JPH11505123A - 異種蛋白質の埋込発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ）（１）宿主細胞中で発現の可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域と、（２）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二の要素が連続し同じ読み枠にあるように第一の要素内に埋め込まれている第二の要素とを有するＤＮＡベクターを準備し；（ｂ）ＤＮＡベクターで宿主細胞を形質転換し、及び（ｃ）異種蛋白質がそのＮ末端で担体蛋白質の第一ドメインに、またそのＣ末端で担体蛋白質の第二ドメインに結合される、その異種蛋白質と担体蛋白質との融合蛋白質を発現する、段階を含む原核宿主細胞中で異種蛋白質を発現するための方法、異種蛋白質の完全発現を確認する方法、並びに、上記の方法に関連する融合蛋白質、ＤＮＡ構築物、プラスミドベクター及び形質転換宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】 異種蛋白質の埋込発現 技術的分野 本発明は微生物宿主細胞による異種蛋白質の生産のための方法に関する。さら に具体的には、本発明は、目的の蛋白質が埋め込まれる、融合蛋白質の形のこの ような蛋白質の発現、さらにまた、その蛋白質を産生するために有用なＤＮＡ構 築物、プラスミドベクター及び形質転換宿主細胞に関する。発明の背景 微生物宿主中の原核及び真核生物両方の本来ない（「異種の」）蛋白質を発現 することは公知であるが、蛋白質の発現には克服しなければならない多くの技術 的困難があり、これらは（ｉ）十分なレベルの発現を得ること、（ｉｉ）容易に 分離し、精製される形で蛋白質を得ること、及び（ｉｉｉ）蛋白質が十分に発現 され、不完全な翻訳又はその後の分解によって末端を切断されないことを保証す ることを含む。一つの試みはそれぞれに対する遺伝子を結合して目的の蛋白質を 別の「担体」蛋白質と一緒に共発現することであって、生じる融合蛋白質は通常 、直接に又は短い結合セグメントによって、互に共有結合した二 つの遺伝子産物を含む。 特に好適な発現系は米国特許第５，１２４，２５５号に記載され、この特許は 参考文献として本明細書に特に組み入れる。その特許では、融合蛋白質が担体蛋 白質として大脳菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）酵素ＣＫＳ（ＣＭＰ− ＫＤＯシンテターゼ、又はＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツ ロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ）を利用するとして開示されている。そ の担体は、目的の蛋白質が担体遺伝子の３’末端に位置するＤＮＡでコードされ 、所望の融合蛋白質の高レベルでの発現を可能にする。しかし、融合生成物が密 接に関連した発現生成物又は同様な分子量の細胞汚染物質から容易に分離できな いことが、この発現系及び他の発現系で起こる。また、典型的に該融合蛋白質の Ｃ末端にある目的の蛋白質が完全長ではなく、その末端が切り取られることも起 こり得る。 これらの困難性は、例えば、目的の蛋白質が、診断免疫アッセイで使用される べきであるエピトープ又はエピトープの組合せであるときには克服される必要が あり、したがって完全に発現され、精製可能でなければならない。従って、広範 囲の完全な異種蛋白質の信頼性のある発現を可能にし、さらに、このよ うな蛋白質の精製を容易にする、改良された発現系を開発することが本発明の目 的である。発明の要約 無傷の異種蛋白質は、その異種蛋白質が融合相手として作用する担体に埋め込 まれ、該担体に付着されていない融合蛋白質として容易に発現され得ることが分 かってきた。この試みは汚染する細胞蛋白質及び汚染する組換え蛋白質末端切断 (truncation)型生成物から蛋白質の精製を簡素化する。 従って、本発明の一つの態様では、（ａ）（１）宿主細胞中で発現可能な担体 蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び（２ ）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一要素及び第二要素が 連続し、同じ読み枠中にあるように第一要素内に埋め込まれている第二要素、を 有するＤＮＡベクターを準備し；（ｂ）該ＤＮＡベクターで宿主細胞を転換し； 及び（ｃ）該異種蛋白質がそのＮ末端で担体蛋白質の第一ドメインに、またその Ｃ末端で担体蛋白質の第二ドメインに結合している、異質蛋白質及び担体蛋白質 の融合蛋白質を発現する工程を含む、原核宿主細胞中に異種蛋白質を発現するた めの方法を開示する。 本発明の第二の態様では、本発明の発現方法によって発現された異種蛋白質を 開示する。上記方法によって製造される、異種蛋白質を含む融合蛋白質も同様に 開示する。 本発明の別の態様では、（ａ）本発明の発現方法により融合蛋白質として異種 蛋白質を発現し；（ｂ）融合蛋白質を単離し；及び（ｃ）担体蛋白質の第二ドメ インの一部分の存在を検出する手段に該融合蛋白質を露呈する段階を含む、異種 蛋白質の完全発現を確認するための方法が開示される。 本発明の更なる態様では、（ａ）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコード する第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び（ｂ）異種蛋白質を コードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二要素が連続し同じ読み取り 枠にあるように、第一要素内に埋め込まれている第二要素を含む、プラスミドベ クター中に挿入するためのＤＮＡ構築物を開示する。 本発明の更に別の側面では、本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクター 、及びそれによって形質転換された宿主細胞を開示する。図面の簡単な説明 本発明の次の説明は添付した図面との関連でより容易に理解 されるだろう： 図１はプラスミドｐＪＯ２１０及びＪＯ２１５の構築、並びに制限部位Ｅｃｏ ＲＩ並びにＢａｍＨＩの除去の図解説明であり； 図２はプラスミドｐＭＣ２００の構築の図解説明であり； 図３はプラスミドｐＪＯ２００の構築の図解説明であり； 図４はプラスミドｐＭＢ２８：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２の構築の図解説明であり； 図５はプラスミドｐＭＢ３４：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築の図解説明であ り； 図６はプラスミドｐＭＢ３８：ｌａｃＺ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）の 構築の図解説明であり； 図７はプラスミドｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳの構築の図 解説明であり； 図８は（Ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０ＤＮＡ配列を含むＰＣＲフラグメントの 作製；（Ｂ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びｐｐ３８（１１７−３７３ａ ａ）ＤＮＡ配列を含むＰＣＲフラグメントの作製；並びに（Ｃ）プラスミドｐＣ ＭＶ−３Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３、プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂ：ＣＫＳ− Ｈ１０、プラスミドｐＣＭＶ−４：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０、プラスミド ｐＣＭＶ−９：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びプラスミドｐＣＭ Ｖ−２６：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の構築の図解説明であり； 図９は（Ａ）プラスミドｐＪＯ２００−ΔＭｌｕＩ；（Ｂ）プラスミド残基１ ５１〜１８０（５’−３’）における意図した改変部位を含む、プラスミドｐＪ Ｏ２００のヌクレオチド配列；（Ｃ）プラスミドｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩ ＡＰへの連結反応のために合成された、変異原オリゴヌクレオチド、５’ＣＧＣ ＧＡＣＧＴ３’の二本鎖構造；及び（Ｄ）改変残基１５１〜１８０（５’−３’ ）を含む、プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩのヌクレオチド配列の図解説明で あり； 図１０はプラスミドｐＥＥｌの構築の図解説明であり； 図１１は（Ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０，ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及び ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡ配列を含むＰＣＲフラグメントの作製； 並びに（Ｂ）プラスミドｐＣＭＶ−２７：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫ Ｓ、プラスミドｐＣＭＶ−２８：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−Ｃ ＫＳ、プラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ：ＣＫＳ −ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫＳ、及びプラスミドｐＣＭ Ｖ−２９：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳの構築の図解説明 であり； 図１２はヌクレオチド１〜９２０のＤＮＡ配列［配列番号５］、及びプラスミ ドｐＪＯ２００のアミノ酸１〜２６０の対応するアミノ酸配列である。発明の詳細な説明 従って、本発明の一つの態様では、（ａ）（１）宿主細胞中で発現可能な担体 蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び（２ ）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二要素が連続 して同じ読み枠にあるように第一要素内に埋め込まれている第二要素、を有する ＤＮＡベクターを準備する工程；（ｂ）宿主細胞を該ＤＮＡベクターで形質転換 する工程；並びに（ｃ）異種蛋白質がそのＮ末端で担体蛋白質の第一ドメインと 、またそのＣ末端で担体蛋白質の第二ドメインと結合している、該異種蛋白質と 担体蛋白質との融合蛋白質を発現する工程を含む、原核宿主細胞中で異種蛋白質 を発現する方法を開示する。 本発明の発現方法では、異種蛋白質は宿主細胞中で発現可能 ないずれの蛋白質であってもよく、発現が宿主の成長を有意に害するか又は阻害 しないように十分に良性であればよい。適当な異種蛋白質は、細菌及びウイルス 蛋白質が好ましいが、細菌、真菌、酵母、ウイルス、原生動物又は他の源（Ｔｒ ｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ又はＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉのよ うな人畜共通伝染病の原因生物を含む）であり得る。 特に好ましくはウイルス蛋白質、及び特にかなり臨床的に重要な病原体である ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、に由来の蛋白質であり、このような蛋 白質はＨＣＭＶ特異的免疫グロブリンの存在又は不在の測定においてアッセイ標 的としてその使用によるＨＣＭＶ感染の診断において重要である。本発明の方法 により発現され得る、及びヒト免疫グロブリンで容易に同定されるエピトープを 含む、代表的ＨＣＭＶ蛋白質としては、ｐｐ３８（３８ｋＤアッセンブリィ蛋白 質）、ｐｐ６５（６５ｋＤ主要マトリックス蛋白質）、ｐｐ５２（５２ｋＤ非構 造的ＤＮＡ結合蛋白質）、ｐｐ１５０（１５０ｋＤ構造的リン酸化蛋白質）が含 まれ、これらのうち、ＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８及びｐｐ６５が好ましい。ＨＣＭ ＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２の中から選ばれたエピトープの免疫原部 分を含 有する異種蛋白質も好ましく、これらのエピトープはＨＣＭＶに対する免疫グロ ブリンについてのアッセイにおいて高感度で特異的な手段を提供することが分か った。 上記方法に使用するのに適する代表的調節領域は原核生物プロモーター及び原 核生物リボソーム結合部位を含むもの、及び特に制御調節がｌａｃオペロンを含 有するものを含む。しかし、使用した宿主細胞に依存して、当該分野で良く知ら れた他の調節領域も使用することができる。 本発明の埋込発現法（embedded expression method）が、非制限的にβ−ガラ クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、及びマルトース結合蛋 白質を含む他の担体蛋白質との幅広い応用を見いだすことが期待されるが、代表 的担体蛋白質（異種遺伝子が融合され、共発現する融合相手）はＣＫＳ蛋白質に 由来するものである。ＣＫＳを使用すると、上記方法で使用したＤＮＡベクター の特に好適な実施態様は、異種蛋白質がＣＫＳの１から１７１のアミノ酸の部分 を含む担体蛋白質の第一ドメインと、ＣＫＳの１７１から２６０のアミノ酸の部 分を含む担体蛋白質の第二ドメインとの間に位置するものである。（下記のよう に、ＣＫＳ蛋白質と称するものは、ポリリン カーＤＮＡ配列によってコードされたＣＫＳ遺伝子の末端に追加の２０個のアミ ノ酸が続く本来のｋｄｓＢ遺伝子の第一の２４０個のアミノ酸の両方を含み得る 。） したがって、本発明の好適な融合蛋白質は配列ＣＫＳ^*−ＣＭＶ^*−Ｔｈｒ−Ａ ｒｇ−ＣＫＳ^**を有するものを含み、ここで（ａ）ＣＫＳ^*はＣＫＳのアミノ酸 １から１７１の部分であり；（ｂ）ＣＭＶ^*はＨＣＭＶ蛋白質の部分であり；及 び（ｃ）ＣＫＳ^**はＣＫＳのアミノ酸１７１から２６０の部分である。これらの うち、ＣＭＶ^*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２，ｐｐ６５及びｐｐ１５０ の部分中から、及び特にＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８もしくはｐｐ６５の免疫原部分 中から又はＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２の免疫原部分から選ば れる融合蛋白質が特に好適である。このような融合蛋白質の特定の例は、ＣＭＶ^* が（ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈ１０；（ｂ）ｐｐ６５（２９７− ５１０ａａ）；（ｃ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ（ここでＳＴ ＯＰは終止コドンである）；及び（ｄ）ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）中から 選ばれるものである。 異種蛋白質の完全発現（intact expression）を確認する本 発明の方法では、融合蛋白質の単離が、他の発現生成物（不完全又は末端切断型 融合蛋白質）又は細胞成分に関して融合蛋白質の電気泳動ゲル中の示差的移動の ような既知の分離法で行ない得る。（なお、「単離」とは、種々の分子種が分離 されるか又は分割されることのみを意味し、所望の融合蛋白質が純粋な形で単離 されることを意味するものではないことに注意すべきである。）単離後、異種蛋 白質にフランキングする担体蛋白質ドメインの部分又は全体の存在を確立するた めの何らかの適当な検出手段を使用してもよい。好ましい検出手段は、担体蛋白 質の第一あるいは第二ドメインに含まれるエピトープと免疫反応を起こす免疫グ ロブリンを含む。融合蛋白質の単離及びこのような検出手段への該蛋白質の露呈 の両方のための特に有用な方法はウエスタンブロット法である。 本発明のＤＮＡ構築物は上記方法及び融合蛋白質に対応するものである。した がって、好適な構築物は、好適な異種蛋白質、エピトープ、調節領域、担体蛋白 質、及び上記融合蛋白質要素の並列（juxtaposition）、をコードする配列を含 有するものである。本発明のプラスミドベタターに組み込まれると、好適なベク ターは、（ａ）ｐＣＭＶ−２７；（ｂ）ｐＣＭＶ−２８； （ｃ）ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ；及び（ｄ）ｐＣＭＶ−２９の中から選ばれるも のを含む。 その種々の態様において本発明は、当該分野で周知の組換え法を用いて行うこ とができる。例えば、担体としてＣＫＳ蛋白質を用いる異種蛋白質の慣用の発現 が上記の米国特許第５，１２４，２５５号に記載されている。関連する方法は米 国特許第５，３１２，７３７及び同第５，３２２，７６９号、並びにここに引用 された参考文献にも詳細に記載されている。 