CN108124452A - 感染溶瘤性单纯疱疹病毒的细胞 - Google Patents

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Abstract

公开了用溶瘤性单纯疱疹病毒感染的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞以及这种感染的细胞在治疗疾病(如癌症)中的用途。

Description

感染溶瘤性单纯疱疹病毒的细胞
发明领域
本发明涉及感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞，以及这种感染细胞在治疗疾病(如癌症)中的应用。
发明背景
由于高死亡率、与之相关的经济和社会负担以及癌症幸存者面临的心理问题，癌症是全球最大的问题之一。
当肿瘤块出现在常规疗法(即，化学疗法或放射疗法)无法达到或影响的区域时，通常会获得对治疗的耐受性。这些区域位于肿瘤块的中心，通常具有高度缺氧环境的特征，这意味着氧气不足以供给细胞和基质的适当呼吸(Shannon,A.M.,D.J.Bouchier-Hayes,C.M.Condron and D.Toomey,2003肿瘤缺氧,化疗耐受性和缺氧相关疗法.癌症治疗综述.29：297-307)(Shannon,A.M.,D.J.Bouchier-Hayes,C.M.Condron and D.Toomey,2003Tumour hypoxia,chemotherapeutic resistance and hypoxia-relatedtherapies.Cancer Treatment Reviews 29:297-307。由于在肿瘤中细胞复制的速度胜过了血管形成的速度，即氧的持续性需求，产生了作为实体瘤固定不变的特征的缺氧条件，从而被细胞氧气传感器检测，其通过刺激血管生成发芽来定位该需求。反过来，血管生成导致在肿瘤块内产生具有不恰当分布的结构紊乱的血管(Kandel，JJ，DJ Yamashiro和J.Kitajewski，2011肿瘤发生和转移中的血管生成(Angiogenesis in Tumor Developmentand Metastasi)，第81-93页，用于血管疾病的治疗性血管生成：用于治疗血管生成疾病的分子机制和靶向临床方法，由M.Slevin编辑，Springer-Verlag Berlin，Berlin)：这导致功能障碍的微血管系统的发展，其导致在整个肿块中氧气的扩散和灌注不充分(Vaupel，P.，O.Thews和M.Heckel，2001实体瘤的治疗耐受性-缺氧和贫血的作用.内科肿瘤学18：243-259)。最终，这创造了进一步增加缺氧的反馈回路。
癌症缺氧区域的一个重要特征是自癌症发病的非常早期阶段以来浸润到肿瘤块中的免疫细胞的显著存在(Di Caro，G.，F.Moschesi，L.Raghi和F.Grizzi，2013免疫细胞：结肠直肠癌进展中的可塑参与者.细胞和分子医药期刊17：1088-1095)。研究最多的细胞类型是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。TAM是在实体瘤的缺氧中心区域中大量动员和聚集的巨噬细胞群体(Turner，L.，C.Scotton,R.Negus和F.Balkwill，1999缺氧抑制巨噬细胞迁移，欧洲免疫学期刊29：2280-2287；Lewis，J.S.，R.J.Landers，J.C.E.Underwood，A.L.Harris和C.E.Lewis，2000巨噬细胞的血管内皮生长因子的表达在乳腺癌的较少血管化的区域中上调.病理学期刊192：150-158；Gollapudi，K.，C.Galet，T.Grogan，H.Zhang，J.W.Said等人，2013肿瘤相关巨噬细胞浸润、高级前列腺癌和根治性前列腺切除术后的生化复发之间的联系.美国癌症研究期刊3：523-529)。TAM具有如下特征：特异性表型，其被激活以响应于微环境信号(例如，细胞因子、生长因子和激素)(Martinez，F.O.，S.Gordon，M.Locati和A.Mantovani，2006人单核细胞对巨噬细胞分化和极化的转录谱：基因表达的新分子和模式.免疫学期刊177：7303-7311)，其通常被称为M2巨噬细胞。虽然他们的伴侣，M1极化的巨噬细胞被激活以响应于炎性分子并且具有高抗肿瘤和免疫刺激功能的特征，但“M2-skewed”巨噬细胞表达显著的前肿瘤活性，抑制炎症过程并促进基质重塑、侵袭、血管生成和存活(Sica，A.，T.Schioppa，A.Mantovani和P.Allavena，2006肿瘤相关巨噬细胞是促进肿瘤进展的独特的M2极化群体：抗癌治疗的潜在靶标欧洲癌症期刊42：717-727)。
已知通过肿瘤细胞连续释放的趋化性细胞因子从血液循环中募集TAM；例如，发现MCP-1、VEGF和CSF-1的表达与许多人类肿瘤中的TAM积累呈正相关(Graves，D.T.,R.Banehill，T.Gananopoulos和H.N.Antoniades，1992单核细胞趋化蛋白-1在人黑色素瘤中的体内表达美国病理学期刊140：9-14；Kacinski，B.M.，1995卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌中的CSF-1及其受体.Annals of Medicine 27：79-85。Arenberg，D.A.，M.P.Keane，B.DiGiovine，S.L.Kunkel，S.R.B.Strom等人，2000人类非小细胞肺癌中的巨噬细胞浸润：CC趋化因子的作用.癌症免疫学免疫疗法49：63-70；Lewis，J.S.,R.J.Laners，J.C.E.Underwood，A.L.Harris和C.E.Lewis，2000巨噬细胞中血管内皮生长因子的表达在乳腺癌的较少血管化区域上调，病理学期刊192：150-158)。然而，它们通过以下几个特征促进了其在肿瘤缺氧区域的特异性积累：显著存在坏死细胞(Lewis，J.，R.J.Laners，R.D.Leek，K.Corke，A.L.Harris等人，1997巨噬细胞在肿瘤血管生成中的作用：缺氧调控.病理学期刊182：A1-A1)和释放大量化学引诱物，如MCP-1(Li,X.,H.Kimura,K.Hirota,H.Sugimoto和H.Yoshida,2005缺氧可降低人类近端肾小管细胞中单核细胞趋化蛋白-1的组成型和TNF-α诱导的表达.生物化学与生物物理研究通讯335：1026-1034)，VEGF(Brown，L.F.，B.Berse，R.W.Jackman，K.Tognazzi，A.J.Guidi等人，1995血管渗透因子(血管内皮生长因子)及其受体在乳腺癌中的表达人体病理学26：86-91)和内皮素(Grimshaw,M.J.,S.Naylor和F.R.Balkwill,2002内皮素-2是乳腺肿瘤细胞的缺氧诱导的自分泌生存因子.分子癌症治疗学1：1273-1281)。一旦聚集到缺氧区域，TAM通过增加几种因子(比如，生长因子、MMP和CXCL)的生成和释放来响应贫氧条件，这些因子反过来影响血管生成、细胞生长、侵袭能力和转移：因此，TAM最终促进肿瘤进展(Sica,A.,T.Schioppa,A.Mantovani和P.Allavena,2006肿瘤相关巨噬细胞是促进肿瘤进展的独特的M2极化群体：抗癌治疗的潜在靶标欧洲癌症期刊42：717-727)。
鉴于其在引发癌症进展中的关键作用，TAM在肿瘤中的浸润已经与大多数实体肿瘤中的不良预后相关：肺癌(Chen,J.J.W.,Y.C.Lin,P.L.Yao,A.Yuan,H.Y.Chen等人，2005肿瘤相关巨噬细胞：癌症进展中的双刃剑，临床肿瘤学期刊23：953-964)，口腔鳞状细胞癌(He,K.-F.,L.Zhang,C.-F.Huang,S.-R.Ma,Y.-F.Wang等人，2014与不良预后相关的CD163+肿瘤相关巨噬细胞和口腔鳞状细胞癌中的肿瘤干细胞.国际生物医学研究2014：838632)，乳头状甲状腺癌(KIM等人，2013)，乳头状肾细胞癌(Behnes,C.L.,F.Bremmer,B.Hemmerlein,A.Strauss,P.Strobel等人，2014肿瘤相关巨噬细胞参与乳头状肾细胞癌的肿瘤进展.Virchows Archiv 464：191-196)，乳腺癌(Mukhtar,R.A.,A.P.Moore,V.J.Tandon,O.Nseyo,P.Twomey等人，2012增殖和新近迁移的肿瘤相关巨噬细胞水平的升高导致乳腺癌的侵袭性增强且结局更差.肿瘤外科年报19：3979-3986；Tang，X.Q.，2013作为乳腺癌的潜在诊断和预后生物标志物的肿瘤相关巨噬细胞.癌症通讯332：3-10)，卵巢癌(Lan,C.Y.,X.Huang,S.X.Lin,H.Q.Huang,Q.C.Cai等人，2013M2极化巨噬细胞的表达与晚期上皮性卵巢癌的不良预后相关.癌症研究与治疗技术12：259-267)和胰腺癌(Kurahara,H.,S.Takao,T.Kuwahata,T.Nagai,Q.Ding等人，2012胰腺癌中表达叶酸受体β的肿瘤相关巨噬细胞的临床意义.外科肿瘤学年报19：2264-2271)。
溶瘤病毒疗法涉及裂解病毒的使用，其可选择性的感染和杀死癌细胞。一些溶瘤病毒是有希望的疗法，因为它们在癌症细胞中的复制显示出优异的选择性，并且它们在肿瘤内的自限性增殖导致更少的毒副作用。几种溶瘤病毒已经在临床上显示出大有前途(Bell,J.,溶瘤病毒：即将来临的批准产品？Mol Ther.2010；18(2)：233-234)。
已知巨噬细胞对疾病部位具有天然的归巢能力，并已经被提出作为基因治疗的细胞载体(Burke等人，基因治疗中巨噬细胞：细胞递送载体和体内靶标.白血球生物学期刊第72卷，no.3 417-428)。
WO2007/113572描述了单核细胞衍生细胞，例如巨噬细胞，其包含磁性材料。该细胞被描述为可用作将治疗剂靶向受试者的病变物的载体，其中所述治疗剂可优选为基因(即治疗病变物的基因疗法)，并且需要治疗的受试者被暴露于磁场以帮助定位病变物中的细胞。相关工作在Muthana等人的“一种提高基于细胞的基因治疗的效果的新的磁性方法.基因治疗(2008)15,902-910”中披露。
Muthana等人，(将治疗性腺病毒靶向人前列腺肿瘤中的巨噬细胞的应用.CancerRes；71(5)2011年3月1日)描述了一种治疗前列腺肿瘤的方法，其中巨噬细胞用缺氧调节的E1A/B构建物和E1A依赖性的溶瘤腺病毒进行转导，通过使用前列腺特异性启动子元件来控制E1A的表达，其增值也限于前列腺肿瘤细胞。在这些实验中，将巨噬细胞用作腺病毒的“沉默载体”，其仅在缺氧环境中被诱导定位复制。诱导腺病毒复制并不导致巨噬细胞的死亡。在Muthana等人(化学疗法或放射后，巨噬细胞递送的溶瘤病毒消除肿瘤再生和转移.Cancer Res；73(2)2013年1月15日)中，作者描述了使用相同的腺病毒方法来研究施用多西他赛或放射治疗后的效果的实验。
发明概述
本发明涉及感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。公开了感染的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞在疾病治疗，特别是癌症治疗方法中的应用。优选的治疗可包括治疗缺氧的组织或癌症，或一部分缺氧的组织或癌症。优选的治疗可包括治疗位于深部组织、器官或身体核心部位中的组织或癌症。
被感染的细胞代表一种专门的载体，其自身靶向病变组织，从而将溶瘤性单纯疱疹病毒直接递送到病变组织，包括组织的缺氧区域，否则治疗剂很难渗透到这些区域。这些细胞不仅仅作为载体。溶瘤性单纯疱疹病毒的感染导致单核细胞或单核细胞衍生细胞死亡，这可能是由病毒复制和细胞裂解引起的。病变组织中时时存在细胞死亡，由此导致溶瘤性单纯疱疹病毒的释放，并直接递送至病变细胞，例如，肿瘤细胞，其可以被溶瘤性单纯疱疹病毒感染和裂解。
此外，溶瘤性单纯疱疹病毒在缺氧组织中引起增强的免疫反应，从而促进对该疾病的免疫反应，例如，抗肿瘤的免疫反应。
在一些实施方式中，单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞也可含有外源磁性材料。在这些实施方式中，治疗方法可以涉及向受试者施加磁场，以便将单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞引导到需要治疗的受试者体内的预期位置。
在本发明的一个方面，提供了离体或体外(ex vivo or in vitro)的感染了溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。
在一些实施方式中，离体或体外的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞也可含有外源磁性材料。
在本发明的一个方面，提供了一种制剂，所述制剂包含感染了溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。
在一个实施方式中，单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞也含有外源磁性材料。
在本发明的一个方面，提供了所述制剂在医疗方法中的应用，例如，癌症治疗。
在本发明的另一方面，提供了一种制备感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的方法，所述方法包括在体外将单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞与溶瘤性单纯疱疹病毒接触。
在一些实施方式中，所述方法还包括将单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞与磁性材料接触。
在本发明的另一方面，提供了一种制备包含感染有溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体的制剂的方法，所述方法包括提供一感染有溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体，以及配制包含所述细胞群体的制剂。
在一些实施方式中，所述群体中的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料。
在本发明的另一方面，提供一种感染了溶瘤性单纯疱疹病毒，并且任选地含有外源磁性材料的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞在疾病治疗方法中的应用。
所述治疗方法可任选地包括向受试者施用所述单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞，并向所述受试者施加磁场，以将含有外源磁性材料的细胞引导到受试者体内的预期位置。
在本发明的另一方面，提供了感染有溶瘤性单纯疱疹病毒、且任选的含有外源磁性材料的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体在制备药物中的应用，所述药物用于治疗疾病。所述治疗可任选地包括向受试者施用所述单核细胞，单核细胞衍生细胞或巨噬细胞，并向所述受试者施加磁场，以将含有外源磁性材料的细胞引导到所述受试者体内的预期位置。
在本发明的另一方面，提供一种包含一感染有溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体的制剂在疾病治疗方法中的应用，其中所述单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料，所述方法包括向受试者施用所述制剂，并向所述受试者施加磁场，以便将施用的制剂中的细胞引导到受试者体内的预期位置。
在本发明的另一方面，提供了一种感染有溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体在制备用于疾病治疗方法的药物中的应用，其中所述单核细胞，单核细胞衍生细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料，所述方法包括向受试者施用所述药物，并向所述受试者施加磁场，以将所施用的药物中的细胞引导到受试者体内的预期位置。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗需要治疗的受试者疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含感染有溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体的制剂，从而治疗所述疾病。任选地，所述群体中的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞可含有外源磁性材料，并且所述方法可任选地进一步包括向所述受试者施加磁场，以将施用的制剂中的细胞引导到受试者体内的预期位置。
