KR102657640B1 - 종양분해성 단순포진 바이러스 감염된 세포 - Google Patents

종양분해성 단순포진 바이러스 감염된 세포 Download PDF

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Abstract

종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 암과 같은 질환의 치료에서의 이러한 감염된 세포의 용도와 함께 개시되어 있다.

Description

종양분해성 단순포진 바이러스 감염된 세포
본 발명은 종양분해성 단순포진 바이러스(oncolytic herpes simplex virus)로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포, 및 암과 같은 질환의 치료에 있어서의 이러한 감염된 세포의 용도에 관한 것이다.
암은 높은 사망률, 이와 관련된 경제적 사회적 부담 및 암 생존자가 직면하는 심리적 문제 때문에 전세계적으로 가장 큰 염려 중의 하나이다.
종양 덩어리가 종래의 치료법, 즉, 화학요법 또는 방사선요법에 의해서는 도달하거나 영향을 받지 못하는 영역에 나타나는 경우 치료에 대한 내성이 일반적으로 획득된다. 이러한 영역들은 종양 벌크의 중심에 위치하며 일반적으로 매우 저산소성 환경을 특징으로 하는데, 이것은 산소 공급이 세포 및 기질의 적절한 호흡에는 불충분함을 의미한다(Shannon, A. M., D. J. Bouchier-Hayes, C. M. Condron and D. Toomey, 2003 Tumour hypoxia, chemotherapeutic resistance and hypoxia-related therapies. Cancer Treatment Reviews 29: 297-307). 고형 종양의 불변의 특징인 저산소 상태는 종양에서의 세포 복제가 혈관 형성의 속도를 능가하기 때문에 발달한다: 따라서, 산소의 계속적인 요구는 혈관신생 맹아(angiogenic sprouting)를 자극함으로써 이러한 필요를 해결하는 세포 산소 센서에 의해 검출된다. 결국, 혈관신생은 암 덩어리 내에 부적절한 분포를 갖는 구조적으로 무질서한 혈관의 생성을 초래한다(Kandel, J. J., D. J. Yamashiro and J. Kitajewski, 201 1 Angiogenesis in Tumour Development and Metastasis, pp. 81 -93 in Therapeutic Angiogenesis for Vascular Diseases: Molecular Mechanisms and Targeted Clinical Approaches for the Treatment of Angiogenic Disease, edited by M. Slevin. Springer-Verlag Berlin, Berlin): 이것은 암 덩어리 전반에 걸쳐 산소의 부적당한 확산 및 관류를 야기하는 기능장애성 미소혈관의 발달을 초래한다(Vaupel, P., O. Thews and M. Hoeckel, 2001 Treatment resistance of solid tumors - Role of hypoxia and anemia. Medical Oncology 18: 243-259). 궁극적으로, 이것은 저산소증을 더욱 증가시키는 피드백 루프를 생성시킨다.
암의 저산소 영역의 중요한 특징은 면역 세포의 현저한 존재이며, 이러한 면역 세포는 암 개시의 매우 초기 단계부터 종양 덩어리로 침투한다(Di Caro, G., F. Marchesi, L. Laghi and F. Grizzi, 2013 Immune cells: plastic players along colorectal cancer progression. Journal of Cellular and Molecular Medicine 17: 1088-1095). 가장 많이 연구된 세포 유형에는 종양-관련 대식세포(TAM)가 있다. TAM은 고형 종양의 저산소 중심 영역에 다수로 동원되어 축적되는 대식세포의 집단이다(Turner, L, C. Scotton, R. Negus and F. Balkwill, 1999 Hypoxia inhibits macrophage migration. European Journal of Immunology 29: 2280-2287; Lewis, J. S., R. J. Landers, J. C. E. Underwood, A. L. Harris and C. E. Lewis, 2000 Expression of vascular endothelial growth factor by macrophages is up-regulated in poorly vascularized areas of breast carcinomas. Journal of Pathology 192: 150-158; Gollapudi, K., C. Galet, T. Grogan, H. Zhang, J. W. Said er a/., 2013 Association between tumor-associated macrophage infiltration, high grade prostate cancer, and biochemical recurrence after radical prostatectomy. American Journal of Cancer Research 3: 523-529). TAM은 사이토킨, 성장 인자 및 호르몬과 같이 미세-환경 신호에 응답하여 활성화되는 특정한 표현형을 특징으로 하며(Martinez, F. O., S. Gordon, M. Locati and A. Mantovani, 2006 Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. Journal of Immunology 177: 7303-7311), 이를 종종 M2 대식세포라고 한다. 이들의 대응물, M1-분극된 대식세포는 염증 분자에 반응하여 활성화되고 높은 항-종양 및 면역-자극 기능을 특징으로 하지만, M2-분극된 대식세포는 현저한 종양전 활성을 발현하여, 염증 과정을 억제시키고 매트릭스 리모델링, 침입, 혈관신생 및 생존을 촉진시킨다(Sica, A., T. Schioppa, A. Mantovani and P. Allavena, 2006 Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: Potential targets of anti-cancer therapy. European Journal of Cancer 42: 717-727).
TAM은 종양 세포에 의해 연속적으로 방출되는 화학주성 사이토킨에 의해 혈액 순환으로부터 모집되는 것으로 알려져 있다; 예를 들면, MCP-1 , VEGF 및 CSF-1 발현이 다수의 인간 종양에서 TAM 축적과 양의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(Graves, D. T., R. Barnhill, T. Galanopoulos and H. N. Antoniades, 1992 EXPRESSION OF MONOCYTE CHEMOTACTIC PROTEIN- IN HUMAN-MELANOMA INVIVO. American Journal of Pathology 140: 9-14; Kacinski, B. M., 1995 CSF-1 AND ITS RECEPTOR IN OVARIAN, ENDOMETRIAL AND BREAST-CANCER. Annals of Medicine 27: 79-85. Arenberg, D. A., M. P. Keane, B. DiGiovine, S. L. Kunkel, S. R. B. Strom et al., 2000 Macrophage infiltration in human non-small-cell lung cancer: the role of CC chemokines. Cancer Immunology Immunotherapy 49: 63-70; Lewis, J. S., R. J. Landers, J. C. E. Underwood, A. L. Harris and C. E. Lewis, 2000 Expression of vascular endothelial growth factor by macrophages is up-regulated in poorly vascularized areas of breast carcinomas. Journal of Pathology 192: 150-158). 그러나, 종양의 저산소 영역으로의 이들의 특이한 축적은 몇 가지 특징에 의해 야기된다: 괴사성 세포의 현저한 존재(Lewis, J., R. J. Landers, R. D. Leek, K. Corke, A. L. Harris et al., 1997 Role of macrophages in tumour angiogenesis: Regulation by hypoxia. Journal of Pathology 182: A1 -A1) 및 다수의 화학주성인자, 예를 들어, MCP-1(Li, X., H. Kimura, K. Hirota, H. Sugimoto and H. Yoshida, 2005 Hypoxia reduces constitutive and TNF-alpha-induced expression of monocyte chemoattractant protein-in human proximal renal tubular cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 335: 1026-1034), VEGF(Brown, L. F., B. Berse, R. W. Jackman, K. Tognazzi, A. J. Guidi et al., 1995 EXPRESSION OF VASCULAR-PERMEABILITY FACTOR (VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH-FACTOR) AND ITS RECEPTORS IN BREAST-CANCER. Human Pathology 26: 86-91) 및 엔도텔린(Grimshaw, M. J., S. Naylor and F. R. Balkwill, 2002 Endothelin-2 is a hypoxia-induced autocrine survival factor for breast tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics 1 : 1273-1281)의 방출. 일단 저산소 영역 내로 축적되면, TAM은 성장 인자, MMP 및 CXCL과 같은 몇 가지 인자들의 생산과 방출의 증가를 통해 산소-고갈 상태에 반응하고, 이것이 결국 혈관신생, 세포 성장, 침입 능력 및 전이에 영향을 미친다: 따라서, TAM은 궁극적으로 종양 진행을 촉진시킨다(Sica, A., T. Schioppa, A. Mantovani and P. Allavena, 2006 Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: Potential targets of anti-cancer therapy. European Journal of Cancer 42: 717-727).
종양 진행을 촉발시키는데 있어서의 이들의 중추적인 역할을 고려해 볼 때, 종양에서의 TAM의 침윤이 대부분의 고형 암에 있어서의 나쁜 예후와 상관관계가 있다: 폐암(Chen, J. J. W., Y. C. Lin, P. L. Yao, A. Yuan, H. Y. Chen et al., 2005 Tumor-associated macrophages: The double-edged sword in cancer progression. Journal of Clinical Oncology 23: 953-964), 구강 편평 상피 세포 암종(He, K.-F., L. Zhang, C.-F. Huang, S.-R. Ma, Y.-F. Wang et al., 2014 CD163+ Tumor-Associated Macrophages Correlated with Poor Prognosis and Cancer Stem Cells in Oral Squamous Cell Carcinoma. BioMed research international 2014: 838632), 유두상 갑상선 암종(KIM et al. 2013), 유두상 신세포 암종(Behnes, C. L., F. Bremmer, B. Hemmerlein, A. Strauss, P. Strobel et al., 2014 Tumor-associated macrophages are involved in tumor progression in papillary renal cell carcinoma. Virchows Archiv 464: 191-196), 유방암(Mukhtar, R. A., A. P. Moore, V. J. Tandon, O. Nseyo, P. Twomey et al., 2012 Elevated Levels of Proliferating and Recently Migrated Tumor-associated Macrophages Confer Increased Aggressiveness and Worse Outcomes in Breast Cancer. Annals of Surgical Oncology 19: 3979-3986; Tang, X. Q., 2013 Tumor-associated macrophages as potential diagnostic and prognostic biomarkers in breast cancer. Cancer Letters 332: 3-10), 난소암(Lan, C Y., X. Huang, S. X. Lin, H. Q. Huang, Q. C. Cai et al., 2013 Expression of M2-Polarized Macrophages is Associated with Poor Prognosis for Advanced Epithelial Ovarian Cancer. Technology in Cancer Research & Treatment 12: 259-267) 및 췌장암(Kurahara, H., S. Takao, T. Kuwahata, T. Nagai, Q. Ding et al., 2012 Clinical Significance of Folate Receptor beta-expressing Tumor-associated Macrophages in Pancreatic Cancer. Annals of Surgical Oncology 19: 2264-2271 ).
종양분해성 바이로테라피(oncolytic virotherapy)는 암세포를 선택적으로 감염시키고 사멸시키는 분해성 바이러스의 사용과 관련된다. 일부 종양분해성 바이러스는 이들이 암세포에서 복제를 위해 정교한 선택을 나타내고 종양 내에서의 이들의 자기-제한 증식이 더 적은 독성 부작용을 초래하기 때문에 유망한 치료법이다. 몇가지 종양분해성 바이러스가 임상에서 대단한 장래성을 보였다(Bell, J., Oncolytic Viruses: An Approved Product on the Horizon? Mol Ther. 2010; 18(2): 233-234).
대식세포는 질환 부위로의 자연 귀소 능력(natural homing ability)을 갖는 것으로 알려져 있으며 유전자 요법을 위한 세포 비히클로서 제안되었다(Burke et al., Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. Journal of Leukocyte Biology Vol. 72, no.3 417-428).
제WO2007/113572호는 자성 물질을 포함하는 단핵구 유래 세포, 예를 들어 대식세포를 기재하고 있다. 세포가 대상체에서 치료제를 병든 물질에 표적화하기 위한 비히클로서 유용한 것으로 기재되어 있으며, 여기서 치료제는 바람직하게는 유전자(즉, 병든 물질의 치료에 대한 유전자 요법)일 수 있으며 치료를 필요로 하는 대상체를 자기장에 노출시켜 병든 물질에서 세포의 위치를 보조한다. 관련 연구가 문헌[Muthana et al. A novel magnetic approach to enhance the efficacy of cell-based gene therapies]에 개시되어 있다. 문헌[Gene Therapy (2008) 15, 902-910.
Muthana et al., (Use of Macrophages to Target Therapeutic Adenovirus to Human Prostate Tumors. Cancer Res; 71 (5) March 1, 2011)]은 전립선 종양의 치료를 위한 접근책을 기재하고 있으며, 여기서는 대식세포가 저산소증-조절된 E1A/B 작제물 및 E1A-의존 종양분해성 아데노바이러스로 형질도입되며, 이의 증식 또한 전립선-특이 프로모터 성분을 사용하여 전립선 종양 세포에 제한되어 E1A 발현을 제어한다. 이러한 실험에서 대식세포는 단지 저산소 환경에 위치시 복제를 유도하는 아데노바이러스의 '무증상 보인자(silent carrier)'로서 사용되었다. 아데노바이러스의 복제의 유도가 대식세포의 사멸을 초래하지는 않았다. 문헌[Muthana et al., (Macrophage Delivery of an Oncoloytic Virus Abolishes Tumor Regrowth and Metastasis after Chemotherapy or Irradiation. Cancer Res; 73(2) January 15, 2013)]에서 저자는 도세탁셀 또는 방사선요법의 투여후 효과를 조사하기 위해 동일한 아데노바이러스 접근법을 사용한 실험을 기재하고 있다.
본 발명은 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포에 관한 것이다. 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 질환의 치료방법, 특히 암의 치료에서 유용한 것으로 개시되어 있다. 바람직한 치료는 저산소성인 조직 또는 암 또는 저산소성인 조직 또는 암의 일부의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 치료는 심부 조직, 기관에 또는 신체의 중심부에 위치한 조직 또는 암의 치료를 포함할 수 있다.
감염된 세포는, 병든 조직에 자가-표적화하여 종양분해성 단순포진 바이러스를 달리 치료제가 침투하기에 매우 어려운 조직의 저산소성 영역을 포함한 병든 조직에 직접 전달하는 특수한 벡터를 나타낸다. 이들 세포는 단순히 벡터로서 작용하는 것이 아니다. 종양분해성 단순포진 바이러스 감염은 단핵구 또는 단핵구 유래 세포의 사멸을 초래하며, 이것은 바이러스 복제 및 세포 용해에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 세포 사멸은 병든 조직에 존재하면서 종양분해성 단순포진 바이러스의 방출 및 병든 세포, 예를 들어 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고 용해될 수 있는 종양 세포로의 직접 전달을 야기한다.
게다가, 종양분해성 단순포진 바이러스는 저산소 조직에서 증진된 면역 반응을 개시하고, 이에 의해 질환에 대한 면역 반응, 예를 들어 항종양 면역 반응을 촉진시킨다.
몇몇 양태에서 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 외인성 자성 물질을 또한 함유할 수 있다. 이러한 양태에서 치료방법은 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 치료를 필요로 하는 대상체의 신체의 목적하는 위치로 향하도록 대상체로의 자기장의 적용을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 생체외 또는 시험관내 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 제공된다.
몇몇 양태에서 생체외 또는 시험관내 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 또한 외인성 자성 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는 제제가 제공된다.
하나의 양태에서 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 또한 외인성 자성 물질을 함유한다.
본 발명의 한 측면에서, 의학적 치료, 예를 들어 암의 치료의 방법에서 사용하기 위한 제제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 시험관내 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 종양분해성 단순포진 바이러스와 접촉시킴을 포함한다.
몇몇 양태에서 상기 방법은 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 자성 물질과 접촉시킴을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 제공하는 단계, 및 상기 세포의 집단을 포함하는 제제를 제형화하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 집단에서 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 외인성 자성 물질을 함유한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 질환의 치료방법에서 사용하기 위한, 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고 외인성 자성 물질을 임의로 함유하는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 제공된다.
치료방법은 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 대상체에게 투여하는 단계 및 외인성 자성 물질을 함유하는 세포가 대상체 신체의 목적하는 위치로 향하도록 자기장을 대상체에 적용하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서 질환의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고, 외인성 자성 물질을 임의로 함유하는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 용도가 제공된다. 치료는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 대상체에게 투여하는 단계 및 외인성 자성 물질을 함유하는 세포가 대상체 신체의 목적하는 위치로 향하도록 자기장을 대상체에 적용하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서 질환의 치료방법에서 사용하기 위한, 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는 제제(여기서, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 외인성 자성 물질을 함유한다)가 제공되며, 상기 방법은 제제를 대상체에게 투여하는 단계 및 투여된 제제의 세포가 대상체 신체의 목적하는 위치로 향하도록 자기장을 대상체에 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 질환의 치료방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단(여기서, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 외인성 자성 물질을 함유한다)의 용도가 제공되며, 상기 방법은 약제를 대상체에게 투여하는 단계 및 투여된 약제의 세포가 대상체 신체의 목적하는 위치로 향하도록 자기장을 대상체에 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는 제제를 상기 대상체에 투여하여, 상기 질환을 치료함을 포함한다. 임의로, 상기 집단에서 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 외인성 자성 물질을 함유할 수 있고 상기 방법은 투여된 제제의 세포가 대상체 신체의 목적하는 위치로 향하도록 자기장을 대상체에 적용함을 임의로 추가로 포함할 수 있다.
종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 세포를 대상체에 투여하는 것은 종양분해성 단순포진 바이러스로의 감염으로부터 소정의 시간내에 수행될 수 있고/있거나, 투여된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 정의된 퍼센트 범위의 죽거나 죽어가는(예를 들어, 용해된) 세포를 함유하도록 선택될 수 있다. 시간 및/또는 세포의 선택은 이들이 치료를 필요로 하는 조직에 위치하는 경우 세포가 세포 사멸을 확실히 겪도록(예를 들어, 감염된 종양분해성 단순포진 바이러스에 의한 용해를 겪도록) 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서 부분의 키트가 제공되며, 상기 키트는 소정량의 종양분해성 단순포진 바이러스 및 소정량의 자성 물질을 포함한다. 키트는 종양분해성 단순포진 바이러스로의 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 감염 및/또는 자성 물질로의 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 부하에 대한 지침서와 함께 제공될 수 있다. 이러한 지침서는 상기 감염 및/또는 부하를 생체외 또는 시험관내, 예를 들어 시험관내 세포 배양의 조건하에서 수행하기 위한 것일 수 있다.
몇몇 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스의 게놈에서 ICP34.5 유전자의 모든 카피는 ICP34.5 유전자가 기능성 ICP34.5 유전자 산물을 발현할 수 없도록 변형된다. 이와 같이 종양분해성 단순포진 바이러스는 ICP34.5 무표지 돌연변이체(null mutant)일 수 있다.
몇몇 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스의 게놈에서 ICP34.5 유전자 중의 하나 또는 둘 다는 ICP34.5 유전자가 기능성 ICP34.5 유전자 산물을 발현할 수 없도록 변형된다.
몇몇 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스는 HSV-1 균주 17의 돌연변이체이다. 바람직한 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스는 HSV1716 (ECACC Accession No. V92012803)이다. 몇몇 양태에서 단순포진 바이러스는 HSV-1 균주 17 돌연변이체 1716의 돌연변이체이다.
몇몇 양태에서 치료되는 질환은 암, 예를 들어 종양이다. 치료는 암의 저산소 영역의 치료일 수 있으며, 이 영역은 세포가 자성에 의해 지시되는 목적하는 위치일 수도 있다. 이와 같이, 치료의 방법은 암의 다른 정상산소 영역과 함께 또는 암의 정상산소 영역의 치료와는 관계없이, 암의 저산소 영역의 치료를 포함할 수 있다. 치료의 방법은 또한 대상체에서 항-종양 반응의 유도를 포함할 수 있다. 치료의 방법은 또한 외인성 자성 물질을 함유하는 투여된 세포를 암의 저산소 영역에 지시하기 위해 자기장을 대상체에 적용함을 포함할 수 있다.
[발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]
본 발명자들의 조사결과들은 종양분해성 단순포진 바이러스가 감염으로부터 96시간 후에 단핵구 유래 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타낸다. 종양분해성 단순포진 바이러스는 일반적으로 세포를 증식시키는 쪽으로 매우 선택적인 용해 활성을 가지며, 원칙적으로 건강한 세포를 해치지 않으면서 종양 세포의 전신 또는 비-국소 투여 및 자기-표적화에 의해 종양 치료를 가능케 하는 것으로 알려져 있다. 이것은 예시적인 안전성 프로파일을 제공한다.
본 발명자들은 단핵구 유래 세포의 감염 후 감염된 세포에서 바이러스가 검출되지는 않지만 연장된 배양시 바이러스의 존재가 회복됨을 관찰하였다(도 1). 이것은 세포의 증식성 감염, 즉, 바이러스 자손에 의한 복제 및 세포 용해를 포함한 것과 일치하지만, 본 발명은 이러한 이론에 얽매이지 않는다. 종양분해성 단순포진 바이러스로의 감염이 단핵구 유래 세포의 세포 사멸을 유도한다는 조사결과는 감염된 단핵구 또는 단핵구 유래 세포가 종양분해성 단순포진 바이러스를 종양의 저산소 영역을 포함한 병든 조직으로 전달하여, 후속적으로 세포가 사멸함에 따라 바이러스가 병든 조직으로 직접 방출되도록 하는데 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 또한 단핵구 유래 세포에서의 종양분해성 단순포진 바이러스 복제, 및 후속적인 세포 사멸(예를 들어, 용해)이 저산소 상태에서 실제로 더 크다는 것을 발견하였다. 이것은 단핵구 유래 세포의 사멸이 저산소성 종양 환경에서 (분명히 우선적으로) 발생하며 종양분해성 단순포진 바이러스를 달리 접근하기 어려운 종양의 저산소성 부분으로 직접 방출시킬 것임을 나타낸다.
따라서, 상당수의 단핵구 또는 단핵구 유래 세포가 표적 조직 또는 종양에 존재하는 경우 이들이 사멸 및 바이러스 방출을 겪도록 보장하기 위해, 대상체로의 감염된 세포의 투여는 종양분해성 단순포진 바이러스로의 감염으로부터 소정 시간내에 수행될 수 있고/있으며 투여된 세포는 정의된 퍼센트 범위의 죽어가는 또는 죽은(예를 들어, 용해된) 세포를 함유하도록 선택될 수 있다.