本発明の発現方法、確認方法、融合蛋白質、ＤＮＡ構築物、プラスミドベクタ ー及び形質転換宿主細胞は、本発明を説明することを意図し本発明の範囲を制限 するものでない以下の実施例と関連付けるとより良く理解されるだろう。以下の 記載及び本明細書全体にわたって、文献の引用は明らかに参考として含めること を意図している。 実施例１ 一般的方法 材料及び供給源 制限酵素，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ ）、ポリヌクレオチドキナーゼ、及びＤＮＡ ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｙｅｒｌｙ，ＭＡ）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ ｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。 ＤＮアーゼＩ及びアプロチニンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃ ｏｒｐ．から購入した。 ＤＮＡ及び蛋白質分子量標準、第一プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル 、及び緩衝液付き半乾燥ブロッティングシステムはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅ ｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）から得た 。 イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、アクリルアミド、Ｎ −Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、４−クロロ−１−ナフトール、Ｃｏｏｍａｓ ｓｉｅ^TMＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００^TM 及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入した。 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識抗体は Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｎｃ． （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。ＥＰＩＣＵＲＩＡＮ Ｃｏ ｌｉ^TM ＸＬ−１ ＢＬＵＥ（ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ −１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ ｌ ａｃ Ｉｑ ＺΔＭ１５ Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^I）］）ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎ ｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＤＮＡ単離キット、ＲＮＡ単離キット、及びＺＡＰ^TM− ｃＤＮＡ合成キットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ，Ｉｎｃ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。 ＧｅｎｅＡｍｐ^TM試薬キット及びＡｍｐｌｉＴａｑ^TM ＤＮＡポリメラーゼは Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から購入した 。一般的方法で使用されたデオキシヌクレオチド三リン酸はＧｅｎｅＡｍｐ^TM試 薬キットからのものであった。 支持ニトロセルロース膜はＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅ ｅｎｅ，ＮＨ）から購入した。 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^TM及び７−デアザ−ｄＧＴＰ及びＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TM ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡポリメ ラーゼによるＤＮＡ配列決定のためのヌクレオチドキットはＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得た。 ポリＡ⁺ｍＲＮＡ精製キットはＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。 アンピシリン付きＬｕｒｉａブロスプレート（ＬＢａｍｐプレート）はＭｉｃ ｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｍｂａｒｄ、ＩＬ）から購入し た。 ＯＰＴＩ−ＭＥＭ^TM培地、牛胎児血清、リン酸緩衝食塩水、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（Ｆ−φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇ Ｆ）Ｕ１６９ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｐｈｏＡ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ^- 、ｍＫ⁺）ｓｕｐＥ４４λ^- ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１）、及びｕｌ ｔｒａＰＵＲＥ^TMアガロースはＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓ ｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。 Ｂａｃｔｏ−トリプトン、Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物、及びＢａｃｔｏ−寒天は Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）から得た。 ＮＺＹ^TMブロスはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。 サケ精子ＤＮＡ、リゾチーム、アンピシリン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、チ メロサール、緩衝液、カゼイン酸加水分解物、ＴＷＥＥＮ ２０^TM（ポリオキシ エチレンソルビタンモノラウレート）、ピロカルボン酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、 フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 、尿素、グリセロール、ＥＤＴＡ、デオキシコール酸ナトリウム及び無機塩類は Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から 購入した。 ポリスチレン微粒子はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇ ｔｏｎ，ＰＡ）から購入した。 過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）はＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）から購 入した。 メタノールはＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入し た。培地、緩衝液及び一般試薬 「スーパーブロス ＩＩ」は１１．２５ｇ／Ｌのトリプトン、２２．５ｇ／Ｌ の酵母抽出物、１１．４ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、１．７ｇ／Ｌの一塩 基性リン酸カリウム、１０ｍＬ／Ｌのグリセロールを含み、水酸化ナトリウムで ｐＨ７．２に調整した。 「トリス緩衝食塩水」又は「ＴＢＳ」はｐＨ７．５で２０ｍＭのトリス、５０ ０ｍＭのＮａＣｌからなった。 「トリス緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ ２０^TM」又は「ＴＢＳＴ」はＴＢＳプラス０ ．０５％ＴＷＥＥＮ ２０^TMからなった。 「膜ブロッキング溶液」はＴＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、 １％のカゼイン酸加水分解物、及び０．０５％のＴＷＥＥＮ ２０^TMからなった 。 「Ｒｕｂａｚｙｍｅ試料希釈緩衝液」又は［ＲｕｂａｚｙｍｅＳＤＢ」は１３ ５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴＷＥＥＮ ２０^TM、０． ０１％のチメロサール及び４％の牛胎児血清を含むｐＨ７．５の１００ｍＭのト リスからなった。 「Ｒｕｂａｚｙｍｅコンジュゲート希釈剤希釈緩衝液」は １３５ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のチメロサール及び１０％牛胎児血清を含む ｐＨ７．５の１００ｍＭトリスからなった。 「ＨＰＲＯ発色溶液」はＴＢＳ中に０．０６％の４−クロロ−１−ナフトール 、０．０２％のＨ₂Ｏ₂及び０．２％メタノールからなった。 「ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液」は２％のＳＤＳ、１０％のグリセロ ール、５％のβ−メルカプトエタノール及び０．１％のブロモフェノールブルー を含むｐＨ６．８の６２ｍＭトリスからなった。 「ＴＥ緩衝液」はｐＨ８．０で１０ｍＭのトリス及び１ｍＭのＥＤＴＡからな った。 「ＴＥＭ溶解（lysis）緩衝液」はｐＨ８．５で５０ｍＭのトリス、１０ｍＭ のＥＤＴＡ及び２０ｍＭの塩化マグネシウムからなった。 「ＰＴＥ緩衝液」はｐＨ８．５で５０ｍＭのトリス及び１０ｍＭのＥＤＴＡか らなった。ウイルス増殖及びｃＤＮＡの作製 ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株又はＴｏｗｎｅ株を交換可能に使用し、５％牛胎児血 清を補充したＯＰＴＩ−ＭＥＭ^TM培地中 で生育するヒト繊維芽細胞中で増殖させた。ＨＣＭＶ ＡＤ１６９及びＨＣＭＶ ゲノムは、Ｃｈｅｅら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ ．１５４：１２５（１９９０）及びＢａｎｋｉｅｒら，ＤＮＡ Ｓｅｑ．２：１ （１９９１）の刊行物に記載されており、その開示内容を参考として本明細書に 含めるものとする。 感染６日後、ＣＭＶ感染繊維芽細胞を遠心分離で収穫し、ＰＢＳで洗浄し、ガ ラス−Ｔｅｆｌｏｎ^TMホモジナイザーで均質化した。全ウイルスＤＮＡは、Ｍｏ ｃａｒｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１２６６（１９ ８５）に記載のように単離した。全ＲＮＡはＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて均質化した細胞から単離し 、ポリＡ⁺ＲＮＡはｍＲＮＡ単離キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ）を用いて単離した。ＨＣＭＶ ｃＤＮＡはＺＡＰ−ｃＤＮＡ^TM合成キット（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて精製ウイルスｍ ＲＮＡから合成した。一般的方法 ＤＮＡの全酵素消化は供給者の指示によって行なった。少な くとも５単位の酵素がＤＮＡ１ミクログラム当たりで使用され、十分な培養時間 がＤＮＡの完全消化を可能にした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＤＮＡ合成 、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ及びＲＮＡの操作で使用する種々のキットにおいて供 給者のプロトコルに従った。標準方法は、Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡ の小規模及び大規模合成、ファージλに感染させたＥ．ｃｏｌｉ細胞からのファ ージ溶菌液ＤＮＡの合成、抗−Ｅ．ｃｏｌｉ抗体の吸収のためのＥ．ｃｏｌｉ溶 菌液の調製、ＤＮＡのフェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱、アガ ロースゲル上のＤＮＡの制限分析、アガロース及びポリアクリルアミドゲルから のＤＮＡフラグメントの精製、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を用い る制限酵素によるＤＮＡの消化で生じた陥凹３’末端の充填、Ｔ４ ＤＮＡリガ ーゼによるＤＮＡフラグメントの連結反応、及びコンピテントＢ１細胞（Ｆ^- ａ ｒａ ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ｈｓｄＲ １７）の調製のために使用した（Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。 ＰＣＲ増幅で生成したプラスミドへのクローニングのためのＤＮＡフラグメン トは、ＰＣＲ反応混合物の制限酵素消化に先立って、フェノール−クロロホルム で抽出し、エタノールで沈澱させた。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定のためのオリゴ ヌクレオチドは、製造者のプロトコルによって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓオリゴヌクレオチド合成器、モデル３８０Ｂ又は３９４で合成した。 ＨＣＭＶ蛋白質Ａ１Ｃ２Ｆ３（ウイルス遺伝子ＵＬ３２由来）、Ｈ１０（ＵＬ ４４）及びｐｐ６５（ＵＬ８３）に対するマウスモノクロナール抗体は、それぞ れ精製ｒｐＭＢ３４（ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３）、精製ｒｐＲＯＳＨ１０（ｌａ ｃＺ−Ｈ１０）、及び精製ｒｐＣＭＶ−９（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ ａａ）によるマウスの免疫化で得られた。ＣＫＳ蛋白質に対するマウスモノクロ ナール抗体は、Ｄａｉｌｅｙらによる国際公開第ＷＯ９３／０４０８８に記載さ れた、精製ｒｐＨＣＶ−２３（ＣＫＳ−ＢＣＤ）によるマウスの免疫化で得られ た。免疫化に使用された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された様に約９０ ％の純度であった。マウスの免疫化、 細胞融合、モノクロナール抗体の選別及びクローニング、並びにモノクロナール 抗体の特性付けのための方法はＭｅｈｔａらによる国際公開第ＷＯ９２／０８７ ３８に記載のものと同様であった。 実施例２ ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の構築 図１〜３に示したように、ｐＪＯ２００ベクターは、Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＭａ ｎｄｅｃｋｉ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：４８８（１９９０）に記載 された、プラスミドｐＴＢ２０１から出発する三段階で構築された。ＣＫＳ発現 ベクターｐＪＯ２００の構築は、Ｅ．ｃｏｌｉＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（Ｃ ＫＳ）蛋白質と組換え蛋白質との融合を可能にした。構造蛋白質ＣＫＳ（ｋｄｓ Ｂ遺伝子としても公知）をコードするＤＮＡ遺伝子配列は、Ｇｏｌｄｍａｎら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１５８３１（１９８６）に公表されている。 ＣＫＳのアミノ酸配列は２４８個のアミノ酸（ａａ）残基を含み、同じ文献に記 載されている。 プラスミドｐＪＯ２００のための構築計画は、制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ及び ＢａｍＨＩ）の除去及びＣＫＳ遺伝子の３’ 末端における多クローニング部位の付加を含んだ。これは、ＣＫＳの３’末端に おける、ＣＭＶ蛋白質抗原をコードするＣＭＶ遺伝子のその後のクローニングを 容易にした。最終的に得られたベクターは、全部で２６０個のアミノ酸で、ポリ リンカーＤＮＡによりコードされた追加の２０個のアミノ酸が後に続いた、本来 のｋｄｓＢ遺伝子由来の最初の２４０個のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを 含んでいた。段階Ａ：ｐＪＯ２１０の構築 プラスミドｐＪＯ２１０はＣＫＳ発現ベクター、ｐＴＢ２０１の誘導体である （図１）。このプラスミドは、ＣＫＳ遺伝子用のプロモーターから上流に位置す るｐＴＢ２０１に存在する単一のＥｃｏＲＩ部位を除去して構築された。大規模 プラスミドＤＮＡ（ｐＴＢ２０１）は一般的方法を用いてＴＢ１細胞から単離さ れた。ＤＮＡはＥｃｏＲＩにより完結するまで消化され、ポリアクリルアミドゲ ル上で精製された。