JPH01240190A - Ｅｂｖ関連抗原の発現ベクター及びそれを組み込んだ大腸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＥＢＶ関連抗原の発現ベクター、及びＥＢＶ関
連抗原を効率よく発現する大腸菌に関するものである。

［従来技術及び発明か解決しようとする問題点］エプス
タイン・バール　ウィルス（ＥＢＶ）はヘルペスウィル
ス科に屈し、ヒトに感染するウィルスてあり、大部分の
日本人は小児期に感染し。

終生このウィルス抗原に対する抗体が存在する。

またＥＢＶは、伝染性単核症（ＩＭ）の病原ウィルスで
あり、バーキウトリンパＮ（ＢＬ）や上咽頭ガン（ＮＰ
Ｃ）などの悪性ＩＩ！瘍との病因論的関係も疑われてい
る。

ＥＢＶ感染の診断は、患者の血液中に出現するＥＢＶに
対する抗体をＥＢＶ感染細胞を用いた蛍光抗体法て測定
する方法が一般的である。しかし、抗ＥＢＮＡ抗体測定
においては、ＥＢＮＡの発現量が非常に少ないため、蛍
光抗体補体法という特殊な方法を用いている。しかしこ
の方法を用いてもなお感度か低く、陽性の判定にあいま
いさが伴い、そのため施設間及び実施者間における判定
結果の不一致がみられるのが現状である。またＥＢＶ関
連疾患の診断のために、各々のＥＢＶの関連抗原に対す
る免疫応答か調べられており、１　Ｍ　＋Ａ性期ては、
早期抗原（ＥＡ）とウィルスカプシド抗原（ＶＣＡ）に
対する抗体価が高いという特徴か知られている（ｌｌｅ
ｎｌｅ、　ａｔ　ａｌ、　Ｓｃｉ、　Ａ＋ｓ。

２４］、　１！１７９）　、また最近になってＥＢＮＡ
か少なくとも５！ｉ類存在することか明らかになり（Ｊ
。

Ｄｉｌｌｎｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、　ＰＮＡＳ、　８３．
１９８６　）その各々のＥＢＮＡに対する抗体価を測定
することの臨床的意義が注目されている。そのためにＥ
ＢＮＡ。

ＥＡ、ＶＣＡなどの各々の抗原に対する抗体価を求める
方法としてＥＢＶ感染Ｂ細胞株を用いた蛍光抗体法が行
なわれているが、分別定量には困難かある。また感染細
胞から単一の抗原を分離精製して用いることも、ＥＢＶ
では困難である。

これらの従来の技術を改良するために、最近プラスミド
ベクターによる動物細胞でのＥＢＶ関連抗原の発現に関
する発明が開示されている（Ｒｏｂｅｒｔ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、、　５０．８２２．
１９８４）軸間１１ｉｊＪ６２−８３８８９）、　この
発明はＥＢＶ関連抗原を個別に発現した細胞を取得でき
るためＥＢＶの各抗原に対する抗体価を分別定量できる
ものである。しかしこの発明は、ＥＢＶ抗原を大量に調
製するには大量の培養細胞が必要となり、しかも分離精
製法か未確立で困難であり、実用性に乏しい技術である
。

したがってＥＢＶ関連抗原を簡易な手段で大量に取得す
る方法を開発することは、ＥＢＶ関連疾患の診断および
ワクチンなどの開発においてきわめて有益なことである
。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記の問題点を解決するために種々の方
法を検討した結果、大腸菌て発現させたＥＢＶ関連遺伝
子産物が、十分な抗原性を保持していることを確認した
。さらにこれを安定かつ大量に供給てき、大量培養での
安全性を保持したシステムを開発し１本発明を完成した
ものである。

すなわち本発明は、ＥＢＶＩ５０連抗原をコードする遺
伝子、またはその一部を含むＤＮＡ断片が入ファージベ
クターのβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の制限酵素切
断部位に挿入されていることを　　　゛特徴とするＥＢ
Ｖ関連抗原の発現ベクター、及びそれを組み込んだ大腸
菌である。

次に、本発明について詳細に説明する。

本発明でいうＥＢＶ５１１３！！抗原をコードする遺伝
子トハ、ＥＡ、ＶＣＡ、ｌ抗原（ＭＡ）、ＥＢＮＡなど
ＥＢＶゲノムに存在する遺伝子をいう、また、その一部
とはＥＢＶ関連抗原をコードする遺伝子の一部の領域を
もつ断片をいう。