본 발명자들은 또한 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고 외인성 자성 물질로 부하된 단핵구 또는 단핵구 유래 세포가 자기 공명 표적화에 의해 혈류로부터 심부 조직 표적(원발성 및 속발성(전이성) 종양 포함)으로 스티어링(steering)될 수 있음을 보여주었다. 예를 들자면, 이것은 자기 공명(예를 들어, MRI, MRT) 시스템 내에 펄스 자기장 기울기(pulsed magnetic-field gradient)를 사용할 수 있다. 따라서, 병든 조직으로 직접적으로 종양분해성 단순포진 바이러스 장착된 세포의 정확한 비침습적 지시와 결부된, 예를 들어 혈액으로의 전신 투여가 현실이 된다.
이러한 접근법은 조직 또는 종양이, 예를 들어 폐, 뇌, 간 또는 척수에서와 같이 수술적으로 제거하기가 어렵거나 불가능한 경우에 특별히 적용된다. 또한, 암 환자에서 하나 이상의 전이성 병변으로의 세포의 표적화는 세포의 각 투여를 독립적인 위치에 표적화하는 각각의 독립적인 자기 공명 세션과 결부된 세포의 단계적 투여를 사용하여 가능하다.
종양에 대한 종양분해성 단순포진 바이러스(oHSV)의 작용을 지시하는 이외에, 숙주 면역 반응이 선천성 면역 효과기, 후천성 항바이러스 면역 반응 및 후천성 항종양 면역 반응을 통해 항종양 반응의 효능을 확립하는데 중요한 역할을 한다는 증거들이 늘어나고 있다(참조; Prestwich et al., Onoclytic viruses: a novel form of immunotherapy. Expert Rev Anticancer Ther. Oct 2008; 8(10): 1581-1588).
몇몇 연구에서는 oHSV가 항종양 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 이것은 동일 동물에서 oHSV로 처리된 병변에서 및 비처리 병변에서의 종양 성장 감소, 무손상 면역 반응을 필요로 하는 oHSV의 효능, 항종양 사이토킨 반응의 유도, 종양 면역 기능장애의 역전 및 종양 항원 제시의 촉진으로서 나타날 수 있다. 항종양 면역 반응의 유도는 전이의 확립을 감소시키거나, 이들의 제거에 기여하고, 종양의 재발로부터 보호할 수 있다.
예를 들면, 문헌[Benencia et al., ((2008) Herpes virus oncolytic therapy reverses tumor immune dysfunction and facilitates tumor antigen presentation. Cancer Biol. Ther. 7, 1 194-1205)]에서 처리된 및 비처리된 병변에서의 성장 감소가 보고되었다. 문헌[참조; Miller and Fraser ((2003) Requirement of an integrated immune response for successful neuroattenuated HSV-1 therapy in an intracranial metastatic melanoma model. Mol. Ther. 7(6):741-747)에서 HSV176의 효능은 종양-특이 증식성 T 세포 반응에 의해 매개되는 무손상 면역 반응을 필요로 하였다.
본 발명자들은 저산소 상태에서 종양분해성 단순포진 바이러스는, 정상산소 상태에 비해, 전염증성 사이토킨 및 전사 인자(예를 들어, IL-8, IL- 1 및 NFKB)의 유도인자임을 여기서 보여주었다. 이러한 조사결과는 저산소 상태에서 종양분해성 단순포진 바이러스의 증가된 염증 반응 특성을 시사하며, 이는 종양분해성 단순포진 바이러스가 저산소증에서 더 큰 바이러스 잠재력을 획득함을 시사하고, 저산소성이고 접근하기 어려운 종양의 표적 중심 영역으로의 단핵구 또는 단핵구 유래 세포에 의한 바이러스 전달을 사용하는 근거를 더욱 뒷받침한다.
종양분해성 단순포진 바이러스
종양분해성 바이러스는 암 세포를 바람직하게는 우선적인 또는 선택적인 방식으로 용해하는(종양용해) 바이러스이다. 비-분할 세포를 능가하여 분할 세포로 선택적으로 복제하는 바이러스는 종종 종양분해성이다. 종양분해성 바이러스는 당업계에 잘 알려져 있으며 문헌[Molecular Therapy Vol.18 No.2 Feb 2010 pg 233-234]에 검토되어 있다.
단순포진 바이러스(HSV) 게놈은 장(L) 및 단(S)으로 명명된 두 개의 공유적으로 연결된 세그먼트를 포함한다. 각 세그먼트는 한 쌍의 역위 말단 반복 서열(inverted terminal repeat sequence)이 측면에 있는 독특한 서열을 함유한다. 긴 반복체(RL 또는 RL) 및 짧은 반복체(RS 또는 Rs)는 뚜렷이 구별된다.
HSV ICP34.5(γ34.5라고도 불림) 유전자가 광범위하게 연구되었으며, HSV-1 균주 F와 syn17+에서 및 HSV-2 균주 HG52에서 서열분석되었다. ICP34.5 유전자의 하나의 카피가 각각의 RL 반복 영역 내에 위치한다. ICP34.5 유전자의 하나 또는 둘 다의 카피를 불활성화시키는 돌연변이체는 신경병원성(neurovirulence)이 결핍되며, 즉, 비병원성/비-신경병원성(비-신경병원성은 동물, 예를 들어 마우스, 또는 인간 환자에서의 LD50이 대략 >106pfu의 범위 내에 있도록 치사 뇌염을 야기하지 않으면서 동물 또는 환자에서 높은 역가의 바이러스(대략 106 플라크 형성 단위(pfu))를 도입할 수 있는 능력으로 정의됨)이고, 종양분해성인 것으로 알려져 있다.
바람직한 종양분해성 단순포진 바이러스(oHSV)는 복제-가능 바이러스(replication-competent virus)이며, 적어도 표적 종양/암 세포에서 복제-가능하다.
본 발명에 사용될 수 있는 종양분해성 HSV는 γ34.5(ICP34.5라고도 불림) 유전자 중의 하나 또는 둘 다가 각 유전자가 기능성 ICP34.5 단백질을 발현, 예를 들어 암호화할 수 없도록 (예를 들어, 결실, 삽입, 부가 또는 치환일 수 있는 돌연변이에 의해) 변형된 HSV를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 HSV에서 γ34.5 유전자의 카피 둘 다는 변형된 HSV가 기능성 ICP34.5 단백질을 발현, 예를 들어 생산할 수 없도록 변형된다.
몇몇 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스는 단순포진 바이러스 게놈에 존재하는 ICP34.5 유전자의 모든 카피(두 개의 카피는 정상적으로 존재한다)가 단순포진 바이러스가 기능적 ICP34.5 유전자 산물을 생산할 수 없도록 교란되어 있는 ICP34.5 무표지 돌연변이체일 수 있다. 또 다른 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스는 적어도 하나의 발현 가능한 ICP34.5 유전자가 결핍될 수 있다. 몇몇 양태에서 단순포진 바이러스는 단지 하나의 발현 가능한 ICP34.5 유전자가 결핍될 수 있다. 또 다른 양태에서 단순포진 바이러스는 발현 가능한 ICP34.5 유전자 둘 다가 결핍될 수 있다. 여전히 또 다른 양태에서 단순포진 바이러스에 존재하는 각각의 ICP34.5 유전자는 발현 가능하지 않을 수 있다. 발현 가능한 ICP34.5 유전자의 결핍은, 예를 들면, ICP34.5 유전자의 발현이 기능적 ICP34.5 유전자 산물을 야기하지 않음을 의미한다.
종양분해성 단순포진 바이러스는 HSV의 임의의 실험실 균주 또는 임상 단리물(비-실험실 균주)를 포함한 임의의 HSV로부터 유도될 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서 HSV는 HSV-1 또는 HSV-2의 돌연변이체이다. 대안적으로 HSV는 HSV-1 및 HSV-2의 인터티픽 재조합체(intertypic recombinant)일 수 있다. 돌연변이체는 실험실 균주 HSV-1 균주 7, HSV-1 균주 F 또는 HSV-2 균주 HG52 중의 하나의 돌연변이체일 수 있다. 돌연변이체는 비-실험실 균주 JS-1의 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는 돌연변이체는 HSV-1 균주 17의 돌연변이체이다. 단순포진 바이러스는 HSV-1 균주 17 돌연변이체 1716, HSV-1 균주 F 돌연변이체 R3616, HSV-1 균주 F 돌연변이체 G207, HSV-1 돌연변이체 NV1020, 또는 HSV 게놈이 추가의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 함유하는 이의 추가의 돌연변이체 중의 하나일 수 있다. 추가의 돌연변이는 불능화 돌연변이(disabling mutation)를 포함할 수 있으며, 이것은 바이러스의 병독성(virulence) 또는 이들의 복제 능력에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 ICP6, ICPO, ICP4, ICP27 중의 임의의 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 유전자 중의 하나에서(임의로 경우에 따라 유전자의 카피 둘 다에서)의 돌연변이는 상응하는 기능적 폴리펩타이드를 발현하는 HSV의 불능(또는 능력 감소)를 야기한다. 예를 들자면, HSV 게놈의 추가의 돌연변이는 뉴클레오티드의 부가, 결실, 삽입 또는 치환에 의해 달성될 수 있다.
다수의 종양분해성 단순포진 바이러스가 당업계에 알려져 있다. 예는 HSV1716, R3616(예를 들어, 참조; Chou & Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.89, pp.3266-3270, April 1992), G207(Toda et al, Human Gene Therapy 9:2 77-2185, October 10, 1995), NV1020(Geevarghese et al, Human Gene Therapy 2010 Sep; 21 (9): 1119-28), RE6(Thompson et al, Virology 131, 71-179 (1983)), 및 Oncovex™(Simpson et al, Cancer Res 2006; 66:(9) 4835-4842 May 1, 2006; Liu et al, Gene Therapy (2003): 10, 292-303), dlsptk, hrR3,R4009, MGH-1, MGH-2, G47△, Myb34.5, DF3γ34.5, HF10, NV1042, RAMBO, rQNestin34.5, R5111, R-LM113, CEAICP4, CEAγ34.5, DF3γ34,5, KeM34.5(Manservigi et al, The Open Virology Journal 2010; 4:123-156), rRp450, M032(Campadelli-Fiume et al, Rev Med. Virol 201 1 ; 21 :2 3-226), Bacol(Fu et al, Int. J. Cancer 201 1 ; 129(6): 1503-10) 및 M032 및 C134(Cassady et al, The Open Virology Journal 2010; 4: 103-108)을 포함한다.
몇몇 바람직한 양태에서 단순포진 바이러스는 HSV-1 균주 17 돌연변이체 1716(HSV1716)이다. HSV 1716은 종양분해성, 비-신경병원성 HSV이며 EP 0571410, WO 92/13943, Brown et al (Journal of General Virology (1994), 75, 2367-2377) 및 MacLean et al (Journal of General Virology (1991), 72, 631-639)에 기재되어 있다. HSV 1716은 특허 절차상의 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(본원에서는 '부다페스트 조약(Budapest Treaty)'이라고 함)의 규정에 따라 수탁 번호 V92012803 하에 영국 SP4 0JG 윌트셔 솔즈베리 포턴 다운에 소재하는 동물 세포 배양, 백신 연구 및 생산 실험실의 유럽 컬렉션, 공중 위생 실험실 서비스에서 1992년 1월 28일자로 기탁되었다.
몇몇 양태에서 단순포진 바이러스는 ICP34.5 유전자 둘 다가, 예를 들어 ICP34.5 유전자의 돌연변이(예를 들어, 삽입, 결실, 부가, 치환)에 의해 기능적 유전자 산물을 발현하지 않지만 달리 야생형 모 바이러스 HSV-1 균주 17+의 게놈을 닮거나 실질적으로 닮도록 변형된 HSV-1 균주 17의 돌연변이체이다. 즉, 바이러스는 HSV-1 균주 17+의 ICP34.5 유전자의 카피 둘 다를 불활성화시키도록 돌연변이되지만 다른 단백질 암호화 서열을 삽입 또는 결실/변형시키도록 변경되지는 않은 게놈을 갖는 HSV1716의 변이체일 수 있다.
몇몇 양태에서 본 발명에 따르는 종양분해성 단순포진 바이러스의 게놈은 폴리펩타이드가 핵산으로부터 발현될 수 있도록 바이러스에 이종성인(즉, 야생형 바이러스에서는 정상적으로 발견되지 않는) 폴리펩타이드의 적어도 하나의 카피를 암호화하는 핵산을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이와 같이, 종양분해성 바이러스는 또한 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 이러한 바이러스의 예는 WO2005/049846 및 WO2005/049845에 기재되어 있다.
폴리펩타이드의 발현을 수행하기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 바람직하게는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전사를 수행할 수 있는 조절 서열, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열(예를 들어, 프로모터)은 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 산물의 발현을 수행하고/하거나 조절할 수 있도록 그 서열에 인접하게 또는 아주 근접하여 위치할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 암호화된 산물은 그 조절 서열로부터 발현 가능할 수 있다.
몇몇 바람직한 양태에서, 종양분해성 단순포진 바이러스는 바이러스에 이종성인 폴리펩타이드(또는 기타의 핵산 암호화된 산물)의 적어도 하나의 카피를 암호화하는 핵산을 함유하도록 변형되지 않는다. 즉 바이러스는 이종성 폴리펩타이드 또는 기타의 핵산 암호화된 산물을 발현할 수 있는 발현 벡터가 아니다. 이러한 oHSV는 유전자 치료법에 적합하지도 유용하지도 않으며 이들이 사용되는 의학적 치료방법은 임의로 유전자 요법을 포함하지 않는 것일 수 있다.
단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포
단핵구는 골수에 의해 생산되는 백혈구(백색 혈구 세포)의 일종이다. 혈중 초기 순환 후, 이들은 정상으로 조직으로 이동하며, 여기서 이들은 대식세포 또는 수지상 세포로 분화한다. 단핵구 및 이들의 대식세포 및 수지상 세포 자손은 식균작용, 항원 제시 및 사이토킨 생산에 관여한다.
식균작용은 세포로의 물질(예를 들어, 미생물성 또는 미립자성 물질 또는, 몇몇 경우에, 영양소)의 섭취(uptake)(ingestion)에 이어 세포 내에서의 물질의 소화 및/또는 파괴를 포함한다. 식균작용은 세포내이입의 특수한 형태이다. 식균작용의 과정은 통상적으로 세포 내로 내재화되는 막 결합 소포(식포) 속으로 물질을 집어삼킴을 포함한다. 그후, 식포는 리소좀과 융합하여 물질의 소화가 일어날 수 있는 포식리소좀을 형성한다. 선천 면역계에서의 단핵구 및 이들의 자손의 역할을 고려할 때, 식균작용은 병원체 및 세포 파괴물(cell debris)의 제거에 있어서 중요한 역할을 한다.
단핵구 또는 단핵구 유래 세포는 말초 혈액 또는 기타 조직으로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 참조; de Almeida et al (A Simple Method for Human Peripheral Blood Monocyte Isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 95(2): 221 -223, Mar/Apr. 2000); Elkord et al (Human monocyte isolation methods influence cytokine production from in vitro generated dendritic cells. Immunology. Feb 2005; 114(2):204-212); Repnik et al (Simple and cost-effective isolation of monocytes from buffy coats. Journal of Immunological Methods Vol. 278, Issues 1-2, July 2003, pages 283-292); Zhang et al (The Isolation and Characterization of Murine Macrophages. Curr. Protoc. Immunol. 83: 14.1.1-14.1.14. 2008); John Q. Davies and Siamon Gordon (The Isolation and Culture of Human Macrophages. Basic Cell Culture Protocols Methods in Molecular Biology Vol 290, 2005, pp105-116).
대식세포는 신체 전반에 걸쳐 광범위하게 분포하는 단핵 포식세포이며, 여기서 이들은 선천적 및 후천적 면역 반응에 참여한다. 대식세포의 생리는 이들이 머무르는 조직 환경 및 이들이 노출되는 국소 자극에 따라 변할 수 있다. 이와 같이 광범위한 상이한 조직-특이 대식세포, 예를 들어 지방 조직으로부터의 지방 조직 대식세포, 혈액 또는 골수로부터의 단핵구, 간으로부터의 쿠퍼 세포가 확인될 수 있다. 대식세포는 분비 세포이며, 사이토킨 및 케모카인의 분비에 의해 면역 반응을 촉진 및 조절할 수 있다. 인간 대식세포는 CD14, CD40, Cd11b 및 CD64와 같은 단백질의 이들의 특이 발현을 고려하여 유동 세포계측에 의해 단리될 수 있다. 대식세포는 기타 포유동물, 예를 들어 마우스 또는 다른 설치류로부터, 유사한 기술에 의해 단리될 수 있다. 단핵구 및 대식세포의 평론에 대해서는 문헌[Nature Reviews Immunology, 11, (2011)]을 참고한다.
단핵구 및 이들의 자손, 예를 들면, 대식세포는 저산소성 조직(낮은 산소 분압을 갖는 조직)으로 유인되는데, 이것은 종종 제한된 종양 혈관화 때문에 포유동물 및 실험 종양의 전형적인 특징이다. 단핵구는 종양 내로 계속해서 모집되며, 여기서 이들이 축적하여 종양 관련 대식세포(TAM)로 분화한다. TAM은 고형 및 혈액학적 악성종양에서 풍부하며 진행, 전이 및 치료법에 대한 내성과 연관된다(Cook and Hagemann. Tumor-associated macrophages and cancer. Current Opinion in Pharmacology. Vol. 12, Issue 4, August 2013, pages 595-601). 연구에서는 대식세포가 광범위하게 다양한 유사분열촉진성, 침습촉진성(proinvasive), 혈관신생촉진성(proangiogenic) 및 전이촉진성(prometastatic) 유전자를 활성화시키는 저산소증유도성 전사 인자를 상향-조절함으로써 종양에서 발견되는 저산소증의 수준에 반응하는 것으로 나타났다(Lewis and Murdoch. Macrophage Responses to Hypoxia, Implications for Tumor progression and Anti-Cancer Therapies. Am J Pathol. Sep 2005; 167(3): 627-635).
본 발명은 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염될 수 있고, 임의로, 예를 들어 식균작용에 의해 외인성 자성 물질을 섭취하여, 자성 물질로 '부하된' 세포를 생산할 수 있는 단핵구, 또는 단핵구 유래 세포, 예를 들면, 대식세포 또는 수지상 세포에 관한 것이다. 세포는 비-인간, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 토끼, 기니 피크, 랫트, 마우스 또는 기타 설치류(설치 목 동물로부터의 세포 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 비-인간 영장류일 수 있거나, 인간 세포일 수 있다. 몇몇 양태에서 세포가 대식세포, 예를 들어 인간 또는 포유동물 대식세포인 것이 바람직하다.
단핵구 또는 단핵구 유래 세포는, 예를 들어 상기한 바와 같이 말초 혈액의 샘플로부터의 단리에 의해, 치료하고자 하는 대상체로부터 단리되거나 수득될 수 있다. 대안적으로, 이것은 기증자 대상체, 예를 들어 (바람직하게는 동일한 종의) 다른 포유동물 또는 인간으로부터 단리되거나 수득될 수 있다. 기증자 단핵구는 면역적합성에 대해 스크리닝될 수 있다. 단핵구 또는 단핵구 유래 세포는 단핵구 또는 단핵구 유래 세포가 아닌 세포를 실질적으로 함유하지 않는 배양물 또는 제제를 제공하는 다른 세포 유형으로부터 단리될 수 있다. 임의로, 적합한 지지 또는 배양보조 세포가 배양물 또는 제제에 존재할 수 있다.
단리된 세포는 시험관내에서 배양될 수 있으며, 여기서 이들은 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고 자성 물질로 부하될 수 있다.
단핵구 또는 단핵구 유래 세포의 감염은 단순포진 바이러스가 세포로 들어갈 수 있도록 하기에 적합한 조건하에서 이에 충분한 시간량 동안 세포를 종양분해성 단순포진 바이러스와 접촉시킴을 말한다. 이러한 감염은 바람직하게는 시험관내 세포 배양의 조건하에서 수행될 수 있다. 인간 및 포유동물 세포의 시험관내 감염을 위한 기술은 당업계의 통상의 숙련가들에게 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Szanto et al. Peristent infection of BHK cells with herpes simplex virus types 1 and 2 in the absence of specific anti-herpetic antibody. Acta Virol. 1976 Feb; 20(1); 40-7); Conner et al. Herpes simplex virus type 1 strain HSV1716 grown in baby hamster kidney cells has altered tropism for non-permissive Chinese hamster ovary cells compared to HSV1716 grown in vera cells. J Virol. 2005 Aug; 79(15):9970-81]을 참조한다. 대식세포의 시험관내 배양을 위한 기술 또한 당업계의 통상의 숙련가들에게 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[John Q. Davies and Siamon Gordon (The Isolation and Culture of Human Macrophages. Basic Cell Culture Protocols Methods in Molecular Biology Vol. 290, 2005, pp105-116)]을 참조한다.
따라서, 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 제조하는 방법은 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포 중의 하나 또는 다수(임의로 집단)를 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 증식성 감염을 허용하기에 충분한 시간 동안, 예를 들어 시험관내 세포 배양의 적합한 조건하에서 다량의 종양분해성 단순포진 바이러스와 접촉시킴을 포함할 수 있다.
임의로, 세포는 바이러스가 세포 사멸을 유도할 수 있는 조건하에서 배양물 중에 유지될 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 감염 후 종양분해성 단순포진가 복제를 겪고 바이러스 자손이 후속적으로 세포를 용해시켜 세포 사멸을 야기한다고 믿는다. 이와 같이, 배양 조건 및 지속시간은 온전한 및 죽은, 예를 들어 용해된, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 혼합물을 갖는 배양물을 생산하는데 적합할 수 있다.
세포는 0.5-100, 임의로 0.5-5, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 1-30, 5-30, 5-50, 또는 30-50 중의 하나의 범위로 감염 다중도(MOI)를 달성하도록 바이러스와 접촉될 수 있다.
