JP2005507239A - 分泌タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明はヒトの分泌タンパク質(SECP)、およびSECPを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、SECPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害の診断・治療・予防に関する。本発明は更に、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の輸送および分泌は、細胞機能のために必須である。タンパク質の輸送は、輸送または分泌されるタンパク質のアミノ末端に存在するシグナルペプチドによって媒介される。シグナルペプチドは、約１０から２０の疎水性アミノ酸群からなり、新生タンパク質をリボソームから小胞体（ER）のような特定の膜で囲まれた区画まで導く。ERを標的とするタンパク質には、分泌経路を進むものとER、ゴルジ体若しくはリソソームなど、分泌細胞器官に残るものがある。分泌経路を進むタンパク質は、細胞外空間へ分泌されるか、または原形質膜内に残る。原形質膜内に保持されるタンパク質は１つ以上の膜貫通ドメインを有し、その各々が約20の疎水性アミノ酸残基からなる。分泌タンパク質は、通常、不活性の前駆体として合成され、分泌経路を移動する際に翻訳後プロセシング現象によって活性化される。そのような現象の例として、グリコシル化、タンパク質分解、およびシグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの除去が挙げられる。タンパク質の運搬の間に起こり得るその他のイベントの例として、新生タンパク質のシャペロン依存アンフォールディングおよびフォールディング、および受容体若しくは細孔複合体とタンパク質の相互作用が挙げられる。アミノ末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の例は以下に述べるが、これらには細胞間シグナル伝達において重要な役割を有するタンパク質が含まれる。そのようなタンパク質の例として、膜貫通受容体および細胞表面マーカー、細胞外基質分子、サイトカイン、ホルモン、成長因子および分化因子、酵素、ニューロペプチド、血管介在物質（vasomediators）、細胞表面マーカー、および抗原認識分子がある（Alberts, B.他（1994）Molecular Biology of The Cell, Garland Publishing, New York, NY, 557-560,582, 582-592ページの概説を参照）。
【０００３】
細胞表面マーカーの例としては、免疫系の白血球細胞上で同定される細胞表面抗原がある。これらの抗原を同定するには、系統的な、モノクローナル抗体（mAb）ベースの「ショットガン（shot gun）」技術が利用される。これらの技術によって、数百種のmAbが、未知の細胞表面白血球抗原類に対して産生されている。それらの抗原は「分化のクラスター群」へとグループ分けされている。分類は、多様な分化白血球細胞型と未分化白血球細胞型とで共通の、免疫細胞化学的な局在パターンに基づく。或るクラスター内の抗原群は或る単一の細胞表面タンパク質を同定すると仮定され、「分化クラスター」すなわち「CD（cluster of differentiation）」名が指定されている。CD抗原類によって同定されるタンパク質類をコードするいくつかの遺伝子が、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、確証されている。CD抗原類の特徴は、膜貫通タンパク質であることと、細胞表面タンパク質であって脂肪酸含有糖脂質、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）への共有結合性接着を介して原形質膜に固着されていることである（Barclay, A. N.他(1995) The Leucocyte Antigen Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, 17-20ページの概説を参照）。
【０００４】
基質タンパク質（MP）は膜貫通タンパク質と細胞外タンパク質であり、組織の形成、成長、再形成、および維持、並びに、炎症反応の重要な介在物質および制御因子として機能する。MPの発現および均衡は、先天的疾患、後成的疾患、若しくは感染性疾患の結果として生じる生化学的変化によって乱されることがある。また、MPは、免疫応答における白血球の遊走、増殖、分化、および活性化に影響を与える。MPは、コラーゲン様ドメイン、EGF様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、およびフィブロネクチン様ドメインを含む１つ以上のドメインの存在によってしばしば特徴づけられる。加えて、MPは重度にグリコシル化されることがある。また、接着相互作用の役割を果たすことのあるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）トリペプチドモチーフを含むことがある。MPの例としては、細胞外タンパク質として、フィブロネクチン、コラーゲン、ガレクチン（galectin）、ビトロネクチンおよびそのタンパク質分解誘導体ソマトメジンBがあり、また細胞接着受容体として、細胞接着分子（CAM）、カドヘリン、およびインテグリンがある（概説に関しては、Ayad, S. 他（1994）The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, 2-16ページ; Ruoslahti, E.（1997）Kidney Int. 51: 1413-1417; Sjaastad, M. D. および Nelson, W. J.（1997）BioEssays 19:47-55を参照）。
【０００５】
ムチンは、非常にグリコシル化された糖タンパクで、粘液ゲルの主要な構造成分である。ムチンの生理学的機能は、細胞保護、機械的保護、分泌液の粘性維持、および細胞認識である。ＭＵＣ６はヒトの胃ムチンであり、胆嚢、膵臓、精小胞、および女性の生殖管にも見つけられる（Toribara, N.W. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:16398-16403）。ＭＵＣ６遺伝子は、ヒトの11番染色体にマップされている（Toribara, N.W. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:5879-5885）。ヘモムチンは新規なショウジョウバエ表面ムチンであり、抗菌エフェクター分子の誘導に関与し得る（Theopold, U. 他（1996）J. Biol. Chem. 217:12708-12715）。
【０００６】
タフテリン類（tuftelin）は、これまでに同定された、異なる４つのエナメル基質タンパク質の１つである。他の３つの既知のエナメル基質タンパク質は、アメロゲニン、エナメリンおよびアメロブラスチンである。これらの成分タンパク質群からのエナメル細胞外基質のアセンブリは、無機質置換を受けるのに適格な基質の産生において重要であると考えられている（Paine C.T.他（1998）Connect Tissue Res.38:257-267）。タフテリンmRNAは非ミネラル化歯原性腫瘍であるヒトエナメル上皮腫において発現されることが知られている(Deutsch D. 他(1998) Connect Tissue Res. 39:177-184)。
【０００７】
オルファクトメジン（olfactomedin）関連タンパク質群は、保存されたＣ末端モチーフを有する、細胞外基質の分泌性糖タンパク質である。これらは、多様な組織に、また、線虫からヒトにいたる広範囲の種にわたって発現される。オルファクトメジン関連タンパク質群は、ヒトにおいて少なくとも５つのファミリーメンバーを持つ遺伝子ファミリーを構成する。この５つのうちの一つのTIGR/ミオシリン(myocilin)タンパク質は目に発現され、緑内障の病原に関連している(Kulkarni, N.H. 他 (2000) Genet. Res. 76:41-50)。Yokoyama 他 (1996) による研究では、AMYと呼ばれる135アミノ酸のタンパク質は、神経芽細胞腫細胞系ｃDNAライブラリのラット神経細胞のオルファクトメジン関連ER局在性タンパク質に９６％の配列同一性を有することが発見され、これはAMYの神経組織における役割が重要であることを示している(Yokoyama, M. 他, (1996) DNA Res. 3:311-320)。ラット脳のcDNAライブラリから単離された神経細胞特異的オルファクトメジン関連糖タンパク質は、オルファクトメジンとの強い配列類似性を示す。この類似性は神経細胞と神経分泌細胞におけるこれらの糖タンパク質の基質関連性機能があることを示唆している(Danielson, P.E. 他 (1994) J. Neurosci. Res. 38:468-478)。
【０００８】
Mac-2 結合タンパク質は90キロダルトンの血清タンパク質(90K)であり、ヒト乳癌細胞系SK-BR-3およびヒト母乳の両方から単離された別の分泌性糖タンパク質である。これは、ヒトマクロファージ関連レクチンであるMac-2に特異的に結合する。成熟タンパク質の構造については、その長さが567アミノ酸で、18アミノ酸リーダーが、その前に付いている。16のシステイン群と、７つの潜在的Ｎ連結グリコシル化部位とがある。最初の106アミノ酸はマクロファージスカベンジャー受容体高システインドメインによって定義される古いタンパク質スーパファミリに極めて類似するドメインを示す(Koths,K. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:14245-14249)90Kはエイズ患者の亜集団群の血清中で上昇し、原発腫瘍サンプルと腫瘍細胞株とにおいて多様なレベルで発現される。Ullrich 他（1994）は90Kが複数の宿主防御系を刺激し、インターロイキン２の分泌を誘発し得ることを実証した。この免疫刺激の原因は、発癌性形質転換、ウイルス感染または病原性侵襲であると提起されている（Ullrich,A., 他（1994）J. Biol. Chem. 269:18401-18407）。
【０００９】
セマフォリン（semaphorin）類は軸索誘導分子の１大グループで少なくとも30種のメンバーがあり、脊椎動物、無脊椎動物、更には数種のウイルスでも発見されている。すべてのセマフォリンは長さが約５００アミノ酸のセマ（sema）ドメインを有する。セマフォリン受容体のニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）はin vitro神経突起の生成を促進することが示されている。ニューロピリンの細胞外領域はCUB、ジスコイジン（discoidin）、およびMAMドメインの３種のドメインからなる。ニューロピリンのCUBおよびMAMモチーフはタンパク質間相互作用に役割を果たすことが示唆されており、さらにセマドメインおよびC末端ドメインを通じてセマフォリンの結合に関与していることが示唆されている(Raper, J.A. (2000) Curr. Opin. Neurobiol. 10:88-94の概説を参照)。プレキシン（plexin）類は神経細胞表面分子であり、カルシウムイオンの存在下で同種親和性結合メカニズムにより細胞接着を媒介する。プレキシン類は、特定の感覚系の受容体や神経細胞において発現されることがわかっている（Ohta, K. 他（1995）Cell 14:1189-1199）。いくつかのプレキシンが、発生段階の神経系において運動神経軸索や中枢神経軸索の誘導を制御するよう機能することを示す証拠もある。プレキシンは、それ自体完全なセマフォリンドメインを有しており、古典的セマフォリンとセマフォリンの結合パートナーの両方の祖先であり得る（Winberg, M.L.他（1998）Cell 95:903-916）。
【００１０】
ヒト妊娠特異的β１糖タンパク質（PSG）は、分子量が72KDa、64KDa、62KDaおよび54KDaの、密接に関連する糖タンパク質類の１ファミリーである。癌胎児抗原と共に、これらは免疫グロブリンスーパファミリ内に或るサブファミリを構成する(Plouzek C.A. およびChou J.Y., Endocrinology 129:950-958) 。PSGの異なる亜集団が、ヒト胎盤の栄養胚葉（trophoblasts）および羊膜や漿膜によって産生されることが発見されている( Plouzek C.A. 他 (1993) Placenta 14:277-285)。
【００１１】
自己分泌型運動促進因子(AMF)は腫瘍細胞の遊走を調節する運動サイトカインの一つであり、したがって、それに伴うシグナル伝達経路の同定は決定的に重要である。自己分泌型運動促進因子受容体（AMFR）の発現は、胸腺腫における腫瘍の進行に関連することが発見された（Ohta Y. 他（2000） Int. J. Oncol. 17:259-264）。AMFRは、分子量78KDaの細胞表面糖タンパク質である。
【００１２】
ホルモンは、血液循環により運ばれ、標的細胞の表面のまたは内部の特異的受容体に結合する分泌分子である。ホルモンは多様な生化学的組成や作用機構を持っているが、２つのカテゴリーに分類し得る。第１のカテゴリーは小さい親油性ホルモンで、標的細胞の原形質膜を通過して拡散し、サイトゾル内受容体または核内受容体に結合し、複合体を形成して遺伝子発現を改変する。これらの分子としては、レチノイン酸やチロキシンが、更には、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン、コルチゾール、アルドステロンなどの、コレステロール由来ステロイドホルモンがある。第２のカテゴリーに含まれる親水性ホルモンは、原形質膜の内側へ信号を伝達する細胞表面受容体に結合することで機能する。そのようなホルモンの例としては、アミノ酸の誘導体としてカテコールアミン類（エピネフリン、ノルエピネフリン）およびヒスタミンが、ペプチドホルモンとしてグルカゴン、インスリン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、およびバソプレッシンがある（Lodish 他（1995）Molecular Cell Biology, Scientific American Books Inc., New York, NY, 856-864ページなど参照）。
プロオピオメラノコルチン(POMC) は、脳下垂体前葉によって合成されるホルモンであるコルチコトロピン(ACTH)の前駆体ポリペプチドで、副腎皮質の刺激において作用する。POMCはまた、ベータ-リポトロピンホルモン（β-LPH）の前駆体ポリペプチドでもある。各ホルモンは、固有の生物活性を持つより小さいペプチド群を含む。α-メラニン細胞刺激ホルモン(α-MSH)と副腎皮質刺激ホルモン様中葉ペプチド(CLIP)はACTHから形成され、γ-リポトロピン(γ-LPH)とβ-エンドルフィンはβ-LPHのペプチド成分であるが、β-MSHはγ-LPH中に含まれる。POMCのエキソン２および３における遺伝子突然変異に起因するACTH欠乏による副腎不全は、早期発症肥満症、副腎不全および赤毛色素沈着を特徴とする内分泌性疾患を生じる(Chretien, M.他 (1979) Canad. J. Biochem. 57:1111-1121, Krude, H. 他 (1998) Nature Genet. 19:155-157, Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. Johns Hopkins University, Baltimore, MD. OMIM Number: 176830: August 1, 2000年8月1日. World Wide Web URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)。
【００１３】
成長因子類および分化因子類は、細胞間伝達の中で機能する分泌タンパク質である。いくつかの因子の活動には、オリゴマー形成が、または膜タンパク質との会合が必要である。それらの因子とそれらの受容体間の複雑な相互作用は、細胞分裂、細胞分化、細胞シグナル伝達および細胞運動性を刺激または抑制する、細胞内信号伝達経路の引き金となる。殆どの成長および分化因子は、その局所環境にある細胞に作用する（パラ分泌シグナル伝達）。成長因子類および分化因子類には３つの主要なクラスがある。第１のクラスには、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、インシュリン様成長因子、および血小板由来の成長因子など、大きなポリペプチド成長因子を含む。第２のクラスには、コロニー刺激因子（CSF）のような造血性成長因子を含む。造血性成長因子類は、Bリンパ球、Tリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、およびそれらの幹細胞前駆体など、血液細胞の増殖および分化を刺激する。第三のクラスは、小さなペプチド因子として、ボンベシン、バソプレッシン、オキシトシン、エンドセリン、トランスフェリン、アンギオテンシンII、血管作用性小腸ペプチド、及び増殖以外の細胞機能を制御するためにホルモンとして働くブラジキニンが含まれる。
【００１４】
成長因子および分化因子は、in vitroでの細胞の腫瘍性転換、およびin vivoでの腫瘍進行において、幾つかの重大な役割を果たす。腫瘍細胞による、成長因子の不適正な発現は、腫瘍の血管新生および転移に寄与し得る。造血時の成長因子の調節異常によって、貧血、白血病、およびリンパ腫が生じ得る。インターフェロンなど幾つかの成長因子は、in vitroおよびin vivoの双方で、腫瘍細胞群に対し細胞毒性を持つ。更に、幾つかの成長因子および成長因子受容体は、構造的にも機能的にも腫瘍性タンパク質類と関連する。加えて、成長因子は癌原遺伝子群および腫瘍抑制遺伝子群の双方の転写調節に影響を与える（Pimentel, E. (1994) Handbook of Growth Factors, CRC Press, Ann Arbor, MI, 1-9ページの概説を参照）。
【００１５】
最初にショウジョウバエにおいて同定されたSlitタンパク質は、中枢神経系正中線形成およびおそらく神経組織の組織発生と軸索の誘導において重要である。Itoh 他は、Slit遺伝子の哺乳類相同体（ヒト Slit-1、Slit-2、Slit-3およびラットSlit-1）を同定した。コードされたタンパク質は、共に保存されたタンパク質間相互作用ドメインであるEFG様モチーフおよび高ロイシンリピートを含む推定分泌性タンパク質である。Slit-1 mRNA、 Slit-2 mRNAおよび Slit-3 mRNAは、それぞれ脳、脊髄、甲状腺に発現される（Itoh, A. 他（1998）Brain Res. Mol. Brain Res. 62:175-186）。タンパク質のSlitファミリーは神経組織内のglypican-1の機能性リガンドであることが示されており、このことは、それらの相互作用は中枢神経系の組織発生時の特定の段階において重要であることを意味する（Liang, Y. 他（1999）J. Biol. Chem. 274:17885-17892）。
【００１６】
神経ペプチドおよび血管介在物質（NP/VM）は、内因性シグナル伝達分子の１大ファミリーを構成する。NP/VMファミリーに含まれる分子は、神経ペプチドおよび神経ペプチドホルモンとして、ボンベシン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、ニューロメディンＮ、メラノコルチン類、オピオイド類、ガラニン、ソマトスタチン、タキキニン類、ウロテンシンIIおよび平滑筋刺激に関する関連ペプチド類、バソプレッシン、および血管作用性小腸ペプチドがある。また、循環系に運ばれるシグナル伝達分子として、アンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン類、ホルミルメチオニルペプチド類、グルカゴン、コレシストキニン、およびガストリンがある。NP/VMは直接にシグナルを伝達し得る他、別の神経伝達物質およびホルモンの活性若しくは放出をモジュレートしたり、またカスケードで触媒酵素として作用することができる。NP/VMの効果は、極端に短い時間から持続性を有するまでの幅を有する(Martin, C. R. 他 (1985) Endocrine Physiology. Oxford University Press, NewYork, NY, 57-62ページに概説されている)。
【００１７】
NP/VMは、多くの神経障害および心血管障害に関与する。例えば、神経ペプチドＹは、高血圧症、鬱血心不全、情動障害、食欲調節に関与する。ソマトスタチンは、下垂体前葉での成長ホルモンおよびプロラクチンの分泌を阻害し、また、腸、膵臓腺房細胞、および膵臓β細胞内の分泌も阻害する。ソマトスタチンレベルの低下は、アルツハイマー病およびパーキンソン病で報告された。バソプレッシンは、腎臓内で水分吸収およびナトリウム吸収を増加させ、また高濃度では、血管平滑筋の収縮、血小板活性化、および肝臓内でのグリコーゲン分解を刺激する。バソプレッシンおよびその類似体は、尿崩症の治療のため臨床的に用いられる。エンドセリンおよびアンジオテンシンは高血圧症に関与し、アンジオテンシンの血漿レベルを減少させるカプトプリルなどの薬剤は、血圧降下に用いられる（Watson, S.および S. Arkinstall（1994）The G-protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 194、252、284、55、および111の各ページ）。
【００１８】
神経ペプチドはまた、侵害受容（痛覚）にも役割を幾つか持つことが示されている。血管作用性小腸ペプチドは、慢性神経障害痛において重要な役割を果たすようである。オピオイド受容体様１受容体に対する内因性リガンドであるノシセプチンは、主に抗侵害受容作用を有すると考えられ、強直性の痛み若しくは慢性痛の、様々な動物モデルにおいて鎮痛特性を有している事が示された（Dickinson, T.およびFleetwood-Walker, S. M.（1998）Trends Pharmacol. Sci. 19:346-348）。
【００１９】
シグナルペプチドを有する他のタンパク質として、酵素活性を持つ分泌タンパク質類がある。酵素活性としては、例えば、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、異性化酵素活性、若しくはリガーゼ活性がある。例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ類は細胞外基質を分解する分泌性加水分解酵素であり、したがって、腫瘍転移、組織形態形成、および関節炎において重要な役割を果たす（Reponen, P. 他（1995）Dev. Dyn. 202:388-396; Firestein, G. S.（1992）Curr. Opin. Rheumatol. 4:348-354; Ray, J. M. およびStetler-Stevenson, W. G.（1994）Eur. Respir. J. 7:2062-2072; Mignatti, P.および Rifkin, D. B.（1993）Physiol. Rev. 73:161-195）。別の例は、脂質合成にまたはエネルギー生成に用いる酢酸を活性化するアセチルCoA合成酵素である（Luong, A. 他（2000）J. Biol. Chem. 275:26458-26466）。アセチルCoA合成酵素が活性化されると、酢酸とCoAからアセチルCoAが形成される。アセチルCoA合成酵素は、AMP結合ドメインシグネチャとして同定される或る配列類似性領域を共有する。アセチルCoA合成酵素は高血圧と関連性があることが示されている(H. Toh (1991) Protein Seq. Data Anal. 4:111-117 およびIwai, N. 他, (1994) Hypertension 23:375-380)。
【００２０】
多くの異性化酵素は、タンパク質の折りたたみ、光伝達、および種々のタンパク質同化経路や異化経路における諸段階を触媒する。或るクラスの異性化酵素は、ペプチジルプロリルシス−トランス異性化酵素（PPIアーゼ）として知られる。PPIアーゼ類は、タンパク質内の特定のプロリンイミド結合の、シスからトランスへの異性化を触媒する。PPIアーゼの２つのファミリーが、FK506結合タンパク質（FKBP）とシクロフィリン（CyP）である。FKBP類が、共に強力な免疫抑制薬であるFK506とラパマイシンとに結合することにより、Ｔ細胞内の複数のシグナル伝達経路が抑制される。特に、FKBPのPPIアーゼ活性は、FK506あるいはラパマイシンの結合によって阻害される。算出した分子量にしたがって名付けたFKBPファミリーの５つのメンバー（FKBP12、FKBP13、FKBP25、FKBP52および FKBP65）は、細胞の様々な領域に局在し、それらの領域で様々なタンパク質複合体と会合する、（Coss, M.他（1995）J. Biol. Chem. 270:29336-29341; Schreiber, S.L.（1991）Science 251:283-287）。