本発明て使用する発現ベクターは、少なくとも以下の２
つの特徴をもつものである。

第一は、入ファージベクターである。第二にβ−ガラク
トシダーゼとの融合タンパク質な産生じ得る発現ベクタ
ーであること、即ち、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子
（１ａｃＺ）を含み、この部分にフレームを合わせて目
的の遺伝子を挿入することにより、目的の遺伝子産物を
β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク賀として発現さ
せることかてきることである。第一の特徴である入ファ
ージベクターを使用する理由は他のベクターに比ベクロ
ーニングする際にＤＮＡの欠失が起こりにくいこと、宿
主菌に共生する必要がないため、宿主に右前なりＮＡも
クローニングできること、さらに遺伝的背景の異なる種
々の大腸菌株を広く用いることができるという点である
。これらの点に関してλファージベクターはｌ１ｅｎｎ
ｅｓｓｙらの構築したプラスミドベクター（Ｈｅｎｎｅ
ｓｓｙ、　ｅｔ　ａｔ、　ＰＮＡＳ。

８０、５６６５．１９８３）よりも有利である０次に第
二の特徴であるβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク
質な産生じ得る発現ベクターを使用する理由は、融合タ
ンパク賀として発現することにより求めるポリペプチド
を多量に発現させ、かつその精製か容易にできるためで
ある。これら二つの特徴を有するベクターとしては例え
ば入ｇ　ｔ　１１　（Ｙｏｕｎｇｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡ
Ｓ、　８０．１１９４．１９８３）がより好ましい。入
ｇｔｌｌは、第一、第二の特徴に加えて溶菌感染を抑制
する遺伝子すなわちリプレッサー遺伝子ｃｌか温度感受
性のｃ　Ｉ　８５７変異てあり、低温においてはλファ
ージの増殖が抑制されるが、高温においてはλファージ
の増殖が開始される。すなわち高温において遺伝子のコ
ピー数が増巾され、それにより遺伝子産物の産生も増大
する。また、ｃ１８５７変異かあることにより、常温て
は感染性のλファージか産生されないこと、さらに溶菌
に関与する遺伝子Ｓがアンバー変異であるため、５ｕｐ
Ｏの遺伝子型の菌株を用いた場合、溶菌かおこらず感染
粒子か産生されないことにより安全性を確保てきる。こ
れらの点で本発明の発現ベクターとして入ｇｔｌｌがよ
り優れてしする。

次に本発明の発現ベクターの構築方法についてノヘル。

ＥＢＶ（７）ＤＮＡ断片、例えばＥＡ、ＶＣＡ、ＥＢＮ
Ａなどをコードする遺伝子を含むＤＮＡ１１片を取得す
るか、またはそのＤＮＡ断片を種々の制限酵素で適宜切
断し、その一部の必要な断片を取得する。取得したＤＮ
Ａ断片にリンカ−を接続した後、入ファージベクターの
１ａｃＺ遺伝子中の制限酵素部位、例えば入ｇｔｌｌの
ＥｃｏＲ１部位に挿入し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージ
ング法により。

組み換え体λファージとして回収する０次に。

ＤＮＡ断片が挿入された組み換え数人ファージであるこ
とを発色大賀５−ブ０（−４−２１１０−３−インドリ
ル−Ｂ−Ｄ−ガラクトシＦ（Ｘｇａｌ）を利用した発色
法により判定し選択する。選択された組み換え数人ファ
ージを常法により増殖し、精製ファージ粒子からＤＮＡ
を抽出し、ＥＢＶのＤＮＡか正しく挿入されているＤＮ
Ａクローンを選択し１本発明の発現ベクターとして取得
する。

次に本発明の入ファージ発現ベクターを組み込んだ大腸
菌、すなわち溶原菌の作製方法について述べる０本発明
の大腸菌は種々のものを使用てきる０発色法により選択
された、ＥＢＶ関連遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した
組み換え数人ファージを大腸菌株に感染させる。その感
染させた大腸菌の中から、低温でコロニーを形成し、高
温て生育しない菌を選択することにより、本発明の組み
換え体λファージの溶原菌が分離できる。なお、この溶
ＴＸ２のひとっであるＹ（入ＥＢＩ−Ｂ）については、
工業技術院微生物工業技術研究所へ受託を申請したか受
理されなかった。

次に、本発明を利用して、ＥＢＶ関連抗原とβ−ガラク
トシダーゼの融合タンパク賀を取得する方法について述
べる０本発明のＥＢＶ関連抗原の発現ベクターを組み込
んだ大腸菌株を、その菌の適正増殖温度で培養し、対数
増殖期に培養温度を高温としてファージ増殖を開始させ
、ＥＷ中の組み換え体ファージの遺伝子コピー数を増巾
させる。

続いてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＯ）を添加し、菌体内のＥＢＶ関連抗原とβ−
ガラクトシダーゼの融合タンパク質を話導し、産生量を
増大させる。集菌後、菌体内可溶性画分を集め、硫安沈
殿により部分精製する。カラムなどによりさらに精製し
、融合タンパク質な取得する。