임의로, 세포는 감염으로부터 소정의 시간내에 대상체에 투여될 수 있다. 이것은 표적 조직 또는 종양에서 세포의 사멸(예를 들어, 용해)이 발생하여 표적 조직에서의 바이러스의 전파 및 확산이 가능하도록 보장하기 위한 것일 수 있다. 이와 같이, 세포의 투여는 감염의 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 이내일 수 있다.
자성 물질로의 단핵구 또는 단핵구 유래 세포의 부하는 또한 시험관내 배양 조건하에서 수행될 수 있으며 이 단계는 종양분해성 단순포진 바이러스로의 세포의 감염 전, 감염과 함께, 또는 감염 후 수행될 수 있다.
단핵구 또는 단핵구 유래 세포를 자성 물질로 부하하는 기술은, 예를 들면,문헌[Kaim et al. MR imagaing with ultrasmall superparamagentic iron oxide particles in experimental soft-tissue infections in rats. Radiology 2002 Dec; 225(3):808-14, and in Muthana et al. A novel magnetic approach to enhance the efficacy of cell-based gene therapies. Gene Therapy (2008) 15, 902-910]에 기재되어 있다. 세포를 약 20 내지 300㎍/ml, 또는 약 50 내지 150㎍/ml, 75 내지 125㎍/ml, 90 내지 110㎍/ml 또는 약 100㎍/ml 중의 하나의 입자 농도를 갖는 자성 입자(magnetic particle)의 현탁액과 접촉시킴으로써 세포가 자성 물질로 부하될 수 있다.
따라서, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 제조하는 방법은 종양분해성 단순포진 바이러스로의 감염 이외에, 세포를 적당한 조건, 예를 들어 시험관내 세포 배양의 조건하에서, 예를 들어 식균작용에 의한, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포로의 자성 물질의 섭취를 허용하기에 충분한 시간 동안 다량의 자성 물질과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
감염 및/또는 자성 물질의 섭취 후, 세포는 원하는 한 추가로 배양, 수집, 분리, 정제 또는 분리하고 적당한 제제로 제형화할 수 있다.
본원에 기재된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 임상 사용을 위한 제제, 예를 들어 약제학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있으며 이러한 제형에서 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 배합될 수 있다. 제제를 제형화 또는 제조하는 방법은 선택된 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제 또는 완충제와 혼합함을 포함할 수 있다.
제제는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함할 수 있으며, 이는 제제가 공통 특성을 갖는 다수의 상기 세포, 예를 들어 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고, 임의로 외인성 자성 물질을 함유하는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포로 구성됨을 의미한다. 제제는 본원에 기재된 바와 같이 임의의 형태를 취할 수 있다. 순전히 예를 들자면, 제제는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제 또는 완충제와 함께 세포의 집단을 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제일 수 있다.
예를 들자면, 제제는 주사 또는 카테터에 의한 전달을 포함할 수 있는 비경구, 전신, 강내, 정맥내, 동맥내 또는 종양내 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 적합한 제형은 멸균 또는 등장성 매질 중에 세포를 포함할 수 있다. 약제 및 약제학적 조성물은 주사에 적합한 유체 형태로, 예를 들어 액체, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼으로서 제형화될 수 있거나, 예를 들어 대상체의 신체에 이식하기에 적합한 데포트 또는 저장소로서 제형화될 수 있으며, 이로부터 세포의 방출 속도는 제어될 수 있다. 데포트 제형은 겔, 페이스트, 농축괴 또는 캡슐을 포함할 수 있다. 제제는 적합한 용기 또는 포장재에 제공될 수 있다. 유체 제형은 인간 또는 동물 신체의 선택된 영역으로 주사에 의해 또는 카테터를 통해 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 정상적인 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타의 문제 또는 합병증 없이 해당 대상체(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합당한 이익/위험 비를 갖는 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투여형 등과 관련된다. 각각의 담체, 보조제, 부형제 등은 제형의 다른 성분들과 상용성이라는 의미에서 또한 "허용가능"해야 한다. 적합한 담체, 보조제, 부형제 등은 표준 약학 교재, 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 찾아볼 수 있다.
세포의 집단은 공통 특성을 갖는 다수의 상기 세포, 예를 들어 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염되고, 임의로 외인성 자성 물질을 함유하는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 말한다. 몇몇 양태에서 집단은 주어진 유형의, 즉, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 대략 수 백 개 이상의 세포를 함유한다. 집단은 주어진 유형의 수 천 개 이상의 세포 또는 대략 1x104, 1x105, 1x106, 1x107개 이상의 다수의 세포를 가질 수 있다. 집단은 세포의 시험관내 배양물에 존재하거나 이로부터 단리될 수 있거나, 세포의 제제에, 예를 들어 약제학적 조성물 또는 약제에 존재할 수 있다.
세포의 집단은 주어진 유형의 배양물 또는 제제 중의 모든 세포, 또는 실질적으로 모든 세포, 즉 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포인 배양물 또는 제제 중의 모든 세포, 또는 실질적으로 모든 세포를 말할 수 있다. 몇몇 양태에서 세포의 제제 또는 배양물은 다른 유형의 세포, 예를 들어 배양보조 세포 또는 섬유아세포를 함유할 수 있으며, 이것은 제제의 일부로서 간주되지 않을 수 있다. 몇몇 양태에서 세포의 집단에서 세포의 적어도 80%가 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포인 것이 바람직하다. 몇몇 양태에서 이러한 퍼센트는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 중의 하나일 수 있다.
바람직하게는, 세포의 집단에서 집단의 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 적어도 80%, 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 중의 하나는 oHSV로 감염되며, 임의로 또한 외인성 자성 물질을 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서 집단의 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 실질적으로 모두, 예를 들어 95% 이상이 oHSV로 감염되며 임의로 또한 외인성 자성 물질을 함유한다.
세포의 집단에서, oHSV로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 일부는 세포 사멸을 겪을 수 있다(예를 들어, oHSV에 의한 용해될 수 있다). 죽어가는 또는 죽은(예를 들어, 용해된) 세포가 oHSV로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포 또는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단의 1-50%를 차지할 수 있다. 몇몇 양태에서 이 범위는 0.5%-5%, 1-5%, 1-10%, 1-20%, 10-20%, 10-30%, 20-40% 또는 30-50% 중의 하나일 수 있다. 이것은 대상체에 투여시 집단 중의 죽어가는 또는 죽은(예를 들어, 용해된) 세포의 퍼센트일 수 있다.
몇몇 바람직한 양태에서, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 바이러스에 이종성인 폴리펩타이드(또는 기타의 핵산 암호화된 산물)의 적어도 하나의 카피를 암호화하는 핵산을 함유하도록 변형되지 않는다. 즉 세포는 이종성 폴리펩타이드 또는 기타의 핵산 암호화된 산물을 발현하도록 변형되지 않는다. 이러한 세포는 유전자 치료법에 적합하지도 또는 유용하지도 않으며 이들이 사용되는 의학적 치료방법은 임의로 유전자 요법을 포함하지 않는 것일 수 있다(즉, 의학적 치료방법은 이종성 폴리펩타이드 또는 기타의 핵산 암호화된 산물의 발현에 의존한다).
임의로, 및 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 감염시키는 oHSV는 또한 바이러스에 이종성인 폴리펩타이드(또는 기타의 핵산 암호화된 산물)을 암호화하는 핵산을 함유하도록 변형되지 않은 것일 수 있으며 이로서 또한 유전자 치료법에 적합하지도 또는 유용하지도 않으며 이들이 사용되는 의학적 치료방법은 임의로 유전자 요법을 포함하지 않는 것일 수 있다.
투여는 바람직하게는 "치료학적 유효량"으로 이루어지며, 이것은 개인에게 이익을 보여주기에 충분하다. 투여되는 실제량, 및 투여의 속도 및 시간-경과는 치료되는 질환의 성질 및 중증도에 따라 좌우될 것이다.
치료의 처방, 예를 들어 투여량에 대한 결정 등은 일반의 및 기타 의사의 책임 내에 있으며, 전형적으로 치료하고자 하는 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여의 방법 및 의사에게 공지된 기타의 인자들을 고려한다. 앞서 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 찾아볼 수 있다.
몇몇 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스의 복제 또는 증식은 저산소성 환경에 반응하지 않는다. 즉, 종양분해성 단순포진 바이러스는 저산소성 환경에 반응하게 되도록 야생형 바이러스 또는 모 종양분해성 바이러스(예를 들어, HSV1716)에 비해 변형(또는 추가로 변형)되지 않는다. 예를 들면, 바이러스 복제 및/또는 유전자 발현은 감염된 세포 또는 주변 조직에서 저산소증에 반응하는(예를 들어, 활성화되거나 억제되는) 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 프로모터(들)의 조절하에 있지 않다.
몇몇 양태에서 종양분해성 단순포진 바이러스는 종양 조직을 포함한 특정 조직 유형에서 복제 또는 증식하도록 야생형 바이러스 또는 모 종양분해성 바이러스(예를 들어, HSV1716)에 비해 변형(또는 추가로 변형)되지 않는다. 예를 들면, 바이러스 복제 및/또는 유전자 발현은 특정 조직에서의 위치에 반응하는(예를 들어, 활성화되거나 억제되는) 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 프로모터(들)의 조절하에 있지 않다. 예를 들면, 바이러스 복제 및/또는 유전자 발현은 하나 이상의 조직 특이 또는 종양 특이 프로모터(또는 기타의 조절 요소)의 조절하에 놓여있지 않다.
단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 감염이 세포의 이산 집단의 형성을 유도한다
종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 대식세포의 유전자 발현 분석은 감염 후 세포가 몇몇 전염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1, CXCL-1, 몇몇 항염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-10, CXCL-6 및 기타 인자, 예를 들면, NFκB, VEGF-A, 및 TGF-β를 포함한 특정 인자의 발현에 있어서 변화를 겪음을 나타낸다.
이와 같이, 종양분해성 단순포진 바이러스로의 감염은 특정 유전자/단백질의 발현의 뚜렷한 패턴을 갖는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포임을 특징으로 하는 세포의 이산 집단의 형성을 초래한다. 세포는 배양 또는 제형화의 조건, 즉, 정상산소성(약 18 내지 22% p02) 또는 저산소성(5% 미만 p02　및 바람직하게는 0.1 내지 3% p02)을 추가로 특징으로 할 수 있다. 세포는 임의로 단리되거나 정제된, 세포의 시험관내 또는 생체외 제제로서 제공될 수 있고, 각각의 정상산소 또는 저산소 상태하에서 배양물 중에 또는 제형 중에 유지된 세포일 수 있다.
몇몇 양태에서, 동일한 유형의 비감염된 세포에 비해, 전염증성 사이토킨 IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1, CXCL-1 중의 하나 이상의 발현이 상향조절될 수 있다. 이러한 상향조절은 바람직하게는 세포가 저산소 상태(예를 들어, 약 0.1% p02)에 있을 때 일어날 수 있다. IL-8 및/또는 IL-1의 상향조절은 적어도 2배, 임의로 3배, 또는 5배일 수 있다. NFκB 또는 TGF-β 또는 CXCL6 발현의 상향조절이 또한 저산소 상태하에서 관찰될 수 있다. NFκB 및 기타 인자의 상향조절은 1형 T 세포 반응(Th1 및/또는 Tc1)의 유도와 일치할 수 있으며, 이것은 암의 치료를 위해 바람직하며 세포로부터 바이러스 입자가 방출되는 경우 대상체에서 개시되는 항-바이러스 Th1 유형 면역 반응에 대한 첨가제일 수 있다.
몇몇 양태에서, 동일한 유형의 비감염된 세포에 비해, IL-8, IL-1, NFκB, IL-10, 및 VEGFA 중이 하나 이상의 발현이 상향조절될 수 있다. 이러한 상향조절은 바람직하게는 세포가 저산소 상태(예를 들어, 5% 미만 p02　및 바람직하게는 0.1 내지 3% p02)에 있을 때 일어날 수 있다. 이러한 상향조절은 적어도 2배, 임의로 3배, 또는 5배, 또는 그 이상일 수 있다.
몇몇 양태에서, 동일한 유형의 비감염된 세포에 비해, 항염증성 사이토킨 IL-10, CXCL-6 중의 하나 이상의 발현이 하향조절될 수 있다. 이러한 하향조절은 세포가 정상산소 상태에 있을 때 일어날 수 있다.
몇몇 양태에서, 정상산소 상태하에서 IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1, 및 VEGFA 중의 하나 이상은 상향조절될 수 있고 NFκB, TGF-β, IL-10, CXCL6 및 CXCL1 중의 하나 이상은 하향조절될 수 있다.
몇몇 양태에서, 저산소 상태하에서 IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1, NFκB, TGF-β, IL-10, VEGFA, CXCL6 및 CXCL1 중의 하나 이상은 상향조절될 수 있다.
유전자/단백질의 상향조절 또는 과발현은 주어진 유형의 세포 또는 조직에 대해 정상적으로 예상되는 것보다 더 큰 수준으로 마커의 발현을 포함한다. 이와 같이, 상향조절은 동일 유형의 바이러스 감염된 및 비감염된 세포 간의 발현 수준을 비교함으로써 결정될 수 있다.
발현의 수준은 절대 비교를 위해 정량할 수 있거나, 상대 비교가 이루어질 수 있다. 발현은 유전자 발현을 측정함으로써, 예를 들어 mRNA 수준의 측정에 의해, 또는 단백질 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다.
몇몇 양태에서 상향조절은 시험 샘플에서의 발현 수준이 대조 샘플에서의 발현 수준의 적어도 1.1배인 경우에 존재하는 것으로 간주될 수 있다. 몇몇 양태에서 발현의 수준은 대조 샘플에서의 발현 수준의 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4, 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3.0, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 적어도 5.0, 적어도 6.0, 적어도 7.0, 적어도 8.0, 적어도 9.0, 또는 적어도 10.0배 중의 하나로부터 선택될 수 있다.
하향 조절은 상응하는 방식으로 결정될 수 있으며, 예를 들어 몇몇 양태에서 하향 조절은 시험 샘플에서의 발현 수준이 대조 샘플의 발현 수준의 0.9배 미만인 경우에 존재하는 것으로 간주될 수 있다. 몇몇 양태에서 발현의 수준은 대조 샘플에서의 발현 수준의 0.8배 미만, 0.7배 미만, 0.6배 미만, 0.5배 미만, 0.4배 미만, 0.3배 미만, 0.2배 미만, 또는 0.1배 미만 중의 하나로부터 선택될 수 있다.
따라서, 감염된 세포는 뚜렷하고 확인 가능한 세포 집단을 나타내며, 이것이 차용 면역요법(adoptive immunotherapy)의 방법(예를 들어, 문헌[Darcy et al., Current Opinion in Immunology 2014, 27:46-52 and in Andreesen et al., Journal of Leukocyte Biology Volume 64, October 1998, p419-426]에 기재된 바와 같음)에서 유용한데, 여기서는 세포가 대상체의 신체에서 면역 반응, 바람직하게는 항종양 반응을 촉진시키는 정의된 인자 또는 사이토킨의 발현 및/또는 분비를 통해 치료학적 효과를 제공한다. 세포 집단의 이러한 작용은 종양분해성 단순포진 바이러스를 병든 조직에 운반하고 이를 조직에서 방출하여 별도의 바이러스-매개된 항종양 반응을 야기하는 이들의 능력에 추가적인 것이다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서 대상체로부터 혈액 또는 조직 샘플을 수득하는 단계, 상기 혈액 또는 조직 샘플로부터 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 분리하는 단계, 상기 세포를 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염시키는 단계, 상기 감염된 세포를 포함하는 제제를 제형화하는 단계 및 상기 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 방법은 차용 면역요법의 방법의 일부일 수 있다.
자성 물질
자성 물질은 자기적으로 민감한 물질, 자화성 물질 또는 자기장에 의해 조작(예를 들어, 이동) 및/또는 배치될 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 자성 물질은 비자성(non-magnetic)이지만 자기장에 의한 조작 또는 배치에 민감할 수 있거나, 자성(magnetic)(예를 들어, 자기장 선의 공급원)일 수 있다. 이와 같이, 자성 물질은 본질적으로 자성일 수 있거나 자기장에서 반응, 예를 들어 이동하는 것일 수 있다.
바람직한 양태에서 자성 물질은 자기적으로 민감한 입자이거나, 유체, 예를 들어 종종 자성유체(ferrofluid)로도 불리는 자기적으로 민감한 입자가 현탁액으로 있는 유체이다.
자기적으로 민감한 입자는 자기적으로 민감한 입자, 자화성 입자, 또는 자기장에 의해 조작(예를 들어, 이동) 및/또는 배치될 수 있는 입자를 포함할 수 있다. 자기적으로 민감한 입자는 비자성이지만 자기장에 의한 조작 또는 배치에 민감할 수 있거나, 자성(예를 들어, 자기장 선의 공급원)일 수 있다.
전형적으로 입자는 세포에 손상을 야기하지 않으면서 시약을 세포에 전달하기에 적합한 크기이다. 한 양태에서, 입자는 10㎛ 내지 5nm, 예를 들면, 1㎛ 내지 10nm, 예를 들면, 200nm 내지 20nm 또는 5nm 내지 50nm의 평균 크기를 갖는다. 또 다른 측면에서 자기적으로 민감한 입자는 구형 비드일 수 있으며 적어도 약 0.05㎛, 적어도 약 1㎛, 적어도 약 2.5㎛, 및 전형적으로 약 20㎛ 미만의 직경을 가질 수 있거나, 약 5 내지 50nm, 10 내지 40nm, 20 내지 30nm 또는 약 25nm의 직경을 가질 수 있다.
이론에 제한하고자 하는 것은 아니지만, 보다 큰 입자가 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포로의 개선된 섭취를 제공할 것으로 믿어진다. 예를 들면, >30nm의 자철석 입자는 식 T = μBsinθ(여기서, T는 회전력이고, μ는 자기 모멘트이고, B는 자속 밀도이고, θ는 적용된 장과 입자의 자화 벡트 간의 각도이다)에 지정된 대로 진동 자기장에서 회전력을 경험할 것이다. 예를 들면, 정확한 양의 회전력은 입자 형상에 의해 영향을 받는다. 이러한 회전력에 의해 유도되는 입자의 이동이 입자를 세포 내로 및 세포의 표면을 가로질러 '드레그(drag)'하여 식균작용 메카니즘에 의한 입자의 흡수를 유도하는 것으로 믿어진다. 정상적인 세포 과정에 의한 입자의 섭취는 (예를 들면, 유전자총법 또는 전기천공법과 비교하여) 세포에 기계적 손상이 없어서 입자 전달 후 세포 생존율을 개선시킴을 의미한다.
자기적으로 민감한 입자는, 예를 들면, U.S. 특허 출원 공보 제20050147963호 또는 제20050100930호, 또는 U.S. 특허 제5,348,876호(이들 각각은 전문이 참고로 포함된다)에 기재된 자기적으로 민감한 입자, 또는 상업적으로 이용 가능한 비드, 예를 들면, 상품명 DYNABEADS™ 및/또는 MYONE™ 하에 Dynal AS(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California USA)에 의해 생산된 것들일 수 있다. 특히, 자기적으로 민감한 입자에 연결된 항체들은, 예를 들면, 미국 특허 출원 제20050149169호, 제20050148096호, 제20050142549호, 제20050074748호, 제20050148096호, 제20050106652호, 및 제20050100930호, 및 U.S. 특허 제5,348,876호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전문이 참고로 포함된다.
한 측면에서 입자는 상자성, 초상자성, 강자성 및/또는 반강자성 물질, 예를 들면, 원소 철, 크롬, 망간, 코발트, 니켈, 또는 이의 화합물 및/또는 배합물(예를 들어, 망간 및 코발트 페라이트)을 포함한다. 입자는 초상자성 산화철(SPIO) 입자일 수 있다. 예를 들면, 적합한 화합물은 철 염, 예를 들면, 산화철, 마그네타이트(Fe304), 마그헤마이트(γFe2O3), 그레자이트(Fe3S4) 및 이산화크롬(Cr02)을 포함한다.
입자는 중합체에, 예를 들면, 중합체 매트릭스의 기공 내에 매봉된 자성 물질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 입자는 생체적합성 코팅, 예를 들면, 실리카 또는 중합체, 예를 들면, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 또는 폴리에틸렌이민에 의해 둘러싸인 자성 코어(magnetic core)를 포함할 수 있다.
자기적으로 민감한 입자는 시약을 포함할 수 있다. 시약은 공유 또는 비공유 결합(예를 들면, 수소 결합, 정전 상호작용, 이온 결합, 친유성 상호작용 또는 반 데르 발스 힘)에 의해 입자와 결합(예를 들어, 접합)될 수 있다. 하나의 측면에서 시약 및 입자는, 예를 들면, 시약을 반응성 측쇄를 지닌 입자, 예를 들면, 단백 시약의 티로신 잔기에 연결하기 위해서는 벤지딘, 또는 탄수화물 그룹에 연결하기 위해서는 과옥소산염에 노출시킴으로써 공유적으로 결합된다. 또 다른 측면에서 입자는 결합 활성을 갖는 분자(예를 들어, 아비딘)에 연결될 수 있고 시약은 상기 결합 분자의 리간드(예를 들어, 비오틴)에 연결될 수 있다. 이것은 입자 및 시약이 시험관내에서 용이하게 접합되도록 할 수 있다. 추가의 측면에서 입자는 매트릭스, 예를 들면, 중합체 매트릭스에 흡수된 시약을 포함할 수 있다.
자성 물질은 바람직하게는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포로부터 외인성이며, 즉, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 외부에서 유래하고 임의로 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포에 정상적으로 존재하는 물질이 아니다.
자기장의 적용
단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 외인성 자성 물질로 부하된 양태에서, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 대상체에 투여한 후, 투여된 세포를 대상체 신체의 목적하는 위치로, 예를 들어 종양으로 지시하기 위해 자기장을 대상체에 적용할 수 있다. 이에 의해 세포가 자력(magnetic force)에 적용되는데, 자력은 자성 물질이 기울기를 갖는 자기장에 있는 경우 자성 물질에 가해지는 힘이다. 자력은 자성 물질이 자기장의 공급원 쪽으로 이동하게 할 수 있다. 자력은 또한 입자가 회전력을 경험하게 할 수 있다. 몇몇 방식에서, 자력은 입자가 자기장의 공급원으로부터 이동하게 할 수 있다. 이것은 입자가 자기적으로 차단되어 회전할 수 없는 경우에 일어날 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 자석, 또는 자석 배열의 '힘의 장(force field)'은 자성 물질이 자력을 경험하게 되는 자석 또는 자석 배열을 둘러싼 공간의 용적을 말한다.