【００２１】
CyPのペプチジルプロリル異性化酵素活性は、Ｔ細胞活性化につながるシグナル伝達経路の一部である可能性がある。CyP異性化酵素活性はタンパク質折りたたみおよびタンパク質輸送に関連しており、またタンパク質複合体のアセンブリまたは分解、およびタンパク質活性の調節にも関与している可能性がある。例えば、ショウジョウバエにおいてCyP NinaAはロドプシンの正確な局在化に必要であり、哺乳類のCyP（Cyp40）はステロイド受容体に結合するHsp90/Hsc70複合体の一部である。哺乳類CypAはヒト免疫不全ウイルス１（HIV-1）からのgagタンパク質と結合するが、この相互作用はシクロスポリンによって抑制し得ることが示されている。シクロスポリンは強力な抗HIV-1活性を有するので、CypAはHIV-1の複製において重要な機能を果たし得る。最後に、Cyp40は転写因子c-Mybに結合し、これを不活化することが示されているが、この作用はシクロスポリンによって逆転される。この作用は、転写、形質転換および分化の調節でのCyp類の関与を意味する（Bergsma, D.J. 他（1991）J. Biol. Chem. 266:23204 -23214; Hunter, T.（1998）Cell 92: 141-143; Leverson, J.D. および Ness, S.A.（1998）Mol. Cell. 1:203-211）。
【００２２】
分子シャペロンは一組の保存されたタンパク質ファミリであり、生理的条件下およびストレス条件下で外来のタンパク質を選択的に認識し、結合する。このようにしてこれらのタンパク質補因子は不可逆性凝集反応やミスフォールディング（誤った折り畳み）を妨げる。多くのシャペロンはまた、熱ショック(ストレス)タンパク質でもある。すべての主要な熱ショックタンパク質のファミリ(Hsp104、 Hsp90、Hsp70、Hsp60/GroELおよび低分子量Hsp類) は不可逆性のアンフォールディング（変性）反応を抑制する。熱ショックタンパク質はまた、新しく合成されたタンパク質が膜を横切って移動するのに適する、フォールディングしていない構造に維持するように作用する。Bip（binding protein、結合タンパク質）は小胞体（ER）hsp70タンパク質の相同体である。Bip（哺乳動物細胞のGrp78或いは、酵母のKar2としても知られている）は基本的にタンパク質合成および分泌のすべての面に関与しており(Yu, M. 他 (2000) J. Biol. Chem. 275:24984-24992)、変異体表面糖タンパク質（VSG）を含む新規に合成された分泌タンパク質に一過的に会合することがわかっている。Apg-1 および apg-2は熱ショックタンパク質のhsp110ファミリに属する。 このマウスapg-1 遺伝子はヒトhsp70RY遺伝子に構造的に関連しており、また32〜39℃の熱ショックによって誘導することができる。apg-2 はhsp70RYのマウス相同体のアイソフォームのように思えるが、熱誘発性であると考えられない(Nonoguchi, K. 他(1999) Gene 237:21-28)。
【００２３】
プロリンリッチγ-カルボキシグルタミン酸（Gla）タンパク質（PRGP）類は、ビタミンK依存性１回貫通型膜内在性タンパク質ファミリーのメンバーである。PRGPタンパク質はGlaリッチなほぼ45アミノ酸の細胞外アミノ末端ドメインを特徴とする。細胞内カルボキシル末端領域には配列PPXYの１つまたは２つのコピーがあり、PPXYは、シグナル伝達、細胞周期進行、およびタンパク質代謝回転のような、細胞の多様な機能に関与する種々のタンパク質に存在するモチーフである（Kulman, J.D. 他, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1370-1375）。Glaを形成するグルタミン酸残基の翻訳後修飾過程は、ビタミンK依存性のカルボキシル化である。Glaを含むタンパク質としては、血液凝固に関与する血漿タンパク質類がある。これらのタンパク質とは、プロトロンビン、タンパク質Ｃ、ＳおよびＺ、並びに血液凝固第VII因子、第IX因子および第X因子である。オステオカルシン（骨-Glaタンパク質、BGP）およびマトリックスGlaタンパク質（MGP）もまた、Glaを含む（Friedman, P.AおよびC.T. Przysiecki（1987）Int. J. Biochem. 19:1-3、C. Vermeer（1990）Biochem. J. 266:625-636）。
【００２４】
ショウジョウバエ遺伝子crossveinless 2の特徴は、まず、推定上のシグナル配列または膜貫通配列を有することである。また、部分的なVon Willebrand（フォンウィルブランド）因子Dドメインをも持つが、このドメインは分子内結合と分子間結合の形成を調節することが知られるドメイン群に類似している。また、５ヶ所のシステインリッチドメインをも持つが、これらはBMP（骨形成タンパク質）様リガンド群を結合するとされている。これらの特徴は、crossveinless 2 が細胞外で作用するか、または分泌経路において、直接にリガンドのシグナル伝達を可能にするように作用し、したがって、翅脈特異化（vein specification）において或る役割を果たすとされているBMP様シグナル伝達経路に関与することを示唆する（Conley, C.A. 他（2000）Development 127:3947-3959）。脊椎動物およびショウジョウバエの胚における背腹軸形成（dorsal-ventral patterning）には、位置情報勾配（a positional informational gradient）を発生させるための細胞外タンパク質群の保存されたシステムを必要とする。
【００２５】
抗原認識分子群は、すべての脊椎動物が、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫による感染を防ぐために発達させてきた高度且つ複雑な免疫系において重要な役割を果たす。免疫系の主な特徴は、「自己」分子と外来分子すなわち抗原とを区別する能力である。この能力は、リンパ球、顆粒球および単球のような白血球によって発現される分泌タンパク質および膜貫通タンパク質によって主に媒介される。これらのタンパク質の多くは、保存された構造ドメインの１つ以上のリピートを持つメンバーたる免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーに属する。このIgドメインは、Igフォールド（折りたたみ）と呼ばれる或る配列でのジスルフィド結合によって接合されている、逆平行のβシート群から構成されている。IgスーパファミリのメンバーにはT細胞受容体、主要組織適合性(MHC)タンパク質、抗体および「分化クラスター」またはCD抗原のような免疫細胞特異的表面マーカーが含まれる。これらの抗原を同定するには、系統的な、モノクローナル抗体（mAb）ベースの「ショットガン（shot gun）」技術が利用される。これらの技術によって、数百種のmAbが、未知の細胞表面白血球抗原類に対して産生されている。それらの抗原は「分化のクラスター群」へとグループ分けされている。分類は、多様な分化白血球細胞型と未分化白血球細胞型とで共通の、免疫細胞化学的な局在パターンに基づく。或るクラスター内の抗原群は或る単一の細胞表面タンパク質を同定すると仮定され、「分化クラスター」すなわち「CD（cluster of differentiation）」名が指定されている。CD抗原類が同定するタンパク質類をコードするいくつかの遺伝子が、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、確証されている。CD抗原類の特徴は、膜貫通タンパク質であることと、細胞表面タンパク質であって脂肪酸含有糖脂質、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）への共有結合性の接着を介して原形質膜に固着されていることである（Barclay, A. N.他(1995) The Leucocyte Antigen Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, 17-20ページの概説を参照）。
【００２６】
MHCタンパク質群は、外来抗原に結合し、これらをT細胞に提示する細胞表面マーカーである。MHC分子はクラスIまたはIIのどちらかに分類される。クラスIのMHC分子(MHC I)はほとんどすべての細胞表面に発現され、またキラーT細胞に対する抗原の提示に関与する。例えば、ウイルスに感染した細胞は細胞内ウイルスタンパク質を分解し、細胞表面のMHCI分子に結合したタンパク質断片を表現する。MHC I/抗原複合体は、感染した細胞とその中のウイルスを破壊するキラーT細胞によって認識される。クラスIIMHC分子はB細胞およびマクロファージのような免疫系の分化した抗原提示細胞で主に発現する。これらの細胞は細胞外液から外来タンパク質を取り込み、細胞表面にMHC II/抗原複合体を発現する。この複合体はヘルパーT細胞を活性化し、次にヘルパーT細胞が、免疫反応を刺激するサイトカインおよび他の因子を分泌する。MHC分子はまた、臓器移植後の臓器拒絶反応において重要な役割を果たす。拒絶反応は、移植受容者のT細胞群が、移植された臓器の外来MHC分子群に対し、外来抗原に結合した自己MHC分子群に対するのと同様の応答をする場合に発生する(Alberts, B. 他 (1994) Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, New York, NY, 1229-1246ページの概説を参照)。
【００２７】
抗体または免疫抗原はB細胞の表面で発現されるか、または、B細胞によって分泌されて血液循環に入る。抗体は、血液中や他の細胞外液中で外来抗原に結合し、それらを中和する。プロトタイプの抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの同じポリペプチド重鎖（Ｈ鎖）と２つの同じポリペプチド軽鎖（Ｌ鎖）からなる四量体である。この配列は、抗体分子に対して特徴的なＹ型を形成する。抗体はＨ鎖組成に基づいて分類される。抗体の５つのクラスであるIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMは、α、δ、ε、γおよびμのＨ鎖型によって定義される。L鎖にはｋ とλの 2つのタイプがあり、どちらもH鎖対を持つペアとして会合している。血液循環内に見られる抗体の最も一般的なクラスであるIgGは四量体であるが、抗体の他のクラスのものは一般にこの基本的構造の変異体か、または多量体である。
【００２８】
Ｈ鎖とＬ鎖は各々、Ｎ末端可変領域とＣ末端定常領域を有する。定常領域はＬ鎖の約１１０のアミノ酸と、Ｈ鎖の約３３０または４４０のアミノ酸から構成される。定常領域のアミノ酸配列は、或る特定クラスのＨ鎖またはＬ鎖群の内では、ほぼ同一である。可変領域は約１１０のアミノ酸からなり、Ｈ鎖とＬ鎖の両方にある。しかし、可変領域のアミノ酸配列は、特定クラスのＨ鎖またはＬ鎖群の中でも異なる。Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域のそれぞれに、広範な配列多様性を持つ３つの高頻度可変領域があり、各々約５〜１０のアミノ酸からなる。抗体分子において、HおよびL鎖の高頻度可変領域は一緒になって抗原認識部位を形成する( 前出のAlberts, 1206-1213 ページと 1216-1217ページ参照)。
【００２９】
Ｈ鎖とＬ鎖は両方とも反復されるIｇドメインを含む。例えば、典型的なＨ鎖は４つのIgドメインを含んでおり、そのうちの３つは定常領域内に発生し、１つは可変領域内に発生して抗原認識部位の形成に寄与している。同様にして、典型的なＬ鎖は２つのIgドメインを含み、そのうちの１つは定常領域内に発生し、他の１つは可変領域内に発生する。
【００３０】
免疫系は体内に入る外来分子を認識し、それに応答する能力を持っている。したがって、免疫系はすべての可能性のある抗原に対する抗体の完全な蓄積で武装していなければならない。このような抗体の多様性は、可変領域と定常領域とをコードする遺伝子セグメント群の体細胞性再配列によって作られる。これらの遺伝子セグメント群は、各々の遺伝子セグメントが隣接する高度に保存されたDNA配列間で生じる、部位特異的組換えによって連結されている。何百という異なった遺伝子セグメントがあるため、何百万という独自の遺伝子が、組み合わせにより作成され得る。その上、これらのセグメントの不正確な連結とこれらのセグメント内での異常に高頻度の体細胞性突然変異が、多様な抗体集団の産生に更に寄与している。
【００３１】
発現プロファイリング
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００３２】
骨リモデリングと骨粗しょう症
骨リモデリングは、並置された骨を吸収する破骨細胞と骨を形成する骨芽細胞、および骨細胞チームワークによって生じる。これらの細胞のその前駆体からの発達および増殖は、骨の微小環境において産生される成長因子およびサイトカインのネットワークによって、また全身的ホルモンによって決定される(Manolagas (1998) Aging 10:182-190; Teitelbaum 他 (1997) J Leukoc Biol 61:381-388)。吸収と沈着との間の同調的なバランスが、骨の完全性を保持するために必要であり、破骨細胞および骨芽細胞間の親密かつ複雑な相互作用が必要とされる。骨ホメオスタシスの正常な状態において、骨リモデリング活動は骨格の機械的要求が少ないところでは骨塊を除くように働き、機械的負担が繰り返し伝達されるところでは骨形成が行われる。
【００３３】
骨は有機相および無機相からなる複合材である。この組織の重量の約70%はミネラルか、無機質(主にリン酸カルシウム)であり、5〜8％は水であり、残りは有機基質または細胞外基質である。ミネラル相のほぼ95%は特定の結晶性ヒドロキシアパタイトで構成されており、無機相の残りの5%を構成する不純物で、そのヒドロキシアパタイトが含浸されている。有機相の98%はI型コラーゲンおよび多様な非コラーゲン性タンパク質で構成され、残りの2%は細胞である (Einhorn (1996) The bone organ system: form and function. In: Marcus 他、編集, Osteoporosis, Academic Press, New York NY).。 骨芽細胞および骨細胞による基質沈着の過程、またその後のミネラル化および破骨細胞の骨再吸収作用との共役は、全身性ホルモン、ペプチドおよび下流のシグナル伝達経路タンパク質、局在性転写因子、サイトカイン、成長因子および基質リモデリング遺伝子との複合的相互作用によって決定される。
【００３４】
副甲状腺ホルモン(PTH)とそのシグナル伝達系は成人骨格における骨リモデリングの主要な制御因子である(Masiukiewicz 及びInsogna (1998) Aging 10:232-239; Mierke 及びPellegrini (1999) Curr Pharm Des 5:21-36)。これらは血流中カルシウムのホメオスタシスにおいて重要な役割を有している。 PTHの急性in vivo作用は骨再吸収を増加することである。ただしPTHの血液循環レベルの増加が続くと、骨の形成と再吸収の両方が促進される。、PTHシグナル伝達経路はまた、骨形成時の軟骨形成の制御にも関与する(Vortkamp,他 (1996) Science 273:613-622; Lanske 他 (1999) J Clin Invest 104:399-407)。
【００３５】
いくつかの他のホルモンおよび局在的因子は骨の健康に重要である。まだ完全には理解されていない阻害および刺激の複雑なパターンにおいて、成長ホルモン、インスリン様成長因子-1、性的ステロイド、甲状腺ホルモン、PTHおよびプロスタグランディンE2のような向カルシウム性(calciotrophic )ホルモン、種々のサイトカイン（インターロイキン-1ベータ、インターロイキン-6、および腫瘍壊死因子アルファ）、および1,2,5-ジヒドロキシビタミンD(カルシトリオール)はすべて、骨リモデリング過程において協調的に働く。エストロゲンは破骨細胞活性の阻害に関与している(Jilka 他(1992) Science 257:88-91; Poli 他 (1994) EMBO J 13:1189-1196; Srivastava 他 (1998) J Clin Invest 102:1850-1859。エストロゲンは骨または骨髄におけるサイトカインの産生を止めることによって骨の喪失を防いでいる可能性がある(Kimble、 他(1995) Endocrinology 136:3054-3061)。インターロイキン-1ベータ、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子アルファのような種々のサイトカインは骨リモデリングに影響を与える(de Vernejoul (1996) Eur J Clin Chem Clin Biochem 34:729-734)。
【００３６】
生涯を通じて、古い骨は取り除かれ(再吸収)、また新しい骨は骨格に追加される(形成)。幼児期および10代では、古い骨が除かれる速度より速く、新しい骨が追加される。結果として、骨はより大きくなり、より重くなり、またより密度が高くなる。骨の形成は、20代中ごろまで最高の骨塊に到達するまで、再吸収より早いペースで続く。骨の再吸収は３０代の後は、徐々に骨形成より速くなり、閉経後の最初の二三年に最も速くなり、死ぬまでずっと続く。骨の再吸収が迅速になりすぎるか、または置換が遅過ぎると骨粗しょう症になる。骨粗しょう症の２つの主なクラスは一次性と二次性骨粗しょう症である。I型骨粗しょう症は５０才から７0才までのサブセットの閉経後女性に発症し、椎体と前腕の骨折を伴う。II型骨粗しょう症は７０才以上の男女に発症し、大腿付け根と近位上腕骨および脛骨の骨折を伴う。場合によっては、骨粗しょう症は他の疾患の徴候となる(Fauci 他 (1998) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill Companies, New York NY, 2249ページ).現在の治療はこれらの成長の制御系を遮り、骨芽細胞の成長と働きを促し、破骨細胞の成長と活性を阻害するように意図されている。
【００３７】
癌における細胞外マトリックス
正常組織のホメオスタシスは上皮細胞とその微小環境との間の動的な相互作用によって維持されている。組織が癌化してくると、癌細胞、支質や内皮のような隣接する正常細胞とそれらの微小環境の間で相反的相互作用が生じる。後者は不溶性細胞外マトリックス(ECM)として定義され、線維芽細胞からなる支質、脂肪細胞、脈管構造、常在免疫細胞、およびサイトカインと成長因子の通常の環境である。上皮実質は基底膜によって物理的に支質と別れており、基底膜は、高度に組織化された、特殊なECMであり、その成分は支質ECMとは異なり、上皮細胞が付着する。上皮細胞とその微小環境との間の複合的相互作用が正常な、均衡の取れたホメオスタシスの維持に重要であることが、細胞生物学によってモデル系で堅固に確立された。この均衡が破壊されると、悪性かつ転移性動態を促進し得るような異常細胞増殖、接着、機能および遊走が誘発され得る。ECMのin vitro使用は、細胞をin vivoの生理的環境により近い状態を提供する。マトリゲル（Matrigel） マトリックスはEHSマウス肉腫(ECMタンパク質が豊富な腫瘍)から単離された、再構成の基底膜である。Matrigel マトリックスはラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン（entactin）およびヘパリン硫酸プロテオグリカンからなる。これはまた、成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびその他の構成成分を含む。in vivoで基底膜と通常接触している細胞は、in vitroでMatrigel 基底膜マトリックス上で培養すると、十分に分化することがしばしばある。微小環境の癌発症と癌転移への関与を理解し、癌細胞および微小環境間の相互作用をいかに操作するかによって、新しい治療標的が得られるであろう。
【００３８】
新規の分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド群の発見により、新規の組成物群を提供することで、当分野の要望に応えることができる。これら新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管疾患、神経系疾患、および発達障害の、診断・治療・予防において有用であり、また、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物群の効果についての算定にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、総称して「SECP」、個別にはそれぞれ「SECP-1」、「SECP-2」、「SECP-3」、「SECP-4」、「SECP-5」、「SECP-6」、「SECP-7」、「SECP-8」、「SECP-9」、「SECP-10」、「SECP-11」、「SECP-12」、「SECP-13」、「SECP-14」、「SECP-15」、「SECP-16」、「SECP-17」、「SECP-18」、「SECP-19」、「SECP-20」、「SECP-21」、「SECP-22」、「SECP-23」、「SECP-24」、「SECP-25」、「SECP-25」、「SECP-26」、「SECP-27」、「SECP-28」、「SECP-29」、「SECP-30」「SECP-31」、及び「SECP-32」と呼ぶ分泌タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ ID NO:1-32のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００４０】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群より選択されたポリペプチドをコードするような単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-32からなる群から選択したポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:33-64を有する群から選択される。
【００４１】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-32を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物体を提供する。
【００４２】
また、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。 製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００４３】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００４４】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００４５】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００４６】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００４７】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択される。一実施例では、SEQ ID NO:1-32からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的SECPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００４８】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的SECPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００４９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的SECPの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００５０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一の天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００５１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００５２】