精製されたｐＴＢ２０１／ＥｃｏＲＩフラグメントはついで デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ 断片により処理した。この酵素はＥｃｏＲＩ消化後に生じた陥凹３’末端を充填 し、平滑末端とした。ＤＮＡはＫｌｅｎｏｗ 断片による処理後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱し、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液中に再懸濁し、最後に室温で４時間Ｔ４ ＤＮＡリガ ーゼを用いて連結反応した。この連結反応混合物はコンピテントＴＢ１細胞に形 質転換された。ＤＮＡのミニプレプ（miniprep）を形質転換体から調製し、ＤＮ ＡはＥｃｏＲＩ部位の欠失について選別された。プラスミドｐＪＯ２１０を単離 したが、これはプラスミドｐＴＢ２０１のＥｃｏＲＩ部位を欠失していた。段階Ｂ：ｐＪＯ２１５の構築 プラスミドｐＪＯ２１５はプラスミドｐＪＯ２１０の誘導体である（図１）。 このプラスミドは、Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８３：７１７７（１９８６）の橋かけ変異誘発法（bridge mutagenesis procedu re）を用いて、ＣＫＳ遺伝子用のプロモーターに位置するｐＪＯ２１０の単一Ｂ ａｍＨＩ部位を除去することにより構築された。ＴＢＩ細胞からのプラスミドＤ ＮＡ（ｐＪＯ２１０）は一般的方法を用いて単離された。ＤＮＡはＢａｍＨＩに より完結するまで消化し、アクリルアミドゲル上で精製した。精製したｐＪＯ２ １０／ＢａｍＨＩフラグメントはついで、ＢａｍＨＩ部位に及ぶプラ スミドの領域中のｐＪＯ２１０のＤＮＡ鎖の一つに相補的で、配列［配列番号１ ］を有する変異原オリゴヌクレオチドと混合した。 このオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＪＯ２１０に組み込まれると、Ｂａｍ ＨＩ部位を除去する単一のＧ→Ｃ塩基変化（上で下線を付けた、ヌクレオチド♯ １５）を含んでいた。 変異原オリゴヌクレオチドをｐＪＯ２１０／ＢａｍＨＩと混合した後、混合物 を３分間煮沸し、５分間室温まで冷却し、ついでコンピテントＴＢ１細胞に形質 転換した。ミニプレプＤＮＡは形質転換体から調製し、ＢａｍＨＩ部位の欠失に ついて選別した。プラスミドｐＪＯ２１５を単離したが、これはｐＪＯ２１０の ＢａｍＨＩ部位を欠失していた。段階Ｃ：ｐＭＣ２００の構築 プラスミドｐＭＣ２００（図２）は、Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎｇ、 Ｇｅｎｅ６８：１０１（１９８８）に記載された、プラスミドｐＭＷ５０７の誘 導体である。このプラスミドは、Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎｇにより記 載された遺伝子合成のＦｏｋＩ法を用いるｐＭＷ５０７中に多クローニ ング部位を含む合成オリゴヌクレオチドのクローニングにより構築された。 規模プラスミドｐＭＷ５０７ＤＮＡは一般的方法を用いてＴＢ１細胞から単離 した。そのＤＮＡをＳｍａＩにより完全に消化し、ついで配列［配意列番号２］ を有するオリゴヌクレオチドと混合した。 これは末端におけるＦｏｋＩアーム及び数個の制限酵素部位を含んでいた。 多クローニング部位ヌクレオチドは次の制限部位及び配列を含んでいた：５’ ＦｏｋＩアーム−ＢｇｌＩＩ 付着末端−ＳａｌＩ／ＡｃｃＩ／ＨｉｎｃＩＩ− ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ−ＫｐｎＩ−ＳｍａＩ／ＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ −ＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ−停止コドン−ＢｇｌＩＩ付着末端−ＦｏｋＩアーム３’ 。オリゴヌクレオチドをｐＭＷ５０７／ＳｍａＩと混合し、混合物を３分間煮沸 し、５分間室温まで冷却し、ついでコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。ミ ニプレプＤＮＡ を形質転換体から調製し、多クローニング部位の存在について選別した。プラス ミドｐＭＣ２００は、ＤＮＡ配列決定により確認されたようにｐＭＷ５０７への 多クローニング部位の挿入を含んでいた。段階Ｄ：ｐＪＯ２００の構築 プラスミドｐＪＯ２００はプラスミドｐＪＯ２１５の誘導体である（図３）。 プラスミドｐＪＯ２００はｐＭＣ２００からの多クローニング部位の除去及びｐ ＪＯ２１５中のＣＫＳ遺伝子の３’末端におけるこの部位のクローニングによっ て構築された。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＣ２００及びｐＪＯ２１５の両方）は一般的方 法を用いてＴＢ１細胞から単離した。プラスミドｐＪＯ２１５ＤＮＡをＢｇｌＩ Ｉにより完全に消化し、ついで連結反応中にプラスミドの再環化を防ぐために仔 牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理した。プラスミドｐＭＣ２００ ＤＮＡはＦｏｋＩで消化した。ＦｏｋＩによるプラスミドｐＭＣ２００の消化に より、プラスミドから多クローニング部位ＤＮＡを切り出したが、このＤＮＡは ＢｇｌＩＩ付着末端を含み、ＢｇｌＩＩで消化した後、それはｐＪＯ２１５ＤＮ Ａ中に容易に連結できた。プラスミドｐＪＯ２１５／ＢｇｌＩＩ／ＣＩＡＰ及び ｐＭＣ２００／ＦｏｋＩ（１０６塩基対）から切り出された多クローニング部位 はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。 プラスミドｐＪＯ２１５／ＢｇｌＩＩ／ＣＩＡＰ及びｐＭＣ２００／ＦｏｋＩ から切り出された多クローニング部位は混合され、１６℃でＴ４ＤＮＡリガーゼ により一晩連結された。翌日、連結反応混合物はコンピテントＴＢ１細胞に形質 転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ＢｇｌＩＩ部位にお ける正しい配向で多クローニング部位の存在について選別した。プラスミドｐＪ Ｏ２００は正しい配向で多クローニング部位を含んでいた。ＢｇｌＩＩ部位にお けるｐＪＯ２００中の多クローニング部位のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定によっ て確認した。 実施例３ ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３発現ベクターｐＭＢ３４ プラスミドｐＭＢ３４はＨＣＭＶ配列を含み、Ｅｌｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｃｌ ｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２７：９７１（１９８９）に記載されたｌａｃＺ発現ベクタ ーｐＲＯＳの誘導体であった。 ｐＲＯＳベクターは、ｌａｃＺ遺伝子の下流に配置されたポリリンカークローニ ング部位を有するｌａｃＺ遺伝子（１−３７５アミノ酸）の末端切断形を含んで いた。ｐＭＢ３４プラスミドは二段階で構築された。第一段階は、１５０ｋＤ（ ｐｐ１５０）の塩基性ＨＣＭＶリン酸化蛋白質をコードするｐｐＵＬ３２の二つ の領域の結合、ついでこのＨＣＭＶ融合体とｐＲＯＳのｌａｃＺ遺伝子の３’末 端との結合を必要とした。段階Ａ：ｐＭＢ２８：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２の構築 プラスミドｐＭＢ２８［プラスミドｐＲＯＳの誘導体（図４）］は、ｐＲＯＳ のポリリンカー領域へのＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２を含むＤＮＡフラグメントのクロー ニングによって構築された。ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２は、ｐｐ１５０のアミノ酸５９ ５〜１４（ｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３〜１８４２、ここでヌクレオチ ド１及び３１４４は、Ｃｈｅｅら（１９９０）及びＢａｎｋｉｅｒら（１９９１ ）で報告されたように、ＡＤ１６９ＤＮＡの相補鎖の、それぞれヌクレオチド４ ２９９３及び３９８５０に対応する）をコードするｐｐＵＬ３２遺伝子の領域か らのＨＣＭＶゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＲＯＳ）は一般的方法を用いてＤＨ５α細胞から 単離した。プラスミドｐＲＯＳはＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ベ クター骨格はアガロースゲル上で精製した。ＳａｌＩ部位を含むｐｐＵＬ３２の ヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を含 むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１８４２で始まるアンチセンスプライマーを合成 し、ゲノムＨＣＭＶ ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物を加えた。ＰＣＲ増幅後、 反応混合物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ａ１Ｃ２（ｐｐＵＬ３２の ヌクレオチド１７８３〜１８４２）として既知のエピトープを含む６０塩基対フ ラグメントをアガロースゲル上で精製した。この精製フラグメントはついで１６ ℃で一晩インキュベートすることにより精製ｐＲＯＳ／ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩ Ｉに連結された。翌日、連結反応混合物をコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換 した。ミニプレプＤＮＡを形質転換体から調製し、その形質転換体はｌａｃＺ遺 伝子の末端のｐＲＯＳにおける６０塩基対フラグメントの存在について選別され た。プラスミドｐＭＢ２８はＡ１Ｃ２フラグメントを含んでいた。ｐＭＢ２８の Ａ１Ｃ２のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認し、Ａ１Ｃ２を コードする領域がｌａｃＺコーディング配列と同じ位相内（in-frame）にあるこ とを決定した。段階Ｂ：ｐＭＢ３４：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築 プラスミドｐＭＢ３４［プラスミドｐＭＢ２８の誘導体（図５）］は、Ａ１Ｃ ２ＤＮＡ配列のすぐ下流で、ｐＭＢ２８のポリリンカー領域へＨＣＭＶ−Ｆ３エ ピトープを含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した。 ＨＣＭＶ−Ｆ３エピトープを含むＤＮＡフラグメントは、ｐｐ１５０のアミノ酸 １００６〜１０４８（ヌクレオチド３０１６〜３１４４）をコードするｐｐＵＬ ３２のλｇｔ１１サブクローンから得られ、Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１２６６（１９８５）に記載されたλｇｔ１１ ライブラリーからのものであった。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ２８）は一般的方法を用いてＤＨ５α細胞か ら単離した。ファージ溶解液は一般的方法を用いてファージλｇｔ１１クローン λ−Ｆ３から調製した。プラスミドｐＭＢ２８をＳｔｕＩで消化し、平滑断端を もつベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ファージλ−Ｆ３ＤＮＡはＥ ｃｏＲＩで消化し、陥凹３’末端をＤＮＡポリメラー ゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で充填し、平滑末端とした。平滑末端化した１２９塩基 対λ−Ｆ３フラグメントはアガロースゲル上で精製し、ついでその平滑末端を１ ６℃で一晩ｐＭＢ２８／ＳｔｕＩに連結した。連結反応混合物は翌日コンピテン トＤＨ５α細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡその形質転換体から作製し 、形質転換体を正しい配向のｌａｃＺ遺伝子の末端でｐＭＢ２８中の１２９塩基 対フラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＭＢ３４は正しい配向で Ｆ３フラグメント含んでいた。プラスミドｐＭＢ３４のＦ３のＤＮＡ配列はＤＮ Ａ配列決定で確認された。Ｆ３コーディング領域はｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２コーディ ング配列と同じ位相内にあった。ｐＭＢ３４のｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３構築物の コーディング領域は、「ｌａｃＺ（１−３７５ａａ）−Ａ１Ｃ２（５９５−６１ ４ａａ、ｐｐ１５０）−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３（１００６−１０４８ａａ、 ｐｐ１５０）」と表示される構築物を結果的に生じさせる、Ａ１Ｃ２とＦ３の間 の配列［配列番号３］ Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ （又はＫ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ）を有する、５個のアミの酸の橋かけを含んでいた。 ペンタペプチド挿入体を含む完全構築物は、 本明細書中で「Ａ１Ｃ２Ｆ３」と称する。 実施例４ ｌａｃＺ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）発現ベクターｐＭＢ３８の構築 プラスミドｐＭＢ３８［ｌａｃＺ発現ベクターｐＲＯＳの誘導体（図６）］は ポリリンカー領域ｐＲＯＳへＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含む ＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築された。ＨＣＭＶ−ｐ ｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントはリン酸化蛋白質ｐｐ ３８のアミノ酸１０６−３７３（ｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３１６−１１１ ９、ここでヌクレオチド１及び１１１９はそれぞれＡＤ１６９ＤＮＡ配列のヌク レオチド１１６２０３と１１７３２１に対応する）をコードするｐｐＵＬ８０ａ 遺伝子の領域からのゲノムＨＣＭＶ ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得られた。 プラスミドｐＲＯＳはＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたベクタ ー骨格はアガロースゲル上で精製した。ｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３１６で 始まりＳａｌＩ部位を含むセンスプライマー、及びｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチ ド１１１９ で始まりＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマーを合成し、両方のプ ライマーをゲノムＨＣＭＶ ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増 幅後、反応混合物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐｐ３８（１０６− ３７３ａａ）を含む８０４塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。 精製フラグメントはついで１６℃で一晩精製ｐＲＯＳ／ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩ Ｉに連結した。連結反応混合物は翌日コンピテントＤＨ５α細胞に形質転換され た。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、形質転換体をｌａｃＺ遺伝 子の末端のｐＲＯＳ中の８０４塩基対ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）フラグメ ントの存在について選別した。プラスミドｐＭＢ３８はｐｐ３８（１０６−３７ ３ａａ）フラグメントを含んでいた。ｐＭＢ３８中のｐｐ３８（１０６−３７３ ａａ）のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認し、ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ ）コーディング領域はｌａｃＺコーディング配列と同じ位相内にあった。 実施例５ ｐＪＯ２００に基づくＣＫＳ−ＣＭＶ発現ベクターの構築 ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００は一連の６個のＣＫＳ−Ｃ ＭＶ遺伝子融合構築物の出発点として使用した。二種類のＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子 融合プラスミドを構築した。