자기장은 자장 공급원, 전형적으로 자석, 또는 자석의 배열에 의해 제공될 수 있다. 자석은 전자석일 수 있다. 선택되는 자석의 유형 및 크기/힘은 용도에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, 세포가 신체의 표면 근처 종양, 예를 들어 원발성 흑색종에 국소적으로 투여되는 경우, 세포를, 예를 들어 조직 또는 혈관을 통해, 종양 부위 쪽으로 지시하는데 적합한 자력을 적용하는 데에는 소형 자석(handheld magnet)으로도 충분할 수 있다. 기타의 경우에, 예를 들면 종양이 신체내 심부에 위치하는 경우 및/또는 투여가 종양에 비-국소적, 예를 들어 전신 투여인 경우, 대상체는 가변적 또는 진동성의, 그리고 바람직하게는 조절 가능한 자기장, 예를 들면, 전자석의 자기장 또는 자기 공명 이미징(MRI), 핵 자기 공명 이미징(NMRI) 또는 자기 공명 단층촬영(MRT) 장치에 의해 제공된 자기장에 놓일 수 있다.
몇몇 바람직한 양태에서 본 발명에 따르는 방법 및 용도는 자성 물질로 부하된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 피부 근처에 위치하지 않는 선택된 조직 또는 종양에, 즉, 심부 조직 또는 기관에 지시 또는 표적화함을 포함한다. 심부 조직 또는 기관은 피부의 표면으로부터 적어도 4cm 또는 5cm 또는 그 이상 떨어져 있는 것일 수 있다(치료하고자 하는 조직 또는 종양의 영역의 중심로부터 피부의 표면까지의 최단 거리로서 측정됨). 조직 또는 종양은 대상체 신체의 중심부(즉, 다리 및 팔을 포함하지 않는 신체의 부분)에 있을 수 있다. 조직 또는 종양은 머리, 목, 흉부, 복부, 또는 골반에 있을 수 있다. 조직 또는 종양은 부신, 부신 수질, 항문, 충수, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계(뇌를 포함하거나 배제함) 소뇌, 자궁경부, 결장, 십이지장, 자궁내막, 담낭, 식도, 심장, 회장, 창자, 공장, 신장(들), 눈물샘, 후두, 간, 폐(들), 림프, 림프절, 종격, 장간막, 자궁근층, 비인두, 장막, 난소, 췌장, 귀밑샘, 말초 신경계, 복막, 흉막, 전립선, 직장, 침샘, S상결장, 소장, 비장, 위, 고환, 가슴샘, 갑상샘, 또는 자궁과 같은 주요 장기 중의 하나이거나, 주요 장기 중의 하나에 있을 수 있다. 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포는 저산소성인 조직 또는 종양의 영역으로 지시되거나 표적화될 수 있다.
치료를 수행하기 위해, 대상체는 자성 물질로 부하된 세포를 투여받고, 자기장 내에 배치될 수 있다. 그후, 자기장은 필요에 따라 세포가 투여되는 조직, 예를 들어 혈관 구조의 건설을 고려하여 세포 내에 함유된 자성 물질에 자력을 적용하여 자성 물질(및 세포)을 대상체 신체의 목적하는 위치 쪽으로 지시하도록 대상체 및/또는 세포에 대해 변경되거나 달리 조작될 수 있다.
자성 물질로 부하된 세포, 및 기타의 제제를 신체내 표적 부위로 자기적으로 안내 및/또는 국소화하기 위한 장치 및 기술[때때로 자기주입법(Magnetofection)이라고 부름]은 당업계의 통상의 숙련가들에게 알려져 있으며, 예를 들자면, 문헌[Muthana et al., (A novel magnetic approach to enhance the efficacy of cell-based gene therapies. Gene Therapy (2008) 15, 902-910); Polyak and Friedman, (Magnetic targeting for site-specific drug delivery: applications and clinical potential. Expert Opinion on Drug Delivery, January 2009, Vol. 6, No. 1 : Pages 53-70); Plank et al., (Magnetically enhanced nucleic acid delivery. Ten years of magnetofection-Progress and prospects. Advanced Drug Delivery Reviews. Vol. 63, Issues 14-15, November 2011, pages 1300-1331); and in Li et al., (Targeting Cancer Gene Therapy with Magnetic Nanoparticles Oncotarget. Apr 2012; 3(4):365-370)]에 기재되어 있다.
바람직한 양태에서, 대상체의 신체로의 자기장의 적용은 비-침습적이고 비-수술적이다. 자기장 공급원은 정상적으로 대상체 신체의 외부에 있으며 바람직한 양태에서 대상체 신체와 물리적으로 접촉하지 않는다.
암
암은 임의의 원치않는 세포 증식(또는 원치않는 세포 증식을 자체 발현하는 임의의 질환), 신생물 또는 종양 또는 원치않는 세포 증식, 신생물 또는 종양의 증가된 위험 또는 소인일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있으며 원발성 또는 속발성(전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있으며 임의의 조직에 위치할 수 있다. 조직의 예는 부신, 부신 수질, 항문, 충수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계(뇌를 포함하거나 배제함) 소뇌, 자궁경부, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피 세포(예를 들어, 신장 상피), 담낭, 식도, 교질 세포, 심장, 회장, 공장, 신장, 눈물샘, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프아세포, 턱, 종격, 장간막, 자궁근층, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 귀밑샘, 말초 신경계, 복막, 흉막, 전립선, 침샘, S상결장, 피부, 소장, 연질 조직, 비장, 위, 고환, 가슴샘, 갑상샘, 혀, 편도선, 기도, 자궁, 음문, 백혈구를 포함한다.
치료하고자 하는 종양은 신경계 또는 비신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양, 예를 들어 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 뇌실막세포종, 쉬반종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 희소돌기아교세포종은 중추 또는 말초 신경계에서 유래할 수 있다. 비신경계 암/종양은 임의의 다른 비신경 조직에서 유래할 수 있으며, 예는 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 간종양, 포피모양 암종, 전립선 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 난소 암, 췌장 암, 흉선 암종, NSCLC, 혈액학적 암 및 육종을 포함한다.
몇몇 양태에서 암을 고형 종양일 수 있다.
저산소증
몇몇 양태에서, 조직 또는 암은 저산소 환경을 갖는 것일 수 있으며 치료는 둘러싸고 있는 정상산소 세포와 함께 또는 이들과 무관하게 그 환경내 세포에 지시될 수 있다.
생리학적 정상산소증(normoxia)은 조직들 간에, 동물들 간에, 및 개인들 간에 다르다. 조직 또는 기관은, 예를 들면, 혈관구조의 패턴에 따라 가변적인 측정치를 가질 수 있다. 일반적으로, 건강한 포유동물 내부 조직 및 기관은 전형적으로 20mmHg 이상[약 2.62% 산소](예를 들어, 뇌에서는 약 >35mmHg, 장 조직에서는 >50mmHg, 간에서는 >35mmHg, 근육에서는 >25mmHg)의 산소의 평균 분압을 가질 것이다.
살아있는 대상체에서 생리학적 정상산소증 및 저산소증의 측정을 위한 기술은 본원에 참고로 포함된 문헌[Carreau et al., (J. Cell. Mol. Med. Vol.15, No.6, 2011 pp.1239-1253)]에 기재되어 있다. 이들은 비-침습적 및 침습적 기술을 포함한다. 비-침습적 기술은 이미징 기술, 예를 들면, 양전자 방사 단층 촬영(PET), 자기 공명 분광법(MRS, 예를 들어　19F-MRI, 혈중 산소 의존적-MRI, 또는 동적 조영 증강 MRI), 근적외선 분광법(NIRS), 및 전자 상자성 공명 분광법(EPR)을, 임의로 니트로이미다졸(예를 들어, 아조마이신)과 같은 저산소증 마커와 함께 포함한다. 다른 기술들은 폴라로그래픽 센서(종종 산소 분압을 측정하기 위한 최적 표준으로 간주됨), pO2 민감성 형광 염료, 예를 들면, 염화루테늄과 함께 광섬유-기반 센서, 및 질량 분광법의 사용을 포함한다.
몇몇 양태에서 치료의 방법은 대상체 조직에서 정상산소 상태 및/또는 저산소 상태를 측정 또는 결정하는 단계, 예를 들어 산소 분압의 측정, 및 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포로의 치료를 위해, 대상체 및/또는 대상체의 조직 또는 조직의 일부를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 세포가 외인성 자성 물질을 함유하고 정상산소/저산소 상태의 결정이 자기 공명법을 사용하여 이루어지는 양태에서 정상산소/저산소 상태의 결정 및 선택된 조직 또는 조직의 일부로의 세포의 지시 둘 다는 임의로 동시에 수행될 수 있다.
저산소증은 종양에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 상응하는 혈관신생 또는 신생혈관증식 없는 종양의 빠른 성장은 산소 농도가 정상의(정상산소성) 건강한 조직에서보다 더 낮은 종양의 영역을 야기한다. 이와 같이, 저산소 미세환경이 발달하고 종양 세포의 대사가 저산소성 환경에 적응하게 될 수 있다. 종양 저산소증은 문헌[Kizaka-Kondoh et al., (Tumor hypoxia: A target for selective cancer therapy. Cancer Sci December 2003, vol. 94, no.12, 1021 -1028) and Hockel and Vaupel (Journal of the National Cancer Institute Vol. 93, No.4, February 21, 2001, p266-276)]에 논의되어 있으며, 이들 각각은 특별히 본원에 참고로 포함된다.
종양 저산소증은 고형 종양에서 흔하다. 다수의 고형 종양은 임상 크기, 단계, 등급 또는 조직학에 의해 예측될 수 없는 낮은 O2 분압 영역을 함유한다. 몇몇 양태에서 저산소증은 약 20mmHg 미만, 약 15mmHg 미만, 약 14mmHg 미만, 약 13mmHg 미만, 약 12mmHg 미만, 약 11mmHg 미만, 약 10mmHg 미만, 약 9mmHg 미만, 약 8mmHg 미만, 약 7mmHg 미만, 약 6mmHg 미만, 약 5mmHg 미만, 약 4mmHg 미만, 약 3mmHg 미만, 약 2mmHg 미만, 또는 약 1mmHg 미만 중의 하나의 산소 분압에 의해 정의될 수 있다. 몇몇 양태에서 저산소증은 0.01 내지 15mmHg, 5 내지 15mmHg, 0.01 내지 10mmHg, 3 내지 10mmHg, 5 내지 10mmHg, 7 내지 10mmHg, 8 내지 10mmHg, 8 내지 11mmHg, 또는 7 내지 12mmHg 범위의 산소 분압을 갖는 조직으로서 정의될 수 있다. 몇몇 양태에서 저산소증은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12mmHg 중의 하나의 산소 분압을 갖는 조직으로서 정의될 수 있다. [주의: 1mmHg = 133.322Pa; 1% 산소 = 1.013kPa 또는 약 7.64mmHg]
세포 대사가 저산소 상태에 적응될 수 있기 때문에, 저산소증은 또한 하나 이상의 마커의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다.
이러한 마커는 전사 인자, 예를 들어 NFκB 또는 저산소증 유도 인자(HIF) 패밀리 중의 하나, 예를 들어 동형 HIF-1α, HIF-2α를 포함한다. HIF-1α는 두 개의 서브유닛, HIF-1α 및 HIF-1β를 갖는다. HIF-1α 및 HIF-2α는 저산소증 발생 수 분 내에 유도된다. HIF-1α는 주로 저산소중에 대한 급성 반응이고 HIF-1α 수준은 연장된 저산소증에서 감소하는 경향이 있다. HIF-2α 수준은 저산소증에서 시간에 따라 계속해서 증가하는 경향이 있다. HIF-1α의 유도는 정상적으로 HIF-2α의 유도를 위해 필요한 것보다 더 낮은 pO2(< 5%[Carreau et al])를 필요로 한다. 이와 같이, 몇몇 양태에서 저산소증은 NFκB, HIF-1α 또는 HIF-2α의 발현의 상향조절을 측정함으로써 결정될 수 있으며, 이 측정치를 생리학적으로 정상산소 상태에 있는 것으로 간주되는 상응하는 조직과 비교할 수 있다.
또 다른 그룹의 마커는 저산소증 조절된 마이크로RNA(HRM)이며, 이것은 miR-21, 23a, 23b, 24, 26a, 26b, 27a, 30b, 93, 103, 106a, 107, 125b, 181a, 181b, 192, 195, 210 및 213을 포함하고, 이것은 저산소성 세포에서 상향조절될 수 있다. 몇몇 마이크로RNA는 miR-15b, 16, 19a, 20a, 20b, 29b, 30b, 30e-5p, 101, 141, 122a, 186, 197, 320과 같은 저산소성 세포에서 하향-조절될 수 있다. 이와 같이, 몇몇 양태에서 저산소증은 하나 이상의 저산소증 조절된 마이크로RNA의 상향조절 또는 하향조절을 측정함으로써 결정될 수 있다. 측정치를 생리학적으로 정상산소 상태에 있는 것으로 간주되는 조직과 비교할 수 있다.
저산소증은 프로테옴(proteome) 변화를 유도할 수 있으며, 이것은 종양 저산소증의 경우에 저산소 환경에 대한 종양 전파 및 적응을 촉진시킬 수 있다. 이러한 적응은, 예를 들어 당분해 효소, 글루코스 전달체(예를 들어, GLUT1 및 GLUT3), 형광형성 분자, 생존 및 성장 인자(예를 들어, VEGF), 안지오제닌, PDGF-β, 또는 TGF-β의 전사를 자극함으로써 영양 고갈에 적응함을 포함할 수 있다.
대상체
치료하고자 하는 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 비-인간 포유동물일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 암으로 진단되었거나, 암이 있는 것으로 의심될 수 있다.
키트
본 발명의 몇몇 측면에서 부분의 키트가 제공된다. 몇몇 양태에서 키트는 소정량의 종양분해성 단순포진 바이러스, 예를 들어 소정의 바이러스 양 또는 바이러스 입자의 수/양/농도를 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다. 종양분해성 단순포진 바이러스는 세포의 감염에 적합하도록 제형화될 수 있다. 키트는 소정량의 자성 물질을 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염시키기 위한 및/또는 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 자성 물질로 부하하기 위한 지침서와 함께 제공될 수 있다. 이러한 지침서는 상기 감염 및/또는 부하를 생체외 또는 시험관내에서, 예를 들어 시험관내 세포 배양의 조건하에서 수행하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에 따르는 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 수행될 수 있거나, 산물이 존재할 수 있다. 용어 "시험관내"는 실험실 조건에서 또는 배양 중의 물질, 생물학적 성분, 세포 및/또는 조직을 갖는 실험을 포함하도록 의도되는 반면 용어 "생체내"는 온전한 다세포 유기체를 사용한 실험 및 과정을 포함하는 것으로 의도된다. "생체외"는 유기체의 바깥에, 인간 또는 동물 신체의 바깥에 존재하거나 일어나는 것을 나타내며, 이것은 유기체로부터 채취된 조직(예를 들어, 전체 장기) 또는 세포일 수 있다.
본 발명은 기재된 측면 및 바람직한 특징의 조합을 포함하지만, 이러한 조합이 명백히 용인할 수 없거나 분명히 피해지는 경우는 제외된다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 측면 및 양태는 이하에서, 예를 들자면, 첨부된 도면을 참고로 하여 예시될 것이다. 추가의 측면들 및 양태들은 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다. 본문에 언급된 모든 문서들은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 원리를 예시하는 양태 및 실험이 이하에서 첨부된 도면을 참고로 하여 논의될 것이며, 여기서:
도 1. 4 pfu/세포 HSV1716로의 감염 및 정상산소 상태 또는 저산소 상태에서의 배양 후 다양한 시간에서의 인간 대식세포의 적정을 보여주는 차트. 대략 300,000개의 일차 인간 대식세포를 1,180,000 pfu HSV1716로 감염시켰으며, 샘플을 감염후 다양한 시간에 수집하고 HSV1716을 Vero 세포에서 적정하였다. 총 적정 가능한 바이러스를 시간에 대비하여 그래프로 나타내었으며 점선은 투입 바이러스의 양을 나타낸다.
도 2. 다양한 투입 moi에서 HSV1716로의 정상산소증 감염의 72 hrs 후 인간 대식세포로부터의 출력(총 pfu)을 보여주는 차트이다. 대략 300,000개 일차 인간 대식세포를 moi 40, 4, 0.4 및 0.04에서 HSV1716로 감염시켰으며, 샘플을 감염후 72hrs에 수집하고 HSV1716을 Vero 세포에서 적정하였다.
도 3. MOI 0(대조군)(A) 및 5(B)에서 감염으로부터 72시간 후 LNCaP 세포 집단의 대표적인 밀도 플롯. BL3-A 검출기(X축)는 PI의 척도인 반면, BL1-A 검출기(Y축)는 GFP의 척도이다. 각각의 점은 세포를 나타낸다. 사분면 R4는 HSV1716에 의해 감염되지 않은 살아있는 집단을 보여주고(PI-/GFP-); 사분면 R3 및 R5는 죽은 세포의 양을 나타내며(PI+); R2는 HSV1716에 의해 감염된 살아있는 세포를 보여준다(Pl-/GFP+). 대조군(A)에서는 세포 집단이 R4에 주로 분포되지만, MOI 5 (B) 세포는 우측(R3+R5) 및 플롯의 상측(R2)으로 이동하며, 이것은 각각 증가된 세포 사멸 및 HSV1716에 의해 감염된 살아있는 세포의 퍼센트의 존재를 나타낸다. 플롯은 Attune 혈구계산 소프트웨어로부터 수득되었다.
도 4. HSV1716은 LNCaP 세포 종양분해를 유도한다. (A) X축은 MOI를 보여주고, Y축은 HSV1716을 섭취한 살아있는 세포의 퍼센트를 보여준다. 통계적 유의성은 MOI 0.5 및 5 둘 다에서 정상산소 상태에서 관찰되었다(각 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소성=각 데이터 포인트의 우측 막대). (B) X축은 MOI를 나타내는 반면, 세포 사멸의 퍼센트는 Y축 상에 보고되어 있다. 세포 사멸은 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 5에서 통계적으로 유의하다(정상산소성= 각 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소성=각 데이터 포인트의 우측 막대). 중요하게도, 데이터는 다중 비교를 위한 이원 Anova 검증을 사용하여 측정된, n=4 반복의 평균 ± SEM, p-값 < 0.05이다.
도 5. MOI 0(대조군)(A) 및 5(B)에서 감염으로부터 72시간 후 PC3 세포 집단의 대표적인 밀도 플롯. BL3-A 검출기(X축)는 PI의 척도이고, BL1-A 검출기(Y축)는 GFP의 척도이다. 각각의 점은 세포를 나타낸다. 사분면 R4는 HSV1716에 의해 감염되지 않은 살아있는 집단을 보여주고(PI-/GFP-); 사분면 R3 및 R5는 죽은 세포의 양을 나타내며(PI+); R2는 HSV1716에 의해 감염된 살아있는 세포를 보여준다(Pl-/GFP+). 세포 집단이 주로 살아있는 세포로 구성된(R4에 분포된 사례) 대조군(A)에 비해, MOI 5(B)에서 일관된 비율의 세포가 우측(죽은 세포) 및 플롯의 상측(R2: 감염된 살아있는 세포)으로 이동하였다. 플롯은 Attune 혈구계산 소프트웨어로부터 수득되었다.
도 6. HSV1716은 PC3에 대해 세포독성 효과를 갖는다. (A) X축은 MOI를 보여주고, Y축은 HSV1716을 섭취한 살아있는 세포의 퍼센트를 보여준다. 통계적 유의성은 MOI 0.5 및 5 둘 다에서 정상산소 상태에서 관찰되었다(각 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소성=각 데이터 포인트의 우측 막대). (B) X축은 MOI를 나타내고, Y축은 세포 사멸의 퍼센트를 보여준다. 세포 사멸은 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 0.5 및 5에서 통계적으로 유의하다(정상산소성= 각 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소성=각 데이터 포인트의 우측 막대). 결과는 다중 비교를 위한 이원 Anova 검증을 사용하여 측정된, 4 (A) 및 8 (B) 반복의 평균 ± SEM, p-값 < 0.05이다.
도 7. MOI 0(대조군)(A) 및 5(B)에서 감염으로부터 120시간 후 T47D 세포 집단의 대표적인 밀도 플롯. BL3-A 검출기(X축)는 PI의 척도이고, BL1-A 검출기(Y축)는 GFP의 척도이다. 각각의 점은 세포를 나타낸다. 사분면 R4는 HSV1716에 의해 감염되지 않은 살아있는 집단을 보여주고(PI-/GFP-); 사분면 R3 및 R5는 죽은 세포의 양을 나타내며(PI+); R2는 HSV1716에 의해 감염된 살아있는 세포를 보여준다(Pl-/GFP+). 살아있는 세포 집단(A, 대조군)은 감염으로부터 120시간 후 플롯의 우측으로 이동하며(B, MOI 5), 이것은 죽은 세포의 존재를 나타낸다. 현저한 비율의 세포가 또한 R2 사분면에서 관찰되었다(감염된 살아있는 세포). 플롯은 Attune 혈구계산 소프트웨어로부터 수득되었다.
도 8. HSV1716 감염은 T47D 세포 사멸을 유도한다. (A) X축은 MOI를 보여주고, Y축은 HSV1716을 섭취한 살아있는 세포의 퍼센트를 보여준다. 통계적 유의성은 MOI 0.5 및 5 둘 다에서 정상산소 및 저산소 상태에서 관찰되었다(정상산소 상태=각 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소 상태=각 데이터 포인트의 우측 막대). (B) X축은 MOI를 나타내고, Y축은 죽은 세포의 퍼센트를 보여준다. 세포 사멸은 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 5에서 통계적으로 유의하다. 결과는 다중 비교를 위한 이원 Anova 검증을 사용하여 측정된, n=3 (A) 및 n=5 (B) 독립적인 실험의 평균 ± SEM, p-값 < 0.05이다.
