CN118086318A - 一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和应用 - Google Patents

一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于稳转细胞株技术领域，具体涉及一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和应用。所述稳转细胞株的保藏编号为CCTCC NO.202410，分类命名：过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株LLC‑P2X7R，过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，所述方法包括：构建过表达P2X7R基因的质粒；将构建的过表达质粒GV658‑P2X7R进行扩增；将步骤(2)所得的质粒使用lip2000转染LLC细胞后，使用嘌呤霉素筛选获得过表达P2X7R基因的细胞株LLC‑P2X7R。本发明将LLC细胞株的P2X7R进行过表达，P2X7R过表达可以促进LLC细胞细胞迁移、侵袭能力等。本发明构建的过表达P2X7R的小鼠非小细胞肺癌细胞株，为深入研究非小细胞肺发生发展的作用及分子机制奠定基础。

Description

一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和 应用
技术领域
本发明属于稳转细胞株技术领域，具体涉及一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和应用。
背景技术
嘌呤能P2型受体是一类以细胞外核苷酸为配体的质膜受体，包括离子通道型P2X和G蛋白偶联型P2Y两个亚家族。其中，P2X7R是P2XR亚家族成员，三个亚基构成功能性的P2X7R，P2X7R亚基有595个氨基酸残基，每个亚基由一个胞内短N端、两个跨膜结构域、一个胞外环和一个长C端组成。ATP作为P2X7R的天然激动剂，P2X7R对ATP刺激产生双相反应，短时间ATP刺激P2X7R，会促进Na+、Ca2+内流和K+外流；而在长期或高剂量的ATP刺激后会形成一个大孔，允许＜900Da分子通过。在正常生理条件下，P2X7R对ATP的亲和力较低，受体的生物学功能受到限制。而肿瘤微环境中的ATP浓度的升高，足以激活P2X7R，导致细胞膜上的离子通道被打开，对Na+、Ca 2+和K+通透，激活多种不同的信号通路，调控肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和凋亡，在肿瘤进展中发挥重要作用。
报道显示2020年，全世界有220万肺癌新病例，是世界上第二大最常见被诊断的癌症；有180万肺癌死亡病例，分别占全球癌症发病率和死亡率的11.4％和18％。85％肺癌患者患病类型为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)，而NSCLC又包括腺癌、鳞癌和大细胞癌三种。目前，NSCLC的治疗主要包括手术治疗、放化疗、免疫治疗和靶向治疗等，尽管在综合治疗方面已经取得了很大的进展，但NSCLC患者5年生存率仍不理想。由于疾病在早期通常无症状，大多数NSCLC患者在确诊时已处于晚期，且伴有局部或远隔脏器转移。肿瘤细胞侵袭和转移是导致NSCLC患者死亡的主要原因，因此，深入探究NSCLC进展的分子机制，寻找有效的潜在治疗靶点对于NSCLC的治疗具有重要意义。
LLC细胞是小鼠Lewis肺癌细胞，它是由原发性Lewis肺癌植入C57BL小鼠的肺部引起肿瘤，分离获得小鼠肺腺癌组织的稳定细胞系，属于非小细胞癌。该细胞被广泛用作转移的模型，用于研究癌症化疗药物的机制，且具有高度致瘤性；用于研究肿瘤发生、发展和治疗等。LLC细胞作为NSCLC研究的重要模型，在NSCLC的分子机制、治疗方案、药物筛选等方面都有着重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和应用，以解决背景技术中存在的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株，所述稳转细胞株的保藏编号为CCTCC NO.202410，分类命名：过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株LLC-P2X7R，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期2024年1月9日。