本明細書中でエピトープ埋込（epitope-embedding ）と称する第一のものは、ＣＭＶ遺伝子ＤＮＡ配列がｐＪＯ２００のヌクレオチ ド６３８（ＣＫＳのアミノ酸１７１に対応する）においてＣＫＳ遺伝子内に挿入 されるように構築された。この構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ＣＭＶ− ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と称した。この種の構築物からＥ．ｃｏｌｉ中 で発現された融合蛋白質はＣＫＳアミノ酸配列内に完全に埋め込まれた抗原のエ ピトープを含む。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ（下記）はこの様に構築された。 第二タイプのＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合プラスミドは、ＣＫＳアミノ酸２４８ に対応する位置でＣＫＳ遺伝子の３’末端に連結したＣＭＶ遺伝子ＤＮＡ配列を 用いて構築された。この構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ＣＭＶ」と称し た。プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ、ｐＣＭＶ−３Ｂ、ｐＣＭＶ−４、ｐＣＭＶ−９ 、及びｐＣＭＶ−２６（下記）はこのように構築された。大規模プラスミドＤＮ Ａ（ｐＪＯ２００）は一般的方法で単離し、下記の構築物のために使用した。段階Ａ：ｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ［プラスミドｐＪＯ２００の誘導体（図７）］は、 プラスミドｐＭＢ３４に含まれたＡ１Ｃ２Ｆ３ ＤＮＡのＰＣＲ増幅により得ら れた、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＪＯ２００のＳ ｔｕＩ部位にクローニングすることによって構築された。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ３４）は一般的方法で単離した。プラスミド ｐＪＯ２００ＤＮＡをＳｔｕＩ及びＭｌｕＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロ ースゲル上で精製した。 ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ消化はＣＫＳ遺伝子の３’末端の部分を除去し、それは連 結反応で後に回復された。２つのＰＣＲ誘導ＤＮＡフラグメントは３経路の連結 反応でこのベクター骨格にクローン化された。Ａ１Ｃ２Ｆ３はＳｔｕＩ／Ｍｌｕ Ｉ ＤＮＡフラグメントとしてクローン化され、ＣＫＳ遺伝子の残りの３’部分 はＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントとしてクローン化され、完全なＣ ＫＳ遺伝子を回復した。 ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプラ イマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４で始まる アンチセンスプライマー を合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅 後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む２０４塩 基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。ｐＪＯ２００のヌクレオチド ６４０（ＭｌｕＩ部位を含む）で始まるセンスプライマー、及びｐＪＯ２００の ヌクレオチド９０５で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＪ Ｏ２００を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。（上記のヌクレオチド番号付けは図 １２に示されたＤＮＡ配列に対応する。）ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＭｌｕＩ 及びＢａｍＨＩで消化し、ＣＫＳ遺伝子の３’部分を含む２６６塩基対フラグメ ントをゲル精製した。これらの精製ＰＣＲ誘導ＤＮＡフラグメントはついで１６ ℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩに連結された。翌日、連結反応混 合物はコンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。 ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位 に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３の存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ はＳｔｕＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３を含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３のＤＮＡ 配列及びＣＫＳ遺伝子の３’末端はＤＮＡ配列決定により確認した。２ 個のアミノ酸（スレオニン及びアルギニン）の橋かけを含む蛋白質ｒｐＣＭＶ− １ＡをコードするＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳのコーディング領域はＡ１Ｃ２ Ｆ３とＣＫＳの３’末端との間のＭｌｕＩ部位に起因した。さらに、ＣＫＳのア ミノ酸１７１は構築物においては二重鎖化され、それは「ＣＫＳ（１−１７１ａ ａ）−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と称した。段階Ｂ：ｐＣＭＶ−３Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築 プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ［プラスミドｐＪＯ２００の誘導体（図８Ａ及びＣ ）］は、プラスミドｐＭＶ３４に含まれるＡ１Ｃ２Ｆ３ ＤＮＡのＰＣＲ増幅で 得られた、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含むＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００の ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングすることによって構築された。プラ スミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロ ースゲル上で精製した。ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８ ３で始まるセンスプライマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続くＡ１Ｃ２Ｆ３コー ディング配列の末端に終止コドンを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４で 始まるアンチセンスプライマーを合成し、プ ラスミドｐＭＢ３４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合 物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む２０４塩基対フラグ メントをアガロースゲル上で精製し、ついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／Ｓａｃ Ｉ／ＢａｍＨＩに連結した。 連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。 ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位にお けるｐＪＯ２００中の２０４塩基対フラグメントの存在について選別した。プラ スミドｐＣＭＶ−３ＡはＣＫＳ遺伝子と同じ位相内で融合したＡ１Ｃ２Ｆ３フラ グメントを含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３のＤＮＡ配列及びＣＫＳ遺伝子の３’末端 を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−Ａ １Ｃ２Ｆ３」と称した。段階Ｃ：ｐＣＭＶ−３Ｂ：ＣＫＳ−Ｈ１０の構築 プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂ［プラスミドｐＪＯ２００の別の誘導体］は、Ｒｉ ｐａｌｔｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ４６：３９（１９ ９４）に記載された、プラスミドｐＲＯＳＨ１０からのＨＣＭＶ−Ｈ１０を含む ＤＮＡフラグ メントを、ｐＪＯ２００中にクローニングすることによって構築された。Ｈ１０ ＤＮＡ配列は、ＨＣＭＶからの５２ｋＤのリン酸化蛋白質をコードするｐｐＵＬ ４４から誘導された。ｐＲＯＳＨ１０のｐｐＵＬ４４のＨ１０部分はｐｐＵＬ４ ４のヌクレオチド６０４−１２９９を含み、ここでヌクレオチド１及び１２９９ はそれぞれＡＤ１６９ＤＮＡ配列の相補鎖のヌクレオチド５６５１２及び５５２ １４に対応する。Ｈ１０は、アミノ酸２０２−４３４に対応する、リン酸化蛋白 質ｐｐ５２のＣ末端側の半分をコードする。プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂは、Ｈ１ ０ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅で得られた、ｐＲＯＳＨ１０からのＨ１０ＤＮＡフラ グメントをｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることで 構築された。 プラスミドｐＪＯ２００はＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ベクター骨格 はアガロースゲル上で精製した。ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチ ド６０４で始まるセンスプライマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続くＨ１０コー ディング配列の末端に終止コドンを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９で 始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＲＯＳＨ１０を含むＰＣ Ｒ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増 幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｈ１０を含む６９６塩基 対フラグメントをアガロースゲル上で精製し、ついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００ ／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結した。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ− １Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から合成 し、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位におけるｐＪＯ２００中の６９６塩基対フラグメ ントの存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−３ＢはＣＫＳ遺伝子と同じ 位相内で融合したＨ１０フラグメントを含んでいた。Ｈ１０のＤＮＡ配列及びＣ ＫＳ遺伝子の３’末端を確認した。ＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１− ２４８ａａ）−Ｈ１０」と称した。段階Ｄ：ｐＣＭＶ−４：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０の構築 プラスミドｐＣＭＶ−４［ｐＪＯ２００のさらなる誘導体］は、それぞれｐＭ Ｂ３４及びｐＲＯＳＨ１０に由来のＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨＣＭＶ−Ｈ１ ０の両方を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００中にクローニング することによって構築された。 プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格を アガロースゲル上で精製した。２つのＰＣＲ誘 導ＤＮＡフラグメントを３経路連結反応でこのベクター骨格にクローン化した。 Ａ１Ｃ２Ｆ３はＳａｃＩ／ＰｓｔＩＤＮＡフラグメントとしてクローン化し、Ｈ １０はＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントとしてクローン化した。 ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプラ イマー、及びＰｓｔＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４で始まる アンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含むＰＣＲ反応混合 物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ａ１ Ｃ２Ｆ３を含む２０４塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。Ｐｓ ｔＩ部位を含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４で始まるセンスプライマー、 ＢａｍＨＩ部位が後に続くＨ１０コーディング配列の末端に終止コドンを含むｐ ｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、 プラスミドｐＲＯＳＨ１０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反 応混合物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｈ１０を含む６９６塩基対フラグ メントをアガロースゲル上で精製した。 ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨＣＭＶ−Ｈ１０精製ＰＣＲ誘 導ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨ Ｉに連結された。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形 質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００の ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０の存在について 選別した。プラスミドｐＣＭＶ−４はｐＪＯ２００のＣＫＳ遺伝子の末端にＡ１ Ｃ２Ｆ３及びＨ１０を含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０のＤＮＡ配列を確認 した。組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−４をコードするＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０ 構築物のコーディング領域はＡ１Ｃ２Ｆ３とＨ１０の間のＰｓｔＩ部位に起因し た２個のアミノ酸の橋かけを含んでいた。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「Ｃ ＫＳ（１−２４８ａａ）−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌ−Ｑ−Ｈ１０」と称した。ジペプチ ド挿入体を含む完全構築物は本明細書中「Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０」と称する。段階Ｅ：ｐＣＭＶ−９：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）の構築 プラスミドｐＣＭＶ−９［ｐＪＯ２００のさらに別の誘導体］は、ｐｐ６５の アミノ酸２９７−５１０をコードするｐｐ ＵＬ８３の領域からのＨＣＭＶｃＤＮＡのＰＣＲ増幅で得られたＨＣＭＶ−ｐｐ ６５（２９７−５１０ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００中にクロ ーニングすることによって構築された。使用したフラグメントはｐｐＵＬ８３の ヌクレオチド８８９−１５３０からなり、ここでヌクレオチド１及び１６８３は それぞれ、ＡＤ１６９ＤＮＡ配列の相補鎖のヌクレオチド１２１０３７及び１１ ９３５５に対応する。 