도 9. MOI 0(대조군)(A), 5(B) 및 50(C)에서 감염으로부터 96시간 후 MDM 세포 집단의 대표적인 밀도 플롯. BL3-A 검출기(X축)는 PI의 척도이고, BL1-A 검출기(Y축)는 GFP의 척도이다. 각각의 점은 세포를 나타낸다. 사분면 R4는 HSV1716에 의해 감염되지 않은 살아있는 집단을 보여주고(PI-/GFP-); 사분면 R3 및 R5는 죽은 세포의 양을 나타낸다(PI+). 세포 집단이 살아있는 세포로 주로 구성된 대조군(A)에 비해, MOI 5(B)에서 그래프의 우측으로의 전환이 관찰되며(R3, R5), 이것은 죽은 세포의 퍼센트 증가를 나타낸다. MOI 50(C)에서는, 세포 사멸의 약간의 증가가 검출되지만, MOI 5와 50 간에 상당한 차이는 없다. 플롯은 Attune 혈구계산 소프트웨어로부터 수득되었다.
도 10. HSV1716은 MDM 세포 사멸을 야기한다. X축은 MOI를 나타내고, Y축은 죽은 세포의 퍼센트를 나타낸다. 세포 사멸은 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 5 및 50에서 통계적으로 유의하다(p-값 < 0.001)(정상산소 상태=각 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소 상태=각 데이터 포인트의 우측 막대). MOI 50에서는, 저산소 상태하에서 세포 사멸의 증가가 관찰된다. 결과는 n=4 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다. 통계적 비교는 다중 비교를 위한 이원 Anova 검증을 사용하여 수행된다.
도 11. 표 1 : 대식세포-조건부 배지에서 검출된 HSV1716의 농도(PFU/ml). 표는 MOI 0, 5, 50로 감염되고 정상산소 및 저산소 상태하에서 배양된 MDM으로부터 수집된 상청액에 존재하는 HSV1716의 농도(PFU/ml)를 나타낸다. 세로열은 상이한 미세환경(정상산소증, 저산소증)을 보여주고; 가로열은 수행된 바이러스 감염을 나타낸다(대조군, MOI 5, MOI 50). 바이러스 입자는 MOI 5 및 50 둘 다에서 검출되었으며, 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 50에서 농도가 더 높았다. 데이터는 n=4 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다.
도 12. HSV1716은 인간 대식세포를 용해시키고 미세환경으로 방출된다. X축은 MDM이 감염된 MOI를 보여주고, Y축은 플레이트로부터 수집된 상청액에서 발견된 HSV1716의 농도(PFU/ml)를 보여준다. 결과는 저산소 상태하에서 MOI 50에서 통계적으로 유의하다(p-값 < 0.0001, 다중 비교를 위한 이원 Anova 검증을 사용하여 결정됨). 데이터는 n=4 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 보여준다. 정상산소성=각각의 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소성=각각의 데이터 포인트의 우측 막대.
도 13. MDM-조건부 배지에 함유된 바이러스 입자는 LNCaP 세포 사멸을 유도한다. X축은 조건부 배지가 수집된 대식세포를 감염시키는데 사용된 MOI를 보여준다. Y축은 죽은 세포의 퍼센트를 보여준다. 세포 사멸은 정상산소 상태에서 MOI 50에서 통계적으로 유의하다(p-값 < 0.01). 결과는 n=3 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 다중 비교를 위한 이원 Anova 검증을 사용하여 수행하였다. 정상산소성=각각의 데이터 포인트의 좌측 막대; 저산소성=각각의 데이터 포인트의 우측 막대.
도 14. 표 2: HSV1716은 MDM 유전자 발현 수준의 변화를 유도한다. 표 2는 정상산소(두번째 렬) 및 저산소(세번째 렬) 상태 둘 다에서 MOI 50에서 HSV1716 감염으로부터 48시간 후 관심의 대상인 10개 유전자(첫번째 렬에 명명됨)에 대해 계산된 MDM 유전자 발현에 있어서의 배수 변화(fold change)를 보여준다. 각 상태하에서 감염을 두 번 반복하였다. 밑줄 친 값은 유전자 발현에 있어서의 관련 변화, 상향-조절(값 > 1) 또는 하향-조절(값 < 1)을 직설적으로 나타내며; 즉, 밑줄 친 값 5.13은, MOI 50로 감염 후, 사이토킨 IL-8은 저산소 상태에서 과발현되어, 대조군에 비해 5배 증가를 초래하는 것으로 밝혀졌음을 의미한다.
도 15. 감염된 MDM(MOI 50)으로의 원주체(spheroid)의 침윤이 원주체 세포 사멸을 유도한다. 그래프는 침윤(실험 9일째)으로부터 5일 후 유동 세포계측에 의해 검출된 세포 사멸을 보여준다. Y축은 % 세포 사멸(PI+)을 보여주고, X축은 MDM이 침윤 전 감염된 MOI를 보여준다. 대조군 원주체(대조군) 및 비감염 MDM(0)으로의 침윤 간에는 생존능에 있어서 유의적인 차이가 관찰되지 않았지만, 세포 사멸은 MOI 50을 대조군 및 0 둘 다와 비교하는 경우(p-값 = 각각 0.009, 0.004) 원주체가 MOI 50(50)(51 ± 5.92% 세포 사멸)로 감염된 MDM로 침윤될 때에 통계적으로 유의하였다. 결과는 n=3 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 다중 t 검증을 사용하여 수행되었다.
도 16. 환자에서 특정 조직에 대한 세포-기반 치료법을 조정하기 위한 MR 표적화의 가능한 사용, (a) 개략도: 이들 연구를 위해 사용된 세포는 환자 혈액으로부터 단리된 단핵구로부터 유도된다. 세포를 다양한 자극의 존재하에서 배양하여 '치료적' 대식세포(예를 들어, 사이토킨, 치료적 유전자 또는 바이러스)를 생산하고, 도일한 환자 내로 다시 재주입 전에 초상자성 산화철 입자(SPIO)로 부하한다, (b) 개략도: 그후 대상체를 MRI 스캐너의 중심에 두고, 여기서 선형 공간 암호화 자기 기울기(linear spatial encoding magnetic gradient)를 사용하여 자성체(magnetized body) 상에 힘을 유도할 수 있다. 대상체의 혈류로 주사된 자성 세포는 적용된 자기장의 영향하에서 순환하여 병든 장기/조직에 표적화된다. 필드 맵 플롯(field map plot)은 상당한 장 기울기가 MRI 경사 코일에 의해 다양한 방향으로 생성될 수 있음을 입증한다. 생성된 자기장(dB/dy 장)은 증가된 세포 섭취를 위해 자성 세포를 병든 조직 쪽으로 나아갈 수 있다.
도 17. 자성 대식세포는 MR 표적화를 사용하여 원발성 전립선 종양 쪽으로 나아간다, (a) MR 표적화를 위한 영상 기울기를 사용한 표적화 영역의 도식. A-Y 기울기는 도시된 바와 같이(어둡게 칠해진 상자) 전립선의 위치를 표적화하기 위해 동물을 가로질러 똑같이 적용된다. 그후 삼백만 개의 자기적으로 표지된 대식세포를 i.v. 주사를 통해 마우스에 투여한 다음 마취된 마우스를 7T MRI 스캐너의 등중심에 위치시켰다. 대상체를 2개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 1시간 후 영상화하였다(MR 표적화 없음). 그룹 2는 MRI 표적화를 겪었다. 사후 증가된 수준의 인간 대식세포 섭취가 (b) MRI 표적화한지 1시간 후 콜라게나제-처리된 종양의 FACS 분석, 및 (c) 항-인간 CD68 항체 및 러시안 블루(SPIO의 경우)로의 파라핀 왁스-매봉된 종양 섹션의 조직학적 염색에 의해 확인되었다. 각 그룹에 대한 대표적인 RARE 영상 및 R2 맵이 (d) 및 (e)에 나타내어져 있다. 막대 = 200㎛.
도 18. 자성 대식세포는 MR 표적화를 사용하여 폐 전이 쪽으로 나아간다. 짧은-펄스 자기 기울기를 사용하여 SPIO-부하된 대식세포를 폐 쪽으로 나아가게 하였다, (a) 콜라게나제-처리된 폐의 FACS 분석은 유의적으로 더 많은 인간 CD14+ 대식세포가 MR 표적화를 사용하지 않고서라기 보다는 사용하여 폐에 존재함을 보여주었다, (b) 이것은 폐 구획에서 인간 CD68 및 러시안 블루에 대한 증가된 면역염색에 의해 달성된다, (c) CD31 및 H&E로의 면역염색은 폐로의 자성 대식세포의 MR 표적화된 전달이 표적화 없는 전달에 비해 폐 혈관구조에 불리한 영향을 미치지 않음을 나타내었다. 대표적인 데이터가 n=3 마우스/그룹에서 2회의 레플리케이트 실험 중의 하나로부터 나타내어져 있다. SEM이 도시되어 있다. * 패널 A에서 비-MR 표적화 폐와 비교하여 P < 0.01. 막대 = 50㎛.
도 19. 자성 표적화는 인간 전립선(LUC-LNCaP) 종양에 대한 대식세포 바이로테라피의 항-종양 효과를 증가시킨다. 종양을 갖는 마우스에게 종양분해성 바이러스, HSV1716(MDM+OV)을 지닌 단일 용량의 인간 단핵구-유도 대식세포(MDM)를 투여하였다. 이들은 세 가지 그룹의 마우스로 나뉘어졌다(각각은 5마리 마우스/그룹임). 한 그룹은 전립샘 또는 폐로의 MR 표적화를 1 h 동안 겪었고(MDM+OV+MRT), 다른 그룹은 MRI 스캐너에 노출되었지만 MR 표적화는 없었으며(MDM+OV 무 MRT) 세번째 그룹(MDM+OV)은 MRI 스캐너에 들어가지 않았다. 추가의 마우스 그룹은 100ul의 PBS(대조군), 단일 용량의 1 x 107　pfu HSV1716(OV) 또는 3 백만개의 비처리 MDM을 제공받았다. 마우스를 MS 이미징 시스템을 사용하여 매우 영상화하였으며, 21일 후, 종양 및 폐를 제거하고 조직학을 위해 가공하였다, (a) 종양 광도(tumor luminosity)는 MR 표적화가 종양 성장에 대한 OV-MDM의 효과를 유의적으로 개선시켰음을 보여주었다 (b) 다양한 처리 후 원발성 종양의 대표적인 IVIS 영상 및 사진 (c) MR 표적화의 존재 또는 부재하에서 MDM+OV에 대한 대표적인 RARE 영상은 치료법의 시작 및 종료시 종양 크기의 현저한 차이를 보여준다 (d). (e) 원발성 종양에서 괴사의 존재 및 (f) MR 표적화의 존재 또는 부재하에 MDM+OV를 제공받은 마우스의 폐에서의 전이를 보여주는 H&E 염색된 섹션의 외관. 모든 그룹으로부터 상응하는 데이터가 (e)에 나타내어져 있다. 나타낸 데이터는 평균+/-SEM이다. 정량 분석은 조직 섹션당 10 고출력 장(HPF; x20 배율)에서 수행하였다. 통계적 유의차, MDM+OV+MRT 내지 MDM+OV(MR 표적화 없음)와 비교하여 *P < 0.05; **P < 0.001; ***P < 0.0001, ^는 MDM+OV(MR 표적화 없음) 및 자유 OV 그룹을 비교한다; 막대, 200㎛.
도 20. 신규한 경내피 이동(TEM) 흐름 분석을 사용한 초기 MRT 조사. 3D 종양 원주체 뿐만 아니라 혈관 내피 층을 수용할 수 있는 유동 챔버(flow chamber)를 설계하였다. 따라서, 유동하는 '자성 세포'는 혈관벽에서 내피 세포를 가로지르는 세포의 통과를 시뮬레이션하는 3D 종양에 들어가기 전에 혈관 장벽을 가로지를 필요가 있을 것이다(A: 좌측 패널). TEM 유동 챔버는 구형(6mm 직경) 균일 7T 자기장을 갖는 MRI 스캐너의 등중심에 배치된다. (-y) 기울기 방향으로 300mT/m의 강도와 펄스 기울기(max의 50%)를 적용하였다. 생성된 불균일 자기장(dB/dy 장)이 증가된 섭취를 위해 자성 입자를 종양 원주체 쪽으로 나아가게 할 수 있다(A: 우측 패널). (B) 세포 사멸에 대한 SPIO의 영향을 보여주는 그래프; 섭취는 MRT가 적용되지 않은 경우와 비교하여 MRI 영상의 왜곡 및 신호 손실에 의해 확인되었다(Ci). 리포터 아데노바이러스(AdCMVGFP)를 지닌 대식세포로 침윤된 전체 원주체의 상응하는 형광 영상이 (Cii)에 나타내어져 있다. 효소적으로 분산된 원주체의 유동 세포계측 결과, 자성-세포 침윤 원주체의 수(CD14+인 원주체에 존재하는 전체 세포의 %)는 기울기가 적용된 경우에 유의적으로(*P<0.03) 증가되는 것으로 드러났다(Ciii &iv). 데이터는 평균 ± SEM이며 6회 레플리케이트 실험을 나타낸다. MRT 처리된 세포와 비교한 통계적 유의차 p = 0.0001. 막대 = 100um.
도 21. 자성 대식세포는 MRI 스캐너에서 생성된 자기장을 사용하여 원발성 전립선 종양 내로 나아갔다. 삼백만 개의 자기적으로 표지된 대식세포를 i.v. 주사를 통해 투여한 다음 마우스를 11 MRI 스캐너의 등중심에 위치시켰다. 대상체를 2개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 1시간 후 영상화하였다(MRT 없음). 그룹 2는 MRT를 겪었다. 한 편당 고출력 장 당 혈관의 수가 CD31 표지된 종양의 구획에 기록되었다(a). 대식세포를 MRT를 사용하여 조직 쪽으로 나아가게 하는 것이 MRT를 제공받지 않은 마우스와 비교하여 종양에서의 혈관 수에 대해 유의적인 영향을 미치지 않았다(p=0.5165). 종양으로의 MRT 후 각 그룹에 대한 대표적인 MRI 영상은 신호의 정성적 감소를 보여주며 이것은 두 그룹 모두에서 횡축 이완 속도(transverse relaxation rate)의 분석에 의해 확인되었다(b). 그룹 2는 그룹 1을 능가하여 증가된 감쇠 속도(decay rate)을 보인다. MRI와의 신호 차를 살펴보기 위한 추정된 최상의 에코 시간(best echo time)은 대략 60ms이며 - MRI 스티어링(steering)은 이러한 에코 시간에서 신호의 10% 감소를 야기한다. 이러한 유의적인 신호 감소는 그룹 2에서 증가된 수준의 철의 존재를 시사한다. 종양 조직의 정상적인 감쇠 속도가 또한 비교를 위해 나타내어져 있다(대조군). 이 실험을 반복하되 SPIO 없이 대식세포를 사용하였다(그룹당 N=3마리 마우스). (c)에서 종양의 MRI 영상에서 아주 적은 왜곡이 보이며, 이것은 자성 대식세포의 낮은 섭취를 나타내고, 이것은 콜라게나제 처리된 조적의 FACS 분석에 의해 확인되었다(d). 제시된 데이터는 평균 ± SEM이다. 막대 = 200um.
도 22. 자성 대식세포는 다른 조직/기관에서 매우 작은 수로 검출되었다. 종양으로의 자성 대식세포의 MRI 스티어링은 아주 소수의 대식세포가 다른 조직에 국소화되게 하였다. 이것은 사후 제거된 조직 및 기관의 파라핀-왁스 매봉된 구획의 조직학적 염색에 의해 밝혀졌다. MRT를 제공받았거나 MRT를 제공받지 않은 종양을 가진 마우스로부터 채취한 간 및 비장의 대표적인 구획이 나타내어져 있다. 이러한 조직 둘 다에서 항-CD68로의 염색 후 인간 대식세포(<2%, 간 & <1% 비장 )가 조금 검출되었다. 막대=100um
도 23. 자성 대식세포는 MRT를 사용하여 폐 전이의 영역으로 나아갔다. 이것은 철-양성 인간 대식세포를 검출하기 위해 EPCAM(인간 전립선 종양 세포를 검출하기 위해) 및 러시안 블루(PB)로의 폐 조직의 왁스-매봉된 연속 구획의 조직학적 염색에 의해 확인되었다. 대표적인 영상은 PB에 대해 양성인 대식세포가 MRI 스티어링 후 마우스의 폐 내의 전이성 축적물(metastatic deposit)에 아주 근접하여 검출되었음을 보여준다(a). 중요하게도, MRT에 의해 폐에 표적화된 대식세포를 갖는 철이 또한 H&E 염색 후 보였다(b). 막대 = 200um 및 막대 = 50um.
도 24. HSV1716이 LNCaP 및 대식세포 종양분해를 유도함을 보여주는 그래프. HSV1716:GFP를 정상산소(20% 02) 및 저산소(0.5% O2) 배양 조건에서 배양한 LNCaP 세포의 배양물에 가하였다. 종양 세포 사멸을 프로피듐 요오다이드를 사용하여 유동 세포계측에 의해 평가하였으며 비감염 세포를 능가하여 유의적으로 증가되었다(a). 이것은 용량 의존적이었으며 정상산소증에서 MOI 5에서 p< 0.03 MOI 50에서 p<0.001 & 저산소증에서 MOI 5에서 p<0.01 MOI 50에서 p<0.001이었다. MOI 5 및 50 둘 다에서 정상산소 및 저산소 상태 간에 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. HSV1716은 감염 후 48h에 유동 세포계측에 의해 평가되는 바와 같이 MOI 5 및 50에서 MDM에 의해 효과적으로 섭취된다. 정상산소 배양 조건은 저산소 상태에 비해 MOI 5(p< 0.0004) 및 MOI 50(p < 0.001)에서 대식세포를 발현하는 유의적으로 더 많은 GFP를 야기하지만(b) 흥미롭게도 감염 후 96 h에 대식세포 상청액에서 검출된 HSV1716의 농도(PFU/ml)는 정상산소 상태에 비해 저산소증에서 MOI5 및 50 둘 다에서 더 컸다. 마지막으로, 대식세포 세포 사멸은 HSV1716로의 감염 후 정상산소증 및 저산소증 둘 다에서 동일하게 전염성이 있었다(p<0.2) (c, d). 데이터는 n=4 독립적인 실험의 평균 ± SEM이다.
도 25. HSV176은 인간 대식세포를 감염시키고, 복제하고, 사멸한다. GFP 태그된 HSV1716으로 감염된 7일째 인간 단핵구-유도 대식세포는 감염의 유의적인 증가를 입증하며, 이것은 세포 사멸의 증가와 상관성이 있다. 차트는 (A) 인간 단핵구-유도 대식세포의 감염, (B) 대식세포 사멸을 보여준다. 모든 데이터는 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였으며 6회의 독립적인 실험을 수행하였다(n=6). X축 0=대식세포(바이러스 없음).
도 26. 인간 대식세포 내에서의 HSV1716 복제. 바이러스 단백질의 발현의 조사 결과, 바이러스 복제를 위해 필요한 전초기(ICPO) 및 후기(gB) 유전자 둘 다가 대식세포에서의 유의적인 유전자 발현을 입증하는 것으로 나타났다. 차트는 (A) ICPO 발현, (B) ICP8 발현, (C) gB 발현을 보여준다. 모든 데이터는 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였으며 6회의 독립적인 실험을 수행하였다(n=6). X축 0=대식세포(바이러스 없음).
도 27. 인간 대식세포에서 세포 사멸의 메카니즘. HSV1716은 아폽토시스를 통해 Fas 의존적 방식으로 대식세포를 사멸시키며, FasL 및 Bcl-2 유전자 발현 둘 다는 5의 MOI에서 HSV1716로 감염시킨지 24시간 후 상형조절되었다. 자가소화작용에 관여하는 유전자의 발현(Atg5 및 LC3B)은 유의적으로 변하지 않았다. 차트는 (A) FasL, (B) Bcl-2, (C) LC3B, (D) Atg5의 발현을 보여준다. 모든 데이터는 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였으며 6회의 독립적인 실험을 수행하였다(n=6). X축 0=대식세포(바이러스 없음).
도 28. HSV1716 감염은 대식세포에서 염증성 표현형을 유도한다. 7일 단핵구-유도 대식세포의 HSV1716 감염은 감염시킨지 24시간 후 염증의 전형적인 마커의 mRNA 발현을 유의적으로 유도한다. 차트는 (A) IL-6, (B) IL-8, (C) IL-10, (D) TNFalpha, (E) TGFbeta, (F) NFkappaB에 대한 mRNA의 발현을 보여준다. 모든 데이터는 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였으며 6회의 독립적인 실험을 수행하였다(n=6). X축 0=대식세포(바이러스 없음).
도 29. HSV1716 감염은 대식세포에서 염증성 표현형을 유도한다. 7일 단핵구-유도 대식세포의 HSV1716 감염은 전형적인 염증성 M1 대식세포 마커(NOS2, CXCL10)의 mRNA 발현을 유의적으로 유도하고 종양-유도된 대식세포(MRC1)에 의해 발현된 전형적인 M2 마커를 하향 조절한다. 차트는 (A) Arg1, (B) Nos2, (C) MRC1, (D) VEGF, (E) CXCL10의 mRNA 발현을 보여준다. 모든 데이터는 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였으며 6회의 독립적인 실험을 수행하였다(n=6).
도 30. HSV1716 감염이 대식세포에서 PCNA 발현을 유도함을 보여주는 차트. 7일 단핵구-유도 대식세포의 HSV1716 감염은 PCNA 발현을 유의적으로 유도한다. 이것은 말기에 분화된 비-종양 세포에서 바이러스 복제 및 대식세포 세포 사멸을 유도하는 잠재적인 메카니즘이다. 모든 데이터는 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였으며 4회의 독립적인 실험을 수행하였다(n=4).