进一步的，所述P2X7R来源于小鼠，所述稳转株的出发细胞为LLC细胞。
进一步的，所述P2X7R基因序列的NCBI登录号为NM_011027。
过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，所述方法包括：
(1)构建过表达P2X7R基因的质粒；
(2)将构建的过表达质粒GV658-P2X7R进行扩增；
(3)将步骤(2)所得的质粒使用lip2000转染LLC细胞后，使用嘌呤霉素筛选获得过表达P2X7R基因的细胞株LLC-P2X7R。
进一步的，
所述步骤(1)中，构建过表达P2X7R基因的质粒使用的引物为：
上游引物：
5'-GTGGATCCGAGCTCGGTACCCGCCACCATGCCGGCTTGCTGCAGCTG-3'，其为SEQ ID NO:1序列；
下游引物：5'-ATATTTTATTACCGGTTTAATTAATCAGTAGGGATACTTGAAGCCAC-3'，其为SEQ ID NO:2序列。
进一步的，
所述(1)的步骤包括：
a目的基因的模板来自吉凯基因文库，依据Genbank上已公布的小鼠P2X7R基因序列NM_011027，设计合成引物用于扩增P2X7R基因编码序列全长，引物含交换配对碱基、限制性核酸内切酶Kpn I和Pac I酶切位点，在ATG前增加Kozak序列GCCACC，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。PCR扩增得到目的基因P2X7R；
b使用核酸限制性内切酶Kpn I和Pac I对GV658载体和a中的P2X7R目的基因的PCR产物同时进行双酶切，GV658载体酶切后形成线性化载体，所述GV658载体原件顺序：CMVenhancer-MCS-polyA-EF1A-zsGreen-sv40-puromycin，酶切后产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后使用凝胶回收试剂盒回收纯化酶切后的PCR产物和线性化的载体；
c使用T4连接酶将步骤b中目的基因P2X7R的酶切产物与酶切后线性化GV658载体，进行连接构建GV658-P2X7R过表达质粒。
进一步的，所述(3)中，使用lip2000将质粒转染LLC细胞的步骤包括：
消化LLC细胞后分别接种至12孔板，放置于5％ CO2、37℃培养箱内过夜培养，转染时细胞密度达到80％以上且细胞状态良好，取无菌1.5ml EP管标记为A管：加入100ul的DMEM培养基与10ul lip2000，轻轻混匀；另取无菌1.5ml EP管标记为B管：分别加入50ulDMEM培养基与1.5ug GV658-P2X7R；然后分别取A管中55ul混匀液加入B管，轻轻混匀，室温静置5min，培养24h；
从培养箱中取出已接种细胞的12孔培养板，将上述B管中的混合物加入到过表达组内，转染12h后细胞换液，48h倒置荧光显微镜观察到过表达组，细胞中有大量绿色荧光蛋白提示转染效率较高，可以用于后续体外瞬时转染实验。
进一步的，所述(3)中，使用嘌呤霉素筛选获得过表达P2X7R基因的细胞株LLC-P2X7R的步骤包括：
a嘌呤霉素浓度的筛选：
当细胞密度达80％～90％时，按照密度为3×105个/孔，接种LLC细胞于24孔细胞培养板，然后置于5％ CO2、37℃培养箱，当24孔板中细胞汇合度达50％～70％时，将配好的嘌呤霉素溶液，10mg/ml的嘌呤霉素用ddH2O稀释至1mg/ml，加入孔中，使各孔中嘌呤霉素浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml，24h后更换同等浓度的含有嘌呤霉素的新鲜DMEM完全培养基，继续培养；72h后，观察到LLC细胞全部死亡时的最低嘌呤霉素浓度分别为1ug/ml和5ug/ml，将嘌呤霉素的筛选浓度提高为原来的两倍，即2ug/ml为LLC细胞稳定转染的筛选浓度，后续维持浓度同筛选浓度。
b将转染P2X7R基因过表达质粒GV658-P2X7R的LLC细胞，于5％CO2、37℃培养箱继续培养48h，分别使用含2ug/ml和10ug/ml嘌呤霉素的DMEM完全培养基筛选，每2～3d更换培养基，14天左右，直到未转染细胞全部杀死，然后用含与上述筛选浓度相同的维持浓度的DMEM完全培养基维持筛选并扩增培养，筛选获得稳转株LLC-P2X7R。
过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的应用，所述稳转细胞株用于构建疾病模型，所述疾病模型用于肿瘤疾病的机制研究、靶向药物的研发或筛选。