更に本発明は、SEQ ID NO:33-64からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００５３】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、前記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、前記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v）（i）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【００５４】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００５５】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００５６】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００５７】
（定義）
用語「SECP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などからの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得た、実質的に精製されたSECPのアミノ酸配列を指す。
【００５８】
用語「アゴニスト」は、SECPの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。アゴニストとしては、SECPと直接に相互作用、あるいはSECPが関与する生物学的経路の各成分に作用してSECPの活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００５９】
「対立遺伝子変異体／変異配列」は、SECPをコードする、別の形態の遺伝子である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変容したmRNAまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【００６０】
SECPをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、SECPと同じポリペプチド、或いはSECPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、SECPをコードするポリヌクレオチド配列にとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、アレル変異配列群との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、SECPをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性をも含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なSECPとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にSECPの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００６１】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【００６２】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる。
【００６３】
用語「アンタゴニスト」は、SECPの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、SECPと直接相互作用すること、あるいはSECPが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってSECPの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００６４】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFaｂ、F(ab')₂ 及びFv断片を指す。SECPポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷のポリペプチド群を用いて、または、当該の小ペプチド群を持つ断片群を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、所望によりキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００６５】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００６６】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド構成要素は修飾された糖基(例えば、リボヌクレオチドの2'-OH 基が2'-F または 2'-NH₂で置換されている)を有することが可能で、これらの糖基は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性あるいは血中でのより長い寿命など、望む性質を改善しうる。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【００６７】
「イントラマー（intramer）」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【００６８】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【００６９】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成することが可能な任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【００７０】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え体、または合成のSECPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００７１】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'-AGT-3'」は、相補配列「3'-TCA-5'」と対合する。
【００７２】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む(有する)組成物」及び「〜のアミノ酸配列を有する組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む広範囲の任意の成分を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。SECPをコード、若しくはSECPの断片群をコードするポリヌクレオチド配列群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００７３】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブリシステム（GCG, Madison, WI）か、あるいはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００７４】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。

【００７５】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
【００７６】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００７７】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドの、少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって修飾されたポリペプチドである。
【００７８】
「検出可能な標識」は、測定可能なシグナルを生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【００７９】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【００８０】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンはコードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって、新しいタンパク質がアセンブリされることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００８１】
「断片」は、SECPの又はSECPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００８２】
SEQ ID NO:33-64の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:33-64を特定に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:33-64のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:33-64を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:33-64の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:33-64の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００８３】
SEQ ID NO:1-32 のある断片は、SEQ ID NO:33-64のある断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-32 の断片には、SEQ ID NO:1-32を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ ID NO:1-32 の断片は、SEQ ID NO:1-32を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-32 の断片、及び断片が対応するSEQ ID NO:1-32 の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００８４】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００８５】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【００８６】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００８７】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「percent similarity(類似率)」として一致率を報告する。
【００８８】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及び他のパラメータをデフォルト設定に設定して用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００８９】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【００９０】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００９１】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００９２】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【００９３】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスが選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【００９４】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年４月２１日)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００９５】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【００９６】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００９７】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【００９８】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００９９】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容的アニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。許容条件は、どのハイブリダイゼーション実験でも一定でありうるが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験によって変更することができる。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１００】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。或いは、約６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlのせん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１０２】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C₀tまたはR₀t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１０３】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１０４】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１０５】
「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、SECPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、SECPの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１０６】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１０７】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、SECPの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、SECPのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【０１０８】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１０９】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１１０】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１１１】
SECPの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断、及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成的或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、SECPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１１２】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、SECPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１１３】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１１４】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１１５】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１６】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、核酸の一部が単に付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１１７】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１１８】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１１９】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１２０】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１２１】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。SECPをコードする核酸若しくはその断片、またはSECP自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞、染色体、細胞小器官または細胞から単離された膜からの抽出物や、細胞や、溶解しているか基板に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プリント等から構成され得る。
【０１２２】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１２３】
「実質的に精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合する他の構成要素の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましいのは少なくとも９０％が無いものを指す。
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１２４】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１２５】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１２６】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１２７】
ここで用いる「遺伝形質転換体(transgenic organism)」とは任意の生物であり、限定するものではないが動植物を含み、生物の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することにより、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの感染によって行う。或る実施例において、核酸はレンチウイルスベクターのような組換えウイルスベクターを用いた感染によって導入することができる(Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989)等の参考文献に記載されている。
【０１２８】
特定の核酸配列の「変異体／変異配列」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも40％の配列同一性を有する核酸配列であると定義する。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、所与の種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１２９】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１３０】
（発明）
本発明は、新規のヒト分泌タンパク質群（ＳＥＣＰ）および、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づく。また、これらの組成物を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性障害、心血管障害、神経障害、および発達障害の、診断、治療、および予防の開発に基づく。
【０１３１】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列に相当する物理的な完全長クローンのIncyte ID 番号を示す。完全長のクローンは列３に示すポリペプチド配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０１３２】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）とそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号（Genbank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、GwnBank相同体(類)の注釈を示す。
【０１３３】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１３４】
表２および３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが分泌タンパク質であることを確立している。
【０１３５】
例えば、SEQ ID NO:1 は934残基の長さで、L146 残基よりD934残基まで、ヒトIg様膜タンパク質（GenBank ID g3766136) と95％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)で確認された（表２参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:1はまた、免疫グロブリンドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。
【０１３６】
他の例としてSEQ ID NO:10 は表面糖タンパク質(GenBank ID g8101109)であるクルーズ トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi） GP63-4 タンパク質にY296残基からG398残基まで33%、C418残基からE481残基まで35%、E196からL271残基まで31%、G534残基からP594残基まで29%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.9e-19であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:10はまた、リーシュマノリシン（leishmanolysin） メタロプロテアーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPSからのデータと、DOMOおよびPRODOMデータベースの付加的なBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:10がメタロプロテアーゼであることのさらに確証的な証拠を提供する。
【０１３７】
また他の例として、SEQ ID NO:12は、残基M1から残基P419まで、ヒト妊娠特異的β1−糖タンパク質7前駆体(GenBank ID g609314) と98％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは6e-229であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。
【０１３８】
SEQ ID NO:24は免疫グロブリンドメイン、フィブロネクチンタイプIIIドメインおよびロイシンリッチリピートドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表2参照）。「免疫グロブリンドメイン」および「フィブロネクチンドメイン」は分泌タンパク質の一つのタイプである基質タンパク質の特徴である特徴的モチーフである。
【０１３９】
