

Etapa A

Construcción de pCMV-1A:CKS-A1C2F3-CKS

El plásmido pCMV-1 A, un derivado del plásmido pJO200 (Figura 7), se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-A1C2F3, obtenido por amplificación por PCR de ADN de A1C2F3 contenido en el plásmido pMB34, en el sitio StuI de pJO200.

Se aisló ADN plasmídico a gran escala (pMB34) por métodos generales. Se digirió ADN del plásmido pJO200 con StuI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. La digestión con StuI/BamHI eliminaba una porción del extremo 3' del gen de CKS que se restituía después en la reacción de ligación. Se clonaron dos fragmentos de ADN obtenidos por PCR en esta cadena principal del vector en una reacción de ligación de 3 vías. Se clonó A1C2F3 como un fragmento de ADN de StuI/MluI y la porción 3' restante del gen de CKS se clonó en un fragmento de ADN de MluI/BamHI, restituyendo el gen de CKS completo.

Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 que contenía un sitio StuI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 3144 de ppUL32 que contenía un sitio MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pMB34. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con StuI y MluI y el fragmento de 204 pares de bases que contenía A1C2F3 se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 640 de pJO200 (que contenía un sitio MluI) y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 905 de pJO200 y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pJO200. (Las numeraciones de nucleótidos anteriores se corresponden con la secuencia de ADN que se muestra en la Figura 12). Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con MluI y BamHI y el fragmento de 266 pares de bases que contenía la porción 3' del gen de CKS se purificó en gel. Estos fragmentos de ADN obtenidos por PCR purificados se ligaron después en pJO200/StuI/BamHI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligación se transformó en células XL-1 Blue competentes.

Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de A1C2F3 insertado en el sitio StuI de pJO200. El plásmido pCMV-1A contenía A1C2F3 insertado en el sitio StuI. La secuencia de ADN de A1C2F3 y el extremo 3' del gen de CKS se confirmaron mediante secuenciación de ADN. La región codificante de la construcción CKS-A1C2F3-CKS que codifica la proteína rpCMV-1A contenía un puente de dos aminoácidos (treonina y arginina) aportado por el sitio MluI entre A1C2F3 y el extremo 3' de CKS. Además, el aminoácido 171 de CKS estaba duplicado en la construcción, que se denominó "CKS(1-171aa)-A1C2F3-T-R-CKS(1-260aa)".

Etapa B

Construcción de pCMV-3A:CKS-A1C2F3

El plásmido pCMV-3A, un derivado del plásmido pJO200 (Figuras 8A y C), se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-A1C2F3, obtenido por amplificación por PCR de ADN de A1C2F3 contenido en el plásmido pMB34, en los sitios SacI/BamHI de pJO200. El plásmido pJO200 se digirió con SacI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 que contenía un sitio SacI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 3144 de ppUL32 que contenía un codón de terminación en el extremo de la secuencia codificante de A1C2F3 seguido de un sitio BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pMB34. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SacI y BamHI y el fragmento de 204 pares de bases que contenía A1C2F3 se purificó en un gel de agarosa y después se ligó en pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC.

La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de 204 pares de bases en pJO200 en los sitios SacI/BamHI. El plásmido pCMV-3A contenía el fragmento A1C2F3 fusionado en la fase de lectura abierta con el gen de CKS. Se confirmó la secuencia de ADN de A1C2F3 y del extremo 3' del gen de CKS. Esta construcción de fusión de CKS-CMV se denominó "CKS(1-248aa)-A1C2F3".

\newpage

Etapa C

Construcción de pCMV-3B:CKS-H10

El plásmido pCMV-3B, otro derivado del plásmido pJO200, se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-H10 del plásmido pROSH10, descrito en Ripalti et al., J. Virological Methods 46: 39 (1994), en pJO200. La secuencia de ADN de H10 se obtuvo de ppULA4, que codifica una fosfoproteína de 52 kD de HCMV. La porción H10 de ppUL44 en pROSH10 contenía los nucleótidos 604-1299 de ppUL44, donde los nucleótidos 1 y 1299 se corresponden con los nucleótidos 56512 y 55214, respectivamente, de la cadena complementaria de la secuencia de ADN de AD169). H10 codifica la mitad C-terminal de la fosfoproteína pp52, que se corresponde con los aminoácidos 202-434. Se construyó el plásmido pCMV-3B por clonación del fragmento de ADN de H10 de pROSH1O, obtenido por amplificación por PCR de la secuencia de ADN de H10, en los sitios SacI/BamHI de pJO200.

El plásmido pJO20 se digirió con SacI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 604 de ppUL44 que contenía un sitio SacI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1299 de ppUL44 que contenía un codón de terminación en el extremo de la secuencia codificante de H10 seguido de un sitio BamHI y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pROSH10. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SacI y BamHI y el fragmento de 696 pares de bases que contenía H10 se purificó en un gel de agarosa y después se ligó con pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de 696 pares de bases en pJO200 en los sitios SacI/BamHI. El plásmido pCMV-3B contenía el fragmento de H10 fusionado en la fase de lectura abierta con el gen de CKS. Se confirmó la secuencia de ADN de H10 y del extremo 3' del gen de CKS. Esta construcción de fusión de CKS-CMV se denominó "CKS(1-248aa)-H10".

Etapa D

Construcción de pCMV-4:CKS-A1C2F3-H10

El plásmido pCMV-4, un derivado adicional de pJO200, se construyó por clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR que contenían tanto HCMV-A1C2F3 como HCMV-H10 obtenidos de pMB34 y pROSH10, respectivamente, en pJO200.

El plásmido pJO200 se digirió con SacI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se clonaron dos fragmentos de ADN obtenidos por PCR en una reacción de ligación de 3 vías en esta cadena principal del vector. Se clonó 1C2F3 como un fragmento de ADN de SacI/PstI y se clonó H10 como un fragmento de ADN de PstI/BamHI.

Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 que contenía un sitio SacI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 3144 de ppUL32 que contenía un sitio PstI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pMB34. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SacI y PstI y el fragmento de 204 pares de bases que contenía A1C2F3 se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 604 de ppUL44 que contenía un sitio PstI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1299 de ppUL44 que contenía un codón de terminación en el extremo de la secuencia codificante de H10 seguido de un sitio BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pROSH10. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción
se digirió con PstI y BamHI y el fragmento de 696 pares de bases que contenía H10 se purificó en un gel de agarosa.

Los fragmentos de ADN obtenidos por PCR purificados de HCMV-A1C2F3 y HCMV-H10 se ligaron después en pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de A1C2F3 y H10 insertados en los sitios SacI/BamHI de pJO200. El plásmido pCMV-4 contenía A1C2F3 y H10 en el extremo del gen de CKS en pJO200. Se confirmó la secuencia de ADN de A1C2F3 y H10. La región codificante de la construcción CKS-A1C2F3-H10 que codifica la proteína recombinante rpCMV-4 contenía un puente de dos aminoácidos aportado por el sitio PstI entre A1C2F3 y H10. Esta construcción de fusión de CKS-CMV se denominó "CKS(1-248aa)-A1C2F3-L-Q-H10". La construcción completa, incluyendo el inserto dipeptídico, se denomina en la presente memoria "A1C2F3-H10".