本发明一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株及构建方法和应用的有益之处：
本申请将LLC细胞株的P2X7R基因进行过表达，得到过表达P2X7R的小鼠NSCLC稳转细胞株，可以促进细胞生长、侵袭及迁移能力；本发明提供的基因修饰细胞株的构建方法相对高效，为深入研究NSCLC发生发展的作用分子机制奠定基础。
附图说明
图1是本发明对照质粒GV658和P2X7R过表达质粒GV658-P2X7R转染小鼠非小细胞肺癌LLC细胞后，倒置荧光显微镜观察荧光强度来判断转染效率；
图2是本发明LLC-P2X7R稳转细胞株荧光图和过表达P2X7R的western blot鉴定结果图；
图3是本发明通过细胞划痕实验检测过表达P2X7R对LLC细胞迁移能力的影响结果图；
图4是本发明通过Transwell实验检测过表达P2X7R对LLC细胞迁移和侵袭能力的影响结果图；
图5是本发明通过western blot检测过表达P2X7R影响LLC细胞的迁移和侵袭机制图；
图6是本发明小鼠成瘤实验中荷瘤小鼠和肿瘤大小图；
图7是本发明小鼠成瘤实验中生长曲线图；
图8是本发明小鼠成瘤实验肿瘤的重量统计图；
图9是本发明通过western blot检测小鼠成瘤实验中瘤体组织中癌细胞迁移和侵袭的机制图；
具体实施方式
下面结合附图对其具体实施方式作进一步阐述。
如下实施例中的试剂和仪器均为常规实验试剂和仪器。
实施例1：
一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株，所述稳转细胞株的保藏编号为CCTCCNO.202410，分类命名：过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株LLC-P2X7R，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期2024年1月9日。所述P2X7R来源于小鼠，所述稳转株的出发细胞为LLC细胞。所述P2X7R基因序列的NCBI登录号为NM_011027。
过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，所述方法包括：
(1)目的基因的模板来自吉凯基因文库，依据Genbank上已公布的小鼠P2X7R基因序列(NM_011027)，设计合成引物用于扩增P2X7R基因编码序列全长，引物含交换配对碱基、限制性核酸内切酶Kpn I和Pac I酶切位点，在ATG前增加Kozak序列(GCCACC)，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。PCR扩增得到目的基因P2X7R。PCR引物序列如下：
上游引物SEQ ID NO:1：
5'-GTGGATCCGAGCTCGGTACCCGCCACCATGCCGGCTTGCTGCAGCTG-3'；
下游引物SEQ ID NO:2：
5'-ATATTTTATTACCGGTTTAATTAATCAGTAGGGATACTTGAAGCCAC-3'。
PCR反应体系如下:
表1PCR反应体系
PCR反应条件如下：
表2PCR反应条件
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到有KpnI和Pac I双酶切位点的目的基因P2X7R。
(2)使用核酸限制性内切酶Kpn I和Pac I对GV658载体和(1)中PCR产物同时进行双酶切，37℃酶切30min。GV658载体酶切后形成线性化载体，所述GV658载体原件顺序：CMVenhancer-MCS-polyA-EF1A-zsGreen-sv40-puromycin。酶切后产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后使用凝胶回收试剂盒回收纯化，酶切后的PCR产物和线性化的载体。具体酶切体系如下：
表3酶切体系
(3)使用T4连接酶将步骤(2)中P2X7R的PCR的酶切产物与酶切后线性化GV658载体，进行连接构建GV658-P2X7R过表达载体。具体如下：于冰水浴中配制如表4连接反应体系。按照诺唯赞公司的快速克隆技术试剂盒(ClonExpress IIOne Step Cloning Kit)说明书，于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
表4PCR产物与载体连接体系