また他の例として、SEQ ID NO:25はヒトapg-2タンパク質GenBank ID g4579909) と残基Ｍ１から残基D841まで97％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:25はまた、Hsp70タンパク質ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:25 が分泌タンパク質分子であるという、さらに確証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:2-9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13-23、およびSEQ ID NO:26-32については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-32の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１４０】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列をアセンブルするのに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:33-64を同定するため、或いはSEQ ID NO:33-64と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（3'）位置を示す。
【０１４１】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方のアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N₁_N₂_YYYYY_N₃_N₄ と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N_1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１４２】
あるいは、接頭コードは手作業で編集されたか、ゲノムDNA配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を同定する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する同じ配列の分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。

【０１４３】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１４４】
表５はIncyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記のポリヌクレオチド配列をアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１４５】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型((SNP) を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列３はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列４はSNP の識別番号(SNP ID)を示す。列5はSNPが存在するEST配列内の位置(EST SNP)を示し、列６は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置を示す。列７はEST配列内に存在する対立遺伝子を示す。列8および列９はSNP部位に存在する２つの対立遺伝子を示す。列10はESTに存在する対立遺伝子に基づいてSNP部位に含まれるコドンによってコードされるアミノ酸を示す。列11〜14は四つの異なったヒト母集団における対立遺伝子1の発生頻度を示す。n/d(検出されない)の項目は母集団における対立遺伝子１の発生頻度が低すぎて検出されなかったことを示し、また、n/a(利用不可)はその母集団において対立遺伝子の発生頻度が決定されなかったことを示す。
【０１４６】
本発明はまた、SECPの変異体も含む。好適なSECPの変異体は、SECPアミノ酸配列に対して、少なくとも約80％、あるいは少なくとも約90％、さらには少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、SECPの機能的または構造的特徴を少なくとも1つ含む変異体である。
【０１４７】
本発明はまた、SECPをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例において、本発明は、SECPをコードするSEQ ID NO:33-64からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。SEQ ID NO:33-64のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１４８】
本発明はまた、SECPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、SECPをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:33-64からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:33-64からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、SECPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１４９】
さらに、或いは別法では、本発明のポリヌクレオチド変異体は、SECPをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体は、SECPをコードするポリヌクレオチド配列と有意な配列同一性をもつ部分であり得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって生じるブロックの配列の追加または欠損のため、その変異体は通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。スプライス変異体は、SECPをコードするポリヌクレオチド配列とその全長にわたって、約70％以下の、或いは約60％以下の、或いは約50％以下のポリヌクレオチド同一性を有することがありうるが、スプライス変異体の部分は、SECPをコードするポリヌクレオチド配列の部分に、少なくとも約70％の、或いは少なくとも約85%の、或いは100％のポリヌクレオチドの配列同一性を有することになる。
例えば、SEQ ID NO:63の配列を持つ或るポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:48の配列を持つポリヌクレオチドのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:64の配列を持つ或るポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:53の配列を持つポリヌクレオチドのスプライス変異体であり、またSEQ ID NO:62の配列を持つ或るポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:58の配列を持つポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記のスプライス変異配列は何れも、SECPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードすることができる。
【０１５０】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るSECPをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のSECPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されているとみなす。
【０１５１】
SECPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のSECPのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するSECP或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされたアミノ酸配列を変えないで、SECP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する他の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１５２】
本発明はまた、SECP及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、SECPまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０１５３】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:33-64 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１５４】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０１５５】
SECPをコードする核酸配列は当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(例えば、 Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318--322を参照)。別の方法にインバースPCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(例えば、Triglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１５６】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１５７】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化されるフルオロフォア（蛍光色素）と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１５８】
本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にSECP、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号に固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り、これらの配列をSECPの発現に利用可能である。
【０１５９】
種々の目的でSECPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１６０】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、SECPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのSECPの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって遺伝的多様性が生み出される。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所与の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６１】
別の実施例によれば、SECPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてSECP自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60、Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202-204を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にSECPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質の配列または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１６２】
このペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（例えばChiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421を参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる。（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０１６３】
生物学的に活性なSECPを発現させるために、SECPをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む。これらの要素には、ベクター及びSECPをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、SECPをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。SECPをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照)。
【０１６４】
当業者に周知の方法を用いて、SECPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換え技術がある(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章、8章及び１6-17章、Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,9章、13章及び16章等を参照)。
【０１６５】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、SECPをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌などの微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス：CaMVまたはタバコモザイクウイルス：TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある。（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. 及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J. 他T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815、McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１６６】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、SECPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、SECP をコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニングおよび増殖は、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。ベクターのマルチクローニング部位にSECPをコードする配列を連結反応するとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照)。抗体の産生などのために多量のSECPが必要な場合は、SECPの発現を高レベルで誘導するベクターが使用し得る。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１６７】
酵母の発現系を使用してSECPを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列群を組み込むことを可能にする(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181-184を参照)。
【０１６８】
植物系を使用してSECPを発現することも可能である。SECPをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進される（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311）。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. 他 (1984) Science 224: 838-843; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）。これらの作製物は、直接DNA形質転換にまたは病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページ等を参照）。
【０１６９】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にSECPをコードする配列を連結し得る。アデノウイルスゲノムの非必須のE1またはE3領域へ挿入することにより、宿主細胞内でＳＥＣＰを発現する感染ウイルスを得ることができる(例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照)。+更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７０】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばHarrington, J.J.他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。
【０１７１】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるSECPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、SECPをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素及び／または内因性の発現要素や、同じベクター上に或いは別のベクター上に選択マーカー遺伝子を含み得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１７２】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. 他. (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. 他. (1980) Cell 22:817-823等を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシド系ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F. 他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDが、文献に記載されている(Hartman, S.C及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。
【０１７３】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、SECPをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、SECPをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がSECPをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１７４】
一般に、SECPをコードする核酸配列を含み且つSECPを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNAハイブリダイゼーション或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【０１７５】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてSECPの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このような技術の例としては、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、フローサイトメーター（FACS）などが挙げられる。SECP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０１７６】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。SECPをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、SECPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１７７】
SECPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養され得る。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。SECPをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過してのSECPの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１７８】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０１７９】
本発明の別の実施例では、SECPをコードする天然の核酸配列、変更された核酸配列、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラSECPタンパク質が、SECP活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、SECPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、SECPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１８０】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したSECPの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば³⁵Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８１】
本発明のSECPまたはその断片を用いて、SECPに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも1つ以上の試験化合物を用いて、SECPへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドまたは受容体）または小分子が挙げられる。一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのSECPの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。別の実施例において、このようにして同定された化合物は天然のリガンドの受容体SECPである(Howard, A.D. 他(2001) Trends Pharmacol. Sci.22:132-140; Wise, A. 他 (2002) Drug Discovery Today 7:235-246等を参照)。
【０１８２】
別の実施例では、この化合物はSECPが結合する天然の受容体、少なくとも受容体の断片、または、リガンド結合部位または結合ポケットの全部あるいは一部を含む受容体の断片に密接に関連し得る。例えば、この化合物はシグナルを伝播できるSECPの受容体、あるいは、シグナルを伝播できないSECPのデコイ受容体であり得る(Ashkenazi, A. 及びV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260; Mantovani, A. 他 (2001) Trends Immunol. 22:328-336)。この化合物は既知の技術を用いて合理的に設計され得る。このような技術の例にはヒトの関節リューマチの治療に有効な化合物etanercept (ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)の作成に使われる技術が含まれる。Etanercept はヒトIgG₁のFc部分に結合した或る操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体二量体である。