二段階ネステッド（nested）ＰＣＲ反応を用いて、鋳型としてＨＣＭＶｃＤＮ Ａを用いてＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡフラグメントを精 製した。外側ネストＰＣＲ増幅反応のために、ｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８０ ７で始まるセンスプライマー、及びｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５７２で始ま るアンチセンスプライマーを合成し、ＨＣＭＶｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物 に加えた。ＰＣＲ増幅後、外側ネスト反応混合物を内側ネストＰＣＲ増幅反応の ための鋳型ＤＮＡとして使用した。内側ネストＰＣＲ増幅反応のために、Ｓａｃ Ｉ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９で始まるセンスプライマー、及 びＢａｍＨＩ部位が後に続くｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）コーディング配列 の末端に終止コドン を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０で始まるアンチセンスプライマーを 合成し、外側ネスト増幅ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後 、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａ ａ）を含む６４２塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。 プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格を アガロースゲル上で精製した。ＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）精製 ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ に連結された。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質 転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００のＳ ａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）の存在に ついて選別した。プラスミドｐＣＭＶ−９はｐＪＯ２００のＣＫＳ遺伝子の末端 にｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含んでいた。ｐｐ６５（２９７−５１０ａ ａ）のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ一ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１− ２４８ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）」と称した。段階Ｆ：ｐＣＭＶ−２６：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の構築 プラスミドｐＣＭＶ−２６［ｐＪＯ２００のさらに別の誘導体］は、ｐＭＢ３ ８由来のｐｐ３８（ヌクレオチド３４９−１１１９）のアミノ酸１１７−３７３ をコードするｐｐＵＬ８０ａの領域からのｐｐ３８ＤＮＡのＰＣＲ増幅で得られ たＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＪ Ｏ２００中にクローニングすることによって構築した。 ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３４９で始まるセンスプラ イマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続く終止コドンを含むｐｐＵＬ８０ａのヌク レオチド１１１９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、ｐＭＢ３８ＤＮＡ を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢ ａｍＨＩで消化し、ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含む７７１塩基対フラグ メントをアガロースゲル上で精製した。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ３４）は一般的方法で単離した。プラスミド ｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消 化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１ ７−３７３ａａ）精製ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結された。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ− １Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製 し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入されたｐｐ３８（１１７− ３７３ａａ）の存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−２６はｐＪＯ２０ ０中のＣＫＳ遺伝子の末端にｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含んでいた。ｐ ｐ３８（１１７−３７３ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融 合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）」と 称した。 実施例６ ＣＫＳエピトープ埋込発現ベクターｐＥＥ１の構築 ＣＫＳエピトープ埋込発現ベクターは、ＣＫＳ蛋白質内にエピトープ含有組換 え蛋白質の埋込を可能にして、作製された。ｐＥＥ１と称するベクターは「ＣＫ Ｓ（１−１７１ａａ）−組換え蛋白質−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ） 」と称した。このｐＥＥ１ベクターはＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ ２００から出発し二段階で構築された。第一段階では、変異原オリゴヌクレオチ ドは、ＭｌｕＩ部位及びＳａｃＩ部位の両方を除くように、ｐＪＯ２００のＣＫ Ｓ遺伝子の５’末端付近に配置された一対の隣接ＭｌｕＩにクローン化された。 ｐＪＯ２００へのこの改変は、次の段階でＣＫＳ遺伝子中のさらに下流に導入さ れるべき唯一のＭｌｕＩクローニング部位の使用を可能にする。第二段階では、 プラスミドｐＣＭＶ−１ＡからのＤＮＡのフラグメントはこの改変ｐＪＯ２００ ベクターにクローン化され、このようにしてＣＫＳ遺伝子中へのＳｔｕＩ／Ｍｌ ｕＩフラグメントとして遺伝子の埋込を可能にした。段階Ａ：ｐＪＯ２００−ΔＭｌｕＩの構築 プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ［ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の誘導 体（図９Ａ）］は、変異原オリゴヌクレオチドを用いてｐＪＯ２００ＤＮＡ中の ヌクレオチド１６１−１７４（アミノ酸１１−１５）に配置された一対の隣接し たＭｌｕＩ部位及びＳａｌＩ部位を除去することによって構築された。本来のｐ ＪＯ２００ＤＮＡ配列の改変部位はヌクレオチド配列１５１−１８０ ５’−３ ’に含まれていた（図９Ｂ）。二つの標的化変異原ヌクレオチドｐＪＯ２００Ｄ ＮＡチミン− １６６及びｐＪＯ２００ＤＮＡアデニン−１６９は、二つのＭｌｕＩ部位及びＳ ａｌＩ部位と同様に、注目される。 プラスミドｐＪＯ２００をＭｌｕＩで消化し、エタノールで沈澱し、アルカリ ホスファターゼ緩衝液に再懸濁した。プラスミドｐＪＯ２００／ＭｌｕＩはつい で仔牛胞アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理され、自己連結を防ぐため に５’リン酸基を除去した。ＤＮＡはＣＩＡＰでの処理後、フェノール−クロロ ホルムで抽出され、エタノールで沈澱され、ＴＥ緩衝液に再懸濁された。ベクタ ー骨格はついでアガロースゲル上で精製した。 図９Ｃの変異原オリゴヌクレオチドはｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰへの 連結のために合成された。このオリゴヌクレオチドはその３’末端で自己相補的 であり、アニーリング段階が後に続く熱変性段階の後、二本鎖構造の形成を可能 にした。変異原オリゴヌクレオチドはＭｌｕＩで消化したｐＪＯ２００ＤＮＡへ の連結を可能にするＭｌｕＩ付着末端を含んでいた。このオリゴヌクレオチドの 配列は、本来のｐＪＯ２００ＤＮＡ配列とは異なり、ｐＪＯ２００ＤＮＡ Ｔ１ ６６及びｐＪＯ２００ＤＮＡ Ａ１６９残基が変異原オリゴヌクレオチド（図 ９Ｃ及びＤ、下線で注意したように）で逆転していた。このように、変異原オリ ゴヌクレオチドがｐＪＯ２００のＭｌｕＩ部位にクローン化されると、ＭｌｕＩ 部位及びＳａｌＩ部位の両方を破壊した。 合成変異原オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’ 末端でリン酸化された。反応混合物は２０分間６５℃まで加熱され、キナーゼを 不活性化した。室温まで冷却後、リン酸化オリゴヌクレオチドをｐＪＯ２００／ ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰと混合し、５分間６５℃まで加熱し、ついで室温まで徐々に 冷却して、それ自体へのリン酸化オリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にし た。連結反応緩衝液及びＴ４ＤＮＡリガーゼをついで加え、混合物は２０℃から ４℃まで温度が低下するように、一晩インキュベートした。連結反応混合物は翌 日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをそ の形質転換体から調製し、ＭｌｕＩ及びＳａｌＩ部位の欠失について選別した。 プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩはこれらの制限酵素部位を失って、単離され た。ＣＫＳ遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列分析で確認された。Ｍｌ ｕＩ及びＳａｌＩ部位の除去に加えて、変異原オリゴ ヌクレオチドは、Ｓｅｒ−ＴｈｒからＴｈｒ−Ｓｅｒまでのヌクレオチド１６６ −１７１でコードされたアミノ酸を変えた。プラスミドｐＪＯ２００ＤＮＡ配列 はそれによってプラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ ＤＮＡに改変され、図９Ｄ のヌクレオチド１５１−１８０ ５’−３’の部分配列を有した。段階Ｂ：ｐＥＥ１の構築 プラスミドｐＥＥ１［プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩの誘導体（図１０） ］は、ＣＫＳ遺伝子内に埋め込まれたＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む、プラスミ ドｐＣＭＶ−１ＡからのＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩを、ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩのＳ ｔｕＩ／ＢａｍＨＩ中にクローニングして構築された。ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ に存在するＣＫＳコーディング領域内のＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメ ントをプラスミドｐＣＭＶ−１ＡからのＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩフラグメントで置 換して、生じるプラスミドｐＥＥ１はＣＫＳ遺伝子内に埋め込まれたＨＣＭＶ− Ａ１Ｃ２Ｆ３を含んでいた。プラスミドｐＥＥ１はプラスミドｐＣＭＶ−１Ａと は異なり、ｐＥＥ１はＣＫＳ遺伝子の５’末端に存在する下流ＭｌｕＩ部位を含 まなかった。それゆえ、ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩによるｐＥＥ１の消化はＨＣＭＶ −Ａ１ Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントを放出し、ブラント／ＭｌｕＩ相容性付着末端ＤＮ ＡフラグメントとしてＣＫＳ遺伝子中に埋め込むための他の遺伝子を受容するこ とができる、アガロースゲル上で精製後のベクター骨格を提供する。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ及びｐＣＭＶ−１Ａ）は一 般的方法で単離された。プラスミドｐＣＭＶ−１ＡはＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩで 消化され、Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＣＫＳ遺伝子の３’末端を含む４６１塩基対フラグ メントはアガロースゲル上で精製した。プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩはＳ ｔｕＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した 。Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む４６１塩基対フラグメント及びｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ／ ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩベクター骨格は共に混合され、１６℃で一晩連結された。 連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した 。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩの４ ６１塩基対Ａ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。プラスミ ドｐＥＥ１はＡ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントを含み、ＣＫＳ遺伝子の５’末端 のＭｌｕＩ部位を含まなかった。ＣＫＳ遺伝子 の３’末端及びＡ１Ｃ２Ｆ３フラグメントのＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により 確認した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、ア ガロースゲル上でベクター骨格を精製して、他のＤＮＡフラグメントとの連結の 調製で完全にＡ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントを除去した。この精製ベクター骨 格は、図式的に「５’Ｘ−目的遺伝子−Ｙ３’」（ここでＸは平滑末端、Ｙは例 えばＭｌｕＩ又はＢｓｓＨＩＩのようなＭｌｕＩ相容性付着末端である）として 表示される、正しい読み枠のＣＫＳ遺伝子中に埋め込むためのＤＮＡフラグメン トを受容可能であった。プラスミドｐＥＥ１は、１９９５年５月１日にブダペス ト条約の規定により、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２（米国）に寄託され、受託番号 ＡＴＣＣ６９７９８が与えられた。 実施例７ ｐＥＥ１に基づくＣＫＳエピトープ埋込発現ベクターの構築 ＣＫＳ発現ベクターｐＥＥ１は一連の４種のＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ遺伝子融 合構築物の出発点として使用した。各構築物 のために、プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格 を精製した。ＰＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ骨格はその５’末端にＳｔｕＩ部位 を、その３’末端にＭｌｕＩ部位を有する、ＰＣＲによって生成したＣＭＶ遺伝 子フラグメントを受容できた。ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化後、ＰＣＲフラグメ ントはｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ骨格と同じ位相内にクローン化された。こ れらのベクターから発現したＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合蛋白質は「ＣＫＳ（１ −１７１ａａ）−ＣＭＶ−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と表示され 、ここでＴ及びＲはベクター中に導入された合成ＭｌｕＩ部位でコードされたス レオニン及びアルギニン残基である。