Etapa E

Construcción de pCMV-9:CKS-pp65(297-510aa)

El plásmido pCMV-9, otro derivado más de pJO200, se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-pp65(aa 297-510), obtenido por amplificación por PCR de ADNc de HCMV de la región de ppUL83 que codifica los aminoácidos 297-510 de pp65, en pJO200. El fragmento usado consistía en los nucleótidos 889-1530 de ppUL83, donde los nucleótidos 1 y 1683 se corresponden con los nucleótidos 121037 y 119355, respectivamente, de la cadena complementaria de la secuencia de ADN de AD169.

Se usó una reacción de PCR anidada de dos fases para generar el fragmento de ADN de HCMV-pp65(aa 297-510) usando ADNc de HCMV como molde. Para la reacción de amplificación por PCR anidada exterior, se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 807 de ppUL83, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1572 de ppUL83, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADNc de HCMV. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción de PCR anidada exterior se usó como ADN molde para la reacción de amplificación por PCR anidada interior. Para la reacción de amplificación por PCR anidada interior, se diseñaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 889 de ppUL83 que contenía un sitio SacI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1530 de ppUL83 que contenía un codón de terminación en el extremo de la secuencia codificante de pp65 (aa 297-510) seguido de un sitio BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el ADN amplificado por PCR anidada exterior. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SacI y BamHI y el fragmento de 642 pares de bases que contenía pp65 (aa 297-510) se purificó en un gel de agarosa.

El plásmido pJO200 se digirió con SacI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN purificado de HCMV-pp65(aa 297-510) se ligó después en pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de pp65 (aa 297-510) insertado en los sitios SacI/BamHI de pJO200. El plásmido pCMV-9 contenía pp65(aa 297-510) en el extremo del gen de CKS en pJO200. Se confirmó la secuencia de ADN de pp65 (aa 297-510). Esta construcción de fusión de CKS-CMV se denominó "CKS(1-248aa)-pp65(297-510aa)".

Etapa F

Construcción de pCMV-26:CKS.pp38(117-373aa)

El plásmido pCMV-26, otro derivado más de pJO200, se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía HCMV-pp38(aa 117-373), obtenido por amplificación por PCR de ADN de pp38 de la región de ppUL80a que codifica los aminoácidos 117-373 de pp38 (nucleótidos 349-1119) obtenido de pMB38, en pJO200.

Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 349 de ppUL80a que contenía un sitio SacI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1119 de ppUL80a que contenía un codón de terminación seguido de un sitio BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN de pMB38. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con SacI y BamHI, y el fragmento de 771 pares de bases que contenía pp38 (aa 117-373) se purificó en un gel de agarosa.

Se aisló ADN plasmídico (pMB34) a gran escala por métodos generales. Se digirió el plásmido pJO200 con SacI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN purificado de HCMV-pp38(aa 117-373) se ligó después en pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de pp38 (aa 117-373) insertado en los sitios SacI/BamHI de pJO200. El plásmido pCMV-26 contenía pp38 (aa 117-373) en el extremo del gen de CKS en pJ0200. Se confirmó la secuencia de ADN de pp38 (aa 117-373). Esta construcción de fusión de CKS-CMV se denominó "CKS(1-248aa)-pp38(117-373aa)".

Ejemplo 6 Construcción de vector de expresión de CKS que embebe epítopos pEE1

Se preparó un vector de expresión de CKS que embebe epítopos que permitía el embebimiento de proteínas recombinantes que contenían epítopos dentro de la proteína CKS. El vector, denominado en la presente memoria pEE1, también se denominó "CKS(1-171aa)-Proteína Recombinante-T-R-CKS(171-260aa)". Este vector pEE1 se construyó en dos etapas que comenzaban con el vector de expresión de CKS pJO200. En la primera etapa, se clonó un oligonucleótido mutagénico en un par de sitios MluI adyacentes localizados cerca del extremo 5' del gen de CKS en pJO200, eliminando ambos sitios MluI y un sitio SalI. Esta modificación en el pJO200 permite el uso de un sitio de clonación MluI único que se introduce adicionalmente cadena abajo en el gen de CKS en la siguiente etapa. En la segunda etapa, se clonó un fragmento de ADN del plásmido pCMV-1A en este vector pJO200 modificado, permitiendo de este modo el embebimiento de genes como fragmentos de StuI/MluI en el gen de CKS.

Etapa A

Construcción de pJO200-\DeltaMluI

El plásmido pJO200-\DeltaMluI, un derivado del vector de expresión de CKS pJO200 (Figura 9A), se construyó por eliminación de un par de sitios MluI adyacentes y un sitio SalI localizados en los nucleótidos 161-174 (aminoácidos 11-15) en la secuencia de ADN de pJO200 usando un oligonucleótido mutagénico. El sitio de modificación de la secuencia de ADN de pJO200 nativa estaba contenido en la secuencia de nucleótidos 151-180 5'-3' (Figura 9B). Se señalan los dos nucleótidos mutagénicos dirigidos, la timina 166 del ADN de pJO200 y la adenina 169 del ADN de pJO200, así como los dos sitios MluI y el sitio SalI.

El plásmido pJO200 se digirió con MluI, se precipitó con etanol y se resuspendió en tampón de fosfatasa alcalina. Después, el plásmido pJO200/MluI se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP) para eliminar los grupos fosfato 5' para evitar la autoligación. El ADN se extrajo con fenol-cloroformo después del tratamiento con CIAP, se precipitó con etanol y se resuspendió en tampón TE. Después, la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa.

El oligonucleótido mutagénico de la Figura 9C se sintetizó para la ligación en pJO200/MluI/CL4P. Este oligonucleótido era complementario consigo mismo en su extremo 3' y era capaz de formar una estructura bicatenaria después de una etapa de desnaturalización por calor seguida de una etapa de hibridación. El oligonucleótido mutagénico contenía extremos MluI cohesivos que permitían la ligación en el ADN de pJO200 digerido con MluI. La secuencia de este oligonucleótido se diferenciaba de la secuencia de ADN de pJO200 nativa en que los restos T166 del ADN de pJO200 y A169 del ADN de pJO200 estaban invertidos en el oligonucleótido mutagénico (Figuras 9C y D, como se señala mediante el subrayado). Por lo tanto, cuando el oligonucleótido mutagénico se clonaba en el sitio MluI de pJO200, eliminaba ambos sitios MluI y el sitio SalI.