본 발명의 하나 이상의 양태의 상세는 실시예에 의해 본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에 의해 고려되는 최적 방식의 구체적인 설명을 포함하여 아래 첨부된 설명에 제시된다. 본 발명은 이러한 구체적인 설명에 제한되지 않으면서 실시될 수 있음은 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.
실시예
아래에 제시된 실시예는 종양분해성 HSV1716(Seprehvir)으로 감염된 종양-조건부(tumour-conditioned) 대식세포가 iNOS, IL-6, IL-8 및 TNF-α와 같은 전염증성 인자의 발현을 특징으로 하는 전형적인 활성화 (M1) 프로파일을 나타냄을 보여준다. 게다가, M1 대식세포는 초상자성 산화철 나노입자(SPIO)를 사용하여 자기적으로 표지한 다음 모든 자기 공명 이미징 시스템(MRI)에 고유한 펄스 자기장 기울기를 사용하여 혈류에서 원발성 및 속발성 종양을 포함한 심부 표적 조직으로 비침습적으로 스티어링될 수 있다. 본 출원인은 세포-기반 종양분해성 바이로테라피를 전달하기 위해 이러한 자기 공명 표적화(MRT) 접근법을 사용하였다. 이완계측(relaxometry) 측정은 표준 MR 이미징이 이후에 이러한 치료법의 효능을 모니터링하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 1
HSV1716 및 인간 일차 대식세포
1) 초기 연구에서 인간 대식세포를 대략 4 pfu/세포로 하여 HSV1716으로 감염시킨 다음 세포를 정상 및 저산소 상태항서 배양하였다. 샘플을 감염후 다양한 시점에서 제거하고(+1.5hr, +24hrs, +48hrs 및 +72hrs) 적정하였다(도 1).
1시간 내에 바이러스의 90%가 대식세포에 의해 흡착되었으며 그후 24 또는 48 hrs에는 정상산소 상태 또는 저산소 상태에서 어떠한 바이러스도 검출할 수 없었다(적정의 검출 한계는 100pfu/ml이다).
유의적으로, 바이러스는 72 hrs에 검출할 수 있었지만 이 때의 양은 정상산소성 vs 저산소성 대식세포에서 유사하였다. 이러한 신생 바이러스는 어느 정도 일시적인 잠복 상태로 들어온 원래의 투입물일 수 있거나 대식세포의 첫번째 복제를 나타내기 때문에 상당히 흥미롭다.
2) 대식세포를 감소하는 HSV1716 moi(40, 4, 0.4 및 0.04)로 감염시키고 샘플을 단지 72 hrs 후 적정하였다. moi 40, 4 및 0.4에서 감염된 대식세포로부터는 바이러스가 검출되었지만 0.04 moi에서 감염된 것들에서는 검출되지 않았다(도 2). 흥미롭게도, 투입 pfu에 비해 72 hrs 후 검출된 바이러스의 비는 대략 동일하였으며 도 1에 나타낸 두 개의 다른 72hr 정상산소증/저산소증 시점으로부터의 것들과 유사하였다.
요약하면, 인간 일차 대식세포는 HSV1716를 흡착시키는 높은 성능을 가진 것으로 밝혀졌으며, 활성 바이러스는 배양시 48 hrs 후 대식세포로부터 회수될 수 있다.
실시예 2
세 개의 상이한 암 세포주가 사용되었으며(LNCaP, PC3, T47D) 대식세포는 인간 단핵 세포로부터 유도되었고; 다세포 원주체는 아가로스-코팅된 배양 플레이트 상에서 제조되었으며; HSV1716GFP가 형광 현미경법 및 유동 세포계측에 의해 암 세포 및 종양 원주체에 의한 섭취를 정량하는데 사용되었고; 마지막으로, RT-PCR이 HSV1716 감염 후 대식세포 유전자 발현의 변화를 분석하기 위해 수행되었다.
결과는 HSV1716이 전립선 및 유방 암 세포주에서 세포 사멸을 유도하고 HSV1716에 의해 감염된 대식세포는 96시간 내에 효과적으로 사멸되며; 또한, HSV1716-감염된 대식세포로의 원주체의 침윤은 종양 원주체 세포 사멸을 야기함을 보여주었다.
재료 및 방법
세포주
인간 전립선 암종 세포주 LNCaP 및 PC3 및 인간 유방 암종 세포주 T47D는 Dr Helen Bryant(Department of Oncology, The Medical School, Sheffield, UK)에 의해 제공되었다. 세포를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI에서 배양하였다.
인간 MDM의 제조
대식세포는 혈소판-고갈 연막으로부터 단리한 인간 단핵 세포로부터 유도하였다(Blood Transfusion Service, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, UK). 단핵 세포를 Ficoll 구배 원심분리를 사용하여 혈액으로부터 분리하였다(BURKE 2003). 분리 후, 단핵 세포를 T75 조직 배양 플라스크(-70 x 106개 세포/플라스크)에 시딩하고 2% AB 혈청으로 보충된 IMDM에서 3일간 배양하였다.
단순포진 바이러스 1716
HSV1716은 Virttu Biologies(Glasgow, UK)에 의해 제공되었다. 종양 세포의 감염은 0.5 및 5의 감염 다중도(MOI), 즉, 감염 동안 세포당 첨가된 바이러스 입자의 수를 사용하여 수행하였다. 대식세포 감염을 위해, 5 및 50의 MOI를 사용하였다. GFP로 표지화하여 HSV1716을 검출하였다(유동 세포계측 및 형광 현미경법으로 측정됨).
일차 MDM의 감염
MDM을 2% AB 혈청으로 보충된 IMDM 중에서 3일간 배양하고; 3일 후, 세포를 PBS로 세척하고 배지를 10% FBS로 보충된 RPMI로 교체하였다. 세포를 MOI 50에서 감염시키고 밤새 배양하였다(정상산소 상태: 20% pO2; 저산소 상태: 0.1% pO2). 24시간 후, 조건부 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포를 추가로 72시간 동안 배양하였다. 감염으로부터 96시간(4일) 후, 세포 생존능을 유동 세포계측에 의해 측정하였다.
종양 원주체로의 일차 MDM의 침윤
종양 원주체는 2 x 104개 세포/웰을 100㎕ RPMI(+10% FBS) 중에서 2% 아가로스-코팅된 96-웰 플레이트에 시딩함으로써 LNCaP 세포를 사용하여 제조하였다. 72시간(3일) 후, 5 x 103개의 감염된 대식세포를 각 웰에 가하였다. 세포 사멸의 분석은 추가로 5일 후 수행하였으며; 매일 원주체를 형광 현미경하에서 관찰하여 저산소성 중심부에서의 HSV1716GFP의 존재를 검출하였다.
유동 세포계측
세포 생존능/사멸 및 GFP 발현은 유동 세포계측에 의해 측정하였다. 세포를 수확하고, PBS에 재현탁시키고 PI(1㎕/샘플)로 표지하여 세포 사멸을 정량하였다. Attune Acoustic Focusing 세포계측기(Life Technologies)를 사용하여 각 샘플에서 PI 양성 세포 및 GFP 양성 세포의 퍼센트를 분석하였다. PI(여기 파장: 488nm; 최대 방출: 617nm)는 BL3 검출기에 의해 검출하였으며; BL1이 GFP 검출을 위해 사용되었다(488nm에서 여기 및 509nm에서 최대 방출).
RT-PCR
역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하여, 감염된 대식세포에서의 RNA 수준을 검출하고 HSV1716이 유전자 발현의 변화를 초래하는지를 알아보았다. 세포(1.5 x 106)를 6-웰 플레이트에 평판배양하고 MOI 50에서 HSV1716으로 감염시켰다. 48시간 동안 배양한 후(정상산소 상태: 20% p02; 저산소 상태: 0.1% p02), 세포를 수확하고 RNA 추출을 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 수행하였다. cDNA는 Primer design Precision nanoScript RT 키트 및 T100 Thermal 사이클러(Bio-Rad)를 사용하여 RNA로부터 합성하였다. cDNA를 관심 유전자의 프라이머와 함께 384-웰 PCR 플레이트에 평판배양하였다. PCR은 ABI7900 실시간 PCR을 사용하여 수행하였다.
IL-6
정방향: 5'-CGAAAGTCAACTCCATCTGCC-3'
역방향: 5'-GGCAACTGGCTGGAAGTCTCT-3'
IL-8
정방향: 5'-GGGCCATCAGTTGCAAATC-3'
역방향: 5'-TTCCTTCCGGTGGTTTCTTC-3'
TNFa
정방향: 5'-CCAGGAGAAAGTCAGCCTCCT-3'
역방향: 5'-TCATACCAGGGCTTGAGCTCA-3')
IL-1
정방향: 5 -CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3'
역방향: 5'-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3')
NFκB
정방향: 5'-ACCTGAGTCTTCTGGACCGCTG-3'
역방향: 5'-CCAGCCTTCTCCCAAGAGTCGT-3'
TGFβ
정방향: 5'-TAGGAACAGGCGGCGACGAATACA-3'
역방향: 5'- CACAATCACAAGGCAACTTCAAT-3'
IL-10
정방향: 5 -GCCTAACATGCTTCGAGATC-3'
역방향: 5 ' -CTC ATG G CTTTGT AG ATG CC-3 '
VEGF-A
정방향: 5'-GAAGTTCATGGACGTCTACCAG
역방향: 5 -CATCTGCTATGCTGCAGGAAGCT-3'
CXCL-6
정방향: 5'-GAATTTCCCCAGCATCCCAAAG-3'
역방향: 5'-TGCCTTCTGCACTCCCTTTATC-3'
CXCL-1
정방향: 5'-AGAATGTTTTCAAATGTTCTCCAGTC-3'
역방향: 5'-GGCCATTTGCTTGGATCCG-3'
통계적 분석
데이터는 평균 ± SEM으로 보고된다. 통계적 분석 및 그래픽은 GraphPad Prism을 사용하여 수행하였다. 다중 분석을 위한 이원 ANOVA 검증 및 다중 t 검증을 수행하여 수득된 실험 데이터를 비교하였다. 통계적 유의도는 p = 0.05의 값으로 제한되었다.
결과
HSV1716은 종양 세포 사멸을 유도한다
LNCaP 세포주
전립선 암 세포에 대한 HSV1716의 종양분해 가능성을 분석하기 위해, LNCaP 세포를 12-웰 플레이트(2 x 104개 세포/웰)에 시딩하고 MOI 0(대조군), 0.5 및 5에서 HSV1716로 감염시켰다. 살아있는 세포에 의한 바이러스 섭취를 가시화하기 위해 HSV1716-GFP를 사용하여 감염을 반복하였다. 플레이트를 정상산소성 및 저산소성 항온처리기에서 유지시켜, HSV1716이 산소화된 및 비-산소화된 조건 둘 다에서 세포를 사멸시키는 능력을 조사하였다. 24시간 후, 조건부 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 72시간 후, 플레이트를 수확하고 세포를 유동 세포계측에 의해 분석하였다. 세포 사멸은 Pl(+) 세포로서 측정되었고; 살아있는 세포에서의 바이러스 섭취는 GFP(+)/PI(-) 세포로서 측정되었다(도 3). 감염으로부터 72시간 후, 정상산소 상태에서 MOI 0.5에서는 세포의 56 ± 6.35%(p<0.0001) 그리고 MOI 5에서는 세포의 53 ± 8.7%(p<0.0001)에서 바이러스 섭취가 관찰된 반면, 저산소 상태에서는 수준이 상당히 더 낮았다(MOI 5에서 6 ± 4.73%, p<0.05). MOI 5에서, 통계적으로 유의적인 수준의 세포 사멸이 정상산소 상태(31 ± 7.32%, p<0.01) 및 저산소 상태(38 ± 1.36%, p<0.05) 둘 다에서 관찰되었다(도 4). 흥미롭게도, 바이러스 섭취가 저산소 상태하에서 높은 것 같지는 않지만, 결과에서는 MOI 5에서 유의적인 수준의 세포 사멸이 밝혀졌다(도 4).
PC3 세포주
PC3은 높은 전이 능력을 갖고 LNCaP보다 상당히 더 공격적인 전립선 암 세포주이다. 2 x 104개 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고 MOI 0, 0.5 및 5에서 HSV1716으로 감염시켰다. 세포를 정상산소 및 저산소 상태에서 72시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 조건부 배지를 신선한 배지로 교체하여 세포에 의해 섭취되지 않은 바이러스 입자를 제거하였다. 72시간 후, 세포를 유동 세포계측에 의해 분석하고 PI(-)/GFP(+) 세포의 양을 플롯팅하였다(도 5). 바이러스 섭취의 퍼센트는 정상산소 상태에서 바이러스 입자에 의해 감염된 살아있는 세포의 유의적인 존재를 나타낸다(MOI 0.5에서 20 ± 4.46%, MOI 5에서 17 ± 4.37%, p<0.05); 세포 사멸은 정상산소 상태(MOI 0.5에서 23 ± 2.49%, p<0.0001, 및 MOI 5에서 7 ± 3.14%, p<0.01) 및 저산소 상태(MOI 0.5에서 20 ± 1.34% 및 MOI 5에서 19 ± 2.68%, p<0.05) 둘 다에서 통계적으로 유의하였다. 살아있는 세포의 바이러스 섭취의 퍼센트 및 세포 사멸이 그래프로 기록되었다(도 6).
T47D 세포주
상이한 유형의 고형 종양에 대한 HSV1716의 종양분해 능력을 조사하기 위해, 유방 암종 세포주, T47D의 감염의 효과를 평가하였다. 1 x 105개 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고 MOI 0, 0.5 및 5에서 HSV1716 및 HSV1716-GFP로 감염시켰다. 세포를 정상산소 및 저산소 상태에서 72시간 동안 배양하고 유동 세포계측으로 분석하였다. 세포 사멸의 신호는 어떠한 조건에서도 관찰되지 않은 반면, 바이러스 섭취는 심지어 MOI 0.5에서도 현저하게 높았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, T47D 세포주가 HSV1716에 반응하지 않는지, 또는 전립선 암종 세포주보다 단지 덜 민감한지를 확인하기 위해 120시간 후 분석을 반복하였다. 120시간 후, 세포를 유동 세포계측에 의해 관찰하였으며 PI(-)/GFP(+) 세포의 양을 플롯팅하였다(도 7). 살아있는 세포에 의한 바이러스 섭취는 MOI 0.5 및 5에서 유의적이었으며, 저산소증(MOI 0.5에서 27 ± 5.52%, MOI 5에서 17 ± 2.18%, p<0.001)보다는 정상산소증(MOI 0.5에서 38 ± 0.35%, MOI 5에서 49 ± 0.49%, p<0.0001)에서 상당히 더 높은 수준이었으며, 세포 사멸은 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 5에서 유의적인 것으로 밝혀졌다(각각 29 ± 1.37% 및 22 ± 5.82%, p<0.0001)(도 8b).
인간 대식세포에 대한 HSV1716 감염의 효과
HSV1716은 인간 대식세포를 효과적으로 사멸시킨다
대식세포가 HSV1716 치료법에 대한 전달 시스템으로서 사용될 수 있을지를 결정하기 위해서는, 대식세포 세포에 대한 바이러스 감염의 결과를 검사하는 것이 기본이었다. 분리한지 3일 후, MDM을 수확하고 계수하였다; 1 x 106개 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 일단 세포가 플라스틱에 부착되면, 감염을 실시하였다. HSV1716를 MOI 0(대조군), 5 및 50으로 하여 가하였다. 세포를 정상산소 및 저산소 상태에서 96시간 동안 배양하였다. 배지를 24시간 후 신선한 배지로 교체하고, 추가의 연구를 위해 4일째에 상청액을 각 웰로부터 수집하였다. 96시간 후, 플레이트를 수확하고 세포 생존능을 유동 세포계측에 의해 분석하였다. 결과는 MOI 5 및 50 둘 다에서의 세포의 효과적인 사멸과 정상산소 상태(MOI 5에서 63 ± 2.76%, MOI 50에서 62 ± 2.42%, pO.0001) 및 저산소 상태(MOI 5에서 43 ± 4.91%, p<0.001, 및 MOI 50에서 57 ± 7.34%, p<0.0001) 둘 다 하에서 세포 사멸의 높은 퍼센트를 보여주었다(도 9, 10).
감염된 대식세포는 바이러스 입자를 방출한다
세포의 절반 이상이 HSV1716에 의해 사멸하기 때문에, 감염후 상당한 바이러스 복제 및 세포의 용해가 미세환경에서 바이러스 입자의 방출을 야기해야 한다. 따라서, HSV1716이 대식세포를 사멸하고 복제하는 능력을 확인하기 위해, 감염으로부터 96시간 후 각 웰로부터 상청액을 수집하여 분석하였다. 샘플은 정상산소 및 저산소 상태 둘 다에서 MOI 0, 5 및 50으로 하여 감염된 세포로부터 획득된 배지로 이루어지며 상청액 중의 바이러스 입자의 존재를 적정에 의해 알아보았다. HSV1716은 MOI 5 및 50에서 감염된 MDM의 상청액에서 검출되었고, MOI가 높을수록 농도가 더 높은 반면, 대조군에서는 바이러스가 관찰되지 않았다(표 1(도 11)). 흥미롭게도, 저산소 상태하에서 감염된 세포로부터 수집된 샘플은 이들의 정상산소 대응물에 비해 2.5배 더 큰 농도(MOI 5에서) 및 4배 더 큰 농도(MOI 50에서)의 HSV1716을 나타내었다(도 12).
이러한 결과를 재확인하기 위해, 감염된 MDM으로부터 수집된 조건부 배지로 종양 세포의 감염을 수행하였다. LNCaP 세포를 12-웰 플레이트(1 x 104개 세포/웰)에 시딩하고 1ml RPMI 중의 100㎕의 MDM 상청액으로 감염시켰다. 감염으로부터 120시간 후, 세포를 수확하고 유동 세포계측으로 분석하였다. 그러나, 적정 연구(저산소 상태하에서 더 높은 세포 사멸)로부터 예상되는 바와는 대조적으로, PI 염색 후, 세포 사멸은 정상산소 상태하에서 MDM으로부터 수집된 조건부 배지로 감염된 세포에서 MOI 50에서 단지 유의적인 것으로 밝혀졌다(40 ± 7.26%, p<0.01) (도 8).
HSV1716 감염은 대식세포 유전자 발현을 변형시킨다
HSV1716으로의 감염이 어떻게 MDM 유전자 발현을 변화시키는지를 조사하기 위해, 관심대상인 사이토킨 및 성장 인자의 mRNA 수준을 정량적 RT-PCR을 사용하여 정량하였다. 1.5 x 106개 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 MOI 50에서 감염시켰다; 상이한 환경으로 인한 유전자 발현에 있어서의 가능한 변화를 이해하기 위해 플레이트를 정상산소 및 저산소 상태하에서 배양하였다. 감염시킨지 48시간 후, 세포를 수확하고 mRNA를 감염된 세포 및 대조군으로부터 추출하였다. 그후, cDNA를 RNA로부터 합성하고, 관심 유전자의 프라이머와 함께 384-웰 플레이트에 평판배양하였다: 전염증성 사이토킨 IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1, CXCL1; 전사 인자 NFκB, 항염증성 사이토킨 IL-10 및 CXCL-6, 성장 인자 VEGF-A 및 TGF-β. β-액틴이 구조적으로 발현된 하우스키핑 유전자로서 선택되었다. RT-PCR을 실시한 후, 각 유전자의 mRNA 수준을 β-액틴 농도에 대해 정규화하고 발현에 있어서의 배수 변화를 게산하였다. HSV1716 감염에 의해 야기된 유전자 유도 프로파일이 이중으로 수득되었다. 각 유전자에 대해 계산된 발현에 있어서의 배수 변화를 기록하였다; 결과는, MOI 50에서, HSV1716이 전염증성 사이토킨의 유도인자임을 시사한다(저산소 상태에서 IL-8, IL-1 및 전염증성 전사 인자 NFκB의 더 높은 유도 프로파일). 동시에, NFκB 및 전염증성 TGF-β 및 IL-10의 발현은 정상산소증에서 감소된 반면(저산소 상태하에서 후자의 분명한 유도에도 불구하고), 케모카인 CXCL-1 및 CXCL-6에 대해서는 유전자 발현의 검출 가능한 변화가 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 감염 후 VEGF-A의 현저하게 높은 유도가 저산소 상태하에서 관찰되었다(표 2(도 14)).
MDM로의 원주체의 침윤이 종양 수축을 야기한다
종양으로, 및 특히, 저산소성 중심부로의 HSV1716의 전달이 대식세포의 사용에 의해 매개될 수 있는지를 조사하기 위해, 종양 원주체를 만들어 냈다. 원주체의 사용은, 2D 배양물에 비해, 잘-산소화된 영역으로 둘러싸인 산소-고갈 중심 영역에 의해 구성된다는 이점을 갖는다; 따라서, 원주체가 3D 종양을 모방한다. 종양 원주체는 LNCaP 세포를 사용하여 1일째에 생성하였다(1.5 x 104개 세포를 2% 아가로스-코팅된 96-웰 플레이트에 시딩하였다). 세포를 평판배양한지 3일 후(4일째), 800㎛/1mm 직경의 원주체가 발달하였다. MDM을 3일째에 MOI 50에서 HSV1716으로 감염시키고 24시간 동안 배양하였으며, 비감염된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 4일째에, 세포를 수확하고 계수하였다; 원주체를 MOI 0(대조군 MDM) 및 MOI 50(감염된 MDM) 둘 다에서 5 x 103개　MDM으로 침윤시켰다. 또한, 대조군 원주체(비침윤됨)를 계산에 넣었다. 플레이트를 추가로 20시간 동안(9일째까지) 배양하였다. 6일째에, MDM 감염으로부터 72시간 후, 형광 현미경을 사용하여 사진을 촬영하여, 원주체 내부에 (GFP로 표지된) HSV1716의 존재를 가시화하였다. 영상은 HSV1716-감염된 MDM의 존재를 보여주었다; 그러나, MDM은 저산소성 중심부를 둘러싼 생존 가능한 가장자리에 국한된 것으로 보이는 반면, GFP(+) 세포는 원주체의 내부 영역에서 관찰되지 않았다. 원주체의 중심 영역(대조군)은 약간 괴사성이며 예상되는 것보다 현저하게 더 어두운 것으로 밝혀졌다. 9일째에, 원주체를 현미경하에서 더욱 관찰하고 사진을 촬영하였다; 원주체의 형상 및 크기에 있어서의 유의적인 변화는 검출되지 않았다. 침윤으로부터 5일 후(9일째) 원주체를 수확하고 세척하며, 세포 생존능을 유동 세포계측으로 분석하였다; 대조군에서 및 비감염된 MDM로 침윤된 원주체에서 유의적인 세포 사멸은 관찰되지 않았지만, MOI 50에서 감염된 MDM으로의 침윤이 세포의 51 ± 5.92%의 종양분해를 야기하였다(p-값 < 0.01)(도 15).