段階Ａ：ｐＣＭＶ−２７：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳの構築 プラスミドｐＣＭＶ−２７［ｐＥＥ１の誘導体（図１１Ａ及びＢ）］は、ｐＣ ＭＶ−４由来のＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグ メントをｐＥＥ１にクローニングして構築された。プラスミドｐＣＭＶ−２７は １９９５年５月１日にブタペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣに寄託され、受 託番号６９７９７を与えられた。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−４）は一般的方法で単離さ れた。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格、Ｐ ＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩをアガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含 むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕ Ｉ部位を含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９で始まるアンチセンスプライ マーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣ Ｒ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０ を含む９０６塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製９０６塩 基対ＤＮＡフラグメントは１６℃で一晩ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結し た。連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換 した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ ｌｕＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０ＤＮＡフラグメントの存在につい て選別した。プラスミドｐＣＭＶ−２７はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに埋め 込まれたＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０のＤＮＡ配 列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認し た。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ａ １Ｃ２Ｆ３−Ｌ−Ｑ−Ｈ１０−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示され 、ここでＬ及びＱ、並びにＴ並びにＲは、それぞれ、ベクターに導入された合成 ＰｓｔＩ及びＭｌｕＩ部位でコードされたロイシン、グルタミン、スレオニン及 びアルギニン残基である。段階Ｂ：ｐＣＭＶ−２８：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳの 構築 プラスミドｐＣＭＶ−２８［ｐＥＥ１の別の誘導体］は、ｐＣＭＶ−９由来の ＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメン トをｐＥＥ１にクローニングして構築された。プラスミドｐＣＭＶ−２８は、１ ９９５年５月１日にブタペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣに寄託され、受託 番号６９７９９を与えられた。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−９）は一般的方法で単離さ れた。プラスミドｐＥＥ１はＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格はア ガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８ ８９で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８３の ヌクレオチド１５３０で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐ ＣＭＶ−９を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔ ｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含む６４２塩基 対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製６４２塩基対ＤＮＡフラグ メントは１６℃で一晩ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結された。連結反応混 合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換された。ミニプ レプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に 挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡフラグメントの存在について 選別した。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含んだプラスミドｐＣＭＶ−２８ はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に埋め込まれていた。ｐｐ６５（２９７− ５１０ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認 した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）− ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示 され、ここでＴ及びＲはベクターに導入された合成ＭｌｕＩ部位によってコード されたスレオニン及びアルギニン残基である。段階Ｃ：ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）− ＳＴＯＰ−ＣＫＳの構築 プラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ［ｐＥＥ１の更なる誘導体］は、ｐＣＭＶ −９由来のＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡ フラグメントをｐＥＥ１にクローニングして構築された。翻訳すると、プラスミ ドは以下のように、組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８の末端切断形を生じた。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−９）は一般的方法で単離さ れた。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格をア ガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８ ８９で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位が後に続く終止コドンを含む ｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０で始まるアンチセンスプライマーを合成し 、プラスミドｐＣＭＶ−９を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反 応混合物はＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を 含む６４２塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製６４２塩基 対ＤＮＡフラグメントは１６℃で一晩ｐＥＥ１ ／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結された。連結反応混合物を用いて翌日コンピテント ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から 調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に挿入されたｐｐ６５（２９７−５ １０ａａ）ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。ｐｐ６５（２９７−５ １０ａａ）を含んだプラスミドｐＣＭＶ−２８はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ 部位に埋め込まれた。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳ の隣接ＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫ Ｓ（１−１７１ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−Ｔ−Ｒ− ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示され、ここでＳＴＯＰは終止コドンであり、 Ｔ及びＲはベクターに導入された合成ＭｌｕＩ部位によってコードされたスレオ ニン及びアルギニン残基である。ｐｐ６５コーディング配列の末端の終止コドン の存在のために、ＣＫＳ蛋白質のＣ末端領域に対する残りのコーディング配列は 翻訳されず、この構築物からはＥ．ｃｏｌｉ中で発現されなかった。段階Ｄ：ｐＣＭＶ−２９：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＣＫＳの構 築 プラスミドｐＣＭＶ−２９［ｐＥＥ１の誘導体］は、ｐＣＭＶ−２６由来のＨ ＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメント をｐＥＥ１にクローニングして構築された。プラスミドｐＣＭＶ−２９は１９９ ５年５月１日にブタペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣに寄託され、受託番号 ＡＴＣＣ６９７９６が与えられた。 大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−２６）は一般的方法で単離 された。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格を アガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチ ド３４９で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８０ａの ヌクレオチド１１１９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐ ＣＭＶ−２６を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳ ｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含む７７１塩 基対フラグメントを１６℃で一晩ＰＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結した。連 結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。 ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ 部位に挿入 されたｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡフラグメントの存在について選別 した。ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含んだプラスミドｐＣＭＶ−２９はｐ ＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に埋め込まれた。ｐｐ３８（１１７−３７３ａ ａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定によって確認し た。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ ｐ３８（１１７−３７３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示さ れ、ここでＴおよびＲはベクターに導入された合成ＭｌｕＩ部位でコードされた スレオニン及びアルギニン残基である。 実施例８ 組換えＣＭＶ抗原の生成と特性化 プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ、ｐＣＭＶ−３Ａ、ｐＣＭＶ−４、ｐＣＭＶ−９、 ｐＣＭＶ−２６、ｐＣＭＶ−２７、ｐＣＭＶ−２８、ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ、 及びｐＣＭＶ−２９はコンピテントＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株ＸＬ−１Ｂｌｕｅ中 に別々に形質転換された。個々のＨＣＭＶ蛋白質を発現する細菌クローンは１０ ０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むスーパーブロスＩＩ培地中で３７℃で一晩増 殖された。一晩培養物は同じ培地で １：１００に希釈され、６００ｎｍで測定して、培養物が光学密度０．７〜０． ９に達するまで、通気して３７℃で増殖された。誘導前試料は培養物から採取さ れ、１３，０００ｘｇで１分間遠心され、粗細菌溶菌液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥロ ーディング緩衝液に細胞ペレットを再懸濁し、５分間煮沸して調製した。 組換えＨＣＭＶ抗原の合成は、光学密度が０．７〜０．９に達した後、１ｍＭ の最終濃度までのＩＰＴＧの添加で個々の培養物に誘導された。試料はＩＰＴＧ 誘導後４時間培養物から採取され、試料は１３，０００ｘｇで１分間遠心され、 粗細菌溶菌液は、細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に再懸 濁し、５分間煮沸して、調製された。細胞は４℃で１２，０００ｘｇで１５分間 で集められ、次の処理まで−８０℃で凍結された。 誘導前及び誘導後試料は第一（Ｄａｉｉｃｈｉ）プレキャスト４〜２０％勾配 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードされた。泳動後、ゲルは５０％メタノール及び１ ０％酢酸中０．１２５％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TMブルー色素の溶液中で１時間染色 され、ついで透明な背景を得るまで、７％酢酸及び５％メタノールの溶液中で脱 色された。蛋白質分子量標準はＥ．ｃｏｌｉ中で発 現した組換えＨＣＭＶ蛋白質の分子量決定のためにゲル上で泳動された。段階Ａ：組換え抗体ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−１Ａ）の特性 化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−１Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ）の発現は、 ｐＣＭＶ−１Ａで形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた 誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動することで評価さ れた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−１Ａ蛋白質が全胞 蛋白質の１５％からなることを示した。組換え蛋白質は４４，０００の見かけの 分子量を有し、３６，０００の計算分子量より大きかった。段階Ｂ：組換え抗原ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３（ｒｐＣＭＶ−３Ａ）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−３Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３）の発現はｐＣＭＶ− ３Ａで形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶離液から得られた誘導前及び 誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ゲルを染色 したＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMの分析は、ｒｐＣＭＶ−３Ａ蛋白質が全細 胞蛋白質の１５％からなることを示した。