El oligonucleótido mutagénico sintético se fosforiló en su extremo 5' usando una polinucleótido quinasa. La mezcla de reacción se calentó a 65ºC durante 20 minutos para inactivar la quinasa. Después de enfriar a temperatura ambiente, el oligonucleótido fosforilado se mezcló con el pJO200/MluI/CIAP, se calentó a 65ºC durante 5 minutos y después se enfrió gradualmente a temperatura ambiente para permitir la hibridación del oligonucleótido fosforilado consigo mismo. Después se añadieron tampón de ligación y ADN ligasa T4 y la mezcla se incubó durante una noche a medida que se disminuía la temperatura desde 20ºC hasta 4ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la pérdida de los sitios MluI y SalI. Se aisló el plásmido pJO200\DeltaMluI, que había perdido estos sitios de enzimas de restricción. La secuencia de ADN del extremo 5' del gen de CKS se confirmó por secuenciación de ADN. Además de eliminar los sitios MluI y SalI, el oligonucleótido mutagénico cambiaba los aminoácidos codificados por los nucleótidos 166-171 de Ser-Thr a Thr-Ser. De este modo, la secuencia de ADN del plásmido pJO200 se modificó al ADN del plásmido pJO200\DeltaMluI, que tenía la secuencia parcial de los nucleótidos 151-180 5'-3' de la Figura 9D.

Etapa B

Construcción de pEE1

El plásmido pEE1, un derivado del plásmido pJO200\DeltaMIul (Figura 10), se construyó por clonación de un fragmento StuI/BamHI del plásmido pCMV-1A, que contenía HCMV-A1C2F3 embebido dentro del gen de CKS, en los sitios StuI/BamHI de pJO200\DeltaMluI. Por sustitución del fragmento de ADN de StuI/BamHI dentro de la región codificante de CKS presente en pJO200\DeltaMluI con el fragmento StuI/BamHI del plásmido pCMV-1A, el plásmido pEE1 resultante contenía HCMV-A1C2F3 embebido dentro del gen de CKS. El plásmido pEE se diferenciaba del plásmido pCMV-1 en que el pEE1 no contenía los sitios MluI cadena arriba presentes en el extremo 5' del gen de CKS. Por lo tanto, la digestión de pEE1 con StuI y MluI liberaría el fragmento de ADN de HCMV-A1C2F3 y proporcionaría una cadena principal del vector después de la purificación en un gel de agarosa capaz de aceptar otros genes para su embebimiento dentro del gen de CKS como fragmentos de ADN con extremos romos/cohesivos compatibles con MluI.

Se aislaron ADN plasmídicos a gran escala (pJO200\DeltaMluI y pCMV-1A) mediante métodos generales. El plásmido pCMV-1A se digirió con StuI y BamHI y el fragmento de 461 pares de bases, que contenía A1CZF3, y el extremo 3' del gen de CKS, se purificaron en un gel de agarosa. Se digirió plásmido pJO200\DeltaMluI con StuI y BamHI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 461 pares de bases que contenía A1C2F3 y la cadena principal del vector pJO200\DeltaMluI/StuI/BamHI se mezclaron y se ligaron durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de ADN de A1C2F3 de 461 pares de bases en pJO200\DeltaMIul. El plásmido pEE1 contenía el fragmento de ADN de A1C2F3 y no contenía sitios MluI en el extremo 5' del gen de CKS. La secuencia de ADN del extremo 3' del gen de CKS y el fragmento A1C2F3 se confirmaron mediante secuenciación de ADN. La digestión del plásmido pEE1 con StuI y BamHI, seguida de la purificación de la cadena principal del vector en un gel de agarosa, eliminó completamente el fragmento de ADN de A1C2F3 en la preparación para la ligación con otros fragmentos de ADN. Esta cadena principal del vector purificada podría aceptar fragmentos de ADN para su embebimiento dentro del gen de CKS en la fase de lectura abierta correcta, representada esquemáticamente como "5' X-Gen de Interés-Y 3'", donde X es un extremo romo e Y es un extremo cohesivo compatible con MluI, como por ejemplo, MluI o BssHII. El plásmido pEE1 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (Estados Unidos) bajo los términos del Tratado de Budapest el 1 de mayo de 1995 y se acordó el Nº de Acceso ATCC 69798.

Ejemplo 7 Construcción de vectores de expresión de CKS que embebe epítopos basados en pEE1

El vector de expresión de CKS pEE1 se utilizó como el punto de partida para una serie de cuatro construcciones de fusión de genes de CKS-CMV-CKS. Para cada construcción, se digirió el plásmido pEE1 con StuI y MluI y se purificó la cadena principal del vector. La cadena principal de pEE1/Stul/MluI era capaz de aceptar fragmentos génicos de CMV generados por PCR que tenían un sitio StuI en su extremo 5' y un sitio MluI en su extremo 3'. Después de la digestión con StuI y MluI, los fragmentos de PCR se clonaron en la fase de lectura abierta en la cadena principal de pEE1/StuI/MluI. Las proteínas de fusión de CKS-CMV-CKS expresadas a partir de estos vectores se denominaron "CKS(1-171aa)-CMV-T-R-CKS(171-260aa)", donde T y R eran restos de treonina y arginina codificados por el sitio MluI sintético introducido en el vector.

Etapa A

Construcción de pCMV-27:CKS-A1C2F3-H10-CKS

El plásmido pCMV-27, un derivado de pEE1 (Figuras 11A y B), se construyó por clonación de un fragmento de ADN amplificado por PCR que contenía HCMV-A1C2F3-H10 obtenido de pCMV-4, en pEE1. El plásmido pCMV-27 se depositó en la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest el 1 de mayo de 1995 y se acordó el Nº de Acceso ATCC 69797.

Se aislaron ADN plasmídicos a gran escala (pEE1 y pCMV-4) mediante métodos generales. El plásmido pEE1 se digirió con StuI y MluI y la cadena principal del vector, pEE1/StuI/MluI, se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 que contenía un sitio StuI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1299 de ppUL44 que contenía un sitio MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pCMV-4. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con StuI y MluI y el fragmento de 906 pares de bases que contenía A1C2F3-H10 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN de 906 pares de bases se ligó en pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de ADN de A1C2F3-H10 insertado en los sitios StuI/MluI de pEE1. El plásmido pCMV-27 contenía A1C2F3-H10 embebido en los sitios StuI/MluI de pEE1. La secuencia de ADN de A1C2F3-H10 y la secuencia de ADN adyacente de CKS se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Esta construcción de fusión de CKS-CMV-CKS se denominó "CKS(1-1711aa)-A1C2F3-L-Q-H10-T-R-CKS(171-260)" donde L y Q y T y R son los restos de leucina, glutamina, treonina y arginina codificados por los sitios PstI y MluI sintéticos, respectivamente, introducidos en el vector.

Etapa B

Construcción de pCMV-28:CKS-pp65(297-510aa)-CKS

El plásmido pCMV-28, otro derivado de pEE 1, se construyó por clonación de un fragmento de ADN amplificado por PCR que contenía HCMV-pp65(aa 297-510) obtenido de pCMV-9, en pEE1. El plásmido pCMV-28 se depositó en la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest el 1 de mayo de 1995 y se acordó el Nº de Acceso ATCC 69799.