【０１８３】
一実施態様では、SECPに特異的に結合、刺激、あるいは阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でSECPを発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。SECPを発現する細胞またはSECPを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、SECPまたは化合物のいずれかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１８４】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたSECPと混合させるステップと、SECPとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１８５】
アッセイはその天然のリガンドに結合する能力、またはその天然のリガンドの天然の受容体への結合を阻害する能力を評価するために使うことができる。このようなアッセイの例には、米国特許第5,914,236号 および米国特許第6,372,724号で説明されているような放射標識法が含まれる。関連する実施例において、一つ以上のアミノ酸置換をポリペプチド化合物(受容体等)に導入して、その天然のリガンドへの結合能力を改善または改変することができる(Matthews, D.J. and J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30等参照)。その他の関連する実施例において、一つ以上のアミノ酸置換をポリペプチド化合物(受容体等)に導入して、その天然のリガンドへの結合能力を改善または改変することができる(Cunningham, B.C. 及びJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他 (1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988等参照)。
【０１８６】
本発明のSECPまたはその断片を用いて、SECPの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。ある実施態様では、SECPの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をSECPと混合し、試験化合物の存在下でSECPの活性を試験化合物不在下でのSECPの活性と比較する。試験化合物の存在下でのSECPの活性の変化は、SECPの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をSECPの活性に適した条件下でSECPを含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイのいずれかにおいて、SECPの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１８７】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、SECPまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換される。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０１８８】
SECPをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他 (1998) Science 282:1145-1147）。
【０１８９】
SECPをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、SECPをコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別の実施態様において、例えばSECPを乳汁内に分泌するなどSECPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０１９０】
（治療）
ＳＥＣＰのいくつかの領域と分泌タンパク質群との間には、例えば配列およびモチーフの文脈における、化学的および構造的類似性が存在する。さらに、SECPの発現は、副腎、脳、胎児胸腺、乳房、甲状腺、卵巣、乳房腫瘍、後根神経節、心臓、鼻ポリープ、膵臓、回腸および松果体組織、神経組織、生殖組織、および胎児組織、並びにアルツハイマー病に関連する組織と密接に関連する。さらに、SECPを発現する組織の数例は、表６を見られたい。このように、SECPは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管疾患、神経系疾患、および発達異常において、或る役割を果たすと考えられる。ＳＥＣＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９１】
したがって、一実施態様において、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＳＥＣＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、そのような疾患のうち、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管疾患の中には、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠状動脈バイパス手術が含まれ、神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性痴呆が含まれ、また発達障害の中には、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれる。
【０１９２】
別の実施態様では、SECPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、上記しだけに限られるものではないが疾患を含むSECPの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９３】
さらに別の実施態様では、実質的に精製されたSECPを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むSECPの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９４】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSECPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SECPの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１９５】
更なる実施例では、SECPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にSECPのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管疾患、神経系疾患、および発達異常が含まれる。一実施態様では、SECPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはSECPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的化機構、或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１９６】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSECPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、SECPをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０１９７】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組合せて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０１９８】
SECPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたSECPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてSECPと特異的に結合するものの同定が可能である。SECPに対する抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えば由来はラクダまたはラマ）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において利点を持つようであり、免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発においても利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０１９９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、SECPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２００】
SECPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。SECPのアミノ酸群の短い区間を、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２０１】
SECPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D.他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２０２】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発された技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452-454を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、SECP特異的一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２０３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２０４】
SECPに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')₂ 断片と、F(ab')₂ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２０５】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫測定法には、SECPとその特異性抗体との間の複合体の計測が含まれる。二つの非干渉性SECPエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２０６】
放射免疫測定法技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、SECPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でSECP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のSECPエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のKaは、SECPに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のSECPエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０^９〜１０^１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、SECP抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０^６〜１０^７liter／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、SECPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２０７】
抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ/ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ/ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体試薬は一般に、SECP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２０８】
本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、SECPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片を、ＳＥＣＰをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(例えばAgrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照)。
【０２０９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288-1296等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225、Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736.等を参照）。
【０２１０】
本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原生動物寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。SECPの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からSECPを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１１】
本発明の更なる実施例では、SECPの欠損による疾患や異常症は、SECPをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってSECP欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２１２】
SECP の発現に効果的である発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、 PRCCMV2、PREP、 PVAX, PCR2-TOPOTA ベクター (Invitrogen, Carlsbad CA)、 PCMV-SCRIPT、 PCMV-TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)およびPTET-OFF、PTET-ON、 PTRE2、 PTRE2-LUC、 PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。SECPを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するSECPをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１３】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPERFECT LIPID TRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２１４】
本発明の別の実施例では、SECPの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でSECPをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4⁺ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２１５】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、SECPの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞にSECPをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他 (1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２１６】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、SECPの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する標的細胞にSECPをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にSECPを導入する際に特に有用であり得る。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なったセグメント群を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２１７】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてSECPをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターはSFVゲノムに基づいている（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのカプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、αウイルスゲノムに、キャプシッドをコードする領域の代わりにSECPのコード配列を導入することによって、ベクター導入細胞において多数のSECPをコードするRNAが産生され、高いレベルでSECPが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群において持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他 (1997) Virology 228:74-83)。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にSECPを導入することできる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２１８】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、二重らせんが十分に開いて、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子と結合する能力を阻害するため、有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E.他 (1994) in: Huber、B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。
【０２１９】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、SECPをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２０】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２２１】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、RNA分子は、SECPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によって産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２２】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするために、RNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を加える。
【０２２３】
本発明の更なる実施例は、SECPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現の改変に効果的な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、SECPの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、SECPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、SECPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、SECPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２２４】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変えるのに有効であるとされている化合物の化学的修飾、天然または非天然の化合物の既存の、市販または私的なライブラリからの選択、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインすること、および組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリからの選択がある。SECPをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。SECPをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、SECPをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化を検出することは、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。特異的ポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物のスクリーニングは、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて行うことができる。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド等）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関する（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２２５】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照）。
【０２２６】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２２７】
本発明の或る更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、SECP、SECPの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはSECPのインヒビターなどからなる。
【０２２８】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２２９】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３０】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３１】
SECPまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、SECPまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオン性N末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２３２】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２３３】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（例えば、SECPまたはその断片、SECPの抗体、SECPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）量を意味する。治療有効性及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED₅₀（集団の５０％の治療有効量）またはLD₅₀（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比が治療指数であり、LD₅₀/ED₅₀比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED₅₀を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０２３４】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の全身健康状態、被験者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、薬剤の併用、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２３５】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100.000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、パク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２３６】
（診断）
別の実施例では、SECPに特異的に結合する抗体が、SECPの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはSECPやSECPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。SECPの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからSECPを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２３７】
SECPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのSECPの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なSECPの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とSECPに対する抗体とを混合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのSECPの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２３８】
本発明の別の実施例では、SECPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るSECPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、SECPの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のSECP値の調節を監視する。
【０２３９】
一実施形態では、SECPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、SECPをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られているか、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、そのプローブがSECPをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２４０】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、SECPをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:33-64の配列、或いはSECP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４１】
SECPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、SECP及びSECP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、³²Pまたは³⁵S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２４２】
SECPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、SECPの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、そのような疾患のうち、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管疾患の中には、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠状動脈バイパス手術が含まれ、神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性痴呆が含まれ、また発達障害の中には、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれる。変異SECPの発現を検出するために、患者から採取した体液或いは組織を利用して、SECPをコードするポリヌクレオチド配列を、サザン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法と、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマトのELISA様アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４３】
ある実施態様では、SECPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。SECPをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のSECPをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２４４】
SECPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、SECPをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２４５】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２４６】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２４７】
SECPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはSECPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはSECPをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２４８】
或る実施態様において、SECPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、SECPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。このDNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰによって、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異が生じる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、また統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２４９】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば、少なくとも16の一般的ＳＮＰが非インスリン依存型真性糖尿病と関連がある。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫性疾病等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンでの変異体（MBL2）は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰と相関することがわかっている。ＳＮＰはまた、生命を脅かす毒性等の薬剤への患者の反応に影響する遺伝変異体の同定という薬理ゲノミックスにおいても有用性がある。例えば、N-アセチルトランスフェラーゼにおける或る変異は抗結核剤、イソニアジドに応答した末梢神経障害の発生率が高くなるが、ALOX5 遺伝子のコアプロモータの変異は５-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬での治療に対する臨床的反応を減少する。異なった集団でのSNPの分布についての分析は遺伝的浮動、突然変異、組み換えおよび選択の研究に有用であると共に、集団の起源と移動の調査にも有用である(Taylor, J.G他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.及びZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P.他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２５０】
ＳＥＣＰの発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２５１】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０２５２】
別の実施例では、SECP、SECPの断片、SECPに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５３】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２５４】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２５５】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および薬物の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを示す、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることは毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境衛生科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについては<http://www.niehs.nih.gov>/oc/news /toxchip.htmで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２５６】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２５７】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２５８】
プロテオームのプロファイルは、SECPに特異的な抗体を用いてSECP発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２５９】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも毒性学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２６０】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２６１】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０２６２】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集 (1999) Oxford University Press, Londonに記載がある。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０２６３】
本発明の別の実施例ではまた、SECPをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされる（例えばHarrington, J.J. 他（1997）Nat. Genet. 15:345-355、Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(例えば、 Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０２６４】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（Heinz-Ulrich, 他 (1995) 前出のMeyers, 965-968ページ等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のSECPをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患の素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０２６５】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニング、またはその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が遺伝的連鎖によって特定のゲノム領域、例えば、血管拡張性失調症の11q22-23領域に、大まかに位置決めされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他 (1988) Nature 336:577-580を参照)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２６６】
本発明の別の実施例では、SECP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。SECPと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２６７】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、SECP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したSECPを検出する。精製したSECPはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２６８】
別の実施例では、SECPと特異結合可能な中和抗体がSECPとの結合について試験用化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。このようにして、SECPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在をも、抗体を使って検出できる。
【０２６９】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術が、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、SECPをコードするヌクレオチド配列をその新技術に用い得る。
【０２７０】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２７１】
上述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、米国特許出願第60/293.728号、第60/297.019号、第60/299.297号、第60/300.537号、第60/301.936号、第60/366.041号、第60/362.439号、および第60/363.649号を含め、言及することを以て特に本明細書の一部となす。
【実施例】
【０２７２】
１ cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２７３】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２７４】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ選択（３００〜１０００bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen Carlsbad CA）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE (Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテントな大腸菌細胞に形質転換した。
【０２７５】
２ cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２７６】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKAN２蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２７７】
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences 社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて同定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２７８】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864、Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた。（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するようにアセンブリした。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を引き出した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列間の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって指定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０２７９】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は全体を引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０２８０】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアセンブリ及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:33-64のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０２８１】
４ ゲノム DNA からのコード配列の同定及び編集
推定上の分泌タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C及びS. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C及びS. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶアセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が分泌タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて分泌タンパク質について問合せて分析した。潜在的な分泌タンパク質もまた、分泌タンパク質として注釈を付けたインサイトcDNA配列に対する相同性を基に同定した。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブリプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集した、または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０２８２】
５ cDNA 配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
スティッチ配列（ Stitched Sequence ）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ以上のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列上に或る区間が存在する場合、この３つの区間は全て等しいと考えられた。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われる順にステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０２８３】
ストレッチ配列（ Stretched Sequence ）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載したようにアセンブリされた部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
６ SECP をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
【０２８４】
SEQ ID NO:33-64をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:33-64 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２８５】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 もっとも、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０２８６】
この方法で、SEQ ID NO:50は、59.0〜68.0センチモルガンの間隔内で14番染色体にマッピングされた。
【０２８７】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合されている膜への標識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
BLASTを適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２８８】
【数１】

【０２８９】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２９０】
或いは、SECPをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリされる（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、SECPをコードするcDNAの組織特異的および疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０２９１】