如本文所述，可以在感染溶瘤性单纯疱疹病毒的预定时间内，向受试者施用感染了溶瘤性单纯疱疹病毒的细胞，和/或施用的细胞可以选择含有特定百分比范围的死亡或即将死亡(例如裂解)的细胞。时间和/或细胞的选择可以是，例如，确保细胞在位于需要治疗的组织中时，正在经历细胞死亡(例如通过感染溶瘤性单纯疱疹病毒而经受裂解)。
在本发明的另一个方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒包含预定量的溶瘤性单纯疱疹病毒和预定量的磁性材料。所述试剂盒可同时提供说明书，所述说明书用于利用溶瘤性单纯疱疹病毒感染感染单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞和/或用于利用所述磁性材料加载单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。这样的说明书可以用于在离体或体外，例如，在体外细胞培养的条件下，进行所述感染和/或加载。
在一些实施方式中，对溶瘤性单纯疱疹病毒的基因组中的ICP34.5基因的所有拷贝进行修饰，使得ICP34.5基因不能表达功能性的ICP34.5基因产物。因此，所述溶瘤性单纯疱疹病毒可能是ICP34.5无效突变体。
在一些实施方式中，对溶瘤性单纯疱疹病毒基因组中的一个或两个ICP34.5基因进行修饰，使得ICP34.5基因不能表达功能性的ICP34.5基因产物。
在一些实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒是HSV-1菌株17的突变体。在优选的实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒是HSV1716(ECACC登录号为V92012803)。在一些实施方式中，所述单纯疱疹病毒是HSV-1菌株17突变体1716的突变体。
在一些实施方式中，需治疗的疾病是癌症，例如肿瘤。所述治疗可以是癌症的缺氧区域的治疗，其也可以是细胞磁性导入的预期位置。因此，治疗方法可以涉及癌症的缺氧区域的治疗，或者与癌症的其它常氧区域一起治疗，或独立于癌症的常氧区域的治疗。治疗方法还可以涉及在受试者中诱导抗肿瘤应答。治疗方法还可以涉及向受试者施加磁场，以便将含有外源磁性材料的施用细胞引导到癌症的缺氧区域。
描述
发明人的发现表明，溶瘤性单纯疱疹病毒能够在感染96小时后杀死单核细胞衍生细胞。通常已知溶瘤性单纯疱疹病毒对增殖细胞具有高度选择性裂解活性，原则上允许通过全身或非局部施用进行肿瘤治疗，并且自发靶向肿瘤细胞而不伤害健康细胞。这提供了示例性的安全特性。
本发明人已经观察到，在感染单核细胞衍生细胞后，在感染的细胞中未检测到病毒，但在传代培养时病毒重新出现了(图1)。这与细胞的生产性感染一致，即涉及病毒后代的复制和细胞裂解，尽管本发明不受这种理论的限制。溶瘤性单纯疱疹病毒感染导致单核细胞衍生细胞死亡的发现意味着感染的单核细胞或单核细胞衍生细胞可用于将溶瘤性单纯疱疹病毒递送至病变组织，包括递送到肿瘤的缺氧区域，随后随着细胞死亡，将病毒直接释放到病变组织。
发明人还发现，单核细胞衍生细胞中的溶瘤性单纯疱疹病毒复制和单核细胞衍生细胞随后的细胞死亡(例如裂解)实际上在缺氧条件下更显著。这表明，单核细胞衍生细胞的死亡(明显优先地)在缺氧的肿瘤环境中发生，并直接将溶瘤性单纯疱疹病毒释放到难以接近的肿瘤的缺氧部位。
因此，为了确保大量的单核细胞或单核细胞衍生细胞存在于目标组织或肿瘤中时会经历死亡和病毒释放，可从感染溶瘤性单纯疱疹病毒后的预定时间内向受试者施用感染细胞，和/或可以选择含有特定百分比范围的即将死亡或死亡(例如裂解)的细胞为施用细胞。
本发明人还表明，通过磁共振靶向，可以将感染溶瘤性单纯疱疹病毒并负载有外源磁性材料的单核细胞或单核细胞衍生细胞从血流引导至靶向的深部组织(包括原发性和继发性(转移性)肿瘤)。举例来说，这可以使用磁共振(例如MRI，MRT)系统内的脉冲磁场梯度。因此，全身施用，例如，于血液中，与准确的非侵入性引导一起，使得溶瘤性单纯疱疹病毒武装细胞直接进入到病变组织成为现实。
当组织或肿瘤，例如，在肺，脑，肝或脊髓中难以或不可能进行手术切除时，这种方法具有特殊的应用。此外，将细胞靶向癌症患者中的一个或多个转移病灶是可能的，通过细胞的分阶段施用，并与各自独立磁共振技术结合，以将每次施用的细胞靶向独立的位置。
除了溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)对肿瘤的直接作用之外，越来越多的证据表明，通过先天性免疫效应物、适应性抗病毒免疫应答和适应性抗肿瘤免疫应答，宿主免疫应答在建立抗肿瘤应答的效果中起了重要作用。(例如参见Prestwich等人，溶瘤病毒：一种新型的免疫疗法.Expert Rev Anticancer Ther.2008年10月；8(10):1581-1588)。
几项研究已经显示，oHSV能够诱导抗肿瘤免疫应答。这可以表现为，相同的动物中用oHSV处理的病灶和未处理的病灶中，肿瘤的生长减少了，oHSV的效果需要一个完整的免疫应答，从而诱导抗肿瘤细胞因子应答，逆转肿瘤免疫功能障碍和促进肿瘤抗原呈递。诱导抗肿瘤免疫应答可以减少转移的建立，或促进其消除，并防止肿瘤再次复发。
例如，Benencia等人((2008)疱疹病毒溶瘤疗法逆转肿瘤免疫功能障碍并促进肿瘤抗原呈递，Cancer Biol.Ther.7,1194-1205)报道了在处理的和未处理的病灶中的生长减少。在Miller和Fraser((2003)在颅内转移性黑素瘤模型中成功的神经减弱HSV-1治疗对完整的免疫应答的要求.Mol.Ther.7(6)：741-747)中，HSV176的效果需要由肿瘤特异性增殖T细胞响应介导的完整的免疫应答。
本发明人已经在此显示，相对于常氧条件，在缺氧条件下，溶瘤性单纯疱疹病毒是促炎细胞因子和转录因子(例如IL-8，IL-1和NFκB)的诱导物。这些发现表明，在缺氧条件下，溶瘤性单纯疱疹病毒的炎症反应性增加，这表明溶瘤性单纯疱疹病毒在缺氧时获得更大的病毒潜力，进一步支持通过单核细胞或单核细胞衍生细胞递送病毒到缺氧且难以进入的肿瘤的靶向中央区域的合理性。
溶瘤性单纯疱疹病毒
溶瘤病毒是会裂解癌细胞(溶瘤)的病毒，优选以优先或选择性的方式。相比非分裂细胞，在分裂细胞中选择性复制的病毒通常是溶瘤的。溶瘤病毒在本领域中是众所周知的，并在分子治疗Vol.18No.2 2010年2月 第233-234页中有所评述。
单纯疱疹病毒(HSV)的基因组包含指定为长(L)和短(S)的两个共价连接的片段。各片段含有一个侧翼为一对反向末端重复序列的唯一(unique)序列。长重复(RL或RL)和短重复(RS或RS)是不同的。
已经被广泛研究的HSV ICP34.5(也称为γ34.5)基因已经在HSV-1株F和syn17+以及HSV-2株HG52中进行测序。ICP34.5基因的一个拷贝位于每个RL重复区域内。已知ICP34.5基因的一个或两个拷贝失活的突变体缺乏神经毒性，即无毒性/非神经毒性(将非神经毒性定义为能够将高滴度病毒(约106个噬菌斑形成单位(pfu))引入到动物或患者，而不引起致死性脑炎，使得动物(例如小鼠或人类患者)中的LD50在大约≥106pfu的范围内，并且是溶瘤的。
优选的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)是具有复制能力的病毒，至少在目标肿瘤/癌细胞中具有复制能力。
可以用于本发明的溶瘤HSV包括HSV，其中γ34.5(也称为ICP34.5)基因的一个或两个被修饰(例如通过可以是缺失、插入、添加或取代的突变)，使得各自的基因不能表达，例如，编码功能性ICP34.5蛋白。优选地，在本发明所述的HSV中，γ34.5基因的两个拷贝都被修饰，使得修饰的HSV不能够表达，例如，产生功能性ICP34.5蛋白质。
在一些实施方式中，溶瘤性单纯疱疹病毒可以是ICP34.5无效突变体，其中存在于单纯疱疹病毒基因组中的ICP34.5基因的所有拷贝(通常存在2个拷贝)被破坏，使得单纯疱疹病毒不能产生功能性ICP34.5基因产物。在其他实施方式中，溶瘤性单纯疱疹病毒可缺少至少一个可表达的ICP34.5基因。在一些实施方式中，单纯疱疹病毒可仅缺少一个可表达的ICP34.5基因。在其它实施方式中，单纯疱疹病毒可缺少两个可表达的ICP34.5基因。在其他实施方式中，存在于单纯疱疹病毒中的每个ICP34.5基因可能是不可表达的。缺乏可表达的ICP34.5基因意味着，例如，ICP34.5基因的表达不产生功能性ICP34.5基因产物。
溶瘤性单纯疱疹病毒可以衍生自任意HSV，其包括HSV的任何实验室毒株或临床分离毒株(非实验室毒株)。在一些优选的实施方式中，HSV是HSV-1或HSV-2的突变体。或者，HSV可以是HSV-1和HSV-2的型间重组。该突变体可以是实验室毒株HSV-1菌株17、HSV-1菌株F或HSV-2菌株HG52中的任何一种。突变体可以是非实验室菌株JS-1。优选地，突变体可以是HSV-1株17的突变体。溶瘤性单纯疱疹病毒可以是HSV-1菌株17突变体1716、HSV-1菌株F突变体R3616、HSV-1菌株F突变体G207、HSV-1突变体NV1020，或其进一步的突变体，其中HSV基因组含有额外的突变和/或一个或多个异源核苷酸序列的。额外的突变可包括禁用突变，这可能会影响病毒的毒力或其复制的能力。例如，可以在任何一种或多种ICP6、ICP0、ICP4、ICP27中进行突变。优选地，这些基因中的任何一个突变(任选在适当的基因的两个拷贝中)导致HSV不能(或降低其能力)表达相应的功能性多肽。举例来说，HSV基因组的额外突变可以通过核苷酸的添加、缺失，插入或取代来完成。
许多溶瘤性单纯疱疹病毒是本领域已知的。实例包括HSV1716，R3616(例如参见Chou和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.第89卷，第3266-3270页，1992年4月)，G207(Toda等人，人类基因治疗9：2177-2185，1995年10月10日)，NV1020(Geevarghese等人，人类基因治疗2010年9月；21(9)：1119-28)，RE6(Thompson等人，Virology 131,171-179(1983))和OncovexTM(Simpson等人，Cancer Res 2006；66:(9)4835-4842 2006年5月1日；Liu等人，基因治疗(2003)：10,292-303)dlsptk,hrR3,R4009,MGH-1,MGH-2,G47Δ,Myb34.5,DF3γ34.5,HF10,NV1042,RAMBO,rQNestin34.5,R5111,R-LM113,CEAICP4,CEAγ34.5,DF3γ34.5,KeM34.5(Manservigi等人，开放病毒学杂志2010；4：123-156)，rRp450，M032(Campadelli-Fiume等人，Rev Med.Virol2011；21：213-226)，Baco1(Fu等人，Int.J.Cancer2011；129(6)：1503-10)和M032和C134(Cassady等人，开放病毒学杂志2010；4：103-108)。
在一些优选的实施方式中，单纯疱疹病毒是HSV-1株17突变体1716(HSV1716)。HSV1716是一种溶瘤性非神经毒性HSV，并在EP 0571410，WO 92/13943，Brown等人(普通病毒学杂志(1994)，75,2367-2377)和MacLean等人(普通病毒学杂志1991)，72,631-639)中有所描述。HSV 1716已于1992年1月28日保藏于英国SP4 0JG，威尔特郡索尔兹伯里的Porton Down的欧洲动物细胞培养物、疫苗研究和生产实验室、公共健康实验室服务中心，保藏号为V92012803，与国际承认的用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(以下简称“布达佩斯条约”)的规定一致。
在一些实施方式中，单纯疱疹病毒是经修饰的HSV-1菌株17的突变体，使得ICP34.5基因均不表达功能性基因产物，例如通过ICP34.5基因的突变(例如插入、缺失、添加、取代)，但在其他方面类似于或基本上类似于野生型亲本病毒HSV-1株17+的基因组。也就是说，病毒可以是HSV1716的变体，其具有突变的基因组，从而使HSV-1菌株17+的ICP34.5基因的两个拷贝失活，但在别的方面却不改变以便插入或缺失/修饰其他蛋白编码序列。
在一些实施方式中，本发明的溶瘤性单纯疱疹病毒的基因组可以被进一步修饰，以便含有编码与病毒异源的多肽的至少一个拷贝的核酸(即，通常不存在于野生型病毒中)，使得所述多肽可以从核酸中表达。因此，溶瘤病毒也可以是可以表达多肽的表达载体。WO2005/049846和WO2005/049845中描述了这种病毒的例子。
为了实现多肽的表达，编码多肽的核酸优选可操作地连接至调控序列，例如能够实现编码多肽的核酸转录的启动子。与核苷酸序列可操作连接的调控序列(例如启动子)可位于该序列附近或紧邻该序列，使得调控序列可影响和/或控制核苷酸序列产物的表达。核苷酸序列的编码产物因此可以从该调控序列表达。
在一些优选的实施方式中，溶瘤性单纯疱疹病毒没有进行使其含有编码与病毒异源的多肽(或其它核酸编码产物)的至少一个拷贝的核酸的修饰。也就是说，病毒是不表达异源多肽或其它核酸编码产物的表达载体。这样的oHSV不适合，或适用于基因治疗方法，并且其所适用的医疗方法可以是不涉及基因治疗的任意一种方法。
单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞
单核细胞是一种由骨髓产生的白细胞(白血细胞)。在血液中初始循环之后，它们通常进入组织，在那里它们分化成巨噬细胞或树突状细胞。单核细胞及其巨噬细胞和树突状细胞的后代参与吞噬作用、抗原呈递和细胞因子产生。
吞噬作用涉及将物质(例如微生物或颗粒物质，或在某些情况下的营养物质)吸收(摄入)到细胞中，接着消化和/或破坏细胞内的物质。吞噬作用是内吞作用的一种特殊形式。吞噬作用的过程通常涉及将物质吞入膜内结合的囊泡(吞噬体)，其被内化到细胞中。吞噬体然后可以与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，其中可能发生对该物质的消化。考虑到单核细胞及其后代在先天性免疫系统中的作用，吞噬作用在去除病原体和细胞碎片中起主要作用。
可以从外周血或其他组织分离单核细胞或单核细胞衍生细胞(例如参见deAlmeida等人(分离人外周血单核细胞的简单方法.Mem Inst Oswaldo Cruz，Rio deJaneiro，卷95(2)：221-223，2000年3月/4月)；Elkord等人(人单核细胞分离方法影响体外产生的树突细胞的细胞因子产生.免疫学.2005年2月；114(2)：204-212)；Repnik等人(简单且具有成本效益的从血沉棕黄层分离单核细胞.免疫方法期刊卷278，Issue 1-2，2003年7月，第283-292页)；Zhang等人(小鼠巨噬细胞的分离与鉴定.Curr.Protoc.Immunol.83：14.1.1-14.1.14.2008)；John Q.Davis和Siamon Gordon(人巨噬细胞的分离和培养.分子生物学方法中的基本的细胞培养方法第290卷，2005年，第105-116页)。
巨噬细胞是广泛分布于整个身体的单核吞噬细胞，在那里它们参与先天性和适应性免疫反应。巨噬细胞的生理学可以根据它们所处的组织环境和它们所暴露的局部刺激而变化。因此，这样的一系列不同的组织特异性巨噬细胞可以被鉴定，例如，来自脂肪组织的脂肪组织巨噬细胞，来自血液或骨髓的单核细胞，来自肝脏的可扑弗氏细胞。巨噬细胞是分泌细胞，可以通过分泌细胞因子和趋化因子来促进和调控免疫应答。鉴于其蛋白质，如CD14，CD40，Cd11b和CD64的特异性表达，可以通过流式细胞术分离人巨噬细胞。可以用类似的技术从其他哺乳动物，例如，小鼠或其他啮齿动物中分离巨噬细胞。关于单核细胞和巨噬细胞的综述，参见自然综述免疫学，11，(2011)。
通常由于有限的肿瘤血管形成，单核细胞及其后代，如巨噬细胞被吸引至缺氧组织(具有低氧张力的组织)，这是哺乳动物和实验肿瘤的标志性特征。单核细胞不断被招募到肿瘤中，在那里它们积累并分化成肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。实体和血液学恶性肿瘤中存在丰富的TAM，并且TAM与肿瘤的进展、转移和对治疗的抗性相关(Cook和Hagemann.肿瘤相关巨噬细胞和癌症.当前药理学观点.卷12，第4期，2013年8月，第595-601页)。研究已经表明，在肿瘤中发现，巨噬细胞通过上调缺氧诱导转录因子来响应缺氧水平，所述缺氧诱导转录因子激活广泛的促有丝分裂、促侵袭、促血管生成和促转移基因(Lewis和Murdoch，巨噬细胞对缺氧的相应，对肿瘤进展和抗癌治疗的意义.Am J Pathol.2005年9月；167(3)：627-635)。
本发明涉及能够被溶瘤性单纯疱疹病毒感染并且任选地能够摄取外源磁性材料的单核细胞或单核细胞衍生细胞，例如巨噬细胞或树突细胞，例如，通过吞噬作用，产生“负载”磁性材料的细胞。细胞可以是非人的，优选哺乳动物，例如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他啮齿动物(包括来自啮齿类动物目的任何动物的细胞)，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛，马，非人灵长类动物，或者可以是人类细胞。在一些实施方式中，优选的细胞是巨噬细胞，例如人或哺乳动物的巨噬细胞。