次に実施例により、本発明の発現ベクターの構築方法、
及びこれを保持する大腸菌の調製並びに融合タンパク質
の解析について述べる。

実１上１２・ （入ＥＢＩ−８ファージ（ＥＢＮＡＩ抗原発現ベクター
）の構築） ＥＢＶのＤＮＡのＢａｍＨＩ　Ｋ断片より、制限酵素５
ｅａｌを用いて、ＥＢＮＡＩ遺伝子の翻訳領域のＣ末端
側約３分の１を含むＤＮＡ断片を取り出し、これに５゛
末端をポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したＥ
ｃｏＲＩリンカ−をＴ４リガーゼを　　、用いて接続し
た。制限酵素ＥｃｏＲＩ処理により両端なＥｃｏＲ１部
位とした後、入ｇｔｌｌの唯一のＥｃｏＲｒ部位にＴ４
１）ＮＡリガーゼを用いて結合させた。

このＤＮＡ混合液をｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング法
により、ファージ混合液として回収した。このファージ
混合液よりＸｇａｌを利用した判定法により、外来ＤＮ
Ａを組み込んだファージを選択した。いくつかのファー
ジについて大量培養し、ファージ粒子を塩化セシウム平
衡密度勾配遠心法による精製の後、ＤＮＡを抽出した。

各ＤＮＡの制限酵素地図を作製することにより、翻訳フ
レームに合う方向に目的遺伝子が組み込まれたファージ
を選択した。このファージを入ＥＢＩ−８と命名した。

（Ｙ（入ＥＢＩ−８）菌の作製及び菌体内タンパク質の
イムノブロッティング法による解析） 入ＥＢ１−Ｂ　７アージを大腸菌に１２株ＮＦ１８２９
（ＡＴＣＣＮｏ、　：１５４６６）に感染させ、常法に
より組み換え体入ファージ溶原菌を選択した。この菌株
なＹ（八ＦＢＩ−Ｂ）と命名した。Ｙ（入ＥＢＩ−Ｂ）
を培地２０ｍ　ｌに接種し、３０°Ｃて培養した。対数
増殖期に入った時点て４２℃に上昇させ、１ｍＭＩＰＴ
Ｏを加え培養した。集菌後、緩衝液Ａ（０，２Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ塩酸、　０．２ＭＮａＣｌ、　０．０１Ｍ酢酸マグ
ネシウム、　０．０１Ｍ　２−メルカプトエタノール、
５％グリセロール、　ｐＨ７，５）に懸濁し、リゾチー
ムで処理をした。さらに超音波処理後、超遠心を行ない
、上清を回収しその硫安沈殿分画を得た。この部分精製
標品をＳＤＳゲル電気泳動を行ないイムノブロッティン
グ法により分析した。２次抗体としてペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用いた。その結果を第
１図に示した。第１図において、レーンｌがＥＢＮＡ抗
原陰性コントロールとして入ｇｔｌｌのみを組み込んだ
菌体の硫安分画標品、レーン２がＹ（入ＥＢＩ−Ｂ）の
硫安分画標品、レーン３がＥＢＮＡ抗原陽性コントロー
ルとしてのＲａｊｉ細胞の細胞抽出液である。

第１図の結果より、本発明の発現ベクターのひとっであ
るλＥＢＩ−８を組み込んた大腸菌てＥＢＮＡｌの抗原
性をもつ約１４０にダルトンの融合タンパク質が発現さ
れることかわかった。また、この融合タンパク質のβ−
ガラクトシダーゼの抗原性は、同様の方法によりウサギ
抗β−ガラクトシダーゼ抗体とペルオキシダーゼ標識抗
ウサギＩｇＧを用いて確認し、第２図に示した。このよ
うに本実施例で得た溶原菌Ｙ（入ＥＢＩ−８）は、ＥＢ
ＮＡＩ抗原とβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク賀
を産生ずることが証明された。

［発明の効果］ 本発明によって高純度のＥＢＶ関連抗原をβ−ガラクト
シダーゼとの融合タンパク質として容易にかつ大量、安
価に取得することがてきる。そしてこの融合タンパク賀
は、ＥＢＶ関連疾患の診断などのための有用な抗原とし
て使用されつる。したかって本発明は、ワクチンなどの
医薬品および診断薬の開発のために非常に有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗ＥＢＮＡ陽性ヒト血清を用いたイムノフロラ
ティングの結果を示す図であり、第２図はウサギ抗β−
ガラクトシダーゼ抗体を用いたイムノフロラティングの
結果を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＥＢＶ関連抗原をコードする遺伝子、またはその
   一部を含むＤＮＡ断片がλファージベクターのβ−ガラ
   クトシダーゼ構造遺伝子の制限酵素切断部位に挿入され
   ていることを特徴とするＥＢＶ関連抗原の発現ベクター
   。
2. （２）ＥＢＶ関連抗原をコードする遺伝子、またはその
   一部を含むＤＮＡ断片がλファージベクターのβ−ガラ
   クトシダーゼ構造遺伝子の制限酵素切断部位に挿入され
   ているＥＢＶ関連抗原の発現ベクターを組み込んだ大腸
   菌。