組換え蛋白質は４２，０００の見かけ の分子量を有し、３４，０００の計算分子量より大きかった。段階Ｃ：組換え抗原ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０（ｒｐＣＭＶ−４）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−４（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０）の発現はｐＣ ＭＶ−４で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前 及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動することで評価された。 ゲルを染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMの分析はｒｐＣＭＶ−４蛋白質が全細胞蛋 白質の１５％からなることを示した。組換え蛋白質は７０，０００の見かけの分 子量を有し、５８，０００の計算分子量より大きかった。段階Ｄ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）（ｒｐＣＭＶ−９ ）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−９（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ））の 発現はｐＣＭＶ−９で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得ら れた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価され た。ゲル を染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMの分析は、ｒｐＣＭＶ−９蛋白質がともに計算 分子量５１，０００より大きい分子量６０，０００及び５６，０００の２種の蛋 白質の間に等しく分布し全細胞蛋白質の１０％からなることを示した。段階Ｅ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）（ｒｐＣＭＶ−２ ６）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２６（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）） の発現は、ｐＣＭＶ−２６で形質転換されたＸｌ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液か ら得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評 価された。ゲルを染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMの分析はｒｐＣＭＶ蛋白質が全 細胞蛋白質の１０％からなることを示した。組換え蛋白質は６５，０００の見か けの分子量を有し、５４，０００の計算分子量より大きかった。段階Ｆ：組換え抗原ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２７ ）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２７（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ）の 発現はｐＣＭＶ−２７で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得 られた誘導前及び誘導後試 料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TM 染色ゲルの分析はｒｐＣＭＶ−２７蛋白質が全細胞蛋白質の１０％からなるこ とを示した。組換え蛋白質は７２，０００の見かけの分子量を有し、６０，００ ０の計算分子量より大きかった。段階Ｇ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ（ｒｐＣ ＭＶ−２８）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）− ＣＫＳ）の発現は、ｐＣＭＶ−２８で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗 溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳 動して評価された。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−２８ 蛋白質が全細胞蛋白質の５％からなることを示した。組換え蛋白質は５７，００ ０の見かけの分子量を有し、５３，０００の計算分子量より大きかった。段階Ｈ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫ Ｓ−（ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫＳ）の発現は、ｐＣ ＭＶ−２８ＳＴＯＰで形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得ら れた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価され た。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ蛋白質 が全細胞蛋白質の５％からなることを示した。組換え蛋白質は４７，０００の見 かけの分子量を有し、４２，０００の計算分子量より大きかった。段階Ｉ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳ（ｒｐＣ ＭＶ−２９）の特性化 組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２９（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）− ＣＫＳ）の発現はｐＣＭＶ−２９で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶 菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動 して評価された。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−２９蛋 白質が全細胞蛋白質の５％からなることを示した。組換え蛋白質は６７，０００ の見かけの分子量を有し、５５，０００の計算分子量より大きかった。 実施例９ 埋込及び非埋込ＣＫＳ発現の比較 粗溶菌液及び精製蛋白質はＣＫＳ発現の埋込様式及びＣＫＳ発現の非埋込様式 で発現した各組換え抗原に対してＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製された。これは組換 え抗原のＣＫＳ発現の埋込様式をＣＫＳ発現の非埋込様式と直接比較するために 行われた。これらの粗溶菌液及び精製蛋白質は引き続き下記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 及びウエスタンブロットで分析された。Ｅ．ｃｏｌｉからの粗溶菌液は実施例８ に記載されたように調製された。 Ｅ．ｃｏｌｉからの精製蛋白質は次の一般的方法で調製された。実施例７に記 載の細胞ペレットは融解され、追加の１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、２５ｍｇ／ｍ ＬのＤＮアーゼＩ、２ｍｇ／ｍＬのアプロチニンを含んだＴＥＭ溶菌緩衝液中で 均質化された。均質化後、ＰＭＳＦを０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、細 胞を室温又は４℃で３０分間溶菌した。溶菌後細胞溶菌液は４℃で３０分間２５ ，０００ｘｇで遠心された。可溶性Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質及び可溶性組換え抗原は 上澄みに見いだされ、不溶性包接体を形成した組換え抗原はペレット中に見いだ された。可溶性Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質は、引き続いて追加のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ００を含んだＰＴＥ緩衝液で一回、追加の１％デオキシコール酸ナトリウムを含 んだＰＴＥ緩衝液で一 回、及び追加の０．５Ｍ塩化ナトリウムを含んだＰＴＥ緩衝液で一回ペレットを 洗浄してペレットから除去された。組換え抗原を含む不溶性ペレットはついで追 加の８Ｍ尿素を含むＰＴＥ緩衝液に溶解され、４℃で保存された。 粗溶菌液及び精製蛋白質は実施例８に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、 下記のようにウエスタンブロットで分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動 した後、蛋白質は、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ^TM（Inte grated Separation Systems）を用いてニトロセルロース膜に移され、ニトロセ ルロースは膜ブロッキング溶液を用いて一晩ブロックされた。翌日膜はＲｕｂａ ｚｙｍｅ試料希釈緩衝液中に希釈された適当なマウスモノクロナール抗体と室温 で２時間インキュベートされた。ＴＢＳ及びＴＢＳＴで膜を洗浄後、膜はついで ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと室温で１時間インキュベートされた 。ＴＢＳ及びＴＢＳＴで別の洗浄段階後、ブロットは４−クロロ−１−ナフトー ル／過酸化水素で可視化された。段階Ａ：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−２８） とＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）（ＣＭＶ−９）の発現の比較 実施例８Ｄ及び８ＧでＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル による粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−２８（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９ ７−５１０ａａ）−ＣＫＳ）の発現はＩＰＴＧによる誘導で分子量５７，０００ ダルトンの単一主要蛋白質バンドを生じたが、プラスミドｐＣＭＶ−９（ＣＫＳ −ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ））は６０，０００及び５６，０００ダルトン に二重バンドを生じた。これらの構築で誘導後に生じた蛋白質生成物をさらに理 解するために、ウエスタンブロット分析がこれらの粗溶菌液について、及びプラ スミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＳＴ ＯＰ−ＣＫＳ）から得られた粗溶菌液について行なった（実施例８Ｈ参照）。こ の構築物における終止コドンの存在により、ＣＫＳの最後の９０アミノ酸を含ま ない末端切断型蛋白質の形成が生じた。 これら３種の構築物からの溶菌液は、ＣＫＳに対するモノクロナール抗体及び ｐｐ６５に対するモノクロナール抗体で試験された。組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ− ２８ＳＴＯＰ、ｒｐＣＭＶ−２８、及びｒｐＣＭＶ−９のウエスタンブロット分 析の結果は下の表１に示される。Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ −２８ＳＴＯＰ、ｐＣＭＶ−２８、及びｐＣＭＶ−９の発現は期待した完全長の 蛋白質の形成を生じた。さらに、蛋白質末端切断生成物の範囲がＣＫＳ及びｐｐ ６５のモノクロナール抗体の両方に免疫反応的に観察された。末端切断生成物の サイズと数は各蛋白質で変化した。 Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰの発現は期待した完全長 の蛋白質（４７ｋＤにおけるｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ）プラスｐｐ６５モノク ロナール抗体で検出可能な末端切断生成物の範囲の生成を生じた。ＣＫＳモノク ロナー ル抗体で検出される蛋白質生成物はなかった。この結果はＣＫＳモノクロナール 抗体で認識されるエピトープが、アミノ酸１７１〜２６０がｐｐ６５遺伝子の下 流の終止コドンの存在のためにこの蛋白質に存在しないので、ＣＫＳ蛋白質のＣ 末端部分に位置したことを示した。 Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２８の埋込発現は、ＣＫＳモノクロナ ール抗体及びｐｐ６５モノクロナール抗体の両方で検出された、期待した完全な 長さの蛋白質（５７ｋＤ）の生成を生じた。しかし、プラスミドｐＣＭＶ−２８ （４７から４１ｋＤまで）の末端切断生成物はｐｐ６５モノクロナール抗体での み検出された。これは、これらの末端切断生成物がＣＫＳモノクロナール抗体と のエピトープ反応性を失った事実のためであった。 プラスミドｐＣＭＶ−２８からの完全な長さの蛋白質（５７ｋＤで）と、その 全てがｐｐ６５モノクロナール抗体と免疫反応性であるｐＣＭＶ−２８（４７か ら４１ｋＤまで）の末端切断生成物の間に１０ｋＤのギャップが存在することが 観察された。ｐｐ６５モノクロナール抗体に免疫反応性である、プラスミドｐＣ ＭＶ−２８ＳＴＯＰ及びｐＣＭＶ−２８で生じる末端 切断生成物が同じ大きさであることに注目することは重要である。それゆえ、Ｅ ．ｃｏｌｉ中の埋込ＣＫＳ発現中に、（ｉ）完全な長さの蛋白質生成物が作られ るか、又は（ｉｉ）恐らく埋め込まれた遺伝子の翻訳中のリボソーム休止のため に、ＣＫＳのＣ末端（アミノ酸１７１〜２６０）を欠いた１０ｋＤ又はそれより 小さい末端切断（truncaition）生成物が作られた。 理論に拘束されるつもりはないがＥ．ｃｏｌｉ中の埋込融合遺伝子の翻訳中に 二つのことの一つが起こったと思われた。ＣＫＳ遺伝子内に埋め込まれた遺伝子 の翻訳中にリボソームが立ち往生して、蛋白質末端切断生成物を生じたか、又は リボソームが埋込遺伝子をうまく翻訳してＣＫＳ遺伝子の残部によって続けたか である。これは、両方のモノクロナール抗体で検出されたように、完全な長さの 蛋白質（５９ｋＤ）と最大末端切断生成物（５５ｋＤ）の間に１０ｋＤのギャッ プが存在しない、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−９の非埋込発現と対照 的である。 これらの結果は、非埋込ＣＫＳ発現を超える埋込ＣＫＳ発現の二つの長所を示 す。第一に、埋込ＣＫＳ発現は混入する末端切断生成物のサイズを１０ｋＤだけ シフトさせ、したがって標 準クロマトグラフ法を使用するときの末端切断生成物からの完全長蛋白質のクロ マトグラフィー分離を改善する。第二に、ＣＫＳのＣ末端に対するＣＫＳモノク ロナール抗体の使用、及び精製蛋白質のサイズが、埋込エピトープが無傷である 埋込ＣＫＳ発現で生じた精製蛋白質のウエスタンブロットデータから証明するた めに使用できた。この埋込ＣＫＳの末端におけるＣＫＳアミノ酸配列（アミノ酸 １７１〜２６０）はＣＫＳモノクロナール抗体を用いるウエスタンブロットで可 視化できる免疫学的「タグ」として役立つ蛋白質を発現した。その存在は埋め込 みエピトープが精製蛋白質中で無傷であることを保証した。このような蛋白質の Ｃ末端の何らかの欠陥は免疫学的に無関係なＣＫＳ部分に制限されるだろう。段階Ｂ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−２７）とＣＫＳ− Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０（ｐＣＭＶ−４）の発現の比較 実施例８Ｃ及び８ＦでＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル による粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−２７（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３− Ｈ１０−ＣＫＳ）及びｐＣＭＶ−４（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０）の発現は 、 ＩＰＴＧによる誘導で７０，０００〜７２，０００の分子量の単一の主要蛋白質 バンドを生じた。 ウエスタンブロット分析は蛋白質生成物をさらに特性化するために、Ｅ．ｃｏ ｌｉ 中のこれらの構築物の発現から得られた粗溶菌液について行われた。これら 二つの構築物からの溶菌液はＣＫＳに対するモノクロナール抗体及びＨ１０に対 するモノクロナール抗体を用いて試験された。この分析の結果は下の表２に示さ れる。 表２に見られるように、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２７及びｐＣ ＭＶ−４蛋白質の発現により、ＣＫＳ及びＨ１０モノクロナール抗体の両方に免 疫反応性である、期待した 完全長の蛋白質プラスある範囲の蛋白質末端切断生成物の形成を生じた。 