可以从待治疗的受试者分离或获得单核细胞或单核细胞衍生细胞，例如，如上所述通过从外周血样品中分离。或者，它可以从供体受试者，例如，另一哺乳动物或人类(优选同一物种)分离或获得。可以筛选供体单核细胞的免疫相容性。可从其他细胞类型中分离单核细胞或单核细胞衍生细胞，以提供基本上不含非单核细胞或单核细胞衍生细胞的培养物或制剂。任选地，合适的支持物或饲养层细胞可以存在于培养物或制剂中。
分离的细胞可以在体外培养，可以在体外被溶瘤性单纯疱疹病毒感染并负载磁性材料。
单核细胞或单核细胞衍生细胞的感染是指在适于单纯疱疹病毒进入细胞的条件和足够多的时间下，将细胞与溶瘤性单纯疱疹病毒接触。这种感染可以优选在体外细胞培养条件下进行。用于体外感染人和哺乳动物细胞的技术是本领域普通技术人员已知的，例如，参见Szántó等人.在没有特异性抗疱疹抗体的情况下，用1型和2型单纯疱疹病毒持续感染BHK细胞.Acta Virol.1976年2月；20(1)；40-7)；Conner等人,与在vero细胞中生长的HSV1716相比,生长在幼仓鼠肾细胞中的单纯疱疹病毒1型毒株HSV1716已经改变了非许可的中国仓鼠卵巢细胞的向性.J Virol.2005年8月；79(15)：9970-81。用于体外培养巨噬细胞的技术也是本领域普通技术人员已知的，例如参见John Q.Davies和Siamon Gordon(人巨噬细胞的分离和培养.分子生物学方法中基本的细胞培养方法.第290卷，2005年，第105-116页)。
因此，制备感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的方法可以包括在合适的条件下，例如，在体外细胞培养的条件下，将一种或多种(任选地一群)单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞与一定量的溶瘤性单纯疱疹病毒接触足够的时间，使得单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞被生产性感染。
任选地，可以在病毒能够诱导细胞死亡的条件下维持细胞培养。虽然不希望被理论所束缚，但是发明人认为，单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞感染后，溶瘤性单纯疱疹进行复制，病毒后代随后裂解细胞，导致细胞死亡。因此，培养条件和持续时间可能适合于产生具有完整和死亡的，例如，裂解的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的混合物的培养物。
细胞可以与病毒接触，从而实现0.5-100的感染复数(MOI)，任选的为0.5-5,1-10,10-20,20-30,30-40,40-50,50-60,60-70,70-80,80-90,90-100,1-30,5-30,5-50,或30-50中的一种。
任选地，可以在感染后的预定时间内向受试者施用细胞。这可以确保在目标组织或肿瘤中发生细胞死亡(例如裂解)，从而使得病毒在目标组织中的传染和扩散。因此，可以在感染的1小时，2小时，3小时，6小时，12小时，18小时，24小时，30小时，36小时，42小时，48小时，3天，4天，5天，6天或7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天或14天内施用细胞。
用磁性材料负载单核细胞或单核细胞衍生细胞也可以在体外培养条件下进行，并且这个步骤可以在用溶瘤性单纯疱疹病毒感染细胞之前，一起或之后进行。用磁性材料负载单核细胞或单核细胞衍生细胞的技术在例如Kaim等人的超小型超顺磁性氧化铁颗粒的磁共振成像在大鼠实验性软组织感染中的应用.放射学2002年12月；225(3)：808-14，以及Muthana等人的一种提高基于细胞的基因疗法的效果的新的磁性方法.基因治疗(2008)15,902-910)中有所描述。通过将细胞与具有约20-300μg/ml，或约50-150μg/ml，75-125μg/ml，90-100μg/ml中任一种，或约100μg/ml的颗粒浓度的磁性颗粒悬浮液接触，从而将细胞负载有磁性材料。
因此，除了感染溶瘤性单纯疱疹病毒，制备单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的方法可包括以下步骤：在合适的条件下(例如体外细胞培养)，将细胞与一定量的磁性材料接触足够时间，以允许磁性材料摄入(例如，通过吞噬)单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。
在感染和/或摄入磁性材料之后，可以根据需要进一步培养，收集，分离，纯化或分离细胞并配制成合适的制剂。
本文所述的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞可以配制成制剂，例如临床使用的药物组合物或药物，在此类制剂中，可以与药学上可接受的载体，稀释剂或佐剂组合。配制或生产制剂的方法可以包括将选择的细胞与药学上可接受的载体，佐剂，稀释剂或缓冲剂混合。
制剂可包含单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体，这意味着制剂由多个具有共同特征的所述细胞组成，例如，感染有溶瘤性单纯疱疹病毒并且任选地含有外源磁性材料的单核细胞，单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。如本文所述，制剂可以采用任何剂型。单纯举例而言，制剂可以是药物组合物或药物，其包含细胞群体以及药学上可接受的载体，佐剂，稀释剂或缓冲剂。
举例来说，制剂可以配制为用于肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内或瘤内的施用路径，其可以包括通过导管进行注射或递送。合适的制剂可包含处于无菌或等渗介质中的细胞。药物和药物组合物可以配制成适用于注射的流体剂型，例如，可配制成液体、溶液、悬浮液或乳液，或者可以配制成储库或药库，例如，适合植入受试者体内，由此可以控制细胞的释放速率。储库制剂可以包括凝胶剂、糊剂、丸剂或胶囊剂。该制剂可以在合适的容器或包装中提供。可以将流体制剂配制成通过注射或通过导管向人体或动物体的选定区域施用的剂型。
如本文所用，术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在合理的医学判断范围内适合用于与有问题的所述受试者(例如人)的组织接触，且没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险率相称。每种载体、佐剂、赋形剂等在与配方的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。合适的载体、佐剂、赋形剂等可以在标准的药学教科书中找到，例如雷明顿药学大全，第18版，MackPublishing Company，Easton，PA，1990；和“药物赋形剂手册”(Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第2版，1994。
细胞群体指的是具有共同特征的多个细胞，例如，感染了溶瘤性单纯疱疹病毒，并且任选地含有外源磁性材料的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，所述群体将包含大约数百个或更多给定类型的细胞，即单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。所述群体可能具有数千个或更多的给定类型的细胞或数量级约为1×104,1×105,1×106,1×107或更多的细胞。群体可存在于细胞的体外培养物中或者可以从细胞的体外培养物中分离，或者可以存在于细胞制剂中，例如，存在于药物组合物或药物中。
细胞群体可指在培养物或制剂中的所有细胞，或基本上所有细胞为给定类型，即培养物或制剂中的所有细胞或基本上所有细胞是单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，细胞的制剂或培养物可以含有其他类型的细胞，例如，饲养层细胞或成纤维细胞，其可以任选地不被认为是群体的一部分。在一些实施方式中，优选地，在细胞群体中至少80％的细胞是单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，该百分比可以是81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100％中的任何一个。
优选地，在细胞群体中，至少80％或81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100％中任何一个的群体中单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞被oHSV感染，并且任选地还含有外源磁性物质。在一些优选实施方式中，基本上全部，例如群体中95％或更多的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞被oHSV感染，并且任选地还含有外源磁性材料。
在细胞群中，感染了oHSV的一些单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞可能已经经历了细胞死亡(例如被oHSV裂解)。即将死亡或已经死亡(例如裂解)的细胞可能占感染oHSV的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的1-50％，或占单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的群体的1-50％。在一些实施方式中，该范围可以是0.5％-5％，1-5％，1-10％，1-20％，10-20％，10-30％，20-40％或30-50％中的任何一个。这可以是在向受试者施用时群体中即将死亡或已经死亡(例如裂解)的细胞的百分比。
在一些优选的实施方式中，单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞未进行含有编码与细胞异源的多肽(或其他核酸编码产物)的至少一个拷贝的核酸的修饰。即，细胞未进行表达异源多肽或其它核酸编码产物的修饰。这样的细胞不适用于或不能用于基因治疗方法，并且其所用于的医疗方法可以任选地是不涉及基因治疗(即依赖于异源多肽或其它核酸编码产物表达的医疗方法或治疗方法)的方法。
任选地，并且如本文别处所述，单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞感染的oHSV也可以是未进行含有编码与病毒异源的多肽(或其他核酸编码产物)的核酸的修饰，因此也不适用于或不能用于基因治疗方法，并且其所用于的医疗方法可以任选地是不涉及基因治疗的方法。
施用优选为“治疗有效量”，这足以向个体显示有益效果。实际的施用量，以及施用速度和施用的时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量等的决定，在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑从业者已知的待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法和其他因素。上述技术和方案的实例可以在雷明顿药学大全，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins中获得。
在一些实施方式中，溶瘤性单纯疱疹病毒的复制或增殖对缺氧环境不响应。也就是说，相对于野生型病毒或亲本溶瘤病毒(例如HSV1716)，溶瘤性单纯疱疹病毒未进行使其对缺氧环境发生响应的修饰(或被进一步修饰)。例如，病毒复制和/或基因表达不受一种或多种调控元件的控制，例如，在受感染的细胞或周围组织中对缺氧响应(例如激活或抑制)的启动子。
在一些实施方式中，相对于野生型病毒或亲本溶瘤病毒(例如HSV1716)，溶瘤性单纯疱疹病毒未进行使其在包括肿瘤组织的特定组织类型中复制或增殖的修饰。例如，病毒复制和/或基因表达不受一种或多种调控元件(例如，对特定组织中的位置响应(例如被激活或抑制)的启动子)的控制。例如，病毒复制和/或基因表达未处于一种或多种组织特异性或肿瘤特异性启动子(或其他调控元件)的控制之下。
单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的感染诱导形成不同的细胞群体
感染了溶瘤性单纯疱疹病毒的巨噬细胞的基因表达分析表明，在感染之后，细胞经历了某些因子的表达改变，包括一些促炎细胞因子，如IL-6，IL-8，TNF-α，IL-1，CXCL-1，一些抗炎细胞因子，如IL-10，CXCL-6和其它因子，如NFκB，VEGF-A和TGF-β等。
因此，感染了溶瘤性单纯疱疹病毒会导致形成不同的细胞群体，其特征为，具有某些基因/蛋白的不同表达模式的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞。通过培养或制剂的条件，即常氧(约18-22％的pO2)或缺氧(低于5％的pO2，优选0.1-3％的pO2)，所述细胞的特征进一步表现。可以将细胞提供为细胞的体外或离体制剂的形式，任选地是分离的或纯化的，并且可以是分别在含氧量正常或缺氧的条件下在培养基或制剂中维持的细胞。
在一些实施方式中，与相同类型的未感染细胞相比，一种或多种促炎细胞因子IL-6，IL-8，TNF-α，IL-1，CXCL-1的表达可以是上调的。当细胞处于缺氧条件(例如约0.1％的pO2)时，这种上调可以优选出现。IL-8和/或IL-1的上调可以是至少2倍，任选的3倍或5倍。在缺氧条件下也可以观察到NFκB或TGF-β或CXCL6表达的上调。NFκB和其它因子的上调可能与1型T细胞应答(Th1和/或Tc1)的诱导相一致，这对于癌症的治疗是需要的，可能与病毒颗粒从细胞释放时与在受试者中引发的抗病毒Th1型免疫应答相叠加。
在一些实施方式中，与相同类型的未感染细胞相比，一种或多种IL-8，IL-1，NFκB，IL-10和VEGFA的表达可以是上调的。当细胞处于缺氧条件(例如，小于5％的pO2，优选0.1-3％的pO2)时，这种上调可以优选出现。这种上调可以是至少2倍，任选地3倍或5倍或更多。
在一些实施方式中，与相同类型的未感染细胞相比，一种或多种抗炎细胞因子IL-10，CXCL-6的表达可以是下调的。当细胞处于含氧量正常的情况下，可能发生这种下调。
在一些实施方式中，在含氧量正常的条件下，IL-6，IL-8，TNF-α，IL-1和VEGFA中的一种或多种可以是上调的，并且NFκB，TGF-β，IL-10，CXCL6和CXCL1中的一种或多种可以是下调。
在一些实施方式中，在缺氧条件下，IL-6，IL-8，TNF-α，IL-1，NFκB，TGF-β，IL-10，VEGFA，CXCL6和CXCL1中的一种或多种可以是上调的。
基因/蛋白的上调或过表达包括标记的表达水平大于给定类型的细胞或组织通常预期的水平。因此，可以通过比较相同类型的病毒感染细胞和未感染的细胞之间的表达水平来确定上调程度。
可以定量表达水平以进行绝对比较，或者可以进行相对比较。可以通过测定基因的表达，例如，通过测定mRNA水平，或通过测定蛋白质表达来确定表达水平。
在一些实施方式中，当测试样品中的表达水平是对照样品中的表达水平的至少1.1倍时，可以认为存在上调。在一些实施方式中，表达水平可以选自为以下一种：为对照样品的表达水平的至少1.2，至少1.3，至少1.4，至少1.5，至少1.6，至少1.7，至少1.8，至少1.9，至少2.0，至少2.1，至少2.2，至少2.3，至少2.4，至少2.5，至少2.6，至少2.7，至少2.8，至少2.9，至少3.0，至少3.5，至少4.0，至少5.0，至少6.0，至少7.0，至少8.0，至少9.0，和至少10.0倍。
可以以相应的方式确定下调，例如，在一些实施方式中，当测试样品中的表达水平小于对照样品中的表达水平的0.9倍时，可认为存在下调。在一些实施方式中，表达水平可以选自以下一种：小于对照样品的表达水平的至少0.8，小于0.7，小于0.6，小于0.5，小于0.4，小于0.3，小于0.2和小于0.1倍。
因此，感染的细胞代表了不同的和可鉴定的细胞群，其可用于过继性免疫治疗的方法中(例如，如Darcy等人，当前免疫学观点2014,27：46-52和Andreesen等人，白细胞生物学期刊，第64卷，1998年10月，第419-426页中所述)，其中细胞通过表达和/或分泌确定的因子或细胞因子提供治疗效果，所述因子或细胞因子促进受试者体内的免疫应答，优选，抗肿瘤应答。细胞群的这种作用是将溶瘤性单纯疱疹病毒运送到病变组织并将其释放到组织中的附加能力，导致单独的病毒介导的抗肿瘤应答。