Se aislaron ADN plasmídicos a gran escala (pEE1 y pCMV-9) por métodos generales. El plásmido pEE1 se digirió con StuI y MluI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 889 de ppUL83 que contenía un sitio StuI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1530 de ppUL83 que contenía un sitio MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pCMV-9. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con StuI y MluI y el fragmento de 642 pares de bases que contenía pp65 (aa 297-510) se purificó en un gel de agarosa El fragmento de ADN de 642 pares de bases purificado se ligó en pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de ADN de pp65 (aa 297-510) insertado en los sitios StuI/MluI de pEE1. El plásmido pCMV-28 contenía pp65 (aa 297-510) embebido en los sitios StuI/MluI de pEE1. La secuencia de ADN de pp65 (aa 297-510) y la secuencia de ADN adyacente de CKS se confirmaron por secuenciación de ADN. Esta construcción de fusión de CKS-CMV-CKS se denominó "CKS(1-171aa)-pp65(297-510aa)-T-R-CKS(171-260)" donde T y R son los restos de treonina y arginina codificados por los sitios MluI sintéticos introducidos en el vector.

Etapa C

Construcción de pCMV-28STOP:CKS-pp65(297-510aa)-STOP-CKS

El plásmido pCMV-28STOP, un derivado adicional de pEE1, se construyó por clonación de un fragmento de ADN amplificado por PCR que contenía HCMV-pp65(aa 297-510) obtenido de pCMV-9, en pEE1. Cuando se traduce, el plásmido produce una forma truncada de la proteína recombinante rpCMV-28, como se describe a continuación.

Se aislaron ADN plasmídicos a gran escala (pEE1 y pCMV-9) por métodos generales. El plásmido pEE1 se digirió con StuI y MluI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 889 de ppUL83 que contenía un sitio StuI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1530 de ppUL83 que contenía un codón de terminación seguido de un sitio MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido pCMV-9. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con StuI y MluI y el fragmento de 642 pares de bases que contenía pp65 (aa 297-510) se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN de 642 pares de bases purificado se ligó en pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de ADN de pp65 (aa 297-510) insertado en los sitios StuI/MluI de pEE1. El plásmido pCMV-28 contenía pp65 (aa 297-510) embebido en los sitios StuI/MluI de pEE1. Se confirmaron la secuencia de ADN de pp65 (aa 297-510) y la secuencia de ADN adyacente de CKS. Esta construcción de fusión de CKS-CMV-CKS se denominó "CKS(1-171aa)-pp65(297-510aa)-STOP-T-R-CKS(171-260)" donde STOP es el codón de terminación y T y R son los restos de treonina y arginina codificados por los sitios MluI sintéticos introducidos en el vector. Debido a la presencia del codón de terminación en el extremo de la secuencia codificante de pp65, la secuencia codificante restante para la región C-terminal de la proteína CKS no se tradujo ni se expresó en E. coli a partir de esta construcción.

Etapa D

Construcción de pCMV-29:CKS-pp38(aa 117-373)-CKS

El plásmido pCMV-29, un derivado de pEE1, se construyó por clonación de un fragmento de ADN amplificado por PCR que contenía HCMV-pp38(aa 117-373) obtenido de pCMV-26, en pEE1. El plásmido pCMV-29 se depositó en la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest el 1 de mayo de 1995 y se acordó el Nº de Acceso ATCC 69796.

Se asilaron ADN plasmídicos a gran escala (pEE1 y pCMV-26) por métodos generales. Se digirió el plásmido pEE1 con StuI y MluI y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador con sentido, que comenzaba en el nucleótido 349 de ppUL80a que contenía un sitio StuI, y un cebador antisentido, que comenzaba en el nucleótido 1119 de ppUL80a que contenía un sitio MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía plásmido CMV-26. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción se digirió con StuI y MluI y el fragmento de 771 pares de bases que contenía pp38 (aa 117-373) se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de ADN de 771 pares de bases se ligó en pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se transformó al día siguiente en células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia del fragmento de ADN de pp38 (aa 117-373) insertado en los sitios StuI/MluI de pEE1. El plásmido pCMV-29 contenía pp38 (aa 117-373) embebido en los sitios StuI/MluI de pEE1. La secuencia de ADN de pp38 (aa 117-373) y la secuencia de ADN adyacente de CKS se confirmaron por secuenciación de ADN. Esta construcción de fusión de CKS-CMV-CKS se denominó "CKS(1-171aa)-pp38(117-373aa)-T-R-CKS(171-260)" donde T y R son los restos de treonina y arginina codificados por los sitios MluI sintéticos introducidos en el vector.

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Ejemplo 8 Producción y caracterización de antígenos de CMV recombinantes

Los plásmidos pCMV-1A, pCMV-3A, pCMV-4, HCMV-9, pCMV-26, pCMV-27, pCMV-28, pCMV-28STOP y pC-MV-29 se transformaron por separado en E. coli K-12 competentes cepa XL-1 Blue. Los clones bacterianos que expresaban las proteínas de HCMV individuales se cultivaron durante una noche a 37ºC en medio Superbroth II que contenía ampicilina 100 \mug/ml. Los cultivos de una noche se diluyeron 1:100 en los mismos medios y se cultivaron a 37ºC en aerobiosis hasta que el cultivo alcanzó una densidad óptica de 0,7-0,9, medida a 600 nm. Se tomó una muestra previamente inducida del cultivo, se centrifugó durante 1 minuto a 13.000 x g y se preparó un lisado bacteriano bruto por resuspensión del sedimento celular en tampón de carga de SDS-PAGE y ebullición durante 5 minutos.

La síntesis de antígeno de HCMV recombinante se indujo en cada cultivo individual por adición de IPTG a una concentración final de 1 mM después de que la densidad óptica alcanzó 0,7-0,9. Se tomó una muestra del cultivo 4 horas después de la inducción con IPTG, la muestra se centrifugó durante 1 minuto a 13.000 x g y se preparó un lisado bacteriano bruto por resuspensión del sedimento celular en tampón de carga de SDS-PAGE y ebullición durante 5 minutos. Después, las células se recogieron a 12.000 x g a 4ºC durante 15 minutos y los sedimentos celulares se congelaron a -80ºC hasta el procesamiento posterior.

Las muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente se cargaron en geles de SDS-PAGE en gradiente del 4-20% premoldeados de Daiichi. Después del procesamiento, los geles se tiñeron en una solución de colorante azul de Coomassie^{TM} al 0,125% en metanol al 50% y ácido acético al 10% durante 1 hora y después se destiñeron en una solución de ácido acético al 7% y metanol al 5% hasta que se obtuvo un fondo transparente. Se procesaron patrones de pesos moleculares de proteínas en el gel para determinar el peso molecular de las proteínas de HCMV recombinantes expresadas en E. coli.

Etapa A

Caracterización de antígeno recombinante CKS-A1C2F3-CKS (rpCMV-1A)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV=1A (CKS-A1C2F3-CKS) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-1 A en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-1A comprendía el 15% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 44.000, que era superior al peso molecular calculado de 36.000.