논의
조사결과에서는 전립선 암 세포주 LNCaP 및 PC3 및 유방 암 세포주 T47D가 HSV1716에 민감한 것으로 밝혀졌으며, 이것은 이 바이러스가 광범위한 종양을 치료하기 위한 치료법으로서 사용될수 있음을 나타낸다. 상이한 정도이기는 하지만, 전립선 및 유방 암 세포주 둘 다는 72시간(LNCaP, PC3) 및 120시간(T47D) 후 MOI 5에서 HSV1716 감염에 반응을 보였으며; 또한, 살아있는 세포에서 높은 수준의 바이러스 섭취의 검출은 추가의 세포독성 효과가 시간 경과에 따라 유도될 수 있음을 시사한다. 세포 사멸의 퍼센트는 시험된 모든 세포주에 대해 정상산소 및 저산소 상태에서 유사하였다(두 개의 그룹 간에 통계적 유의성은 관찰되지 않았다): 이 결과는 저산소증이 시험관내에서 종양 세포에 HSV1716에 대한 내성을 부여하지 않음을 나타낸다; 따라서, HSV1716은 암의 치료하기 어려운 저산소 영역을 사멸시키는데 잠재적으로 사용될 수 있다. 흥미롭게도, 산소-고갈 상태하에서 유의적인 세포 사멸이 관찰된다는 사실에도 불구하고, 저산소증에서의 바이러스 섭취는 전립선 및 유방 암 세포주 둘 다에 대해 정상산소증에서의 섭취보다 일반적으로 더 낮다 - PC3에 대해서는 유의적이지 않다. 그러나, 높은 보고된 높은 수준의 세포 사멸은 저산소 상태에서 HSV1716에 대한 더 큰 민감성을 시사한다.
인간 대식세포에 대해 수행된 연구들은 이들이 HSV1716에 민감함을 보여주었다. HSV1716이 감염으로부터 96시간 후 대식세포를 사멸시키는 능력은, 이것이 MDM에 의해 종양의 저산소 영역 내부로 운반되고, 복제하고, MDM를 용해시키고, 이어서 근처 암 세포를 감염시켜 사멸시키는, 바이러스에 대한 전달 시스템으로서 MDM을 활용할 수 있는 가능성을 암시하기 때문에, 본질적인 중요성을 갖는다. MDM에서의 HSV1716 복제가 미세환경에서 바이러스 입자의 방출을 야기한다는 것을 추가로 입증하기 위해, 상청액을 감염된 대식세포로부터 수집하였으며, 그 목적은 이를 분석하여 이의 목적은 HSV1716의 존재를 검출하기 위한 것이다. 그 결과, 예상대로 MOI가 증가할수록 바이러스 농도가 증가하는 것으로 드러났다: 흥미롭게도, 저산소 상태하에서 바이러스 입자의 복제 및 방출이 정상산소 상태에서보다 3배 더 컸다. 그러나, LNCaP가 동일 상청액으로 감염된 경우, 120시간 후 정상산소증에서는 MOI 50에서 세포 사멸이 단지 유의적인 반면에, 저산소 상태하에서 또는 더 낮은 MOI에서는 유의적인 값이 관찰되지 않았다. 이 결과는 상청액의 적정 후 관찰된 바이러스 입자의 양이, 저산소증에서 더 높기는 하지만, 일반적으로 3 x 103PFU/ml보다 크지 않다는 사실에 의해 설명될 수 있다: 이러한 양은, 3 x 103　PFU/ml(또는 MOI 5의 경우, 그 미만)로 HSV1716을 함유하는 상청액 100㎕가 2 x 104개 세포를 감염시키는데 사용되었다는 것을 고려할 때, 바이러스가 세포를 사멸시키는 데에는 충분하지 않을 수 있다; 이것은 LNCaP가 MOI < 0.05 - 극히 낮은 MOI에서 감염되었음을 의미한다(HSV1716로 감염을 수행하는 경우, 유의적인 세포 사멸은 단지 MOI 5에서 관찰되었음을 유념한다). 그러나, MDM-조건부 배지에서 검출된 HSV1716의 이러한 낮은 값은 바이러스의 방출을 의미하며, 이러한 조사결과의 중요성은, 추정 치료 접근법에서, 일단 MDM을 통해 전달되고 환경에서 방출되면, 바이러스 입자가 종양 세포와 마주치고, 이를 감염시키고, 복제하여, 바이러스 카피의 수를 더욱 증폭시키고, 후속적으로 종양 내로 널리 퍼뜨린다는 것을 고려할 때 명확하다.
MDM이 HSV1716을 종양으로, 및 특히 저산소 영역으로 전달하는 능력을 시험하기 위해, 실제 종양의 구조를 모방할 목적으로 다세포 3D 원주체를 제조하였다. 주 목적은 세포 사멸이 3D 원주체에서 유도되기 위해 충분히 MDM가 실제로 바이러스를 전달하는지를 알아내기 위한 것이었다. 원주체의 비교적 큰 직경(800㎛ - 1mm)은 현미경하에서 형태 및 크기에 있어서의 가능한 변화를 관찰할 수 있게 하였다. 또한, GFP-표지된 HSV1716의 존재는 원주체 내부에서 감염된 MDM의 존재를 검출하고, 이에 따라 MDM이 실제로 저산소성 중심부에 도달하는지를 관찰할 기회를 제공하였다.
유의적인 세포 사멸이 대조군(p-값 = 0.009) 및 비감염된 MDM로 침윤된 원주체와 비교하여 감염된 MDM(MOI 50)로 침윤된 원주체에서 관찰되었다(p-값 = 0.004).
HSV1716GFP가 감염된 MDM으로 처리된 원주체에서 MDM 감염으로부터 72시간 후(6일째) 관찰되었으며, 약한 gfp 형광이 산소화된 가장자리에 공존하였다. 진한 녹색 균주의 부재는 사용된 소량의 MDM으로 인한 것일 수 있다(단지 5 x 103개 세포가 각 원주체로 침윤되었다). 그러나, 감염된 MDM으로 침윤된 원주체가 유의적인 수준의 세포 사멸(51 ± 5.92%, p-값 < 0.01)을 나타냈기 때문에 HSV1716의 전달은 성공적이었으며, 이는 HSV1716이 MDM 내부에서 복제하여 미세-환경에 확산되어, 궁극적으로 종양 세포를 사멸시킴을 시사한다.
어떻게 HSV1716 감염이 MDM에서 유전자 발현을 변형시키는지를 이해하기 위해, RT-PCR을 수행하였다. 관심 유전자를 이들의 면역 특성, 전염증성 사이토킨 IL-8, IL-6, TNF-α, IL-1, CXCL-1, 항염증성 사이토킨 IL-10, CXCL-6 및 인자 NFκB, VEGF-A, TGF-β에 기초하여 선택하였다. 인간 세포의 바이러스 감염은 일반적으로 전염증성 사이토킨 및 전사 인자의 유도를 야기하는 신호전달 경로의 활성화를 초래한다(Mogensen, T. H., and S. R. Paludan, 2001 Molecular pathways in virus-induced cytokine production. Microbiology and Molecular Biology Reviews 65: 131-+). 따라서, MDM 유전자 발현에 대한 MOI 50에서의 HSV1716 감염의 영향 및 정상산소 및 저산소 상태하에서 수행된 감염들 간의 차이 둘 다를 분석하는 것은 흥미로운 것으로 간주되었다.
MOI 50에서의 HSV1716 감염은 48시간까지 전염증성 사이토킨의 유도를 야기하였으며, 발현의 증가는 특히 저산소 상태하에서 관찰된 반면, 정상산소증에서는 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 사이토킨 IL-8 및 IL-1은 저산소증에서 각각 5배 및 7배 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 저산소 상태하에서 5배 증가된 발현이 또한 NFκB에 대해 관찰되었다; 그러나, 놀랍게도, NFκB는 정상산소증에서 5배까지 하향-조절도니다. 이러한 조사결과는 산소의 부재하에서 더 높은 염증 특성을 가질 수 있는 HSV1716에 대한 MDM의 상이한 반응을 시사한다. 만일 이 경우라면, 이것은 HSV1716이 저산소증에서 더 큰 바이러스 효능을 획득함을 시사한다: 이 결과는 다른 방법으로는 접근하기가 어려운 종양의 중심 영역을 표적으로 하기 위해 MDM에 의한 바이러스 전달을 사용하는 근거를 더욱 뒷받침한다.
항염증성 사이토킨 IL-10 및 성장 인자 TGF-β는 HSV1716 감염 후, 단지 정상산소 상태에서 5배까지 하향-조절된다. 실제, 저산소증 하에서, 항염증성 IL-10 발현에 있어 4배 증가가 관찰되었으며, 이는 가능하게는 전염증성 효과와는 반대된다. 흥미롭게도, 저산소 상태하에서 VEGF-A가 강력하게 상향-조절되며(21배), 이것은 부분적으로는 VEGF-A가 정상적으로 저산소 반응에 관여한다는 사실에 의한 것일 수 있다.
요약하면, 이 연구는 HSV1716이 전립선 및 유방 암 세포주에서 종양 세포 사멸을 유도하며, MDM에서 복제하여 주변 미세환경으로 퍼질 수 있음을 입증한다. 또한, 결과는 MDM를 통해 전달되는 경우, HSV1716이 다세포 3D 원주체에서 세포 사멸을 야기함을 보여준다; 따라서, 종양으로의 종양분해성 HSV1716의 대식세포-매개된 전달이 고형 종양을 치료하기 위한 가능한 치료학적 접근법을 구성한다. 이전에 실시된 임상 시험에 의해 나타난 HSV1716의 대단한 안전성 프로파일은 이를 MDM 전달 가능한 치료법으로서 사용할 수 있는 가능성을 만들어주어 암 환자에게 제공될 수 있는 치료의 범위를 더욱 증가시킬 수 있는 흥미진진한 기회를 준다.
실시예 2에 대한 참조문헌
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실시예 3
인간 대식세포의 단리 및 배양
단핵 세포를 Ficoll-Paque 플러스(Amersham Pharmacia, St. Albans, UK)를 사용하여 혈소판-고갈된 연막(Blood Transfusion Service, Sheffield, UK)으로부터 단리하고 단핵구-유도 대식세포(MDM)는 상기한 바와 같이 제조하였다21 22.
내피 세포 배양
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 24h 동안 5μM 기공 PET 막(Neuroprobe)을 함유하는 콜라겐-코팅된(0.1mg/ml, 인간 타입 IV) 막에 시딩하였다.
인간 다세포 종양 원주체
인간 전립선 암 세포주, LNCaP를 100ul 배지에서 2% 아가로스(Sigma, Dorset, UK) 코팅된 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 시딩하였다(5 x 103). 7-10일 후, 각 웰은 700-800um의 평균 직경을 갖는 종양 원주체를 함유하였다21.
일차 대식세포의 감염
3일째 MDM을 복제 결핍 아데노바이러스(CMV-AdV5-GFP (CMV 프로모터에 의해 구동됨)으로 감염시켰다. 바이러스 최적화 및 GFP 발현 수준은 21에 기재되어 있다.
대식세포에 의한 자성 나노입자의 세포 섭취
MDM(AdCMV-GFP로 감염된)을 100ug/ml SPIO(25nm)(Sigma-Aldrich, Poole, UK)과 밤새 배양하였다. 세포에서의 SPIO 축적은 유동 세포계측에 의해 미리 평가하였으며 문헌[Muthana, M. et al. A novel magnetic approach to enhance the efficacy of cell-based gene therapies. Gene Ther (2008)]에 기재된 바와 같은 광학 현미경에 의해 관찰된 바와 같이 배양 접시의 측면에 배치된 자석 쪽으로 세포가 끌어당겨짐에 의해 확인되었다. 대식세포에 의한 SPIO 흡수 후의 세포 생존능을 또한 측정하고 DNA 염료 프로피듐 요오다이드(PI)를 사용하여 SPIO와 배양하지 않은 세포와 비교하였다. 두 그룹 간에 통계적 유의차는 관찰되지 않았다 p=0.4 (도 20c) N=3.
시험관내 경내피 유동 검정
경내피 이동(TEM) 챔버를 (도 20a)에 나타낸 바와 같이 조립하였다. SPIO-부하된 MDM(PBS + 2% FCS 중의 1.5x105개 세포/ml)을 후모세관 정맥을 통한 혈류와 상응하는 1.4 Dynes/cm2의 전단 응력에서 전형적인 정맥 유속(1.1885ml/min)으로 HUVEC 단일층 위를 유동하도록 하였다. TEM 챔버를 7 Tesla 자석(Bruker BioSpecAVANCEII, 310mm bore, MRI system B/C 70/30)의 ~5mm 말단에서 등중심에 바로 배치하였다. 챔버에서의 유동은 -z 방향(자석 구경의 안팎에서)이었다. 본 출원인은 Reigler 등13에 의해 기재된 바와 같이 펄스 기울기 2 ms 온, 7 ms 오프를 사용하였다. SPIO를 종양 원주체를 함유하는 챔버로 스티어링하기 위해 본 출원인은 펄스 -y 기울기를 30분 동안 과열을 피하기 위해 50% 강도(~300mT/m)로 적용하였다. MRT 후 1H 용적 공명기(Bruker, 300MHz, 1 kW max, 외경 118mm/내경 72mm)로 MR 영상을 캡처하였다(FLASH and RARE).
그후, MDM에 의한 원주체 침윤을 GFP 양성 세포를 검출하기 위한 형광 현미경 및 효소-분산된 원주체를 사용한 유동 세포계측을 사용하여 평가하였다. SPIO-부하된 대식세포 내의 철 함량을 구하기 위해, 세포 펠릿을 분석 전 7-14일 동안 70% 질산 중에 가용화시켰다. 철 농도를 Varian Vista-M PX14를 사용하여 원자 방출 분광법에 의해 검량 표준 철 용액(Fischer Scientific, Loughborough, UK)에 대해 정량하였다.
동소 전립선 이종이식 모델
수컷 CD1 무흉선 마우스를 당해 연구에 사용하였다(Charles Rivers, UK). 1백만개의 LNCaP:LUC 세포(스웨덴 웁살라의 Magnus Essand 교수로부터의 친절한 선물)를 매트리겔 중에서 1:1 혼합하고 배측면 전립선에 주사하였다. 종양 크기는 생물발광 MS 이미징을 사용하여 평가하고 문헌[Muthana, M. et al. Macrophage Delivery of an Oncolytic Virus Abolishes Tumor Regrowth and Metastasis After Chemotherapy or Irradiation. Cancer Res, doi:0008-5472.CAN-12-3056 [pii]10.1 158/0008-5472.CAN-12-3056 (2013)]에 기재된 바와 같이 마우스의 매일의 중량을 측정함으로써 결정하였다. 종양을 지닌 마우스는 대략 이식한지 14일 후 또는 전이 모델에서 전립선으로의 종양 세포의 이식 후 폐 종양이 발달한 경우 21일에 실험에 사용하였다21.
세포 이동을 지시하기 위한 MRI 스캐너의 사용
SPIO를 갖거나 갖지 않는 삼백만 개의 MDM을 100㎕ 용적의 PBS(n=5) 중에서 꼬리 정맥을 통해 투여하였으며, 대조군은 100ul PBS(n=5), 또는 SPIO가 없는 3 x 106개 대식세포를 함유하는 100ul PBS(n=5)를 제공받았다. MDM 투여 직후 마우스를 가스상 이소플루란으로 마취시킨 다음 자석-호환성 홀딩 캡슐 내에 고정하고 즉시 MR 표적화를 수행하였다.
마우스를 n=5의 2개 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 MR 표적화 없는 시간-매칭된 대조군이고 그룹 2는 전립선에 대한 종양 부위(-z, -y)로의 거친 스티어링을 위해 선택된 기울기로 1시간의 MR 표적화(상기 참조)를 겪었다. 폐(+z 및 -y 기울기)로의 스티어링을 위해, x 기울기의 부재가 각 폐에서 자성 입자의 균일한 분포를 보장한다.
지기로 표지된 세포에 대한 힘은 SPIO가 자기적으로 포화되는지에 따라 좌우된다. 불포화되는 경우, 힘은 SPIO의 자화율, 자기장 및 또한 자기장 기울기에 따라 좌우된다(Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K. & Dobson, J. Applications of magnetic 443" nanoparticles in biomedicine. J Phys D Appl Phys 36, R167-R181,(2003)).
그러나 일단 SPIO가 포화에 도달하면, 힘은 더 이상 입자의 자화율에 따라 좌우되지 의존하지 않지만 포화 자화 및 이러한 단지 자기장 기울기가 세포에 적용되는 힘에 영향을 미칠 것이다(Riegler, J. et al. Targeted magnetic delivery and tracking of cells using a magnetic resonance imaging system. Biomaterials 31, 5366-5371, (2010).). SPIO는 전형적으로 1T 훨씬 아래에서 자성 포화에 도달하며, 예를 들면, 문헌(Riegler et al. 2013)에서 SPIO는 대략 300mT에서 포화되며, 따라서 MRT는 동일한 자기장 기울기 ~300mT/m가 사용되는 한 임상 MRI 시스템에서 실행 가능하다.
MRI-스티어링 후, 종양(전립선만)의 고해상도 RARE 및 FLASH 이미지를 촬영하였다. 완료되면 MSE 및 MGE를 사용한 이완계측을 수행하여 횡축 이완 속도를 평가하였다. 처리 후, 동물을 희생시키고 종양, 신장, 간, 폐 및 비장을 포함한 조직을 면역조직화학을 위해 파라핀 왁스에 매봉시키고 고정시키거나 유동 세포계측로 분석하여 대식세포 섭취를 결정하였다.
내피 세포 배양
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 Promocell(Heidelberg, Germany)로부터 입수하여 계대배양 8까지 실험에 사용하였다. 세포(150,000)를 24h 동안 5μM 기공 PET 막(Neuroprobe)을 함유하는 콜라겐-코팅된(0.1mg/ml, 인간 타입 IV) 막에 시딩하였다. 이것은 CD31 염색(데이터는 나타내지 않음)에 의해 알 수 있는 바와 같이 필터 상에 HUVEC의 융합 단일층을 야기하였다.
일차 대식세포의 감염
3일째 MDM을 복제 결핍 아데노바이러스(CMV-AdV5-GFP)으로 감염시켰다. E1A/B-고갈된 아데노바이러스 벡터, CMV-AdV5-GFP(CMV 프로모터에 의해 구동됨)를 293개 인간 배아 신장(HEK) 세포에서 확장된 단일 플라크로부터 단리하였다. 모든 바이러스를 이중 세슘 구배 원심분리에 의해 정제하고, 293개 세포에 대해 플라크 검정에 의해 적정하였으며, 역가는 플라크 형성 단위(PFU)/세포로서 표현되었다. 바이러스 최적화 및 대식세포에서의 GFP 발현 수준은 21에 기재되어 있다.
유동 세포계측 분석
단세포 현탁액은 MDM(공동-형질도입된 MDM을 포함함)을 트립신화함으로써 수득하였다. 그후, 세포를 비특이 항체 결합을 방지하기 위해 1% BSA(Sigma)를 함유하는 PBS 중에서 마우스 항-CD14, 1:100과 4℃에서 30 min 동안 배양하였다. 대안적으로, 원주체를 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 소화시켜 종양 세포와 침윤된 대식세포를 분리하고 세포 사멸은 유동 세포계측기에서 실험하기 직전에 세포에 프로피듐 요오다이드(Sigma)를 첨가함으로써 유동 세포계측에 의해 분석하였다.
대식세포에 의한 자성 나노입자의 세포 섭취
나노입자 세포 섭취 연구를 위해, MDM(AdCMV-GFP로 감염된)을 100ug/ml SPIO(25nm)(Sigma-Aldrich, Poole, UK)과 밤새 배양하였다. SPIO와 배양 후 세포에서의 MNP 축적은 유동 세포계측에 의해 평가하였으며, 이것은 us14에 의해 기재된 바와 같이 프로피듐 요오다이드(PI)로 세포 생존능을 측정함을 포함하였으며 광학 현미경에 의해 관찰된 바와 같이 배양 접시의 측면에 배치된 자석 쪽으로 세포가 끌어당겨짐에 의해 확인되었다(Leica Microsystems UK Ltd).
HSV1716 바이로테라피
치료적 연구를 위해 LNCaP 또는 대식세포를 5 또는 50의 감염 다중도(MOI)에서 HSV1716GFP(결실된 ICP34.5 유전자죄에서 삽입된 GFP 발현 카세트를 갖는 HSV1716 변이체)로 감염시켰다. 세포 사멸은 PI 염색을 사용하여 감염시킨지 96 h 후 유동 세포계측에 의해 평가하였다. Vero 세포 상에서 적정 검정을 사용하여 감염된 대식세포의 청정화된 상청액에서 바이러스 입자를 검출하여 플라크-형성 단위를 구하였다.