因此，本发明的一个方面提供了一种方法，该方法包括从受试者获得血液或组织样品，从所述血液或组织样品中分离单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞，用溶瘤性单纯疱疹病毒感染所述细胞，配制包含所述感染细胞的制剂，并将所述制剂施用于所述受试者。该方法可以是过继免疫治疗方法的一部分。
磁性材料
磁性材料可以包括易受磁性影响的材料、可磁化材料或可以通过磁场操纵(例如移动)和/或定位的材料。磁性材料可以是非磁性的，但是易于被磁场操纵或定位，或者可以是磁性的(例如，磁力线源)。因此，磁性材料可以是固有磁性的，或者可以是在磁场中反应，例如，移动的磁性材料。
在优选的实施方式中，磁性材料是磁敏粒子或者是流体，例如悬浮有磁敏粒子的流体，通常称为铁磁流体，
磁敏粒子可以包括磁敏粒子、可磁化粒子或可以被磁场操纵(例如移动)和/或定位的粒子。磁敏粒子可以是非磁性的，但是易受磁场的操纵或定位，或者是磁性的(例如磁力线源)。
典型地，粒子的尺寸适合于将试剂递送到细胞中而不造成对细胞的损害。一方面，粒子的平均尺寸在10μm和5nm之间，例如在1μm和10nm之间，例如在200nm和20nm之间或者在5nm和50nm之间。在另一个方面，所述磁敏粒子可以是球形珠，并且可以具有以下直径：至少约0.05μm，至少约1μm，至少约2.5μm，并且通常小于约20μm，或者可以具有以下直径：约5至50nm，10至40nm，20至30nm或约25nm。
不希望受到理论的限制，据信，较大的粒子将增加单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的摄取。例如，>30nm的磁性粒子将在公式τ＝μBsinθ的定义下在振荡磁场中经历扭矩，其中τ是扭矩，μ是磁矩，B是磁通密度，θ是施加场和粒子的磁化矢量之间的角度。例如，精确的扭矩量受粒子形状的影响。由这种扭矩引起的粒子运动被认为是“拖曳”粒子进入和穿过细胞表面，通过内吞机制诱导粒子的摄取。通过正常的细胞过程摄取粒子意味着不存在对细胞的机械损伤(例如，与基因枪方法或电穿孔相比)，从而提高粒子递送后的细胞存活率。
磁敏粒子可以是例如在美国专利申请公开号为20050147963或20050100930或美国专利号为5,348,876(每一个都通过引用的方式整体并入本文)中描述的磁敏粒子，或者市售珠子，例如由Dynal AS(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州USA)生产的，商品名为DYNABEADSTM和/或MYONETM的珠子。具体地，在例如美国专利申请号为20050149169,20050148096,20050142549,20050074748,20050148096,20050106652和20050100930以及美国专利号为5,348,876中描述的连接到磁敏粒子的抗体，每一个都通过引用的方式整体并入本文。
在一个方面，所述粒子包含顺磁性，超顺磁性，铁磁性和/或反铁磁性材料，例如元素铁，铬，锰，钴，镍或其化合物和/或其组合(例如锰和钴铁氧体)。粒子可以是超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子。例如，合适的化合物包括铁盐，如氧化铁，磁铁矿(Fe3O4)，磁赤铁矿(γFe2O3)，硫复铁矿(Fe3S4)和二氧化铬(CrO2)。
所述粒子可以包含嵌入聚合物中的磁性材料，例如在聚合物基质的孔内。或者，所述粒子可以包含被生物相容性涂层包围的磁芯，例如二氧化硅或聚合物，比如葡聚糖，聚乙烯醇或聚乙烯亚胺。
磁敏粒子可以包含试剂。所述试剂可以通过共价或非共价键(例如，氢键，静电相互作用，离子键，亲脂相互作用或范德华力)与粒子缔合(例如缀合)。一方面，试剂和粒子共价连接，例如通过将试剂暴露于带有反应性侧链的粒子，例如用于连接到蛋白质试剂的酪氨酸残基的联苯胺或用于与碳水化合物基团连接的高碘酸盐。另一方面，所述粒子可以与具有结合活性的分子(例如抗生物素蛋白)连接，并且该试剂可以与所述结合分子的配体(例如生物素)连接。这使得所述粒子和试剂能够在体外容易缀合。另一方面，所述粒子可以包含被吸收到基质，例如聚合物基质中的试剂。
磁性材料优选对单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞是外源的，即源自单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的外部，并且任选地不是通常存在于单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞中的材料。
磁场的应用
在单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞负载有外源磁性材料的实施方式中，在向受试者施用单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞之后，可以向受试者施加磁场，以便将施用细胞引导至在受试者体内的预期位置，例如，肿瘤。因此，这些细胞受到磁力，这是当磁性材料处于具有梯度的磁场中时施加在磁性材料上的力。磁力可以使磁性材料朝向磁场源移动。磁力还可能导致所述粒子经受扭矩。在一些配置中，磁力可能导致粒子远离磁场源。如果粒子被磁性阻挡并且不能旋转，则会发生这种情况。
如本文所用，磁铁或磁铁阵列的“力场”描述了磁铁或磁铁阵列周围的空间体积，其中磁性材料将经受磁力。
磁场可以由磁场源，通常为磁铁或磁铁阵列提供。磁体可以是电磁体。所选磁铁的类型和尺寸/功率将取决于应用。例如，在将细胞局部施用于身体表面附近的肿瘤的情况下，例如，原发黑色素瘤，手持式磁铁可能足以施加合适的磁力以引导细胞，例如通过组织或血管朝向肿瘤部位。在其他情况下，例如在肿瘤位于体内更深处和/或非局部施用于肿瘤的情况下，例如，全身施用，可以将所述受试者置于可变的或振动的，优选可控制的磁场中，例如电磁体的磁场，或由磁共振成像(MRI)、核磁共振成像(NMRI)或磁共振地形(MRT)设备提供的磁场。
在一些优选的实施方式中，本发明所述的方法和用途涉及将负载有磁性材料的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞指向或靶向至不位于皮肤附近的选定组织或肿瘤，即深层组织或器官。深层组织或器官可以是距离皮肤表面至少4cm或5cm或更远的深层组织或器官(测量的为从待处理的组织或肿瘤区域的中心到皮肤表面的最短距离)。组织或肿瘤可以位于受试者身体的核心处(即不包括腿和手臂的身体部位)。组织或肿瘤可能在头部，颈部，胸腔，腹部或骨盆中。组织或肿瘤可以是以下一种主要器官，或在以下一种主要器官中：例如，肾上腺，肾上腺髓质，肛门，阑尾，膀胱，骨，骨髓，脑，乳房，盲肠，中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑，子宫颈，结肠，十二指肠，子宫内膜，胆囊，食道，心脏，回肠，肠，空肠，肾脏，泪腺(lacrimal glad)，喉，肝，肺，淋巴，淋巴结，纵隔膜，肠系膜，子宫肌层，鼻咽，网膜(omentume)，卵巢，胰腺，腮腺，周围神经系统，腹膜，胸膜，前列腺，直肠，唾液腺，乙状结肠，小肠，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺和子宫。单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞可被定向或靶向缺氧的组织或肿瘤区域。
为了实现治疗，可以向受试者施用负载有磁性材料的细胞，并将细胞在磁场内定位。然后可相对于受试者和/或细胞改变或以其他方式操纵磁场，从而向包含在细胞内的磁性材料施加磁力，将磁性材料(和细胞)引导至受试者体内的预期位置，根据需要考虑施用细胞的组织的构造，例如，血液脉管系统。
用于将载有磁性材料和其他试剂的细胞磁性引导和/或定位到体内的靶部位(有时称为磁转染)的装置和技术是本领域普通技术人员已知的，并且举例来说，在Muthana等人(提高基于细胞的基因疗法的效果的一种新的磁性方法.基因治疗(2008)15，902-910)；Polyak和Friedman，(针对特定位点药物递送的磁性靶向：应用和临床潜力.药物递送专家意见(Expert Opinion on Drug Delivery)，2009年1月，第6卷，第1期：第53-70页)；Plank等人，(磁性增强的核酸递送。磁转染的十年-进展和前景.高级药物递送综述(AdvancedDrug Delivery Reviews)，第63卷，第14-15期，2011年11月，第1300-1331页)；和Li等人(利用磁性纳米粒子的肿瘤标靶的靶向癌症基因治疗(Oncotarget).2012年4月；3(4)：365-370)。
在优选实施方式中，将磁场施加到受试者身体是非侵入性的和非手术的。磁场源通常在受试者身体的外部，并且在优选的实施方式中不会与受试者的身体物理接触。
癌症
癌症可以是任何有害的细胞增殖(或由有害的细胞增殖自身表现的任何疾病)，瘤或肿瘤，或增加的有害细胞增殖、瘤或肿瘤的风险或倾向。癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性(转移性)。瘤或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的例子包括肾上腺，肾上腺髓质，肛门，阑尾，膀胱，血液，骨骼，骨髓，脑，乳房，盲肠，中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑，子宫颈，结肠，十二指肠，子宫内膜，上皮细胞(例如肾上皮细胞)，胆囊，食管，胶质细胞，心脏，回肠，空肠，肾脏，泪腺，喉，肝脏，肺，淋巴，淋巴结，淋巴母细胞，上颌骨，纵隔膜，肠系膜，子宫肌层，鼻咽，网膜(omentume)，口腔，卵巢，胰腺，腮腺，周围神经系统，腹膜，胸膜，前列腺，唾液腺，乙状结肠，皮肤，小肠，软组织，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，舌，扁桃体，气管，子宫，外阴，白血球。
需治疗的肿瘤可能是神经系统肿瘤或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢或外周神经系统，例如，胶质瘤，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，纤维神经瘤，室管膜瘤，神经鞘瘤，神经纤维肉瘤，星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可以起源于任何其他非神经组织，例子包括黑素瘤，间皮瘤，淋巴瘤，骨髓瘤，白血病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，霍奇金淋巴瘤，慢性髓细胞性白血病(CML)，急性骨髓性白血病(AML)，骨髓增生异常综合征(MDS)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，肝细胞瘤，表皮样癌，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结肠癌，卵巢癌，胰腺癌，胸腺癌，NSCLC，血液癌和肉瘤。
在一些实施方式中，癌症可以是实体瘤。
缺氧
在一些实施方式中，组织或癌症可以是具有缺氧环境的组织，并且可以针对该环境内的细胞，或与周围的含氧量正常的细胞一起或独立于它们进行治疗。
生理常氧在组织之间、动物之间以及个体之间变化。组织或器官可具有可变的测量值，例如取决于血管形成的模式。通常，健康的哺乳动物内部组织和器官通常具有大于20mmHg(大约2.62％氧气)的平均氧分压(例如，脑中约＞35mmHg，肠组织中＞50mmHg，肝中＞35mmHg，肌肉中＞25mmHg)。
在Carreau等人(J.Cell.Mol.Med.卷15，第6期，2011第1239-1253页)中描述了用于测量活体受试者中的生理常氧和缺氧的技术，其通过引用的方式并入本文。这些包括非侵入性和侵入性技术。非侵入性技术包括成像技术，如正电子放射断层造影术(PET)，磁共振波谱(MRS，例如19F-MRI，血氧依赖性MRI或动态对比增强MRI)，近红外光谱(NIRS)和电子顺磁共振波谱学(EPR)，任选地与缺氧标记如硝基咪唑(例如，氮霉素)结合。其他技术包括使用极谱传感器(通常被认为是测量氧张力的金标准)，与pO2灵敏的荧光染料(如氯化钌)结合的基于光纤的传感器以及质谱分析法。
在一些实施方式中，治疗方法可以包括测量或确定受试者组织中常氧和/或缺氧的状态，例如，氧分压的测量，以及选择受试者和/或受试者中的组织或部分组织，以用感染了溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞进行治疗。在细胞含有外源磁性材料并且使用磁共振方法确定常氧/缺氧状态的实施方式中，常氧/缺氧的状态的确定和细胞朝向选择的组织或部分组织的引导可以任选地同时进行。
已知缺氧在肿瘤中发生。在没有相应血管新生或血管生成(neovascularisation)的情况下，肿瘤的快速生长导致肿瘤区域内的氧浓度低于正常(含氧量正常)的健康组织中的氧浓度。因此，缺氧微环境发展了，并且肿瘤细胞的代谢可能变得适应缺氧环境。在Kizaka-Kondoh等人(肿瘤缺氧：选择性癌症治疗的靶标，Cancer Sci 2003年12月，第94卷，第12期,1021-1028)和和Vaupel(美国国家癌症研究所期刊第93卷，第4期，2001年2月21日，第266-276页)中评述了肿瘤缺氧，其中每一个都通过引用的方式明确地并入本文。
肿瘤缺氧在实体瘤中很常见。许多实体瘤包含低O2分压的区域，不能通过临床大小、分期、分级或组织学来进行预测。
在一些实施方式中，可以通过以下一种氧分压定义缺氧：小于约20mmHg，小于约15mmHg，小于约14mmHg，小于约13mmHg，小于约12mmHg，小于约11mmHg，小于约10mmHg，小于约9mmHg，小于约8mmHg，小于约7mmHg，小于约6mmHg，小于约5mmHg，小于约4mmHg，小于约3mmHg，小于约2mmHg，或小于约1mmHg。在一些实施方式中，可以将缺氧定义为组织具有0.01至15mmHg，5至15mmHg，0.01至10mmHg，3至10mmHg，5至10mmHg，7至10mmHg，8至10mmHg，8至11mmHg，或7至12mmHg的氧分压。在一些实施方式中，可以将缺氧定义为组织具有以下一种氧分压：约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11和12mmHg。[注：1mmHg＝133.322Pa；1％氧气＝1.013kPa或约7.64mmHg]
由于细胞代谢可以适应缺氧条件，也可以通过测定一个或多个标记物的表达来确定缺氧。
这种标记物包括转录因子，例如，NFκB或缺氧诱导因子(HIF)家族的一种，例如HIF-1α，HIF-2α亚型。HIF-1有两个亚基，HIF-1α和HIF-1β。HIF-1α和HIF-2α在缺氧发生的几分钟内被诱导。HIF-1α主要是对缺氧的急性应答，并且在长时间缺氧的情况下HIF-1α水平趋于降低。随着缺氧时间的推移，HIF-2α水平趋于持续增加。HIF-1α的诱导通常比HIF-2α的诱导需要更低的pO2(<5％[Carreau等人])。因此，在一些实施方式中，可以通过测定NFκB，HIF-1α或HIF-2α表达的上调来确定缺氧，该测定可以与被认为处于生理常氧的相应组织进行比较。
另一组标记物是缺氧调控微小RNA(HRMs)，其包括miR-21,23a，23b，24,26a，26b，27a，30b，93,103,106a，107,125b，181a，181b，192,195，210和213，它们可在缺氧细胞中上调。一些微小RNA可在缺氧细胞中下调，例如miR-15b，16,19a，20a，20b，29b，30b，30e-5p，101,141,122a，186,197,320。因此，在一些实施方式中，可以通过测定一种或多种缺氧调控微小RNA的上调或下调来确定缺氧。测定可以与被认为处于生理常氧的组织进行比较。
缺氧可诱导蛋白质组的变化，这在肿瘤缺氧的情况下可促进肿瘤的繁殖和对缺氧环境的适应。这种适应可涉及对营养匮乏的适应，例如，通过刺激糖酵解酶、葡萄糖转运蛋白(例如GLUT1和GLUT3)、血管生成分子、存活和生长因子(例如VEGF)、血管生成素、PDGF-β或TGF-β的转录。
受试者
待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选为哺乳动物，更优选为人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是病人。受试者可能已被诊断患有癌症，或疑似患有癌症。
试剂盒
在本发明的一些方面中，提供了一套试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可以具有至少一个具有预定量的溶瘤性单纯疱疹病毒(例如，预定量的病毒剂量或数量/量/浓度的病毒颗粒)的容器。可以配制溶瘤性单纯疱疹病毒，从而适合细胞感染。试剂盒还可包括至少一个具有预定量的磁性材料的容器。
试剂盒可同时提供用溶瘤性单纯疱疹病毒感染单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞，和/或用磁性材料负载单核细胞、单核细胞衍生细胞或巨噬细胞的说明书。这样的说明书可以用于例如，在体外细胞培养条件下进行离体或体外的所述感染和/或负载。