Etapa B

Caracterización de antígeno recombinante CKS-A1C2F3 (rpCMV-A1)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-3A (CKS-A1C2F3) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-3A en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-3A comprendía el 15% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 42.000, que era superior al peso molecular calculado de 34.000.

Etapa C

Caracterización de antígeno recombinante CKS-A1C2F3-H10 (rpCMV-4)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-4 (CKS-A1C2F3-H10) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-4 en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-4 comprendía el 15% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 70.000, que era superior al peso molecular calculado de 58.000.

Etapa D

Caracterización de antígeno recombinante CKS-pp65(aa 297-510) (rpCMV-9)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-9 (CKS-pp65(aa 297-510)) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-9 en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-9 comprendía el 10% de la proteína celular total distribuido de forma homogénea entre 2 proteínas de peso molecular de 60.000 y 56.000, siendo ambas de mayor tamaño que el peso molecular calculado de 51.000.

Etapa E

Caracterización de antígeno recombinante CKS-pp38(aa 117-373) (HCMV-26)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-26 (CKS-pp38(aa 117-373)) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-26 en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-26 comprendía el 10% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 65.000, que era superior al peso molecular calculado de 54.000.

Etapa F

Caracterización de antígeno recombinante CKS-A1C2F3-H10-CKS (rpCMV-27)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-27 (CKS-A1C2F3-H10-CKS) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-27 en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-27 comprendía el 10% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 72.000, que era superior al peso molecular calculado de 60.000.

Etapa G

Caracterización de antígeno recombinante CKS-pp65(aa 297-510)-CKS (rpCMV-28)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-28 (CKS-pp65(aa 297-510)-CKS) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-28 en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-28 comprendía el 5% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 57.000, que era superior al peso molecular calculado de 53.000.

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Etapa H

Caracterización de antígeno recombinante CKS-pp65(aa 297-510)-STOP-CKS (rpCMV-28STOP)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-28STOP (CKS-pp65(aa 297-510)-STOP-CKS) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-28STOP en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-28STOP comprendía el 5% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 47.000, que era superior al peso molecular calculado de 42.000.

Etapa I

Caracterización de antígeno recombinante CKS-pp38(aa 117-373)-CKS (rpCMV-29)

La expresión de la proteína recombinante rpCMV-29 (CKS-pp38(aa 117-373)-CKS) se evaluó por procesamiento de muestras inducidas previamente e inducidas posteriormente obtenidas de lisados brutos de células XL-1 Blue transformadas con pCMV-29 en geles de SDS-PAGE en gradiente. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que la proteína rpCMV-29 comprendía el 5% de la proteína celular total. La proteína recombinante tenía un peso molecular aparente de 67.000, que era superior al peso molecular calculado de 55.000.

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Ejemplo 9 Comparación de expresión embebida y no embebida en CKS

Se prepararon proteínas purificadas y lisados brutos a partir de células E. coli para cada antígeno recombinante expresado del modo embebido de expresión en CKS y del modo no embebido de expresión en CKS. Esto se realizó para comparar directamente el modo embebido de expresión en CKS de antígenos recombinantes con el modo no embebido de expresión en CKS. Estos lisados brutos y proteínas purificadas se analizaron posteriormente en SDS-PAGE y transferencias de Western, como se describe a continuación. Los lisados brutos de células E. coli se prepararon como se describe en el Ejemplo 8.

Se prepararon proteínas purificadas a partir de células de E. coli mediante el siguiente método general. Los sedimentos celulares descritos en el Ejemplo 7 se descongelaron y se homogeneizaron en tampón de lisis TEM que contenía lisozima 1 mg/ml, ADNasaI 25 mg/ml y aprotinina 2 mg/ml adicionales. Después de la homogeneización, se añadió PMSF a una concentración final de 0,2 mg/ml y las células se lisaron durante 30 minutos a temperatura ambiente o 4ºC. Después de la lisis, el lisado celular se centrifugó a 25.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. Las proteínas de E. coli solubles y los antígenos recombinantes solubles se encontraban en el sobrenadante y los antígenos recombinantes que formaban cuerpos de inclusión insolubles se encontraban en el sedimento. Se eliminaron las proteínas de E. coli solubles del sedimento por lavado del sedimento una vez en tampón PTE que contenía Triton X-100 adicional, una vez en tampón PTE que contenía desoxicolato sódico al 1% adicional y una vez en tampón PTE que contenía cloruro sódico 0,5 M, sucesivamente. El sedimento insoluble que contenía el antígeno recombinante se solubilizó después en tampón PTE que contenía urea 8 M adicional y se almacenó a 4ºC.

Se analizaron lisados brutos y proteínas purificadas en geles de SDS-PAGE, como se describe en el Ejemplo 8, y en transferencias de Western como se describe a continuación. Después del procesamiento de los geles de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando un Semi-Dry Electroblotter^{TM} (Integrated Separation Sytems) y la nitrocelulosa se bloqueó durante una noche usando una solución de bloqueo de membranas. Al día siguiente, la membrana se incubó con el anticuerpo monoclonal de ratón apropiado diluido en tampón de dilución de muestras de Rubazyme durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar la membrana con TBS y TBST, la membrana se incubó entonces con IgG antirratón de cabra marcada con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de otra etapa de lavado con TBS y TBST, la transferencia se visualizó con 4-cloro-1-naftol/peróxido de hidrógeno.

Etapa A

Comparación de la expresión de CKS-pp65(aa 297-510)CKS (pCMV-28) con CKS-pp65(aa 297-510) (pCMV-9)

La evaluación de los lisados brutos mediante geles de SDS-PAGE tenidos con Coomassie^{TM} en los Ejemplos 8D y 8G demostraba que la expresión del plásmido pCMV-28 (CKS-pp65(297-510aa)-CKS) producía una sola banda proteica predominante de un peso molecular de 57.000 daltons tras la inducción con IPTG, mientras que la expresión del plásmido pCMV-9 (CKS-pp65 (aa 297-510)) producía una banda doble a 60.000 y 56.000 daltons. Para comprender adicionalmente los productos proteicos producidos después de la inducción con estas construcciones, se realizó un análisis de transferencia de Western sobre estos lisados brutos y sobre el lisado bruto obtenido del plásmido pCMV-28STOP (CKS-pp65(297-510aa)-STOP-CKS) (véase el Ejemplo 8H). La presencia del codón de terminación en esta construcción da como resultado la formación de una proteína truncada que no contiene los últimos 90 aminoácidos de CKS.

Lisados de estas tres construcciones se sondaron con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CKS y con un anticuerpo monoclonal dirigido contra pp65. Los resultados del análisis de transferencia de Western de las proteínas recombinantes rpCMV-28STOP, rpCMV-28 y rpCMV-9 se muestran a continuación en la Tabla 1. La expresión de los plásmidos pCMV-28STOP, pCMV-28 y pCMV-9 en E. coli dio como resultado la formación de las proteínas de longitud completa esperadas. Además, se observó una variedad de productos de truncamiento de la proteína, inmunorreactivos para los anticuerpos monoclonales tanto de CKS como de pp65. El tamaño y el número de productos de truncamiento variaban con cada proteína.