마우스에게 3백만 MDM을 단독으로 또는 MOI 50에서 HSV1716과 함께, x107pfu HSV1716 단독 또는 PBS의 꼬리 정맥 주사를 제공하였다(n=5 마우스/그룹). 중요하게도, 3그룹의 마우스에게 MDM+OV를 투여하였으며, 한 그룹은 1 h 동안 MRT를 겪었고, 한 그룹은 1 h 동안 MRI 스캐너에 두었지만 MRT를 받지는 않았으며(MDM+OV no MRT), 다른 그룹은 MRI 스캐너에 들어가지 않았다(MDM+OV). 종양 크기를 MS Lumina II 이미징(MS, Caliper Life Sciences)에 의해 모니터링하였다. 종양이 UK Home Office 규정에 의해 허용되는 최대 용적에 도달하면 동물을 희생시켰으며, 희생시키기 1시간 전에, 마우스에게 FITC:렉틴(종양 혈관구조를 검출하기 위해 사용됨)을 정맥내 주사하였다. 중요하게도, PBS 및 MDM 단독을 제공받은 마우스는 큰 종양 크기로 인해 처리후 14일째에 도태시켰다. 21일째에 모든 다른 종양을 제거하였다. 종양, 신장, 간, 폐, 및 비장을 포함한 절개된 조직을 조직학적 표지화 연구를 위해 OCT 또는 파라핀 왁스에 매봉시켰다.
분석
조직을 두 개로 나누었다; 한 부분은 면역조직학적 분석을 위해 포르말린 고정시켰고 다른 부분은 부착성 섬유 및 지방 조직 없이 해부하여 콜라게나제로 처리하였다.
유동 세포계측: 세포 생존능은 LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain 키트(Invitrogen)를 사용하여 결정하였다. 모든 FACS 데이터는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 LSR II 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 분석하였다.
조직학: 모든 기관의 5 마이크론 섹션을 표적 항원에 대한 특이 항체와 배양하였다; 혈관 구조를 위해 본 출원인은 CD31(1 :100), (AbD Serotec)을 사용하였고 대식세포를 위해 인간 CD68(Dako, Ely, UK)을 1:100로 사용하였으며 아데노바이러스를 검출하기 위해 본 출원인은 E1A를 1:50(Millipore, UK)로 사용하였다. 비오티닐화 이차 항체계를 스트렙트아비딘-접합된 HRP와 함께 사용하였다. 퍼옥시다제 활성을 디아미노벤지딘(Vectastain Elite ABC kit, Vector Labs)으로 국소화시켰다. 종양 중의 철을 검출하기 위해(세포 밀도가 높은 경우) 섹션은 Perls 러시안 블루로 염색하고 개선된 대조를 위해 에오신으로 대조-염색하였다. 폐에서 암 세포를 검출하기 위해 모든 폐 섹션을 상피 세포 접착 분자(EPCAM) 또는 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 모든 면역-국소화(immune-localization) 실험을 다중 조직 섹션에 대해 반복하였으며 백그라운드 염색의 결정을 위해 동형-대칭된 대조물을 포함시켰다.
통게적 분석
데이터는 평균 ± SEM이다. Student's t 검증을 사용하여 데이터의 통계적 유의도를 분석하였다. P 값이 0.05 미만이면 차가 유의하다고 하였다.
보충적인 방법
마우스 과정 및 인간 단핵구 단리는 셰필드 대학 Ethics Committee and UK Home Office Regulations under the Animals (Scientific Procedures) Act 1986에 따라 수행하였다.
결과
본 출원인은 종양분해성 바이러스(HSV1716)를 갖춘 치료 세포를 초-상자성 산화철 나노입자(SPIO)를 사용하여 자기적으로 표지한 다음 자기 공명 이미징(MRI) 시스템 내에서 펄스 자기장 기울기를 사용하여 혈류로부터 심부 표적 조직(원발성 및 속발성 종양)으로 스티어링할 수 있음을 보여준다. 이 기술의 사용은 종양으로의 세포 전달의 현저한 증가 및 종양 부담 및 전이의 유의적인 감소를 초래하였다. 따라서, 본 출원인의 연구는 임상 MRI 스캐너가 이러한 자기적으로 표지된 세포를 이를 체내에 주사한 후 영상화하기 위해서 뿐만 아니라 이들을 체내 하나 이상의 표적 부위로 특이적으로 스티어링하는 데에도 사용될 수 있음을 보여준다. 본 출원인은 종양으로의 대식세포의 전달을 증가시키기 위한 자기 공명 표적화(MRT)의 사용을 기술한다.
본 출원인은 MRI 스캐너의 공간 장(spatial field) 경사 코일을 조작하여 종양 안/주위에 자기장을 형성함으로써 자기적으로 표지된 세포를 종양 쪽으로 비침습적으로 스티어링할 수 있음을 보여준다(도 16).
본 출원인은 이전에, 이러한 MRT가 시험관내 혈관 분기 모델(동맥 분기를 모방한 2D 관)13에서 세포를 영상화하고 이동시키는데 사용될 수 있음을 보여주었다. 여기서, 본 출원인은 MRT가 또한 자성 대식세포를 생체내에서 - 즉, 마우스에서 혈류로부터 두 개의 표적 기관, 동소 전립선 종양 및 이들의 폐 전이 - '스티어링'하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 본 출원인은 대식세포를 세포 비히클(cellular vehicle)의 예로서 사용하였는데, 그 이유는 이들 세포가 매우 식균성이어서 이들의 자성을 유지하면서 SPIO를 쉽게 소모할 수 있기 때문이다14'18'19. 이러한 골수-유도된 세포는 흥미롭게도 암20-22, 심근 경색23, 척수 손상24, 대뇌 허혈25, 파킨슨병26 및 알츠하이머병27 같은 퇴행성 질환과 같은 질환에 대한 세포-기반 치료법으로서 사용된다.
MRT 기술을 생체내 적용하기 전에, 본 출원인은 먼저 600mT/m 경사 코일 세트가 장착된 전임상적 7T MRI 시스템이 자성 대식세포를 내피 층을 가로질러 3D 인간 종양 원주체(MTS) 내로 스티어링함으로써 시험관내에서 자성 대식세포에 대해 상당한 작동력(actuation force)을 생성할 수 있다는 것을 확립하였다. 이를 실시하기 위해, 본 출원인은 인간 대식세포가 인간 혈관 내피 세포의 층으로 코팅된 천공 막 의 표면을 가로질러 순환함으로써 종양 세정맥에서의 흐름을 모방하는 경내피 이동(TEM) 유동 챔버를 설계하였다. MTS를 막 아래 비-접착 챔버에서 배양하였다(도 20a). 챔버가 고-자기장 (7T) 전임상 MRI 시스템의 등중심에 배치되는 경우 GFP 리포터 아데노바이러스(Ad-CMV-GFP)를 발현하도록 형질감염된 인간 대식세포를 SPIO(1.18ug/ml ± 0.3)14로 부하한 다음 막을 가로질러 MTS로 스티어링하였다.
MRT 실험은 MTS 부위에 유효 추가 자기장 오프셋을 B0ff ~ +1.5mT로 하여 원주체(도 20a) 방향으로 1시간 동안 펄스 자기장 기울기(2 ms 온, 7 ms 오프, 50% 강도 ~300mT/m13)를 사용하였다. 대조 조건에서는 샘플을 스캐너의 자기장에 노출시켰지만 기울기는 펄스되지 않았다. MRT를 사용하여, 본 출원인은 T2 *-칭량된 신소 소실을 발견하였으며, 이는 대조 샘플과 비교하여 MRT 노출된 샘플(n=6)에 대해 더 높은 철 농도를 나타내고(도 20ci) GFP-발현 대식세포는 MTS 내에서 명백히 보였다(도 20cii). 유동 분석은 대식세포 섭취와 MRT를 갖지 않는 것(2.9%±1.8)보다는 MRT를 갖는(29.7%±2.6) 침윤 CD14+/PI- 발현 대식세포가 유의적으로 (P=0.0001) 더 많이 생존한다는 것을 더욱 확인시켜 주었다(도 20c iii-iv).
그후 본 출원인은 이러한 MRI 기울기 시스템이 자성 대식세포를 생체내에서 종양으로 스티어링하는데 사용될 수 있는지를 조사하였다(도 17). 3백만 개 SPIO-부하된 대식세포를 동소의 일차 및 전이성 (폐) 전립선 종양을 가진 마우스에게 정맥내 투여하였다. 펄스 자기장 기울기13를 스캐너(Bo = 7T)의 정자기장의 상부에 유효 자기장 오프셋을 Boff ~ +7mT로 하여 전립선(도 17a) 방향으로 1시간 동안 적용하였다. 대조군은 스티어링 기울기의 부재하에서 스캐너의 정자기장에 노출시켰다(no MRT).
MRT는 대조군(7.17%±0.8)에 비해 원발성 전립선 종양(42.2%±2.5)에서 SPIO-부하된 대식세포의 섭취를 유의적으로 (p=0.0001) 증가시켰다(도 17b). 게다가, 이들 세포는 종양 전반에 걸쳐 존재하며, 인간 CD68(판 대식세포 마커)에 대한 항체를 사용하여 종양의 순차적 섹션을 표지화함으로써 및 철에 대한 조직학적 염색(러시안 블루 또는 'PB')에 의해 알 수 있는 바와 같이 MR 표적화 후 종양 혈관구조에서 세포 군집(cell clumping)의 아주 작은 흔적이 있다(도 17c). 대식세포의 MRI 스티어링은 종양 혈관구조에 불리하게 영향을 미치지 않았으며(도 21a) 종양의 다중-에코 RARE MR 이미지에서는 MRT와 no MRT 그룹 간에 차이를 거의 볼 수 없다(도 17d). 이것은 아마도 복셀(voxel) 당 혈액 풀(pool) 철 함량으로 인한 것이다. 그러나, SPIO 주사된 및 비-주사된 대상체 간의 현저한 차이가 T2-칭량된 긴 TE 영상에서 자명하며, 종양 내 신호 강도의 소실(대조군에 비해 MRT에서의 왜곡된 MRI 영상)은 높은 농도의 철의 존재를 나타낸다(도 17e). 생체내 자성 대식세포의 증가된 섭취를 평가하기 위한 노력으로 본 출원인은 그룹 둘 다에서 종양에서의 MR 횡축 이완 감쇠 속도(R2)를 측정하기 위해 MR 이완계측을 사용하였다. R2 측정치는 MRT 그룹의 경우 2, 8s-1　및 대조군의 경우 18.8s- 1이었다. SPIO이 존재하지 않는 종양 조직의 정상적인 R2 감쇠 속도가 또한 비교를 위해 포함되었다(10.5s-1). 보다 높은 감쇠 속도는 MRT 그룹에 대한 증가된 철 섭취를 나타내며 - 사후 분석으로 알 수 있는 바와 같이 MRI로 섭취를 평가할 수 있음을 시사한다. R2 값에 있어서의 상당한 차이를 사용하여 60ms의 TE에서 스핀 에코-기반 MRI 서열과의 신호 차이를 분석하기 위해 최상의 에코 시간을 추정하였으며, 여기서 MRT는 시간-매칭된 대조군에 비해 신호에 있어 10% 감소를 야기하였다.
추가의 대조군에 종양을 가진 마우스를 포함시켰다: (i) MR 표적화를 갖는 비표지된 대식세포, 및 (ii) MR 표적화를 갖지 않는 비표지된 대식세포. 이러한 대조군에 대해, 본 출원인은 MRI 이미징(도 21 c) 및 효소적으로 분산된 종양의 유동 세포계측에 의해 확인되는 바와 같이 종양 내 매우 적은 대식세포를 검출하였다(도 21d). 중요하게도, 본 출원인은 간(모든 세포/조직 섹션의 <2%), 비장(<1%) 및 신장(검출 불가)을 포함하는 다른 조직에서 인간 CD68+ 대식세포를 거의 검출하지 못했다(도 22).
MRT는 폐, 뇌, 간 또는 척수에서와 같이 종양이 수술로 제거하기가 어렵거나 불가능한 경우에 특히 적용된다. 별도의 MRT 세션이 세포-기반 치료법을 암 환자에서 하나 이상의 전이성 병변에 표적화할 수 있다. 2차 생체내 실험에서 본 출원인은 종양을 가진 마우스에서 자성 대식세포를 미세전이를 함유하는 폐로 스티어링하였다. MRT가 다시 3백만 개 대식세포의 투여 후 자성 대식세포를 폐 쪽으로 스티어링시키는데 사용되었다. MRT를 적용하지는 않았지만 동일한 시간의 길이 동안 스캐너의 자기장에 노출된 마우스를 시간-매칭된 대조군으로서 사용하였다.
효소적으로 분산된 폐의 유동 세포계측 분석은 대조군에서보다 MRT 후 유의적으로 더 많은 인간 CD14+ 대식세포의 존재를 보여주었다(각각 17.7%±4 vs. 4.4%±2.6)(도 18a). 이것은 또한 폐의 조직학적 염색에 의해 확인된 반면, CD68+ 인간 대식세포는 MRT 후 마우스의 폐 내의 전이성 축적물 안에 또는 가까이에서 되었다(도 18b 및 도 23a). 이들 대식세포는 또한 러시안 블루에 대해 양성이었으며(도 18c) 이들의 철 함량 또한 H&E 염색 후 가시적이었다(도 23b). 본 출원인은 MRT를 갖거나 갖지 않는 SPIO-표지된 대식세포의 섭취 후 폐에서의 CD31 + 혈관의 형태를 검사하였다(도 18c). 또한, 본 출원인은 이러한 2개 그룹의 마우스에서 5개 종양 각각에서 모든 혈관을 조사하였으며 두 그룹 간에 차이는 발견되지 않았다. 본 출원인은 내피 세포 붕괴의 조짐을 볼 수 없었으며, MRI 표적화 후 혈관의 내강으로부터 멀리 있는 면 안에서 또는 상에서 혈액 응고(예를 들어, 혈소판 응집)의 어떠한 징조도 없었다. 폐 조직의 보다 짧은 T2/T2*로 인해 증가된 섭취의 생체내 입증을 위해 고 자기장에서 종래의 1H MRI 기술로는 폐 유조직을 영상화할 수 없었다. 미래의 기술 개발이 이를 가능하게 할 수 있으며, 예를 들면, 영공에서의 과분극된 가스의 사용이 간접적인 MR 신호 검출 방법으로서 사용될 수 있다28. 그럼에도 불구하고, 상이한 기관 또는 연조직에서, 또는 임상 시스템 상에서, T2* 이미징이 위치를 차지할 수 있다".
MRT의 치료적 이익을 평가하기 위한 최종 실험에서 본 출원인은 치료적 종양분해성 바이러스(OV) HSV1716을 갖춘 SPIO-부하된 대식세포를 종양을 지닌 마우스에 표적화하였다. HSV1716 복제는 PC3 전립선 암 세포{Conner and Braidwood, Cancer Gene Ther. 2012 Jul; 19(7):499-507}에 의해 뒷받침되며 여기서 본 출원인은 저산소(0.5% 02) 및 정상산소(20% O2) 상태 둘 다에서 LNCaP 세포에서의 종양분해를 최초로 보여준다(도 24a). HSV1716은 대식세포에 의해 쉽게 섭취되며 섭취는 정상산소 배양 조건에서 유의적으로 더 높고(MOI5에서 p=0.002 및 MOI50에서 p=0.001)(도 24b), 바이러스 복제는 저산소증에서 더 크며 대식세포 세포 사멸은 저산소 환경에서 똑같이 효과적이다(도 24c,d). 우리의 생체내 모델에서, 종양을 지닌 마우스는 OV-보유 대식세포(MDM+OV)의 단일 정맥내 주사를 제공받았지만, MRI 스캐너에는 노출시키지 않았거나, MRT 없이 스캐너에서 정적이었거나(MDM+OV (no MRT)), MRT를 갖는 스캐너에 노출시켰다(MDM+OV+MRT). 비교의 목적으로 "유리(free)" OV를 별도의 마우스 그룹에 투여하였다. 추가의 대조군의 마우스는 100ul 염수 처리(대조군) 또는 3백만 개 대식세포(MDM)를 정맥내 제공받았다. OV (1 x107　pfu){Sorensen et al., J Nucl Med 2012 53:647-654} 단독은 PBS 또는 MDM 단독을 제공받은 마우스에 비해 7일 이하 동안 원발성 종양 성장을 유의적으로 (P < 0.03) 지연시켰다(도 19a). 이 효과는 HSV1716의 대식세포-매개된 전달로 유의적으로 연장되었다(14일째에 p<0.006 및 21일째에 p<0.007). 중용하게도, MDM+OV 및 MDM+OV(no MRT)를 제공받은 마우스에서 차이는 관찰되지 않았으며, 여기서 후자는 스캐너에는 노출되었지만 스티어링은 없었다. 그러나, 우리의 대식세포 요법의 MRT 표적화는 7일째부터 계속 원발성 종양의 크기를 감소시키는데 있어서 보다 양호할 뿐만 아니라 실험의 전반 동안 원발성 종양 재생을 지연시켰다(도 19a).
처리 첫째날(0일) 및 실험 말기(21일째)에 MR 표적화를 갖거나 갖지 않는 대식세포 OV 요법을 제공받은 마우스의 생물발광은 원발성 종양의 이러한 현저한 감소를 보여주었다(도 19a & b). 이것은 MRI 스캔에서 가시적으로 확인되었다(도 19c). 더욱이, 대식세포-전달된 OV 후 MR 표적화를 겪은 종양은 MR 표적화를 제공받지 않은 것보다 유의적으로 더 괴사성(p<0.001)이었다(도 19e).
처리 첫째날(0일) 및 실험 말기(21일째)에 MR 표적화를 갖거나 갖지 않는 대식세포 OV 요법을 제공받은 마우스의 MR 영상은 원발성 종양의 이러한 현저한 감소를 투영한다. 흥미롭게도, OV 또는 MDM을 지닌 OV로 처리된 마우스로부터의 종양은 상당히 연하고 덜 혈관화되었으며 이것은 PBS 또는 MDM 단독 그룹과 비교하여 감소된 미세혈관 밀도(MVD)와 상관성이 있다. MRT의 부재하에서보다 대식세포-전달된 OV 후 MRT를 겪은 마우스에서 종양에 유의적으로 더 많은 괴사(p<0.001)가 관찰되었다.
본 출원인은 다음으로 어떻게 이러한 치료법이 폐 전이의 발달에 영향을 미치는지를 알아보았다. PBS 또는 MDM 단독으로 주사된 마우스에서 작은 전이가 검출되었으며, 이것은 이러한 그룹에서 원발성 종양이 (이들의 크기로 인해) 4일깨까지 제거되어야 하기 때문이다. 따라서, 이러한 대조군에서의 전이를 다른 실험 그룹과 비교하는 것은 타당하지 않았다. 그러나, 폐 전이의 형성은 no MRT가 사용된 경우와 비교하여 마우스가 OV-보유 대식세포의 전달 후 MRT를 제공받은 경우에 현저하게 감소되었다(도 9f 0.8 ± 0.37 vs. 3.8 ± 0.95 p<0.02).
요약하면, 본 출원인은 MRI 스캐너가 세포를 체내 원발성 및 속발성 종양 둘 다로 비침습적으로 스티어링하는데 사용되어 치료 성장에 있어서 유의적인 개선을 초래할 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이완계측 측정은 MRI 후 MRT를 사용하여 이러한 접근법의 효능을 평가할 수 있음을 시사한다. 이 연구가 종양으로의 세포 전달에 촛점을 맞추기는 하지만, 기술은 이들의 세포 표면 상의 단백질에 대해 지시된 SPIO-접합 항체를 사용하여 "자화"될 수 있는 비-식균성 세포 유형을 포함한 소정의 조직에 임의의 세포(예를 들어, 줄기 세포)를 표적화하는데 사용될 수 있다.
세포의 전달을 증가시키기 의해 자기 공명 이미징 시스템 내에 자기장 기울기를 활용하는 자기 공명 표적화의 사용은 심부 조직 또는 표면 조직에 이상적으로 적합하다. 임상적 번역의 문제는 임상 MRI 시스템에 동일한 표적화 힘을 제공하는 능력에 의존적이다. 300mT/m의 고성능 자기장 기울기 시스템을 갖는 임상 스캐너가 이미 사용중이며 이로써 유사한 힘을 생산할 수 있는 잠재력을 갖는다. 더욱이, 본 출원인은 MRT 후 세포 분포를 영상화할 수 있었으며, 이는 MRI 시스템을 사용한 실시간 영상-안내 표적화에 대한 가능성을 나타낸다. 이러한 조사결과는 치료법에 대한 세포의 개선된 표적화를 위해 수반된 이미징과 MRT의 잠재적 가치를 뒷받침한다.
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Claims (19)

  1. 종양분해성 단순포진 바이러스(oncolytic herpes simplex virus)로 증식적으로(productively) 감염된 생체외 또는 시험관내 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포가 외인성 자성 물질을 포함하는, 생체외 또는 시험관내 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포.
  3. 종양분해성 단순포진 바이러스로 증식적으로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는 암 치료용 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 외인성 자성 물질을 포함하는, 제제.
  5. 종양분해성 단순포진 바이러스로 증식적으로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 시험관내 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 종양분해성 단순포진 바이러스와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 방법이 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포를 자성 물질과 접촉시킴을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 종양분해성 단순포진 바이러스로 증식적으로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 종양분해성 단순포진 바이러스로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 제공하는 단계, 및 상기 세포의 집단을 포함하는 제제를 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 집단의 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 외인성 자성 물질을 포함하는, 방법.
  9. 종양분해성 단순포진 바이러스로 증식적으로 감염된 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 집단을 포함하는, 암 치료 방법에서 사용하기 위한 제제로서, 상기 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포가 외인성 자성 물질을 포함하고, 상기 방법이 상기 제제를 대상체에게 투여하는 단계 및 투여된 제제의 세포가 대상체 신체의 목적하는 위치로 향하도록 자기장을 대상체에 적용하는 단계를 포함하는, 제제.
  10. 소정량의 종양분해성 단순포진 바이러스 및 소정량의 자성 물질을 포함하는, 단핵구, 단핵구 유래 세포 또는 대식세포의 상기 종양분해성 단순포진 바이러스에 의한 증식적 감염에 사용하기 위한 부품들의 키트.
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