可在体外、离体或体内执行本发明所述的方法，或者产物可以在体外、离体或体内存在。术语“体外”旨在包括在实验室条件下或在培养中用材料、生物物质、细胞和/或组织进行实验，而术语“体内”旨在包括用完整的多细胞生物体进行实验和步骤。“离体”是指在生物体外存在或发生的某物，例如，在人体或动物体外，其可能在取自生物体的组织(例如整个器官)或细胞上。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合明显是不允许的或明确避免的。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
现在将参照附图通过举例的方式来说明本发明的各方面和实施方式。其他方面和实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提到的所有文件通过引用的方式并入本文。
附图的简要说明
现在将参照附图讨论说明本发明的原理的实施方式和实验，其中：
图1显示了在常氧或缺氧培养下用4pfu/细胞的HSV1716感染后不同时间的人巨噬细胞的滴定图。用1,180,000pfu的HSV1716感染约30万个原代人巨噬细胞，感染后不同时间收集样品，并在Vero细胞上滴定的HSV1716。以相对时间的总可滴定病毒作图，虚线表示输入病毒的量。
图2显示了在各种输入moi下用HSV1716常氧感染72小时后，来自人巨噬细胞的输出(总pfu)图。大约30万个原代人巨噬细胞在moi40,4,0.4和0.04时被HSV1716感染，仅在感染后72小时收集样品，并在Vero细胞上滴定HSV1716。
图3显示了在MOI 0(对照)(A)和5(B)感染72小时后LNCaP细胞群的代表性密度图。BL3-A检测器(X轴)是PI的量度，而BL1-A检测器(Y轴)是GFP的量度。每个点代表一个细胞。象限R4显示了未被HSV1716(PI-/GFP-)感染的存活群体；象限R3和R5代表死亡细胞(PI+)的数量；R2显示由HSV1716(PI-/GFP+)感染的活细胞。在对照(A)中，细胞群体主要分布在R4中，在MOI5(B)中，细胞向图的右侧(R3+R5)和上侧(R2)移动，这分别表示，细胞死亡增加和由HSV1716感染的活细胞的存在百分比。从Attune细胞计数软件获得该图。
图4显示了HSV1716诱导LNCaP细胞溶瘤。(A)X轴显示MOI，Y轴显示已经摄取HSV1716的活细胞的百分比。在MOI0.5和5下，在常氧条件下(各数据点的左侧柱；缺氧＝各数据点的右侧柱)观察统计显著性。(B)X-轴显示MOI，而Y轴显示细胞死亡百分比。细胞死亡在常氧和缺氧条件下(常氧＝各数据点的左侧柱；缺氧＝每个数据点的右侧柱)，在MOI 5具有统计显著性。值得注意的是，数据是n＝4个重复的平均值±SEM。p值<0.05，通过使用双向Anova测试进行多重比较测定。
图5显示了在MOI 0(对照)(A)和5(B)感染72小时后PC3细胞群的代表性密度图。BL3-A检测器(X轴)是PI的量度，BL1-A检测器(Y轴)是GFP的量度。每个点代表一个细胞。象限R4显示了未被HSV1716(PI-/GFP-)感染的存活群体；象限R3和R5代表死亡细胞(PI+)的数量；R2显示由HSV1716(PI-/GFP+)感染的活细胞。与细胞群主要由活细胞组成(事件分布在R4中)的对照(A)相比，在MOI5(B)时，一致比例的细胞向图的右侧(死细胞)和上侧(R2：感染的活细胞)移动。从Attune细胞计数软件获得该图。
图6显示了HSV1716对PC3具有细胞毒性作用。(A)X轴显示MOI，Y轴显示已经摄取HSV1716的活细胞的百分比。在MOI0.5和5下，在常氧条件下(各数据点的左侧柱；缺氧＝各数据点的右侧柱)观察统计显著性。(B)X-轴显示MOI，Y-轴显示细胞死亡百分比。细胞死亡在常氧和缺氧条件下(常氧＝每个数据点的左侧柱；缺氧＝每个数据点的右侧柱)，在MOI0.5和5下具有统计显著性。结果是4个(A)和8个(B)重复的平均值±SEM。p值<0.05，通过使用双向Anova测试进行多重比较测定。
图7显示了在MOI 0(对照)(A)和5(B)感染120小时后T47D细胞群的代表性密度图。BL3-A检测器(X轴)是PI的量度，BL1-A检测器(Y轴)是GFP的量度。每个点代表一个细胞。象限R4显示未被HSV1716(PI-/GFP-)感染的存活群体；象限R3和R5代表死亡细胞(PI+)的数量；R2显示由HSV1716(PI-/GFP+)感染的活细胞。活细胞群(A，对照)在感染120小时后(B，MOI 5)移向图的右侧，这表明存在死细胞。在R2象限(感染的活细胞)中也观察到显著比例的细胞。从Attune细胞计数软件获得该图。
图8显示了HSV1716的感染诱导T47D细胞死亡。(A)X轴显示MOI，Y轴显示已经摄取HSV1716的活细胞的百分比。在MOI 0.5和5下，在常氧和缺氧条件下(常氧＝每个数据点的左侧柱；缺氧＝每个数据点的右侧柱)观察统计学意义.(B)X轴显示MOI，Y轴显示死细胞的百分比。在常氧缺氧的条件下，细胞死亡在MOI 5时均具有统计学意义。结果是n＝3(A)和n＝5(B)个独立实验的平均值±SEM。p值<0.05，通过使用双向Anova测试进行多重比较测定。
图9显示了MOI 0(对照)(A)，5(B)和50(C)感染96小时后MDM细胞群的代表性密度图。BL3-A检测器(X轴)是PI的量度，BL1-A检测器(Y轴)是GFP的量度。每个点代表一个细胞。象限R4显示未被HSV1716(PI-/GFP-)感染的存活群体；象限R3和R5代表死亡细胞(PI+)的数量。与细胞群体主要由活细胞构成的对照(A)相比，在MOI5(B)处观察到朝向右侧图的切换(R3，R5)，这表明死细胞百分比增加了。在MOI 50(C)时，检测到细胞死亡略有增加，然而在MOI 5和50之间没有显著差异。从Attune细胞计数软件获得该图。
图10显示了HSV1716导致MDM细胞死亡。X轴显示MOI，Y轴显示死亡细胞的百分比。在MOI 5和MOI 50下(p值<0.001)，在常氧和缺氧条件下(常氧＝每个数据点的左侧柱；缺氧＝每个数据点的右侧柱)，细胞死亡具有统计学意义。在MOI 50下，在缺氧条件下观察到细胞死亡的增加。结果是n＝4个独立实验的平均值±SEM。使用双向Anova检验进行多重统计比较。
图11显示了表1：在巨噬细胞条件培养基中检测到的HSV1716浓度(PFU/ml)。该表显示了在MOI 0,5,50下，从感染的MDM收集并在常氧和缺氧条件下孵育的上清液中存在的HSV1716浓度(PFU/ml)。行显示不同的微环境(常氧，缺氧)；列表示进行的病毒感染(对照，MOI 5，MOI 50)。在MOI 5和MOI 50下都检测到病毒颗粒，在常氧和缺氧的条件下，MOI 50的浓度更高。数据是n＝4个独立实验的平均值±SEM。
图12显示了HSV1716裂解人巨噬细胞并将其释放到微环境中。X轴显示感染MDM的MOI，Y轴显示从平板收集的上清液中发现的HSV1716的浓度(PFU/ml)。在缺氧条件下，MOI50的结果具有统计学意义(p值<0.0001，通过使用双向Anova测试进行多重比较测定)。数据显示n＝4个独立实验的平均值±SEM。常氧＝每个数据点的左侧柱；缺氧＝每个数据点的右侧柱。
图13显示了包含在MDM条件培养基中的病毒颗粒诱导LNCaP细胞死亡。X轴显示用于感染巨噬细胞的MOI，从中收集条件培养基。Y轴显示死细胞的百分比。在常氧条件下，细胞死亡在MOI 50处具有统计学意义(p值<0.01)。结果是n＝3个独立实验的平均值±SEM。使用双向Anova检验进行多重比较统计分析。常氧＝每个数据点的左侧柱；缺氧＝每个数据点的右侧柱。
图14显示了表2：HSV1716诱导MDM基因表达水平的改变。表2显示了在常氧(第二行)和缺氧(第三行)条件下，在MOI 50下感染HSV1716 48小时后，对10个目标基因(在第一行中命名)计算MDM基因表达的倍数变化。在每种的条件下感染已经重复了两次。下划线值代表基因表达的指示性相关改变，不管是上调(值>1)还是下调(值<1)；即下划线值5.13意指在MOI 50感染后，发现细胞因子IL-8在缺氧条件下过表达，从而与对照相比，增加了5倍。
图15显示了用被感染的MDM(MOI 50)浸润球体诱导球体细胞死亡。图显示从浸润5天后(实验的第9天)通过流式细胞术检测的细胞死亡。Y轴显示％细胞死亡(PI+)，X轴显示在浸润之前MDM被感染的MOI。对照球体(对照)和用未感染MDM(0)浸润之间观察到活力无显著差异，当在MOI50(50)(51±5.92％细胞死亡)时，当将后者与对照和0(p值分别为0.009,0.004)进行比较时，细胞死亡具有统计学意义。结果是n＝3个独立实验的平均值±SEM。采用多重t检验进行统计分析。
图16显示了MR靶向用于控制基于细胞的治疗至患者的特定组织的可能应用。(a)示意图：用于这些研究的细胞来源于从患者血液分离的单核细胞。这些细胞在各种刺激物的存在下培养以产生“治疗性”巨噬细胞(例如细胞因子，治疗基因或病毒)，并且在再输注回同一患者之前负载超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)。(b)示意图：然后将受试者放置在MRI扫描仪的中心，其中可以用编码磁梯度的线性空间在磁化身体上引发作用力。注射到受试者血流中的磁性细胞在所施加的磁场的影响下循环并靶向到病变器官/组织。实测原图表明，MRI梯度线圈可以在各个方向产生显著的场梯度。所产生的磁场(dB/dy场)可以将磁性细胞引导到病变组织以增加细胞摄取。
图17显示了使用MR靶向将磁性巨噬细胞导入原发性前列腺肿瘤。(a)用于MR靶向的使用成像梯度的目标区域的示意图。A-Y梯度同样适用于整个动物，以如所描绘的那样靶向前列腺的位置(深色阴影框)。然后通过静脉注射向小鼠施用300万个磁性标记的巨噬细胞，然后将局部麻醉小鼠置于7T MRI扫描仪的等中心。受试者被分成两组。第1组在1小时后成像(无MR靶向)。第2组进行了MRI靶向。由(b)MRI靶向后一小时，胶原酶处理的肿瘤的FACS分析，以及(c)用抗人CD68抗体和普鲁士蓝(用于SPIO)进行石蜡包埋的肿瘤切片的组织学染色，事后检验证实了人巨噬细胞摄取水平的增加。(d)和(e)示出了每个组的代表性RARE图像和R2图。柱＝200μm。
图18显示了使用MR靶向将磁性巨噬细胞引导至肺转移瘤。短脉冲磁梯度被用来将负载SPIO的巨噬细胞引导到肺部。(a)经胶原酶处理的肺的FACS分析显示在肺中存在显著更多的具有MR靶向的人CD14+巨噬细胞，而非无MR靶向的人CD14+巨噬细胞。(b)伴随着对肺截面中人CD68和普鲁士蓝免疫染色的增加。(c)CD31和H&E的免疫染色表明，与没有靶向的递送相比，用MR靶向将磁性巨噬细胞递送到肺中，对肺血管没有不利影响。显示了两个重复实验中的一个代表性数据，其中n＝3只小鼠/组。描绘了SEM。与组A中非MR靶向的肺相比，*P<0.01。柱＝50μm。
图19显示了磁性靶向增加巨噬细胞病毒疗法对人前列腺(LUC-LNCaP)肿瘤的抗肿瘤作用。将携带有溶瘤病毒HSV1716(MDM+OV)的单剂量的人单核细胞衍生巨噬细胞(MDM)施用于荷瘤小鼠。将其分成三组小鼠(各5只小鼠/组)。一组进行MR靶向到前列腺或肺(MDM+OV+MRT)1小时，另一组暴露于MRI扫描仪，但没有MR靶向(MDM+OV，没有MRT)和第三组(MDM+OV)没有进入MRI扫描仪。另外一组小鼠接受100μl的PBS(对照)，单剂量的1×107pfu HSV1716(OV)或300万未处理的MDM。每周使用IVIS成像系统对小鼠进行成像，并且在21天之后，将肿瘤和肺移除并进行组织学处理。(a)肿瘤光度表明，MR靶向显著提高OV-MDM对肿瘤生长的效果(b)各种处理后的原发性肿瘤的代表性IVIS图像和照片(c)对于MDM+OV，有或没有MR靶向的代表性RARE图像显示治疗开始和结束时肿瘤大小有明显差异(d)。H&E染色的切片的外观显示(e)原发性肿瘤中存在坏死和(f)接受MDM+OV(有或没有MR靶向)的小鼠的肺中出现转移。显示了所有组的相应数据(e)。所显示的数据是平均值±SEM。对每个组织切片的10个高倍视野(HPF；×20倍)进行定量分析。与MDM+OV+MRT对MDM+OV(无MR靶向)相比，统计学显著性差异，*P<0.05；**P<0.001；***P<0.0001，并且^是比较MDM+OV(无MR靶向)和游离OV组；柱，200微米。
图20显示了使用新的跨内皮迁移(TEM)流式分析的初始MRT研究。设计了可容纳三维肿瘤球体以及血管内皮层的流动室。因此,流动的“磁性细胞”需要在进入3D肿瘤之前穿过血管屏障，模拟细胞穿过血管壁中的内皮细胞(A：左图)。将TEM流动室放置在具有球形(6mm直径)均匀7T磁场的MRI扫描仪的等中心。在(-y)梯度方向上施加了强度为300mT/m的脉冲梯度(最大值的50％)。所产生的不均匀磁场(dB/dy场)可以将磁性颗粒导向肿瘤球体以增加摄取(A：右图)。(B)图片显示SPIO对细胞死亡的影响；与未施加MRT相比，通过MRI图像中的扭曲和信号损失来证实摄取(Ci)。(Cii)显示了用携带报道腺病毒(AdCMVGFP)的巨噬细胞浸润的全部球状体的相应荧光图像。酶促分散的球状体的流式细胞术揭示了当施加梯度(Ciii&iv)时，渗入球体的磁性细胞的数量(存在于CD14+球体中的所有细胞的百分比)显著增加(*P<0.03)。数据是平均值±SEM，并且代表6个重复实验。与MRT处理的细胞相比，统计学显著性差异p＝0.0001。柱＝100um。
图21显示了利用MRI扫描仪中产生的磁场将磁性巨噬细胞导入原发性前列腺肿瘤。通过静脉注射施用300万个磁性标记的巨噬细胞。然后将小鼠置于7T MRI扫描仪的等中心。受试者被分成两组。第1组在1小时后成像(无MRT)。第2组进行MRT。记录CD31标记的肿瘤切片中每个视野的每个高倍视野的血管数目(a)。与没有接受MRT的小鼠相比，使用MRT将巨噬细胞导入到组织中，对肿瘤中的血管数目没有显著影响(p＝0.5165)。MRT进入肿瘤后的每个组的代表性MRI图像显示了信号的质量下降，这通过分析两组(b)中的横向弛豫率来证实。与第1组相比，第2组显示出增加的衰减率。利用MRI观察信号差异的预估的最佳回声时间大约为60ms–MRI转导导致信号的回声时间下降10％。这种显著的信号减少表明，组2中铁的水平增加。肿瘤组织的正常衰减率也用于比较(对照)显示。重复该实验，但使用无SPIO的巨噬细胞(每组N＝3只小鼠)。(c)中肿瘤的MRI图像中几乎没有明显的变形，这表明非磁性巨噬细胞的摄取较低，这通过胶原酶处理的组织的FACS分析进行证实(d)。数据呈现的是平均值±SEM。柱＝200um。
图22显示了在其他组织/器官中检测到极低数量的巨噬细胞。MRI导向的磁性巨噬细胞进入肿瘤导致非常少的巨噬细胞定位于其他组织。这是通过对死后取出的组织和器官的固体石蜡包埋切片进行组织学染色来确定。显示了从接受MRT或没有接受MRT的荷瘤小鼠取得的肝和脾脏的代表性切片。在这两种组织中，检测到用抗CD68染色后的少量人巨噬细胞(<2％，肝和<1％脾)。柱＝100um
图23显示了使用MRT将磁性巨噬细胞导入肺转移区域。这通过以下方法进行证实：用EPCAM(为了检测人前列腺肿瘤细胞)和普鲁士蓝(PB)对肺组织进行石蜡包埋连续切片的组织学染色，来检测铁阳性人巨噬细胞。代表性的图像显示，在MRI转向(a)后，在小鼠肺部转移性沉积物附近检测到PB阳性的巨噬细胞。值得注意的是，在H&E染色后，通过MRT靶向肺的铁以及巨噬细胞也是可见的(b)。柱＝200um和柱＝50um。
图24显示了HSV1716诱导LNCaP和巨噬细胞溶瘤的图。将HSV1716：GFP添加到在常氧(20％O2)和低氧(0.5％O2)培养条件下孵育的LNCaP细胞的培养物中。使用碘化丙锭通过流式细胞术评估肿瘤细胞死亡，并且与未感染的细胞相比，细胞死亡显著增加(a)。在MOI为5，p<0.03，MOI为50，p<0.001的常氧下，以及在MOI为5，p<0.01，MOI为50，p<0.001的缺氧下，这是剂量依赖性的。在MOI5和MOI50时，常氧和缺氧条件之间没有观察到统计学意义。正如感染后48小时的流式细胞术所评估的那样，在MOI 5和50下，MDM可有效吸收HSV1716。与缺氧条件(b)相比，在MOI 5(p<0.0004)和MOI 50(p<0.001)下，常氧的培养条件产生显著更多的表达GFP的巨噬细胞，但是有趣的是，与常氧条件相比，感染86h后在巨噬细胞上清液中检测到的HSV1716浓度(PFU/ml)比在缺氧条件下的MOI5和50的浓度更大。最后，在感染HSV1716(c，d)后，巨噬细胞的死亡在常氧和低氧(p<0.2)中均具有同等的感染性。数据是n＝4个独立实验的平均值±SEM。
图25显示了HSV1716感染、复制并杀死人巨噬细胞。用GFP标记的HSV1716感染人单核细胞衍生的巨噬细胞的第7天，显示出与细胞死亡增加相关的感染显著增加。图表显示(A)人单核细胞衍生的巨噬细胞的感染，(B)巨噬细胞死亡。将所有数据归一化为管家基因GAPDH，并进行6次独立实验(n＝6)。X轴0＝巨噬细胞(无病毒)。
图26显示了HSV1716在人巨噬细胞内复制。病毒蛋白表达的研究表明，病毒复制所需的立即早期(ICP0)和晚期(gB)基因在巨噬细胞中表现出显著的基因表达。图表显示(A)ICP0表达，(B)ICP8表达，(C)gB表达。将所有数据归一化为管家基因GAPDH，并进行6次独立实验(n＝6)。X轴0＝巨噬细胞(无病毒)。