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TABLA 1

1

La expresión del plásmido pCMV-28STOP en E. coli dio como resultado la producción de la proteína de longitud completa esperada (rpCMV-28STOP a 47 kD) más una variedad de productos de truncamiento detectables con el anticuerpo monoclonal de pp65. No se detectaron productos proteicos con el anticuerpo monoclonal de CKS. Este resultado demostraba que el epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal de CKS estaba localizado en la porción C-terminal de la proteína CKS, puesto que los aminoácidos 171-260 no están presentes en esta proteína debido a la presencia del codón de terminación cadena abajo del gen pp65.

La expresión embebida del plásmido pCMV-28 en E. coli dio como resultado la producción de la proteína de longitud completa esperada (57 kD) detectada tanto mediante el anticuerpo monoclonal de CKS como mediante el anticuerpo monoclonal de pp65. Los productos de truncamiento del plásmido pCMV-28 (de 47 a 41 kD), sin embargo, se detectaron solamente por el anticuerpo monoclonal de pp65. Esto se debía al hecho de que estos productos de truncamiento habían perdido el epítopo reactivo con el anticuerpo monoclonal de CKS.

Se observó que existía un hueco de 10 kD entre la proteína de longitud completa (a 57 kD) del plásmido pCMV-28 y los productos de truncamiento del plásmido pCMV-28 (de 47 a 41 kD), siendo todos ellos inmunorreactivos con el anticuerpo monoclonal de pp65. También era importante señalar que los productos de truncamiento producidos por los plásmidos pCMV-28STOP y pCMV-28 que eran inmunorreactivos con el anticuerpo monoclonal de pp65 tenían un tamaño idéntico. Por lo tanto, durante la expresión embebida en CKS en E. coli, (i) se generaba el producto proteico de longitud completa o (ii) se generaban productos de truncamiento que eran 10 kD o más de menor tamaño, que carecían del extremo C-terminal de CKS (aminoácidos 171-260), presumiblemente debido a una pausa del ribosoma durante la traducción del gen embebido.

Aunque sin desear limitarse a teoría alguna, se pensaba que durante la traducción del gen de fusión embebido en E. coli había ocurrido una de dos cosas. O el ribosoma se había "parado" durante la traducción del gen embebido dentro del gen CKS, dando como resultado la producción de productos de truncamiento proteicos, o el ribosoma había traducido con éxito el gen embebido y continuado a través del resto del gen de CKS. Esto era al contrario que la expresión no embebida del plásmido pCMV-9 en E. coli, donde no existía un hueco de 10 kD entre la proteína de longitud completa (59 kD) y el producto de truncamiento de mayor tamaño (55kD), como se detectaba por ambos anticuerpos monoclonales.

Estos resultados demuestran dos ventajas de la expresión embebida en CKS sobre la expresión no embebida en CKS. En primer lugar, la expresión embebida en CKS cambiaba el tamaño de los productos de truncamiento contaminantes en 10 kD, mejorando de este modo la separación cromatográfica de la proteína de longitud completa de los productos truncados, cuando se usan técnicas cromatográficas convencionales. En segundo lugar, el uso del anticuerpo monoclonal de CKS dirigido contra el extremo C-terminal de CKS y el tamaño de la proteína purificada podían usarse para demostrar, a partir de los datos de transferencia de Western de las proteínas purificadas producidas por expresión embebida en CKS, que los epítopos embebidos estaban intactos. La secuencia de aminoácidos de CKS (aminoácidos 171-260) en el extremo de esta proteína expresada en CKS embebida servían como un "marcador" inmunológico que podía visualizarse en una transferencia de Western con el anticuerpo monoclonal de CKS. Su presencia aseguraba que los epítopos embebidos estaban intactos en la proteína purificada. Cualquier irregularidad en el extremo C-terminal de dicha proteína quedaría confinada a la porción de CKS inmunológicamente irrelevante.

Etapa B

Comparación de la expresión de CKS-A1C2F3-H10-CKS (pCMV-27) con CKS-A1C2F3-H10 (pCMV-4)

La evaluación de los lisados brutos mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie^{TM} en los Ejemplos 8C y 8F demostraba que la expresión de los plásmidos pCMV-27 (CKS-A1C2F3-H10-CKS) y pCMV-4 (CKS-A1C2F3-H10) producía una sola banda proteica predominante de peso molecular de 70.000-72.000 daltons tras la inducción con IPTG.

Los análisis de transferencia de Western se realizaron sobre lisados brutos obtenidos de la expresión de estos productos en E. coli para caracterizar adicionalmente los productos proteicos. Los lisados de estas dos construcciones se sondaron con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CKS y con un anticuerpo monoclonal dirigido contra H10. Los resultados de este análisis se muestran a continuación en la Tabla 2.

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TABLA 2

2

Como se observa en la Tabla 2, la expresión de las proteínas de los plásmidos pCMV-27y pCMV-4 en E. coli dio como resultado la formación de la proteína de longitud completa esperada más una variedad de productos de truncamiento de la proteína, que eran inmunorreactivos con los anticuerpos monoclonales tanto de CKS como de H10.

La expresión embebida en CKS de A1C2F3-H10 en E. coli dio como resultado la producción de la proteína de longitud completa (68 kD) y una variedad de productos de truncamiento (de 58 a 48 kD) inmunorreactivos con el anticuerpo monoclonal de H10. Los productos de truncamiento contaminantes producidos a partir de la expresión embebida en CKS estaban separados por 10 kD en tamaño de la proteína de longitud completa. Por el contrario, la expresión no embebida en CKS de A1C2F3-H10 en E. coli dio como resultado la producción de la proteína de longitud completa (68 kD) y una variedad de productos de truncamiento proteico (de 66 a 56 kD) inmunorreactivos con el anticuerpo monoclonal de H10. Los productos de truncamiento proteico contaminantes producidos a partir de la expresión no embebida en CKS no estaban bien separados en tamaños de la proteína de longitud completa.

Las proteínas de longitud completa producidas a partir de la expresión embebida y no embebida en CKS y de los productos de truncamiento proteicos producidos a partir de la expresión no embebida en CKS eran inmunorreactivos con el anticuerpo monoclonal de CKS. Los productos proteicos contaminantes producidos a partir de la expresión embebida en CKS no eran inmunorreactivos con el anticuerpo monoclonal de CKS puesto que el anticuerpo monoclonal de CKS era específico para el extremo C-terminal de CKS.

La expresión embebida en CKS cambiaba el tamaño de los productos de truncamiento contaminantes en 10 kD, mejorando de este modo la separación cromatográfica de la proteína de longitud completa del producto truncado cuando se usan técnicas cromatográficas convencionales. La secuencia de aminoácidos de CKS (aminoácidos 171-260) en el extremo de esta proteína expresada embebida en CKS servía de nuevo como un marcador inmunológico, visualizable en una transferencia de Western con el anticuerpo monoclonal anti-CKS, mostrando que los epítopos embebidos estaban intactos en la proteína purificada.