Ｅ．ｃｏｌｉ中のＡ１Ｃ２Ｆ３の埋込ＣＫＳ発現は、完全な長さの蛋白質（６ ８ｋＤ）及びＨ１０モノクロナール抗体と免疫反応性のある範囲の末端切断生成 物の生成を生じた。埋込ＣＫＳ発現から生じた混入する末端切断生成物は完全長 の蛋白質から大きさで１０ｋＤだけ離れていた。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＡ １Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０の非埋込ＣＫＳ発現により、完全な長さの蛋白質（６８ｋＤ ）及びＨ１０モノクロナール抗体と免疫反応性のある範囲の末端切断生成物（６ ６から５６ｋＤまで）の生成を生じた。非埋込ＣＫＳ発現から生じた混入する蛋 白質末端切断生成物は完全長の蛋白質からうまくサイズ分離されなかった。 埋込及び非埋込ＣＫＳ発現から生じた完全長の蛋白質及び非埋込ＣＫＳ発現か ら生じた蛋白質末端切断生成物はＣＫＳモノクロナール抗体と免疫反応性であっ た。埋込ＣＫＳ発現から生じた混入する蛋白質生成物は、ＣＫＳモノクロナール 抗体がＣＫＳのＣ末端に特異的であるため、ＣＫＳモノクロナール抗体と免疫反 応性でなかった。 埋込ＣＫＳ発現は混入する末端切断生成物の大きさを１０ｋＤだけシフトし、 したがって標準クロマトグラフィー法を用いるときの末端切断生成物からの完全 長蛋白質の分離を改善した。この埋込ＣＫＳ発現蛋白質の末端におけるＣＫＳア ミノ酸配列（アミノ酸１７１〜２６０）は、抗ＣＫＳモノクロナール抗体を用い るウエスタンブロットで可視化可能な免疫学的タグとしても役立ち、埋込エピト ープが精製蛋白質中で無傷であることを示した。段階Ｃ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−１Ａ）とＣＫＳ−Ａ１Ｃ２ Ｆ３（ｐＣＭＶ−３Ａ）の発現の比較 実施例８Ａ及び８ＢでＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル による粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３− ＣＫＳ）及びｐＣＭＶ３Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３）の発現が、ＩＰＴＧによる 誘導で４２，０００〜４４，０００ダルトンの分子量の単一主要蛋白質バンドを 生じさせたことを示した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ^TM染色ゲルの分析はｒｐＣＭＶ− １Ａ及びｒｐＣＭＶ−３Ａ蛋白質がそれぞれ全細胞蛋白質の１５％からなること を示した。 プラスミドｐＣＭＶ−３Ａの非埋込ＣＫＳ発現で得られた、 ｒｐＣＭＶ−３Ａ蛋白質は、細胞溶菌液の遠心後得られた上澄みに完全に存在し た。この蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたようにほぼ１５％の純度であっ た。対照的に、プラスミドｐＣＭＶ−１Ａの埋込ＣＫＳ発現で得られたｒｐＣＭ Ｖ−１Ａ蛋白質は細胞溶菌液の遠心後に得られたペレット内に完全に存在した。 プラスミドｐＣＭＶ−１Ａの発現で得られた包接体（inclusion）は上記のよう に洗浄で精製された。包接体は８Ｍ尿素に可溶化され、ｒｐＣＭＶ−３ＡはＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥで８５〜９０％純度であると決定された。ｒｐＣＭＶ−１Ａの埋込 ＣＫＳ発現は、非埋込ＣＫＳ発現に優る好ましいＣＫＳ発現様式であった。ｒｐ ＣＭＶ−１Ａの精製は埋込ＣＫＳ発現で生じた蛋白質の溶解度の変化のために非 常に簡素化された。 それ故、Ａ１Ｃ２Ｆ３エピトープクラスター（プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ中） の非埋込発現は可溶性組換え抗原を生じさせたが、Ａ１Ｃ２Ｆ３（プラスミドｐ ＣＭＶ−１Ａ中）の埋込ＣＫＳ発現は不溶性組換え抗原を生じさせた。これらの 結果は、非埋込ＣＫＳ発現に優る本発明の埋込ＣＫＳ発現法の別の可能な利点を 示し、組換え蛋白質の精製が、埋込ＣＫＳ発現で精製させる場合、蛋白質の溶解 性の変化のために非常に簡素化され 得る。段階Ｄ：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−２９） とＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）（ＣＭＶ２６）との発現の比較 実施例７Ｅ及び７１でＣｏｏｍａｓｓｉｅ^TMで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ ルによる粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−２９（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１ １７−３７３ａａ）−ＣＫＳ）及びｐＣＭＶ−２６（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７ −３７３ａａ））の発現により、ＩＰＴＧによる誘導で６５，０００〜６７，０ ００ダルトンの分子量の単一の主要蛋白質バンドが生じたことを示した。Ｃｏｏ ｍａｓｓｉｅ^TM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ２９およびｒｐＣＭＶ−２６の蛋 白質がそれぞれ全細胞蛋白質の５％及び１０％からなることを示した。 プラスミドｐＣＭＶ−２６の非埋込ＣＫＳ発現で得られたｒｐＣＭＶ−２６蛋 白質は細胞溶菌液の遠心後得られた上澄み内に完全に存在した。この蛋白質はＳ ＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたように約１０％の純度であった。対照的に、ｐＣＭ Ｖ−２９の埋込ＣＫＳ発現で得られたｒｐＣＭＶ−２９蛋白質は溶菌液の遠心後 得られたペレット内に完全に存在した。プラスミドｐ ＣＭＶ−２９の発現で得られた包接体は上述のように洗浄で精製された。包接体 は８Ｍ尿素に溶解され、ｒｐＣＭＶ−２９はＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５〜９０％の 純度であると決定された。ここで、ｐｐ３８（プラスミドｐＣＭＶ−２６中）の アミノ酸１１７〜３７３の非埋込ＣＫＳ発現は可溶性組換え抗原を生じさせたが 、その蛋白質配列（プラスミドｐＣＭＶ−２９中）の埋込ＣＫＳ発現は不溶性組 換え抗原を生じさせた。 これらの結果は、組換え蛋白質の精製が、埋込ＣＫＳ発現で生成させる場合、 蛋白質の溶解性の変化のために非常に簡素化できることを再び示した。 前述の詳細な説明及び付随の実施例は単に説明であって、添付の請求の範囲及 びそれらの均等物によってのみ規定される本発明の範囲を制限するものとして取 られるべきではない。開示された実施態様に対する種々の変更及び変形は当業者 には明白であろう。例えば、ＣＫＳ担体蛋白質内の部位の任意の数の部位が異種 蛋白質の埋込発現を可能にすることが予想される。さらに、ＣＫＳ又は他の担体 蛋白質の異なる位置の複数の部位が種々の異種蛋白質の同時埋込発現に使用でき ると考えられる。エピトープが担体蛋白質の異なる部位に埋め込まれるこのよう な「セグメント化発現（segmented expression）」は発現レベルを改善すること を可能にするだろう。異種蛋白質のセグメント化発現は、融合蛋白質のほぼ同じ 領域に結合しようとする免疫グロブリンの間の立体障害を最少にすることが期待 されるだろう。発明のさらに別の変形として、ポリリンカー配列が種々の異種蛋 白質をコードするＤＮＡの挿入を容易にするために、担体蛋白質遺伝子に挿入さ れるだろう。さらに、上記実施例のプラスミドの構築がある型の連結（平滑／付 着）を示すが、他の型の連結（平滑／平滑又は付着／付着）も使用可能であろう 。このような変化及び変形は、制限なしで発現方法、確認方法、融合蛋白質、Ｄ ＮＡ構築物、プラスミドベクター、及び本発明の形質転換宿主細胞、並びにそれ らの使用に関するものを含んで、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく行 ない得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）（１）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子 要素に作動可能に結合した調節領域と、 （２）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び 第二の要素が連続し同じ読み枠にあるように第一要素内に埋め込まれている前記 第二要素と を有するＤＮＡベクターを準備し、 （ｂ）前記ＤＮＡベクターで前記宿主細胞を形質転換し、及び （ｃ）前記異種蛋白質と前記担体蛋白質との融合蛋白質を発現し、ここで前 記異種蛋白質はそのＮ末端で前記担体蛋白質の第一ドメインに、またそのＣ末端 で前記担体蛋白質の第二ドメインに結合される、工程を含む、原核宿主細胞中で 異種蛋白質を発現する方法。 ２．異種蛋白質が細菌蛋白質である請求項１に記載の方法。 ３．異種蛋白質がウイルス蛋白質である請求項１に記載の方法。 ４．調節領域が原核生物プロモーター及び原核生物リボソーム結合部位を含む、 請求項１に記載の方法。 ５．調節領域がｌａｃオペロンを含む、請求項４に記載の方法。 ６．担体蛋白質がＣＫＳ蛋白質である請求項１に記載の方法。 ７．異種蛋白質がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の蛋白質である請求項 ６に記載の方法。 ８．異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２、ｐｐ６５及びｐｐ１５０ からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の部分を含む、請求項７に記載の方法。 ９．異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８からなる群から選ばれたウイルス蛋白 質の免疫原性部分を含む、請求項７に記載の方法。 １０．異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐ６５からなる群から選ばれたウイルス蛋白 質の免疫原部分を含む、請求項７に記載の方法。 １１．異種蛋白質がＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２からなる群か ら選ばれたエピトープの免疫原性部分を含む、請求項７に記載の方法。 １２．担体蛋白質の第一ドメインがＣＫＳのアミノ酸１〜１７１の部分を含み、 担体蛋白質の第二ドメインがＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０の部分を含む、請 求項６に記載の方法。 １３．請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記 載の方法により発現された異種蛋白質。 １４．請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２に記載 の方法による異種蛋白質を含む融合蛋白質。 １５．配列ＣＫＳ^*−ＣＭＶ^*−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＣＫＳ^**、ここで、 （ａ）ＣＫＳ^*はＣＫＳのアミノ酸１〜１７１の部分であり、 （ｂ）ＣＭＶ^*はＨＣＭＶ蛋白質の部分であり、 （ｃ）ＣＫＳ^**はＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０の部分である、 を有する請求項１４に記載の融合蛋白質。 １６．ＣＭＶ^*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２、ｐｐ６５及びｐｐ１５０ の部分からなる群から選ばれる請求項１５に記載の融合蛋白質。 １７．ＣＭＶ^*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８からなる群から選ばれたウイルス蛋白 質の免疫原性部分である請求項１５に記載の融合蛋白質。 １８．ＣＭＶ^*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ６５からなる群から選ば れたウイルス蛋白質の免疫原性部分である請求項１５に記載の融合蛋白質。 １９．ＣＭＶ^*がＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２からなる群から 選ばれたエピトープの免疫原性部分である請求項１５に記載の融合蛋白質。 ２０．ＣＭＶ^*が、 （ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈ１０； （ｂ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）； （ｃ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ、ここでＳＴＯＰは終 止コドンである；及び （ｄ）ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ） からなる群から選ばれる請求項１５に記載の融合蛋白質。 ２１．（ａ）請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ に記載の方法による融合蛋白質として異種蛋白質を発現し； （ｂ）前記融合蛋白質を単離し；及び （ｃ）担体蛋白質の第二ドメインの部分の存在を検出する手段に前記融合 蛋白質を露呈する、段階を含む、異種蛋白質の完全発現を確認する方法。 ２２．検出手段が、担体蛋白質の第二ドメインに含まれるエピトープと免疫反応 性である免疫グロブリンを含む、請求項２１に記載の方法。 ２３．確認方法の段階（ｂ）及び（ｃ）がウエスタンブロッティングを用いて行 われる請求項２１に記載の方法。 ２４．（ａ）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコード化する第一の遺伝子要 素に作動可能に結合した調節領域、及び （ｂ）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二 の要素が連続し同じ読み枠内にあるように第一要素内に埋め込まれている前記第 二要素 を含む、プラスミドベクターへの挿入のためのＤＮＡ構築物。 ２５．異種蛋白質が細菌蛋白質である請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。 ２６．異種蛋白質がウイルス蛋白質である請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。 ２７．調節領域が原核生物プロモーター及び原核生物リボソーム結合部位を含む 、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。 ２８．調節領域がｌａｃオペロンを含む請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。 ２９．担体蛋白質がＣＫＳ蛋白質である請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。 ３０．異種蛋白質がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）蛋白質である請求項 ２９に記載のＤＮＡ構築物。 ３１．異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２、ｐｐ６５及びｐｐ１５ ０からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の部分を含む請求項３０に記載のＤＮ Ａ構築物。 ３２．異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８からなる群から選ばれたウイルス蛋 白質の免疫原性部分を含む請求項３０に記載のＤＮＡ構築物。 ３３．異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ６５からなるグループから選ばれたウイ ルス蛋白質の免疫原性部分を含む請求項３０によるＤＮＡ構築物。 ３４．異種蛋白質がＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２からなる群か ら選ばれたエピトープの免疫原性部分を含む請求項３０に記載のＤＮＡ構築物。 ３５．担体蛋白質の第一ドメインがＣＫＳのアミノ酸１〜１７１の部分を含み、 担体蛋白質の第二ドメインがＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０の部分を含む請求 項２９に記載のＤＮＡ構築物。 ３６．請求項２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、 ３４または３５に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクター。 ３７．（ａ）ｐＣＭＶ−２７； （ｂ）ｐＣＭＶ−２８； （ｃ）ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ；及び （ｄ）ｐＣＭＶ−２９ からなる群から選ばれた請求項３６に記載のプラスミドベクター。 ３８．請求項３６に記載のプラスミドベクターで形質転換された宿主細胞。 ３９．請求項３７に記載のプラスミドベクターで形質転換された宿主細胞。