图27显示了人巨噬细胞中的细胞死亡机制。在感染HSV1716 24小时后，在MOI为5时，HSV1716通过细胞凋亡以及以Fas依赖性的方式杀死巨噬细胞，FasL和Bcl-2基因表达均上调。与自噬相关的基因(Atg5和LC3B)的表达没有显著改变。图表显示(A)FasL，(B)Bcl-2，(C)LC3B，(D)Atg5的表达。将所有数据归一化为管家基因GAPDH，并进行6次独立实验(n＝6)。X轴0＝巨噬细胞(无病毒)。
图28显示了HSV1716的感染在巨噬细胞中诱导炎性表型。在感染后24小时，第7天的单核细胞衍生的巨噬细胞的HSV1716感染显著诱导典型炎症标记物的mRNA的表达。图表显示了(A)IL-6，(B)IL-8，(C)IL-10，(D)TNFα，(E)TGFβ，(F)NFκB的mRNA的表达。将所有数据归一化为管家基因GAPDH，并进行6次独立实验(n＝6)。X轴0＝巨噬细胞(无病毒)。
图29显示了HSV1716的感染诱导巨噬细胞中的炎性表型。第7天的单核细胞衍生的巨噬细胞的HSV1716的感染显著诱导典型的炎性M1巨噬细胞标记物(NOS2，CXCL10)的mRNA表达，并下调由肿瘤衍生的巨噬细胞(MRC1)表达的典型的M2标记物。图表显示(A)Arg1，(B)Nos2，(C)MRC1，(D)VEGF，(E)CXCL10的mRNA的表达。将所有数据归一化为管家基因GAPDH，并进行6次独立实验(n＝6)。
图30显示了HSV1716的感染诱导巨噬细胞中的PCNA的表达。第7天的单核细胞衍生的巨噬细胞的HSV1716感染显著诱导PCNA的表达。这是用于在终末分化的非肿瘤细胞中诱导病毒复制和巨噬细胞死亡的潜在机制。所有数据均归异一化为管家基因GAPDH，并进行4次独立实验(n＝4)。
在下面的所附的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方式的细节，其包括发明人设想的用于实施本发明的最佳实施方式的具体细节。对于本领域技术人员来说，本发明可以在不限制这些具体细节的情况下实践本发明是显而易见的。
实施例
下面给出的实施例显示，用溶瘤HSV1716(Seprehvir)感染的肿瘤条件性巨噬细胞显示了经典的活化(M1)谱，具有促炎性因子，例如iNOS，IL-6，IL-8和TNF-α表达的特点。此外，可以使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)对M1巨噬细胞进行磁性标记，然后使用所有磁共振成像系统(MRI)所固有的脉冲磁场梯度从血流非侵入性地引导至深部靶组织，包括原发性和继发性肿瘤。我们已经使用这种磁共振靶向(MRT)方法来递送基于细胞的溶瘤病毒疗法。弛豫时间的测定表明标准的MR成像可以用来监测这种疗法的效果。
实施例1
HSV1716和人原代巨噬细胞
1)在最初的研究中，用约4pfu/细胞的HSV1716感染人的巨噬细胞，然后在正常和缺氧条件下孵育细胞。感染后不同时间点(+1.5小时，+24小时，+48小时和+72小时)取样并滴定(图1)。
在1小时内，90％的病毒已经被巨噬细胞吸附，然后在常氧或缺氧条件下,在24或48小时检测不到病毒(滴定检测限为100pfu/ml)。
值得注意的是，在72小时可检测到病毒，但此时在常氧和缺氧巨噬细胞中的量相似。这种意外显现的病毒具有重大的意义，因为它可能是已经进入暂时潜伏状态的原始输入，也可能代表了巨噬细胞复制的第一波。
2)用减少的HSV1716moi(40,4,0.4和0.04)感染巨噬细胞，仅在72小时后滴定样品。从moi 40,4和0.4感染的巨噬细胞中检测到病毒，但是没有从0.04moi感染的巨噬细胞中检测到病毒(图2)。有趣的是，相对于输入pfu，72小时后检测到的病毒比值与图1所示的其它两个72小时的常氧/缺氧时间点的病毒比值大致相同和相似。
综上所述，发现人原代巨噬细胞具有高的吸附HSV1716的能力，并且在培养48小时后可以从巨噬细胞中回收活性病毒。
实施例2
使用三种不同的癌细胞系(LNCaP，PC3，T47D)和衍生自人单核细胞的巨噬细胞；在琼脂糖包被的培养板上制备多细胞球体；使用HSV1716GFP，使得通过荧光显微镜和流式细胞术定量癌细胞和肿瘤球体的摄取；最后，通过RT-PCR分析HSV1716感染后的巨噬细胞基因表达的变化。
结果显示，HSV1716在前列腺癌和乳腺癌细胞系中诱导细胞死亡，并且在96小时内有效杀伤HSV1716感染的巨噬细胞；此外，用HSV1716感染的巨噬细胞浸润球体引起肿瘤球体细胞死亡。
材料和方法
细胞系
人前列腺癌细胞系LNCaP和PC3以及人乳腺癌细胞系T47D由Helen Bryant博士(英国谢菲尔德医学院肿瘤学系)提供。细胞在添加有10％胎牛血清的RPMI中培养。
人MDM的制备
巨噬细胞衍生自人单核细胞，其从血小板耗尽的血沉棕黄层(血液输血服务，Royal Hallamshire医院，谢菲尔德，英国)分离。通过使用聚蔗糖梯度离心(BURKE 2003)从血液中分离单核细胞。分离后，将单核细胞接种到T75组织培养瓶(个细胞/瓶)中，并在添加有2％AB血清的IMDM中培养3天。
单纯疱疹病毒1716
HSV1716由Virttu生物制剂(英国格拉斯哥)提供。通过使用0.5和5的感染复数(MOI)，即感染期间每个细胞添加的病毒颗粒的数量，进行巨噬细胞感染。用GFP标记来检测HSV1716(用流式细胞术和荧光显微镜进行测定)。
感染原发性MDM
将MDM在添加有2％AB血清的IMDM中培养3天；3天后，用PBS洗涤细胞，用添加有10％FBS的RPMI替换培养基。在MOI 50下，感染细胞并孵育过夜(常氧条件：20％pO2；缺氧条件：0.1％pO2)。24小时后，用新鲜培养基替换条件培养基，并将细胞再孵育72小时。感染96小时(4天)后，用流式细胞术测定细胞活力。
原发性MDM浸润肿瘤球体
通过将2×104个细胞/孔的LNCaP细胞以100μlRPMI(+10％FBS)接种到2％的琼脂糖包被的96孔板中来制备肿瘤球状体。72小时(3天)后，每孔加入5×103个感染的巨噬细胞。再过5天进行细胞死亡分析；每天在荧光显微镜下观察球体，用来检测HSV1716GFP在缺氧核心中是否存在。
流式细胞仪
通过流式细胞术测定细胞活力/死亡和GFP表达。收获细胞，重悬于PBS中并用PI(1μl/样品)标记以定量细胞死亡。使用Attune Acoustic Focusing Cytometer(LifeTechnologies)分析每个样品中PI阳性细胞和GFP阳性细胞的百分比。用BL3检测器检测PI(激发波长：488nm；最大发射波长：617nm)BL1用于GFP检测(在488nm处为激发波长，在509nm处为最大发射波长)。
RT-PCR
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染巨噬细胞的RNA水平，并确定HSV1716是否引起基因表达的改变。将细胞(1.5×106)接种到6孔板中并用MOI50的HSV1716感染。孵育48小时后(常氧条件：20％pO2；缺氧条件：0.1％pO2)，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)收获细胞并进行RNA提取。使用精确引物设计nanoScript RT试剂盒(Primer design PrecisionnanoScript RT Kit)和T100热循环仪(Bio-Rad)将RNA合成cDNA。将cDNA置于具有目标基因引物的384孔PCR板中。使用ABI7900实时PCR进行PCR。
IL-6
正向:5'-CGAAAGTCAACTCCATCTGCC-3'
反向:5'-GGCAACTGGCTGGAAGTCTCT-3'
IL-8
正向:5’-GGGCCATCAGTTGCAAATC-3’
反向:5’-TTCCTTCCGGTGGTTTCTTC-3’
TNFα
正向:5'-CCAGGAGAAAGTCAGCCTCCT-3'
反向:5'-TCATACCAGGGCTTGAGCTCA-3')
IL-1
正向:5'-CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3'
反向:5'-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3')
NFκB
正向:5’-ACCTGAGTCTTCTGGACCGCTG-3’
反向:5’-CCAGCCTTCTCCCAAGAGTCGT-3’
TGFβ
正向:5’-TAGGAACAGGCGGCGACGAATACA-3’
反向:5’-CACAATCACAAGGCAACTTCAAT-3’
IL-10
正向:5’-GCCTAACATGCTTCGAGATC-3’
反向:5’-CTCATGGCTTTGTAGATGCC-3’
VEGF-A
正向:5’-GAAGTTCATGGACGTCTACCAG
反向:5’-CATCTGCTATGCTGCAGGAAGCT-3’
CXCL-6
正向:5’-GAATTTCCCCAGCATCCCAAAG-3’
反向:5’-TGCCTTCTGCACTCCCTTTATC-3’
CXCL-1
正向:5’-AGAATGTTTTCAAATGTTCTCCAGTC-3’
反向:5’-GGCCATTTGCTTGGATCCG-3’
统计分析
数据以平均值±SEM报告。使用GraphPad Prism进行统计分析和制图。进行双向ANOVA检验用于多重比较和多重t检验，以比较获得的实验数据。将统计学意义限于p＝0.05的值。
结果
HSV1716诱导肿瘤细胞死亡
LNCaP细胞系
为了分析HSV1716对前列腺癌细胞的溶瘤潜力，将LNCaP细胞接种到12孔板(2×104个细胞/孔)中，并用MOI 0(对照)，0.5和5的HSV1716进行感染。使用HSV1716–GFP进行重复感染，用来显现活细胞对病毒的摄取。将板保持在含氧量正常和缺氧的培养箱中，以研究HSV1716在含氧和非含氧条件下杀死细胞的能力。24小时后，用新鲜培养基替换条件培养基。72小时后，收集平板并用流式细胞术分析细胞。以PI(+)细胞测定细胞死亡；将活细胞中的病毒摄取测定为GFP(+)/PI(-)细胞(图3)。感染72小时后，在含氧量正常的条件下，在MOI0.5(p<0.0001)和MOI 5(p<0.0001)下，分别观察到有56±6.35％和53±8.7％的细胞被病毒摄取，而在缺氧条件(MOI 5为16±4.73％，p<0.05)下水平非常低。在MOI 5时，在常氧(31±7.32％，p<0.01)和缺氧(38±1.36％，p<0.05)条件下均观察到细胞死亡水平的统计学意义(图4)。有趣的是，尽管在缺氧条件下病毒吸收似乎不是那么高，但是在MOI5时结果显示了显著的细胞死亡水平(图4)。
PC3细胞系
PC3是具有高转移能力的前列腺癌细胞系，并且比LNCaP更具侵袭性。将2×104个细胞接种到12孔板中并用MOI 0,0.5和5的HSV1716感染。将细胞在常氧和缺氧条件下孵育72小时。24小时后，用新鲜培养基替换条件培养基以消除未被细胞摄取的病毒颗粒。72小时后，通过流式细胞术分析细胞并绘制PI(-)/GFP(+)细胞的量(图5)。病毒摄取百分比表明在常氧条件下，感染病毒颗粒的活细胞显著存在(MOI 0.5时为20±4.46％，MOI 5时为17±4.37％，p<0.05)；细胞死亡在常氧(MOI 0.5为23±2.49％，MOI 5，p<0.0001和17±3.14％，MOI 5，p<0.01)和缺氧条件(MOI 0.5时为20±1.34％，MOI 5时为19±2.68％，p<0.05)下均统计上显著。以图形报告由活细胞摄取病毒的百分比和细胞死亡百分比(图6)。
T47D细胞系
为了研究HSV1716对不同类型的实体肿瘤的溶瘤能力，评估了乳腺癌细胞系T47D的感染效果。将1×105个细胞接种到12孔板中，并用MOI 0,0.5和5的HSV1716和HSV1716-GFP感染。将细胞在常氧和缺氧条件下孵育72小时并通过流式细胞术分析。在任何条件下都没有观察到细胞死亡的迹象，即使，病毒摄取显著高达MOI 0.5时(数据未显示)。因此，120小时后进行重复分析，以验证T47D细胞系是否对HSV1716不响应，或仅比前列腺癌细胞系更不敏感。120小时后，通过流式细胞术观察细胞并绘制PI(-)/GFP(+)细胞的量(图7)。在MOI0.5和5时，活细胞的病毒摄取显著高于常氧下(MOI 0.5为38±0.35％，MOI 5为49±0.49％，p<0.0001)和缺氧下(MOI 0.5为27±5.52％，在MOI 5为17±2.18％，p<0.001)的水平，并且在常氧和低氧条件下(分别为29±1.37％和22±5.82％，p<0.0001)，发现在MOI 5时的细胞死亡是非常显著的(图8b)。
HSV1716感染对人巨噬细胞的影响
HSV1716有效杀死人巨噬细胞
为了确定巨噬细胞是否可以用作HSV1716疗法的递送系统，测试病毒感染对巨噬细胞的影响是重要的。分离3天后，收获MDM并计数；将1×106个细胞接种在6孔板中。一旦细胞附着到塑料上，就进行感染。在MOI 0(对照)，5和50下添加HSV1716。将细胞在常氧和缺氧条件下孵育96小时。24小时后用新鲜培养基替换培养基，第4天从每孔收集上清液用于进一步研究。96小时后，收集平板并通过流式细胞术分析细胞活力。结果显示，在MOI5和MOI50下，都可有效杀死细胞，在常氧条件下(MOI5为63±2.76％，MOI50为62±2.42％，p<0.0001)和缺氧条件(在MOI 5为43±4.91％，在MOI 50为p<0.001和57±7.34％，p<0.0001)下，具有高百分比的细胞死亡(图9,10)。
感染的巨噬细胞释放病毒颗粒
由于一半以上的细胞被HSV1716杀死，感染后相当多的病毒复制以及细胞裂解会导致病毒颗粒在微环境中释放。因此，为了证实HSV1716在巨噬细胞中具有杀伤和复制的能力，感染96小时后收集每孔的上清液并进行分析。从常氧和缺氧条件下以MOI 0,5和50感染的细胞获得的培养基组成的样品和上清液中是否存在病毒颗粒，通过滴定确定。在MOI 5和MOI 50感染的MDM上清液中检测到HSV1716，对于较高的MOI具有较高的浓度，而在对照组中没有观察到病毒(表1(图11))。有趣的是，与它们的常氧等价物相比，从缺氧条件下感染的细胞收集的样品显示HSV1716的浓度高2.5倍(在MOI 5下)和4倍(在MOI 50下)(图12)。
为了再次确认这个结果，用从感染的MDM收集的条件培养基感染肿瘤细胞。将LNCaP细胞接种到12孔板(1×104个细胞/孔)中，在1ml RPMI中用100μl的MDM上清液感染。感染120小时后，收集细胞并通过流式细胞术分析。然而，在PI染色后，在常氧条件下从MDM收集的条件培养基感染的细胞中(40±7.26％，p<0.01)，发现细胞死亡仅在MOI 50时显著，与滴定研究所预期的形成对比(在缺氧条件下更高的细胞死亡)(图8)。
HSV1716感染改变巨噬细胞基因表达
为了研究HSV1716感染如何改变MDM基因表达，使用定量RT-PCR定量了目标细胞因子和生长因子的mRNA水平。将1.5×106个细胞接种到6孔板中并在MOI 50下感染；将板在常氧和缺氧条件下孵育，以了解由于不同的环境而可能的基因表达的改变。感染后48小时，收获细胞，从感染的细胞和对照组中提取mRNA。然后从RNA合成cDNA，并将其接种到具有目标基因引物的384孔板中：促炎细胞因子IL-6，IL-8，TNF-α，IL-1，CXCL1；转录因子NFκB，抗炎细胞因子IL-10和CXCL-6，生长因子VEGF-A和TGF-β。选择β-肌动蛋白作为组成型表达的管家基因。进行RT-PCR后，将各基因的mRNA水平针对β-肌动蛋白的浓度进行归一化，并计算表达中的倍数变化。重复获得由HSV1716感染引起的基因诱导谱。报告了计算的每个基因的表达倍数变化；结果表明，在MOI 50时，HSV1716是促炎细胞因子的诱导物(在缺氧条件下IL-8，IL-1和促炎转录因子NFκB的较高诱导谱)。同时，常氧条件下NFκB和抗炎性TGF-β和IL-10的表达降低(尽管在缺氧条件下明显诱导后者)，而没有检测到趋化因子CXCL-1和CXCL-2基因表达的改变。有趣的是，在缺氧条件下观察到感染后VEGF-A的显著高的诱导(表2(图14))。
利用MDM的浸润球体导致肿瘤缩小
为了研究HSV1716向肿瘤递送，特别是向缺氧核心递送是否可以通过使用巨噬细胞介导，产生了肿瘤球状体。与二维培养相比，使用球体的优点在于由被充氧区域包围的氧气耗尽的中心区域构成；因此，球状体模仿了3D肿瘤。在第1天使用LNCaP细胞(接种到2％琼脂糖包被的96孔板中的1.5×104个细胞)产生肿瘤球状体。在细胞铺板(第4天)后3天，已经形成800μm/1mm直径的球状体。在第3天用MOI 50的HSV1716感染MDM，并温育24小时，未感染的细胞用作对照。第4天，收集细胞并计数；在MOI 0(对照MDM)和MOI 50(感染的MDM)下用5×103的MDM浸润球状体。此外，还考虑了对照球体(未浸润)。将平板再孵育120小时(直到第9天)。在第6天，在MDM感染72小时后，使用荧光显微镜拍摄照片，以观察球体内是否存在HSV1716(用GFP标记)。图像显示存在HSV1716感染的MDM；然而，MDM似乎局限于围绕缺氧核心的可行边缘，而在球体内部区域没有观察到GFP(+)细胞。发现球状体(对照组)的中心区域略微坏死，并且比预期的明显更暗。在第9天，在显微镜下进一步观察球状体并拍摄照片；没有检测到球体的形状和大小的显著变化。从浸润5天后(第9天)，收获球体并洗涤，通过流式细胞术分析细胞活力；而对照组和被未感染的MDM浸润的球体没有观察到明显的细胞死亡，以MOI 50感染的MDM浸润导致51±5.92％的细胞溶瘤(p值<0.01)(图15)。