８ SECP をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、該断片から設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて完全長分子の適切な断片を伸長させて生成した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８℃〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０２９２】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２９３】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて96ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg^{２ +}と(NH₄)₂SO₄と２−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマー対、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ１：９４℃で３分間、 ステップ２：９４℃で１５秒間、 ステップ３：５７℃で１分間、 ステップ４：６８℃で２分間、 ステップ５：ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す。ステップ６：６８℃で５分間、 ステップ７：４℃で保管する。
【０２９４】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０２９５】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２９６】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃、 15 秒、ステップ 3: 60℃、 1 分、ステップ 4: 72℃、 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステップ6: 72℃、5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０２９７】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０２９８】
９ SECP をコードするポリヌクレオチドの一塩基多型の同定
一塩基多型性（SNP）として知られる一般的なＤＮＡ配列変異体は、LIFESEQデータベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:33-64において同定された。実施例３に記述されているように、同じ遺伝子からの配列を共にクラスターにしてアセンブリし、これによって遺伝子内のすべての配列変異体の同定ができた。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルターは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルター群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０２９９】
異なる4つのヒト集団のＳＮＰ部位における対立遺伝子頻度を分析するために、高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.)を用いる質量分析によって、更なる特徴付けのためにいくつかのＳＮＰが選択された。白人母集団は、ユタ州の83人、フランス人4人、ベネズエラ３人およびアーミッシュ派２人を含む92人(男性46人、女性46人)で構成された。アフリカ人母集団はすべてアフリカ系アメリカ人である194人( 男性97人、 女性97人)からなる。ヒスパニック母集団はすべてメキシコ系ヒスパニックの324人( 男性162人、 女性162人)からなる。アジア人母集団は126人(男性64人、女性62人)からなり、親の内訳は中国人43%、日本人31%、コリアン13%、ベトナム人5%およびその他のアジア人8%と報告されている。対立形質の発生頻度は最初に白人母集団において分析し、いくつかの例において、この母集団で対立形質分散を示さなかったSNPは他の三つの母集団においてさらに検査しなかった。
【０３００】
１０ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:33-64から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-³²P]アデノシン３リン酸 （Amersham Biosciences）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３０１】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３０２】
１１ マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweilerなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一且つ、無孔の表面を持つ固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D.他. (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.及びJ. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31等を参照)。
【０３０３】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３０４】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)⁺RNAを精製する。各ポリ(A)⁺RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1X 第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害剤、５００μMのdATP、５００μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、２００ｎｇのポリ（A）⁺RNAを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)⁺RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合した後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３０５】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートを持つベクター含有細菌細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３０６】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、０.１％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３０７】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３０８】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３０９】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に等分して１.８cm² のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、１４０μlの５×SSCをチェンバーの隅に加える。アレイを入れたチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０３１０】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３１１】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３１２】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を、ハイブリダイズする種の重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、較正するcDNAのサンプルを２つの蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０３１３】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３１４】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０３１５】
例えば、SEQ ID NO:39 は炎症性応答において差次的発現を示すことがマイクロアレイ分析によって確認された。SEQ ID NO:39 の発現はインターロイキン1 (IL-1) と腫瘍壊死因子(TNF)で処理した内皮細胞系においては少なくとも2倍減少した。
【０３１６】
したがってSEQ ID NO:39は、炎症応答の診断アッセイに有用である。
【０３１７】
SEQ ID NO:43 は骨リモデリングおよび骨粗しょう症に関与するとされている遺伝子の複数のものと同時発現される。したがってSEQ ID NO:43は、骨粗しょう症のような骨疾患の診断アッセイに有用である。
【０３１８】
マイクロアレイ分析は例えば、細胞活性化剤やイオノフォアで処理した後のT細胞白血病における分泌タンパク質の発現レベルを測定するために使用され得る。この種のマイクロアレイ分析に基づいて、SEQ ID NO:48の発現は、 1 μM のPMA と50 ng/ml 〜 10μg/ml のイオノマイシンで1時間処理したJurkat細胞では、未処理の細胞に比べると少なくとも2倍減少した。
【０３１９】
マイクロアレイ分析は未分化の前脂肪細胞と比較した、分化された脂肪細胞における分泌タンパク質のレベルを測定するのに用いられ得る。一つの実施例において、2人の女性ドナーの皮下脂肪から初代培養の前脂肪細胞を得た。前脂肪細胞はF-10 培養液において10%の胎児ウシ血清で培養した。コンフルエント細胞は1μMのロシグリタゾン（rosiglitazone ）(BRL49653、PPARγ アゴニスト)、0.2 mM のIBMX (脂肪細胞の別の分化誘発剤、3-イソブチル-1-メチルキサンチン)および100nMのヒトインスリンで三日間処理したものと、未処理のものである。その後、これらの細胞はF-10 培養液中3%胎児ウシ血清と100nMのヒトインスリンで培養した。分化した脂肪細胞が誘発剤の入っていない培養液中にある未処理の前脂肪細胞と比較された。位相差顕微鏡下で観察された前脂肪細胞の80%から90%が約二週間で脂肪細胞に分化していた。細胞を処理後(偽処理)、二週間までの異なった時点で収集した。分化した脂肪細胞でのSEQ ID NO:44(SEQ ID NO:12のポリペプチドをコードする)の発現は、未分化細胞に比べて5〜7倍下方制御されることがマイクロアレイ分析において示された。この下方制御は処理後一日目から実験の最後まで観察された。したがって、SEQ ID NO:48 は細胞増殖異常疾患および癌のモニタリングに有用性がある。SEQ ID NO:44 は脂質代謝異常のモニタリングおよび疾患段階決定に有用である。
【０３２０】
対照的に、SEQ ID NO:44 の発現は、MAPKキナーゼ/ERKキナーゼ1(MEK1) の選択的、細胞透過性インヒビター(阻害物質)（MAPKおよび、その後のMAPK基質のリン酸化の阻害によって作用する）で処理した後の乳房腺癌細胞系(MCF7)において約二倍上方制御された。この実験において、細胞は8日間、阻害物質25μMで処理した。したがって、SEQ ID NO:44はまた、MAPKキナーゼおよび/またはERKキナーゼ経路によるGPCR媒介シグナル伝達から生じる細胞増殖の異常またはアポトーシスを監視するのに有用である。
【０３２１】
ヒト末梢血単核細胞(PBMC) は免疫系の主要な細胞構成成分を表す個々の細胞集団に分類できる。SEQ ID NO:57 の発現はこれらの細胞を10 ng/ml のイオノマイシン(細胞質ゾルカルシウムを増加するカルシウムイオノフォア)と共に(a)0.1 mM/ml PMA (プロテインキナーゼCの広領域活性化因子)に20時間暴露し、そして(ｂ)1 ng/ml SEB (ヒトT細胞の特殊活性化物質であるブドウ球菌菌体外毒素)に72時間暴露した後、少なくとも2倍増加した。したがってSEQ ID NO:57は、炎症および免疫反応の診断アッセイに有用である。
【０３２２】
前立腺腫瘍細胞系、LNCaP(ヒト前立腺癌)およびMDAPCa2b(ヒト前立腺腺癌)はMatrigel マトリクスで一つの細胞懸濁の組込みによって増殖した。Matrigel マトリックスは、マウス肉腫から単離された再構成基底膜マトリックスであり、ラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン（entactin）およびヘパリン硫酸プロテオグリカンで構成されている。これはまた、成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびその他の構成成分を含む。通常、in vivoで基底膜に接触している細胞は、in vitroでMatrigel 基底膜マトリックス上で培養すると、十分に分化することがしばしばある。微小環境の癌発症と癌転移への関与を理解し、癌細胞および微小環境間の相互作用をいかに操作するかによって、新しい治療標的が得られるであろう。前立腺癌細胞からのRNAは、コロニーが適度の大きさになった時に収集した。SEQ ID NO:58 では、Matrigel中でこれらのヒト前立腺癌が増殖した時にcDNA発現が2倍以上の増加を示した。したがって、SEQ ID NO:58は前立腺癌の診断的マーカーとして、あるいは潜在的治療標的として使うことができる。
【０３２３】
さらなる実施例として、SEQ ID NO:62 の発現は、Matrigelマトリックス中の単一細胞懸濁液（single cell suspensions）においてLNCaP 前立腺癌細胞およびMDAPCa2b 前立腺腺癌細胞で、未処理細胞に比べて、少なくとも2倍増加した。適度の大きさのコロニーが形成された時(すなわち、Matrigelマトリックスの存在下で正常上皮細胞が形態形成を行うために必要な時間の長さ)に、RNAを収集した。LNCaP 前立腺癌細胞系は、50才男子の転移性前立腺癌のリンパ節生検から単離された。LNCaP 細胞は前立腺特異抗原を発現し、前立腺酸性フォスファターゼを産生し、そしてアンドロゲン受容体を発現する。MDAPCa2b 前立腺癌細胞系は63才男子の転位部位から単離された。MDAPCa2b 細胞系は前立腺特異抗原(PSA)とアンドロゲン受容体を発現し、in vitroおよびin vivoで成長し、アンドロゲンに感受性である。この実験により、SEQ ID NO:62は前立腺癌の診断マーカーとして、あるいは潜在的治療標的として使うことができる。
【０３２４】
１２ 相補的ポリヌクレオチド
SECPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のSECPの発現を検出、低下、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びSECPのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがSECPをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３２５】
13 SECP の発現
SECPの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でSECPが発現するために、抗生物質耐性遺伝子及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとSECPを発現する。真核細胞でのSECPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、SECPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３２６】
殆どの発現系では、SECPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でSECPからタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したSECP を直接用いて以下の実施例１７及び１８の、適用可能なアッセイを行うことができる。
【０３２７】
１４ 機能的アッセイ
SECP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのSECPをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORT（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen,）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３２８】
遺伝子発現におけるSECPの影響は、SECPをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。SECP及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３２９】
15 SECP に特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182：488-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたSECPを用いて、標準的なプロトコールで動物（例えば、ウサギやマウス等）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３３０】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてSECPアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等を参照）。
【０３３１】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗SECP活性を検査するには、ペプチドまたはSECPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３３２】
16 特異的抗体を用いる天然 SECP の精製
天然SECP或いは組換えSECPを、SECPに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗SECP抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３３３】
SECPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、SECPを選択的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とSECPとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、SECPを回収する。
【０３３４】
17 SECP と相互作用する分子の同定
SECPまたは生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Iボルトンハンター試薬で標識する(例えばBolton A.E.およびW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照)。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補分子を、標識したSECPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したSECP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なSECP濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したSECPの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３３５】
別法では、SECPと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステムやMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
SECPはまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３３６】
１７ ＳＥＣＰ活性の実証
ＳＥＣＰの成長刺激活性若しくは成長阻害活性のアッセイでは、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の量を測定する（McKay, Ｉ. および Leigh, I., 編集（1993）Growth Factors : A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY）。このアッセイにおいては、様々な量のSECPが、放射性DNA前駆物質である［³H］チミジンの存在中で静止状態3T3培養細胞へと加えられる。このアッセイのためのＳＥＣＰを得る手段は、組換えでも良く、生化学的な調製より得ても良い。酸沈殿し得るDNAへの［³H］チミジンの組み込みが、適切な時間間隔で測定され、組み込まれた量は新規に合成されたDNAの量に直接比例する。少なくとも１００倍のＳＥＣＰ濃度範囲にわたる線形の用量‐応答曲線は、成長の調節活性を示す。ミリリットルあたりの１単位の活性は、５０％の応答レベルを提供するSECPの濃度として定義される。ここで、１００％の応答レベルは、酸沈殿し得るDNAへの［³H］チミジンの最大の組み込みを表す。
【０３３７】
別法では、ＳＥＣＰ活性のためのアッセイで、培養細胞中の神経伝達の刺激若しくは抑制を測定する。培養CHO繊維芽細胞をＳＥＣＰに曝す。エンドサイトーシスによるＳＥＣＰ取込後に、これらの細胞を新鮮培養液で洗浄し、細胞全膜電位を固定したアフリカツメガエル筋細胞を操作して、ＳＥＣＰを含まない媒質中で前記の繊維芽細胞の１つと接触させる。膜電流を、この筋細胞から記録する。対照値に対し増加若しくは減少した電流は、ＳＥＣＰの神経調節効果を示す（Morimoto, T.他（1995）Neuron 15:689-696）。
【０３３８】
別法では、ＳＥＣＰ活性のアッセイで、分泌性の膜で囲まれた細胞小器官におけるＳＥＣＰの量を測定する。上述したように形質移入された細胞を採取し、溶解する。ライセートは、当業者に既知の、ショ糖密度勾配超遠心法などの方法で分画する。そのような方法は、ゴルジ体、ER、小さい膜で囲まれた小胞、およびその他の分泌細胞小器官のような、細胞内区画の単離を可能とする。分画した細胞ライセートおよび全体の細胞ライセートよりの免疫沈降は、ＳＥＣＰ特異抗体を用いて実行され、また免疫沈降サンプルは、SDS-PAGEおよび免疫ブロット技術を用いて解析される。全細胞ライセート中のＳＥＣＰに対する分泌性細胞小器官中のＳＥＣＰ濃度は、分泌経路を通るＳＥＣＰの量に比例する。
【０３３９】
あるいは、SECPのプロテアーゼ活性は、種々の発色性分子と抱合した適切な合成ペプチド基質の加水分解によって測定される。この加水分解の程度は遊離された発色団の分光光度的(または蛍光定量的)吸光度によって定量される（Beynon, R.J. および J.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 25-55ページ）。ペプチドの基質はプロテアーゼ活性のカテゴリにしたがって設計される。このカテゴリーには、エンドペプチダーゼ(セリン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ)、アミノペプチダーゼ(ロイシンアミノペプチダーゼ)、カルボキシペプチダーゼ(カルボキシペプチダーゼAおよびB、プロコラーゲンC-プロテイナーゼ)が含まれる。一般に使われる色素原は、2-ナフチルアミン、4-ニトロアニリンおよびフリルアクリル酸である。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量の酵素および適切な基質を入れる。反応は光学的キュベットで行い、ペプチド基質の加水分解時に遊離される色素原の吸光度の増加または減少を測定する。このアッセイでは、吸光度の変化はSECP活性に比例する。
【０３４０】
別法では、SECPのAMP結合活性の測定を、ＳＥＣＰと³²P標識したAMPとを混合させて行う。この反応溶液を３７℃でインキュベートし、反応はトリクロロ酢酸の添加で終了させる。酸抽出物を中和し、ゲル電気泳動にかけて非結合標識を除去する。ゲル内に留まる放射活性が、このアッセイでのＳＥＣＰ活性に比例する。
【０３４１】
18 分泌活性の実証
分泌活性は、種々の温度で増殖した[³⁵S]メチオニン標識細胞から分泌されたタンパク質を比較することによって定量し、SDS-PAGEを用いて評価され得る。25℃、37℃および39℃で増殖した細胞を標識して、免疫沈降バンドの強度を温度調節の機能として比較され得る。この方法を用いて、熱ストレスは出芽酵母(S. cerevisiae )SEY2101a 細胞の150kDaの分泌糖タンパク質の分泌を90%増加することが示されている(Russo, P. 他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3671-3675)。