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Etapa C

Comparación de la expresión de CKS-A1C2F3-CKS (pCMV-1A) con CKS-A1C2F3 (pCMV-3A)

La evaluación de los lisados brutos mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie^{TM} en los Ejemplos 8A y 8B demostraban que la expresión de los plásmidos pCMV-1 A (CKS-A1C2F3-CKS) y pCMV-3A (CKS-A1C2F3) producían una sola banda proteica predominante de peso molecular de 42.000-44.000 daltons tras la inducción con IPTG. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que las proteína rpCMV-1A y rpCMV-3A comprendían cada una el 15% de la proteína celular total.

La proteína rpCMV-3A, obtenida mediante expresión no embebida en CKS de plásmido pCMV-3A se localizaba en su totalidad dentro del sobrenadante obtenido después de la centrifugación del lisado celular. Esta proteína tenía una pureza de aproximadamente el 15%, como se determinó por SDS-PAGE. Por el contrario, la proteína rpCMV-1A obtenida por expresión embebida en CKS de plásmido pCMV-1A, se localizaba en su totalidad dentro del sedimento obtenido después de la centrifugación del lisado celular. Los cuerpos de inclusión obtenidos por expresión del plásmido pCMV-1A se purificaron por lavado como se ha descrito anteriormente. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en urea 8 M y se determinó que el rpCMV-1A tenía una pureza del 85-90% por SDS-PAGE. La expresión embebida en CKS de rpCMV-1A era el modo preferido de expresión en CKS sobre la expresión no embebida en CKS. La purificación de rpCMV-1A se simplificaba enormemente debido a la solubilidad alterada de la proteína producida por la expresión embebida en CKS.

Por lo tanto, la expresión no embebida en CKS del grupo de epítopos A1C2F3 (en el plásmido pCMV-3A) daba como resultado la producción de un antígeno recombinante soluble, mientras que la expresión embebida en CKS de A1C2F3 (en el plásmido pCMV-1A) daba como resultado la producción de un antígeno recombinante insoluble. Estos resultados demuestran otra ventaja potencial del método de expresión embebida en CKS de la presente invención sobre la expresión no embebida en CKS, por el hecho de que la purificación de proteínas recombinantes puede simplificarse enormemente debido a la solubilidad alterada de las proteínas cuando se producen por expresión embebida en CKS.

Etapa D

Comparación de la expresión de CKS-pp38(117-373aa)-CKS (pCMV-29) con CKS-pp38 (aa 117-373) (pCMV-26)

La evaluación de los lisados brutos mediante geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie^{TM} en los Ejemplos 7E y 7I demostraba que la expresión de los plásmidos pCMV-29 (CKS-pp38(117-373aa)-CKS) y pCMV-26 (CKS-pp38(aa 117-373)) producía una sola banda proteica predominante de un peso molecular de 65.000-67.000 daltons tras la inducción con IPTG. El análisis del gel teñido con Coomassie^{TM} indicaba que las proteínas rpCMV-29 y rpCMV-26 comprendían el 5% y 10% de la proteína celular total, respectivamente.

La proteína rpCMV-26, obtenida por expresión no embebida en CKS de plásmido pCMV-26 se localizaba completamente dentro del sobrenadante obtenido después de la centrifugación del lisado celular. Esta proteína tenía una pureza de aproximadamente el 10%, como se determinaba mediante SDS-PAGE. Por el contrario, la proteína rpGMV-29 obtenida por expresión embebida en CKS de plásmido pCMV-29 se localizaba en su totalidad dentro del sedimento obtenido después de la centrifugación del lisado celular. Los cuerpos de inclusión obtenidos por expresión del plásmido pCMV-29 se purificaron por lavado, como se ha descrito anteriormente. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en urea 8 M y se determinó que la rpCMV-29 tenía una pureza del 85-90% mediante SDS-PAGE. Por lo tanto, la expresión no embebida en CKS de los aminoácidos 117-373 de pp38 (en el plásmido pCMV-26) daba como resultado la producción de un antígeno recombinante soluble, mientras que la expresión embebida en CKS de esa secuencia proteica (en el plásmido pCMV-29) daba como resultado la producción de un antígeno recombinante insoluble.

De nuevo, esto da como resultado que la purificación de proteínas recombinantes puede simplificarse enormemente debido a la solubilidad alterada de las proteínas cuando se producen mediante expresión embebida en CKS.

Se entiende que la descripción detallada anterior y los ejemplos que la acompañan son simplemente ilustrativos y no deben tomarse como limitaciones del alcance de la invención, que se define únicamente mediante las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes. Serán evidentes diversos cambios y modificaciones en las realizaciones descritas para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se espera que cualquier número de sitios dentro de la proteína transportadora CKS permitirán la expresión embebida de proteínas heterólogas. Además, se piensa que múltiples sitios en diferentes posiciones en una CKS u otra proteína transportadora podrían usarse para la expresión embebida simultánea de diversas proteínas heterólogas. Dicha "expresión segmentada", en la que los epítopos se embeben en diferentes sitios en la proteína transportadora, podría permitir niveles mejorados de expresión. También podría esperarse que la expresión segmentada de proteínas heterólogas minimizase el impedimento estérico entre inmunoglobulinas que intentan unirse en aproximadamente la misma región de la proteína de fusión. En otra variación más de la invención podría insertarse una secuencia polienlazadora en el gen de la proteína transportadora para facilitar la inserción de diversos ADN codificantes de proteínas heterólogas. Además, aunque la construcción de plásmidos en los ejemplos anteriores demuestra cierto tipo de ligación (roma/cohesiva) pueden usarse también otros tipos (roma/roma o cohesiva/cohesiva). Dichos cambios y modificaciones, incluyendo sin limitación los relacionados con los métodos de expresión, métodos de confirmación, proteínas de fusión, construcciones de ADN, vectores plasmídicos y células hospedadoras transformadas de la invención y los usos de los mismos, pueden realizarse sin alejarse del espíritu y alcance de la misma.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Abbott Laboratories

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Expresión embebida de proteínas heterólogas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Abbott Laboratories D377/AP6D

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(B)

CALLE: 100 Abbott Park Road

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(C)

CIUDAD: Abbott Park

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(D)

ESTADO: IL

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 60064-3500

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,50 pulgadas, 1,44 Mb, formato MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Apple Macintosh (MS-DOS Emulation)

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: MacOS 7.1.2

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(D)

SOFTWARE: WordPerfect 3.1 (Text Export/ASCII format)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/06841

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-MAYO-1996

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/444.141

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-MAYO-1995

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(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Danckers, Andreas M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO U. S: 32.652

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(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 5742.PC.01

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 708-937-9803

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(B)

TELEFAX: 708-938-2623

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

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\hskip1cm

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 106 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: ambas (lineal y circular)

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

7

8

Claims (34)

1. Un método para expresar una proteína heteróloga en una célula hospedadora procariota que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un vector de ADN que tiene:

(1)

una región de control unida operativamente un primer elemento genético que codifica una proteína transportadora capaz de la expresión en la célula hospedadora y

(2)

un segundo elemento genético que codifica la proteína heteróloga, estando el segundo elemento embebido dentro del primer elemento, de tal modo que el primer y el segundo elemento están contiguos y en la misma fase de lectura abierta;

(b) transformar la célula hospedadora con el vector de ADN; y

(c) expresar una proteína de fusión de la proteína heteróloga y la proteína transportadora, donde la proteína heteróloga se une en su extremo N-terminal con un primer dominio de la proteína transportadora y en su extremo C-terminal con el segundo dominio de la proteína transportadora, donde dicha proteína transportadora es una proteína CKS.