讨论
研究结果显示，前列腺癌细胞系LNCaP和PC3以及乳腺癌细胞系T47D对HSV1716敏感，这表明这种病毒可用作治疗广泛肿瘤的疗法。尽管在不同的程度上，72小时(LNCaP，PC3)和120小时(T47D)后，前列腺癌和乳腺癌细胞系对MOI 5下的HSV1716感染都有反应；此外，活细胞中高水平病毒摄取的检测表明，随着时间的推移可以诱导进一步的细胞毒性效应。常氧和缺氧条件下，所有测定的细胞系的细胞死亡百分比相似(两组间未观察到统计学显著性)：这一结果表明，缺氧不会使HSV1716对体外肿瘤细胞产生抗性；因此，HSV1716可潜在地用于杀死难以治疗的癌症的缺氧区域。有趣的是，尽管在缺氧的条件下观察到明显的细胞死亡，但对于前列腺癌和乳腺癌细胞系，缺氧的病毒摄取通常低于常氧的摄取-而对于PC3则不显著。然而，报道的高水平的细胞死亡表明在缺氧条件下对HSV1716具有更高的敏感性。
对人巨噬细胞进行的研究表明，它们对HSV1716敏感。HSV1716在感染96小时后杀死巨噬细胞的能力具有根本的重要性，因为这意味着利用MDM作为病毒的递送系统的可能性，其将通过MDM转运到肿瘤缺氧区域内，复制，裂解MDM并随后感染并杀死附近的癌细胞。为了进一步证明HSV1716在MDM中的复制导致病毒颗粒在微环境中的释放，从感染的巨噬细胞收集上清液，目的是分析并检测其是否存在HSV1716。结果显示，病毒浓度随着MOI的增加而增加，如预期那样；有趣的是，在缺氧条件下，病毒颗粒的复制和释放比常氧高3倍。然而，当LNCaPs被相同的上清液感染时，120小时后，仅在常氧下明显有细胞死亡，MOI 50时，在缺氧条件或较低MOI下，没有观察到有效值。这个结果可以解释为上清液滴定后观察到的病毒颗粒的数量虽然在缺氧条件下较高，但一般不超过3×103PFU/ml：这样的数量对于病毒杀死细胞是不够的，考虑到使用100μl含有3×103PFU/ml(或更少，在MOI 5的情况下)的HSV1716的上清液感染2×104个细胞；这意味着在MOI<0.05下感染LNCaPs-极低的MOI(注意，当用HSV1716进行感染时，仅在MOI 5下观察到明显的细胞死亡)。然而，在MDM-条件培养基中检测到的如此低的HSV1716值意味着病毒的释放，并且当考虑到在推定的治疗方法中，一旦通过MDM递送并释放到环境中，病毒颗粒会遇到肿瘤细胞，感染它们，复制，进一步扩增病毒拷贝的量，并随后广泛散步到肿瘤中，该发现的重要性是很明确的。
为了测试MDM将HSV1716递送至肿瘤，特别是缺氧区域的能力，制备了多细胞3D球状体，目的是模拟真实肿瘤的结构。主要目标是了解MDM实际递送的病毒，是否足以在3D球体中诱导细胞死亡。相对较大的球体直径(800μm-1mm)允许在显微镜下观察可能的形状和大小的变化。此外，GFP标记的HSV1716的存在提供了检测球体内是否存在感染的MDM的机会，从而观察MDM是否实际上达到了缺氧核心。
与对照组(p值＝0.009)和用未感染的MDM(p值＝0.004)浸润的球体相比，在感染的MDM(MOI 50)浸润的球状体中观察到明显的细胞死亡。
在MDM感染(第6天)72小时后，在用感染的MDM处理的球体中观察到HSV1716GFP，其中弱gfp荧光与氧合边缘共定位。没有显著的绿色染色剂可能是由于使用了少量的MDM(每个球体只浸润5×103个细胞)。然而，由于被感染的MDM浸润的球体显示出显著水平的细胞死亡(51±5.92％，p值<0.01)，这表明HSV1716在MDM内部复制并在微环境中扩散，最终杀死肿瘤细胞，所以成功递送HSV1716。
为了了解HSV1716感染如何改变MDM中的基因表达，进行RT-PCR。基于它们的免疫特性，选择目标基因：促炎症细胞因子IL-8，IL-6，TNF-α，IL-1，CXCL-1，抗炎细胞因子IL-10，CXCL-6和因子NFκB，VEGF-A，TGF-β。人类细胞的病毒感染通常导致诱导促炎细胞因子和转录因子的信号通路的激活(Mogensen,T.H.,和S.R.Paludan，2001病毒诱导细胞因子产生的分子途径.微生物学和分子生物学综述65：131-+)。因此，人们认为有趣的是，分析在MOI50处HSV1716的感染对MDM基因表达的影响以及在含氧量正常和缺氧条件下感染之间的差异。
MOI 50下的HSV1716感染在48小时内引起促炎细胞因子的诱导，并且在缺氧条件下特别观察到表达的增加，而在常氧下没有观察到显著的变化。发现细胞因子IL-8和IL-1分别在缺氧条件下上调5倍和7倍。在缺氧条件下，观察到NFκB的表达也增加了5倍；然而，令人惊讶的是，在常氧下NFκB下调了5倍。该发现表明，MDM对HSV1716具有不同反应，其在没有氧气的情况下可能具有更高的炎症特性。如果是这样的话，这就表明HSV1716在缺氧中获得了更大的病毒效力：这个结果将进一步支持利用MDM将病毒递送到肿瘤的难以通过不同途径进入的靶向中心区域的原理。
HSV1716感染后，抗炎细胞因子IL-10和生长因子TGF-β下调5倍，但仅在常氧状态下下调。事实上，在缺氧的情况下，观察到抗炎性IL-10的表达增加了4倍，可能与促炎症作用相反。有趣的是，在缺氧条件下，VEGF-A有强烈的上调(21倍)，这可能部分归因于VEGF-A通常参与到缺氧响应的事实。
总之，本研究表明，HSV1716诱导前列腺癌和乳腺癌细胞系中的肿瘤细胞死亡，并且能够在MDM中复制并在周围微环境中散布。另外，结果显示，当通过MDM递送时，HSV1716引起多细胞3D球体中的细胞死亡；因此，巨噬细胞介导的将溶瘤HSV1716递送至肿瘤构成治疗实体瘤的可能的治疗方法。先前进行的临床试验显示，HSV1716的安全性极佳，使得以下成为可能：将其用作MDM递送疗法成为进一步增加可提供给癌症患者的治疗范围的令人兴奋的机会。
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实施例3
人巨噬细胞的分离和培养
使用淋巴细胞分离液(Amersham Pharmacia，St.Albans，UK)和先前所述制备的单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)21,22从血小板耗竭的血沉棕黄层(Blood TransfusionService，Sheffield，UK)分离单核细胞。
内皮细胞培养
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种到含有5μM小孔PET膜(Neuroprobe)的胶原包被的(0.1mg/ml，人IV型)膜上，24小时。
人多细胞肿瘤球状体
将人前列腺癌细胞系LNCaP以100μl培养基接种(5×103)至2％琼脂糖(Sigma，Dorset，UK)包被的96孔组织培养板的每个孔中。7-10天后，每个孔含有平均直径为700-800μm的肿瘤球体21。
原发巨噬细胞的感染
第3天，用复制缺陷型腺病毒(CMV-AdV5-GFP(由CMV启动子驱动))感染MDM，文献21中描述了病毒优化和GFP表达水平。
巨噬细胞对磁性纳米颗粒的细胞摄取
用100ug/ml SPIO(25nm)(Sigma-Aldrich，Poole，UK)培养MDM(用AdCMV-GFP感染)过夜。先前用流式细胞术评估细胞中积累的SPIO，并且通过光学显微镜观察的，将细胞吸引到放置在培养皿侧面的磁铁来证实，如Muthana，M等人在一种提高基于细胞的基因疗法的功效的新的磁性方法.Gene Ther(2008)中所述的。巨噬细胞摄取SPIO后，还使用DNA染料碘化丙啶(PI)测定了的细胞活力，并与未用SPIO孵育的细胞相比。在两组之间没有观察到统计学显著性差异p＝0.4(图20c)N＝3。
体外跨内皮细胞流式分析
跨内皮迁移(TEM)室的组装如图(20a)所示。使得负载SPIO的MDM(1.5×105个细胞/ml，在PBS+2％FCS中)以典型的静脉流速(1.1885ml/min)在1.4Dyns/cm2的剪切应力下流过HUVEC单层，这相当于血液流过后毛细血管微静脉。将TEM室直接定位在7特斯拉磁铁(Bruker BioSpecAVANCE II，310mm孔径，MRI系统B/C 70/30)的远端的等中心处。腔室中的流动沿-z方向(进入和离开磁铁孔)。我们使用2毫秒打开，7毫秒关闭的脉冲梯度，如Reigler等人13所述。为了引导SPIO进入包含肿瘤球体的腔室，我们施加强度为50％的脉冲y梯度30分钟以避免过度加热磁共振成像(MRT)后，1H体积共振器(Bruker，300MHz，最大1kW，外径118mm/内径72mm)用来捕获MR图像(FLASH和RARE)。
然后使用荧光显微镜评估MDM浸润的球状体，使用酶促分散的球状体以检测GFP阳性细胞和流式细胞术。为了测定SPIO负载的巨噬细胞内的铁含量，在分析之前将细胞沉淀物溶解在70％的硝酸中7-14天。通过使用Varian Vista-M PX14的原子发射光谱法，相对于校准用标准铁溶液(Fischer Scientific，Loughborough，UK)，定量铁浓度。
原位前列腺异种移植模型
在这些研究中使用雄性CD1无胸腺小鼠(Charles Rivers，UK)。将100万个LNCaP：LUC细胞(来自瑞典乌普萨拉的Magnus Essand教授的赠品)在基底膜基质中以1:1混合，并注射到背外侧前列腺中。通过使用生物性发光的IVIS成像评估确定肿瘤大小并测量小鼠的每日重量，如Muthana，M.等人巨噬细胞递送的溶瘤病毒完全破坏化疗或照射后的肿瘤生长和转移.Cancer Res，doi：0008-5472.CAN-12-3056[pii]10.1158/0008-5472.CAN-12-3056(2013)。在植入后约14天或在转移瘤模型中约21天(当将肿瘤细胞移植前列腺后发生肺部肿瘤时)后将荷瘤小鼠用于实验21。
使用MRI扫描仪来引导细胞运动
通过尾部静脉施用含有或不含有SPIO的三百万的MDM(在100μl体积的PBS(n＝5)中)，对照组接受100ul PBS(n＝5)或含有3x106个不含SPIO的巨噬细胞的100ul PBS(n＝5)中。在MDM施用后立即用气体异氟烷麻醉小鼠，然后将其固定在与磁铁相容的保持胶囊(holding capsule)中，并立即进行MR靶向。
将小鼠分成2组，每组n＝5个。第一组是时间匹配的对照，没有MR靶向，第二组进行1小时的MR靶向(见上文)，选择用于大致导向前列腺(-z，-y)的肿瘤部位的梯度。为了转向肺部(+z和-y梯度)，x梯度不存在从而确保每个肺中磁性颗粒的均匀分布。
磁标记细胞上的力取决于SPIO是否已经变得磁饱和。当不饱和时，力取决于SPIO的磁化率，磁场以及磁场梯度(Pankhurst,Q.A.,Connolly,J.,Jones,S.K.&Dobson,磁性443”纳米颗粒材料在生物医药的应用.J Phys D Appl Phys 36，R167-R181，(2003))。
然而，一旦SPIO达到饱和，力不再依赖于颗粒的磁化率而是依赖于饱和磁化强度，因此只有磁场梯度将影响施加到细胞的力(Riegler，J.等人，使用磁共振成像系统靶向磁性递送和细胞追踪.生物材料31,5366-5371，(2010))。代表性地，SPIO在远低于1T时达到磁饱和，例如在Riegler等人2013中，SPIO在300mT左右达到饱和，因此MRT在临床MRI系统中是可行的，只要使用相同的磁场梯度
在MRI转向之后，拍摄高分辨率RARE和FLASH肿瘤(仅前列腺)图像。一旦完成弛豫时间－使用MSE和MGE评估横向弛豫率。处理后，处死动物，将包括肿瘤，肾，肝，肺和脾的组织，或者固体石蜡包埋并固定用于免疫组织化学，或者通过流式细胞术分析以确定巨噬细胞的摄取。
内皮细胞培养
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自Promocell，(Heidelberg，德国)，并用于直至第8代的实验中。将细胞(150,000)接种24小时到含有5μM孔的PET膜(Neuroprobe)的胶原包被的(0.1mg/ml，人IV型)膜上。如CD31染色所见(数据未显示)，这导致HUVEC在过滤器上会合单层。
原发巨噬细胞的感染
第3天，MDMs被复制缺陷型腺病毒(CMV-AdV5-GFP)感染。该E1A/B缺失的腺病毒载体CMV-AdV5-GFP(由CMV启动子驱动)从单个噬菌斑中分离，在293人胚肾(HEK)细胞中扩增。所有病毒通过双重铯梯度离心纯化，在293细胞上通过噬菌斑测定滴度，其中滴度表示为空斑形成单位(PFU)/细胞。在文献21中描述了巨噬细胞中的病毒优化和GFP表达水平。
流式细胞分析
通过胰蛋白酶化MDM(包括共转导的MDM)获得单细胞悬浮液。然后将细胞在4℃与鼠抗CD14(1：100，在含有1％BSA(Sigma)的PBS中)孵育30分钟，以防止非特异性的抗体结合。或者，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化球体以分离肿瘤细胞和浸润的巨噬细胞，并通过流式细胞术，在流式细胞仪上运行之前立即向细胞中加入碘化丙锭(Sigma)来分析细胞死亡。
通过巨噬细胞对磁性纳米颗粒的细胞摄取
对于纳米颗粒细胞摄取的研究，用磁性纳米颗粒100μg/ml的SPIO(25nm)(Sigma-Aldrich，普尔，英国)培养MDM(感染AdCMV-GFP)过夜。通过流式细胞术评估与SPIO孵育后细胞中积累的MNP，这包括如us14所述用碘化丙啶(PI)测定细胞活力，并如光学显微镜(LeicaMicrosystems UK Ltd)所观察到的，通过将细胞吸引到置于培养皿侧面的磁铁来确认。
HSV1716病毒疗法
为进行治疗性研究，在感染复数(MOI)为5或50的情况下，用HSV1716GFP(将具有GFP表达盒的HSV1716变体插入到缺失的ICP34.5基因位点中)感染LNCaP或巨噬细胞。感染后96小时，使用PI染色通过流式细胞术评估细胞死亡。在感染的巨噬细胞的澄清上清液中，在Vero细胞上使用滴定测定法检测病毒颗粒以确定空斑形成单位。
小鼠仅接受300万MDM的尾静脉注射或用仅在MOI 50，1×107pfu的HSV1716或PBS(n＝5只小鼠/组)的HSV1716进行免疫。值得注意的是，3组小鼠施用MDM+OV，一组进行MRT 1小时，一组坐在MRI扫描仪中1小时，但没有MRT(MDM+OV，无MRT)，另一组未进入MRI扫描仪(MDM+OV)。通过IVIS Lumina II成像(IVIS，Caliper Life Sciences)监测肿瘤大小。一旦肿瘤达到英国内政部规定允许的最大体积，处死动物，处死前1小时，静脉注射小鼠FITC：凝集素(用于检测肿瘤脉管系统)。值得注意的是，由于肿瘤体积大，只接受PBS和MDM的小鼠在处理后14天被淘汰。所有其他肿瘤在第21天被移除。将包括肿瘤，肾，肝，肺和脾的切除组织包埋在OCT或固体石蜡中用于组织学标记研究。
分析
将组织分为两部分；一部分用福尔马林固定用于免疫组织化学分析，另一部分切除无粘连的纤维和脂肪组织，并用胶原酶处理。
流式细胞术：使用LIVE/DEAD Fixable Violet测定细胞活力
死细胞染色试剂盒(Invitrogen)。使用FlowJo软件(Tree Star)在LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上分析所有FACS数据。
组织学：将所有器官的5微米切片与特异性抗体一起孵育用于靶抗原；对于血管，我们使用CD31(1：100)，(AbD Serotec)和巨噬细胞人CD68(Dako，Ely，UK)以1:100检测腺病毒，我们以1:50使用E1A(Millipore，UK)。生物素化的二抗系统与链霉亲和素缀合的HRP一起使用。用二氨基联苯胺(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Labs)定位过氧化物酶活性。为了检测肿瘤中的铁(细胞密度高)，将切片用Perls普鲁士蓝染色并用伊红反染，以改善对比度。为了检测肺中的癌细胞，将所有肺切片用上皮细胞粘附分子(EPCAM)或苏木精和伊红(H&E)染色。在多个组织切片上重复所有免疫定位实验，并包括用于测定背景染色的同种型匹配的对照。
统计分析
数据是平均值±SEM。用t检验分析数据的统计学意义。差异被称为显著性，即P值小于0.05。
补充方法
在动物(科学方法)法案1986下，按照英国谢菲尔德大学伦理委员会和英国内政部条例，进行小鼠程序和人单核细胞的分离。
结果
结果表明，可以使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIOs)磁标记带有溶瘤病毒(HSV1716)的治疗性细胞，然后在磁共振成像(MRI)系统内，使用脉冲磁场梯度从血流转向深靶组织(原发性和继发性肿瘤)。该技术的使用导致细胞递送至肿瘤的显著增加以及肿瘤负荷和转移的显著减少。因此，我们的研究表明，可以使用临床MRI扫描仪，不仅可以在将这些磁性标记的细胞注射到体内之后对其进行成像，而且可以将它们专门引导到身体内的一个或多个靶部位。我们描述了使用磁共振靶向(MRT)来增加巨噬细胞向肿瘤的递送。