【０３４２】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、記載した本発明の方法およびシステムの、種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な修正は、特許請求の範囲内にあるものとする。
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
表２は、GenBank識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈とを示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
表７は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０３４３】

Claims (119)

1. 以下の（ａ）乃至（i）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
   （ａ）SEQ ID NO:1-32（配列番号１乃至32）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
   （ｂ）SEQ ID NO：1、SEQ ID NO:3-11、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19-23、SEQ ID NO:27-28、SEQ ID NO:30および SEQ ID NO:32からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
   （ｃ）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも93％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
   （ｂ）SEQ ID NO：12およびSEQ ID NO:16からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９９％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
   （ｅ）SEQ ID NO:24のアミノ酸配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
   （ｂ）SEQ ID NO：25およびSEQ ID NO:29からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９8％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
   （g）SEQ ID NO:31のアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を本質的に有するポリペプチド
   （ｈ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
   （ｉ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
2. SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. 請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
4. 請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
5. SEQ ID NO:33-64からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
7. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
8. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
9. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
   （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
   （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程。
10. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
12. 以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
    （ａ）SEQ ID NO:33-64を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    （ｂ）SEQ ID NO:33-62、SEQ ID NO:64からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
    （ｃ）SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を本質的に有するポリヌクレオチド
    （d）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （e）（b）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （f）（c）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （g）（ａ）〜（f）のRNA等価物
13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
14. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
    （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
15. 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
16. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
    （ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
18. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-32からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７の組成物。
19. 機能的なSECPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
20. 請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
    （ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
21. 請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
22. 機能的なSECPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
23. 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
    （ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
24. 請求項23に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
25. 機能的なSECPの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
26. 請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させるステップと、
    （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
27. 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
    （ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
    （ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
28. 請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
    （ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含むことを特徴とする方法。
29. 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
    （ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
    （ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
    （ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
    （ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
30. 生物学的サンプル中のSECPの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
    （ａ）前記抗体を前記ポリペプチドと混合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項11に記載の抗体と結合する過程と、
    （ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
31. 請求項11の抗体であって、
    （ａ）キメラ抗体
    （ｂ）一本鎖抗体
    （ｃ）Fab断片
    （ｄ）F(ab')₂ 断片
    （ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
32. 請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
33. 被検者のSECPの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
34. 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
35. 被検者のSECPの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
36. 請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
    （ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
    （ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
    （ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
37. 請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
38. 請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
39. 請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
    （ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
    （ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
    （ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
    （ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
    （ｅ）SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
40. 請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
41. 請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
42. Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
43. 組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
44. SEQ ID NO:1-32からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中で検出する方法であって、
    （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
    （ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:１-32からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドがサンプル中に存在することを示唆することを特徴とする方法。
45. SEQ ID NO:1-32 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
    （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
    （ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-32からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
46. マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
47. ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
    （ａ）サンプルのポリヌクレオチドを標識するステップと、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
    (c)サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量するステップとを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法。
48. 或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
49. 請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
50. 請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
51. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
52. 請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
53. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有する或るヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを更に有することを特徴とするアレイ。
54. 請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが前記のヌクレオチド分子の少なくとも１つと前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
55. 請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
56. SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
57. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリペプチド。
58. SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
59. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
60. SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
61. SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
62. SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
63. SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
64. SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
65. SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
66. SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
67. SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
68. SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
69. SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
70. SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
71. SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
72. SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
73. SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
74. SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
75. SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
76. SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
77. SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
78. SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
79. SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
80. SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
81. SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
82. SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
83. SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
84. SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
85. SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
86. SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
87. SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
88. SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
89. SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
90. SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
91. SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
92. SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
93. SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
94. SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
95. SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
96. SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
97. SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
98. SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
99. SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
100. SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
101. SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
102. SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
103. SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
104. SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
105. SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
106. SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
107. SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
108. SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
109. SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
110. SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
111. SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
112. SEQ ID NO:57のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
113. SEQ ID NO:58のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
114. SEQ ID NO:59のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
115. SEQ ID NO:60のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
116. SEQ ID NO:61のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
117. SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
118. SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
119. SEQ ID NO:64のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。