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2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en que la proteína heteróloga es una proteína bacteriana.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína heteróloga es una proteína viral.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región de control comprende un promotor procariota y un sitio de unión al ribosoma procariota.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la región de control comprende un operón lac.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína heteróloga es una proteína de citomegalovirus humano (HCMV).

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la proteína heteróloga comprende una porción de una proteína viral seleccionada del grupo constituido por las proteínas de HCMV pp38, pp52, pp65 y pp150.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la proteína heteróloga comprende una porción inmunogénica de una proteína viral de HCMV, la proteína pp38.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la proteína heteróloga comprende una porción inmunogénica de una proteína viral de HCMV, la proteína pp 65.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la proteína heteróloga comprende una porción inmunogénica de un epítopo seleccionado del grupo constituido por los epítopos de HCMV H10, que consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 55908 a 55214 de la cadena complementaria de la cepa AD169 de HCMV, F3, que consiste en los aminoácidos 1006 a 1048 de pp 150, y A1C2, que consiste en los aminoácidos 595 a 614 de pp 150.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer dominio de la proteína transportadora comprende una porción de los aminoácidos 1 a 171 de CKS y el segundo dominio de la proteína transportadora comprende una porción de los aminoácidos 171 a 260 de CKS.

12. Una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga embebida en una proteína transportadora, en la que la proteína transportadora es una proteína CKS y la proteína de fusión se ha expresado de acuerdo con el método de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.

13. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 12, que tiene la secuencia CKS*-CMV*-Thr-Arg-CKS**, en la que

(a) CKS* es una porción de los aminoácidos 1 a 171 de CKS.

(b) CMV* es una porción de una proteína de HCMV y

(c) CKS** es una porción de los aminoácidos 171 a 260 de CKS.

14. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13, en la que CMV* se selecciona del grupo constituido por las porciones de las proteínas de HCMV pp38, pp52, pp65 y pp 150.

15. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13, en la que CMV* es una porción inmunogénica de una proteína viral de HCMV, la proteína pp38.

16. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13, en la que CMV* es una porción inmunogénica de una proteína viral de HCMV, la proteína pp65.

17. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13, en la que CMV* es una porción inmunogénica de un epítopo seleccionado del grupo constituido por los epítopos de HCMV H10, que consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 55908 a 55214 de la cadena complementaria de la cepa AD169 de HCMV, F3, que consiste en los aminoácidos 1006 a 1048 de pp 150, y A1C2, que consiste en los aminoácidos 595 a 614 de pp 150.

18. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13, en la que CMV* se selecciona del grupo constituido por:

(a) AIC2F3-Leu-Gln-H10; donde A1C2 consiste en los aminoácidos 595 a 614 de pp 150 y F3 consiste en los aminoácidos 1006 a 1048 de pp 150;

(b) pp65(297-510aa), que codifica los aminoácidos 297 a 510 de pp 65;

(c) pp65(297-510aa)-STOP, donde STOP es un codón de terminación; y

(d) pp38(117-373aa) que codifica los aminoácidos 117 a 373 de pp 38

19. Un método para confirmar la expresión intacta de una proteína heteróloga, que comprende las etapas de:

(a) expresar la proteína heteróloga como una proteína de fusión de acuerdo con el método de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 u 11;

(b) aislar la proteína de fusión; y

(c) exponer la proteína de fusión a medios para detectar la presencia de una porción del segundo dominio de la proteína transportadora.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el medio de detección comprende una inmunoglobulina que es inmunorreactiva con un epítopo contenido en el segundo dominio de la proteína transportadora.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que las etapas (b) y (c) del método de confirmación se llevan a cabo usando una transferencia de Western.

22. Una construcción de ADN para la inserción en un vector plasmídico, que comprende:

(a) una región de control unida operativamente a un primer elemento genético que codifica una proteína transportadora capaz de la expresión en una célula hospedadora y

(b) un segundo elemento genético que codifica una proteína heteróloga, estando el segundo elemento embebido dentro del primer elemento, de tal modo que el primer y el segundo elemento están contiguos y en la misma fase de lectura abierta, donde dicha proteína transportadora es una proteína CKS mediante la que la construcción de ADN, tras la transformación de una célula hospedadora procariota con el vector plasmídico, dirige la expresión de una proteína de fusión de la proteína heteróloga y la proteína transportadora, donde la proteína heteróloga se une en su extremo N-terminal a un primer dominio de la proteína transportadora y en su extremo C-terminal a un segundo dominio de la proteína transportadora.

23. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la proteína heteróloga es una proteína bacteriana.

24. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la proteína heteróloga es una proteína viral.

25. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la región de control comprende un promotor procariota y un sitio de unión al ribosoma procariota.

26. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la región de control comprende un operón lac.

27. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la proteína heteróloga es una proteína de citomegalovirus humano (HCMV).

28. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 27, en la que la proteína heteróloga comprende una porción de una proteína viral seleccionada del grupo constituido por las proteínas de HCMV pp38, pp52, pp65 y pp150.

29. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 27, en la que la proteína heteróloga comprende una porción inmunogénica de una proteína viral de HCMV, la proteína pp38.

30. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 27, en la que la proteína heteróloga comprende una porción inmunogénica de una proteína viral que consiste en la proteína pp65 de HCMV.

31. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 27, en la que la proteína heteróloga comprende una porción inmunogénica de un epítopo seleccionado del grupo constituido por los epítopos de HCMV H10, que consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 55908 a 55214 de la cadena complementaria de la cepa de HCMV AD169, F3, que consiste en los aminoácidos 1006 a 1048 de pp 150, y A1C2, que consiste en los aminoácidos 595 a 614 de pp 150.

32. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 22, en la que el primer dominio de la proteína transportadora comprende una porción de los aminoácidos 1 a 171 de CKS y el segundo dominio de la proteína transportadora comprende una porción de los aminoácidos 171 a 260 de CKS.

33. Un vector plasmídico que comprende una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ó 32.

34. Una célula hospedadora aislada transformada con un vector plasmídico de acuerdo con la reivindicación 33.