我们表明，有可能操纵MRI扫描仪的空间场梯度线圈来形成肿瘤中/周围的磁场，从而非侵入性地将磁性标记的细胞朝向它(图16)。
我们以前表明，这种MRT可以用于体外血管分叉模型(模拟动脉分叉的2D管)中的细胞成像和移动13。在这里，我们表明，MRT也可以用于在体内“引导”磁性巨噬细胞-即从血流到两个靶器官，原位前列腺肿瘤和它们在小鼠中的肺转移。我们已经使用巨噬细胞作为细胞载体的例子，因为这些细胞具有高度的吞噬能力，使得它们在保留其磁性的同时容易地消耗SPIO 14,18,19。这种骨髓来源的细胞越来越多地用于基于细胞治疗的下述疾病：癌症20-22，心肌梗塞23，脊髓损伤24，脑缺血25，退行性疾病，如帕金森病26和阿尔茨海默氏病27。
在体内应用MRT技术之前，我们首先建立了装有600mT/m梯度线圈组的临床前7TMRI系统，其可以在体外对磁巨噬细胞产生大量的驱动力，将它们穿过内皮层导向3D人类肿瘤球体(MTS)。为此，我们设计了一个跨内皮细胞迁移(TEM)流动室，其中人巨噬细胞穿过覆盖有一层人血管内皮细胞的穿孔膜的表面，从而模仿肿瘤小静脉的流动。在膜下面的非粘附室中培养MTS(图20a)。将转染表达GFP报告腺病毒(Ad-CMV-GFP)的人巨噬细胞负载SPIO(1.18ug/ml±0.3)14，然后在腔室放置在高场(7T)临床前MRI系统的等中心时，转向穿过膜进入MTS。
MRT实验在球体的方向上(图20a)使用脉冲磁场梯度(2ms打开，7ms关闭，50％强度)1小时，具有有效的附加磁场偏移，在MTS位置周围的在对照条件下，将样品暴露在扫描仪的磁场中，但没有脉冲梯度。使用MRT，我们发现T2 *－加权信号损失表明，与对照样品相比(图20ci)，MRT暴露样品(n＝6)的铁的浓度较高，并且在MTS内清楚可见GFP表达的巨噬细胞(图20cii)。流式分析进一步证实，与不进行MRT(2.9％±1.8)相比，进行MRT(29.7％±2.6)的巨噬细胞的摄取具有更显著(P＝0.0001)可行的浸润CD14+/PI-表达的巨噬细胞(图20c iii-iv)。
然后，我们调查了这种MRI梯度系统是否可以用来将磁性巨噬细胞导向体内的肿瘤(图17)。将三百万负载SPIO的巨噬细胞静脉内施用于携带原位原发性和转移性(肺)前列腺肿瘤的小鼠。脉冲磁场梯度13在前列腺的方向上(图17a)施加1小时，在扫描仪的静态磁场(B0＝7T)的顶部具有有效的磁场偏移对照组在没有转向梯度(无MRT)的情况下暴露于扫描仪的静态磁场。
与对照组(7.17％±0.8)相比，MRT显著(p＝0.0001)增加原发性前列腺肿瘤(42.2％±2.5)中负载SPIO的巨噬细胞的摄取(图17b)。此外，这些细胞存在于整个肿瘤中，在MR靶向后，使用抗体抗人CD68(泛巨噬细胞标记)和用于铁的组织学染色(普鲁士蓝或“PB”)标记肿瘤的连续切片中可以看出，肿瘤脉管系统中很少有细胞聚集的迹象。使用针对人CD68(泛巨噬细胞标记)的抗体和铁的组织学染色(普鲁士蓝或“PB”)的肿瘤切片(图17c)。巨噬细胞的MRI转向对肿瘤脉管系统没有不利影响(图21a)，在MRT组和无MRT组之间没有看到肿瘤的多回声RARE MR图像的差别(图17d)。这很可能是由于每个体素的血池铁含量。然而，SPIO注射和非注射受试者之间的显著差异在T2加权的长TE图像中很明显，肿瘤内信号强度损失(与对照相比，具有MRT的MRI图像扭曲)，这表明存在高浓度的铁(图17e)。为了评估体内磁性巨噬细胞的增加的摄入量，我们使用MR弛豫时间来测定两组中肿瘤的MR横向弛豫衰减速率(R2)。R2的测定结果为MRT组为21.8s-1，对照组为18.8s-1。也包括用于对照定没有任何SPIO存在的肿瘤组织的正常R2衰减率(10.5s-1)。较高的衰减率表明MRT组的铁摄取增加-表明可以用MRI评估摄取，如死后分析所见。R2值的显著性差异用来估计在60ms的TE下基于自旋回声的MRI序列分析信号差异的最佳回声时间，在此，MRT导致信号在时间匹配的对照上减少10％。
其他对照包括荷瘤小鼠：(i)具有未标记的巨噬细胞，靶向MR，和(ii)具有未标记的巨噬细胞，未靶向MR。对于这些对照组，我们通过MRI成像(图21c)和酶分散的肿瘤的流式细胞术证实，在肿瘤内检测到非常少的巨噬细胞(图21d)。值得注意的是，在包括肝脏(小于2％的所有细胞/组织切片)，脾脏(<1％)和肾脏(未检测到)的其他组织中，我们实际上检测不到人CD68+巨噬细胞(图22)。
当肿瘤难以或不可能通过手术切除时，如在肺，脑，肝或脊髓中，MRT具有特殊的应用。单独的MRT会话可以使基于细胞的疗法靶向癌症患者中的一个或多个转移病灶。在第二次体内实验中，我们将磁性巨噬细胞导入到荷瘤小鼠中含有微转移的肺中。在施用300万个巨噬细胞之后，再次使用MRT将磁性巨噬细胞导向肺。将相同的时间长度的未施用MRT但暴露于扫描仪的磁场的小鼠作为时间匹配的对照。
酶促分散的肺的流式细胞术分析显示在MRT之后存在比对照组显著更多的人CD14+巨噬细胞(分别为17.7％±4对4.4％±2.6)(图18a)。这也通过肺的组织学染色证实，其中在MRT之后的小鼠的肺内的转移性沉积物中或附近检测到CD68+人巨噬细胞(图18b和图23a)。这些巨噬细胞对普鲁士蓝也是阳性的(图18c)，并且在H&E染色后它们的铁含量也是可见的(图23b)。在施用或不施用MRT的SPIO标记的巨噬细胞的摄取后，我们检测了肺内CD31+血管的形态(图18c)。此外，我们检测了这两组小鼠中各5个肿瘤的每个血管，发现两组之间没有差异。在靶向MRI后，我们在血管内或在血管的远侧看不到内皮细胞破裂的迹象，也看不到任何血管凝块(例如血小板聚集)的迹象。由于肺组织的T2/T2*短，不可能在常规1H MRI技术的高场作用下对肺实质进行成像以增加摄取的体内验证。未来的技术发展可能使得这一点成为可能，例如，在空域中使用的超极化气体可以用作间接MR信号检测方法28。尽管如此，在不同的器官或软组织中，或在临床系统上，T2*显像可能有一席之地。
在评估MRT治疗益处的最终实验中，我们将携带治疗性溶瘤病毒(OV)HSV1716的负载SPIO的巨噬细胞靶向荷瘤小鼠。HSV1716的复制由PC3前列腺癌细胞支持(Conner和Braidwood，Cancer Gene Ther.2012年7月；19(7)：499-507)，这里我们在缺氧(0.5％O2)和常氧(20％O2)条件下(图24a)首先显示LNCaP细胞中的溶瘤作用。HSV1716很容易被巨噬细胞摄取，而摄入量在常氧培养条件下(图24b)显著较高(MOI 5时p＝0.002，MOI 50时p＝0.001)，缺氧时病毒复制较大，巨噬细胞死亡同样在缺氧环境有效(图24c，d)。在我们的体内模型中，荷瘤小鼠接受单次静脉内注射携带OV的巨噬细胞(MDM+OV)，但不暴露于MRI扫描仪，在扫描仪中静止，但没有MRT(MDM+OV)(无MRT))，或者暴露在具有MRT(MDM+OV+MRT)的扫描仪中。为了比较的目的，将“游离”OV施用于单独的一组小鼠。另外的对照组小鼠接受100ul盐水处理(对照)或静脉内施用300万个巨噬细胞(MDM)。与仅接受PBS或MDM的小鼠相比，仅用OV(1x107pfu)(Sorensen等人，J Nucl Med 2012 53：647-654)显著(P<0.03)延迟原发性肿瘤生长多达7天(图19a)。用巨噬细胞介导的HSV1716递送，该作用显著延长(第14天，p<0.006，第21天，p<0.007)。值得注意的是，在接受MDM+OV和MDM+OV(无MRT)的小鼠中没有观察到差异，其中后者暴露于扫描仪但没有转向。然而，我们的MRT靶向的巨噬细胞治疗不仅很优越地从第7天起减小原发性肿瘤的大小，也延迟了整个实验的原发性肿瘤再生(图19a)。
在治疗的第一天(第0天)和实验结束时(第21天)接受进行或不进行靶向MR的巨噬细胞OV治疗的小鼠的生物体的发光显示，原发肿瘤显著减少(图19a和b)。这在MRI扫描中被形象地证实(图19c)。此外，与不接受靶向MR的相比，在接受巨噬细胞递送的OV后进行靶向MR的肿瘤明显坏死(p<0.001)(图19e)。
在治疗的第一天(第0天)和实验结束时(第21天)，接受进行或不进行MRT的巨噬细胞OV治疗的小鼠的MR图像反映了原发性肿瘤的显著减少。有趣的是，用OV或携带OV的MDM处理的小鼠的肿瘤显著较淡且血管化程度较低，并且与单独用PBS或MDM的组相比，其与微血管密度(MVD)的降低相关。在接受巨噬细胞递送的OV后进行MRT的小鼠中观察到肿瘤中的坏死(p<0.001)比在不存在MRT的情况下显著更多。
接下来我们确定了这些疗法如何影响肺转移的发展。在仅注射PBS或MDM的小鼠中检测到很少转移，因为这些组中的原发性肿瘤必须在第14天(由于它们的大小)被移除。因此，将这些对照组中的转移与其他实验组进行比较是无效的。然而，与没有使用MRT时相比(图19f 0.8±0.37比3.8±0.95p<0.02)，当小鼠接受携带OV的巨噬细胞递送后接受MRT，肺转移的形成显著降低。
总之，我们表明，MRI扫描仪可用于非侵入性地将细胞导向体内的原发性和继发性肿瘤中，从而导致治疗结果的显著改善。此外，弛豫时间测量表明，MRT后的MRI可以用来评估这种方法的效果。虽然本研究集中于细胞递送至肿瘤，但该技术可用于将任何细胞(例如干细胞)靶向给定组织，包括非吞噬细胞类型，其可使用针对蛋白质的SPIO缀合的抗体“磁化”他们的细胞表面。
利用磁共振成像系统中的磁场梯度来磁共振靶向增加细胞递送，其非常适合深部或浅部组织。临床翻译的问题取决于在临床MRI系统上提供相同的靶向力的能力。具有300mT/m的高性能磁场梯度系统的临床扫描仪已经在使用，并且因此有可能产生相似的力。此外，我们能够对MRT后的细胞分布进行成像，表明使用MRI系统进行实时成像引导靶向的可能性。这些发现支持MRT伴随成像，以改善靶向细胞治疗的潜在价值。
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gggttccatg gtgaagtcaa c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
acctgagtct tctggaccgc tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ccagccttct cccaagagtc gt 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
taggaacagg cggcgacgaa taca 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cacaatcaca aggcaacttc aat 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gcctaacatg cttcgagatc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ctcatggctt tgtagatgcc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
gaagttcatg gacgtctacc ag 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
catctgctat gctgcaggaa gct 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
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gaatttcccc agcatcccaa ag 22
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgccttctgc actcccttta tc 22
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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agaatgtttt caaatgttct ccagtc 26
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
ggccatttgc ttggatccg 19

Claims (19)

1.一种感染溶瘤性单纯疱疹病毒的离体或体外单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞。
2.如权利要求1所述的离体或体外单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞，其特征在于，所述细胞含有外源磁性材料。
3.一种制剂，其特征在于，包括感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的群体。
4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料。
5.权利要求3或4所述的制剂在医疗方法中的应用。
6.一种制备感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法包括体外将单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞与溶瘤性单纯疱疹病毒接触。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞与磁性材料接触。
8.一种制备制剂的方法，所述的制剂包括感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的群体，其特征在于，所述方法包括提供感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的群体，和制备包括所述细胞的群体的制剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述群体中的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料。
10.一种感染溶瘤性单纯疱疹病毒且任选地含有外源磁性材料的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞在疾病治疗方法中的应用。
11.一种感染溶瘤性单纯疱疹病毒且任选地含有外源磁性材料的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞在制备用于疾病治疗的药物中的用途。
12.一种制剂在疾病治疗方法中的用途，所述制剂包括感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的群体，其特征在于，所述单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料，所述方法包括向受试者施用所述制剂，并向所述受试者施加磁场，以便将所述施用制剂中的细胞导入所述受试者体内的预期位置。
13.感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的群体在制备用于疾病治疗方法的药物中的用途，其特征在于，所述单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料，所述方法包括向受试者施用所述药物，并向所述受试者施加磁场，以便将所述施用药物中的细胞导入所述受试者体内的预期位置。
14.用于权利要求10所述的疾病治疗方法中的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞，用于权利要求12所述的疾病治疗方法中的制剂，或权利要求11或13所述的用途，其特征在于，所述疾病为癌症。
15.一种治疗需治疗的受试者的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向所述受试者施用制剂，所述制剂包括感染溶瘤性单纯疱疹病毒的单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞的群体，从而治疗所述疾病。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述群体中的所述单核细胞、单核细胞衍生的细胞或巨噬细胞含有外源磁性材料。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施加磁场，以便将所述施用制剂中的细胞导入所述受试者体内的预期位置。
18.如权利要求15－17任一所述的方法，其特征在于，所述疾病为癌症。
19.一套试剂盒，其特征在于，包括预定量的溶瘤性单纯疱疹病毒和预定量的磁性材料。
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