(4)质粒转化：将10μL上述连接产物加入到100μL感受态TOP10 competent细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上静置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的平板上，恒温培养箱中倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落，接种至含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床180rpm培养过夜，进行质粒提取并用于后续酶切鉴定后，选取阳性克隆菌株取酶切鉴定阳性的重组质粒送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。将测序结果正确的构建好的重组质粒命名为GV658-P2X7R。
GV658-P2X7R过表达质粒和GV658空质粒，转染小鼠非小细胞肺癌LLC细胞，倒置荧光显微镜观察转染效率及western blot检测P2X7R蛋白表达水平。
为了验证所构建的GV658-P2X7R质粒过表达P2X7R的效果，使用LipofectamineTM2000(lip2000)转染试剂将GV658-P2X7R过表达质粒(过表达组)和GV658质粒(空质粒组)分别瞬时转染LLC，同时设立未转染的空白细胞对照组。
转染前一天，消化LLC细胞后分别接种至12孔板，放置于5％ CO2、37℃培养箱内过夜培养，转染时细胞密度达到80％以上且细胞状态良好。取无菌1.5ml EP管标记为A管：加入100ul的DMEM培养基与10ul lip2000，轻轻混匀；另取2个无菌1.5ml EP管标记为B和C管：分别加入50ul DMEM培养基与1.5ug GV658-P2X7R和GV658空质粒；然后分别取A管中55ul混匀液加入B和C管，轻轻混匀，室温静置5min。
从培养箱中取出已接种细胞的12孔培养板，将上述B和C管中的混合物分别加入到过表达组和空质粒组各细胞孔内。空白细胞对照组不做任何处理。转染12h后细胞换液，48h倒置荧光显微镜观察到过表达组和空质粒组，细胞中有大量绿色荧光蛋白(GV658载体中含有绿色荧光蛋白报告基因，转染成功后，细胞内会表达绿色荧光蛋白)(图1A)，提示转染效率较高，可以用于后续体外瞬时转染实验。
分别提取野生型LLC细胞(空白对照组)、空质粒组(GV658)、过表达P2X7R组(GV658-P2X7R)肿瘤细胞中总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度后，western blot检测各组细胞P2X7R，用以确定各组肿瘤细胞中P2X7R蛋白表达水平。
P2X7R蛋表达水平的检测如图1B所示，从图中可以看出，野生型LLC细胞存在P2X7R表达，过表达组细胞中的P2X7R蛋白表达水平明显高于野生型细胞和转染空质粒细胞组。表明本发明所制备的载体能较好地过表达P2X7R在LLC细胞中，Control:野生型LLC细胞；GV658：瞬时转染GV658空质粒的细胞；GV658-P2X7R：瞬时转染GV658-P2X7R质粒的细胞。
(5)嘌呤霉素筛选GV658-P2X7R和GV658稳定表达株。具体过程如下：
嘌呤霉素浓度的筛选：当细胞密度达80％～90％时，按照密度为3×105个/孔，接种LLC细胞于24孔细胞培养板，然后置于5％ CO2、37℃培养箱。当24孔板中细胞汇合度达50％～70％时，将配好的嘌呤霉素溶液(10mg/ml的嘌呤霉素用ddH2O稀释至1mg/ml)加入孔中，使各孔中嘌呤霉素浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml。24h后更换同等浓度的含有嘌呤霉素的新鲜DMEM完全培养基，继续培养；72h后，观察到LLC细胞全部死亡时的最低嘌呤霉素浓度分别为1ug/ml和5ug/ml，将嘌呤霉素的筛选浓度提高为原来的两倍，即2ug/ml为LLC细胞稳定转染的筛选浓度，后续维持浓度同筛选浓度。
使用上述制备的P2X7R基因过表达质粒GV658-P2X7R和GV658空质粒分别转染LLC细胞。转染后于5％CO2、37℃培养箱继续培养48h，分别使用含2ug/ml和10ug/ml嘌呤霉素的DMEM完全培养基筛选，每2～3d更换培养基，14天左右，直到未转染细胞全部杀死。然后用含与上述筛选浓度相同的维持浓度的DMEM完全培养基维持筛选并扩增培养，筛选获得的稳转株分别命名为LLC-Con、LLC-P2X7R。荧光显微镜观察稳转株的绿色荧光表达，western blot检测稳转株中P2X7R蛋白过表达效果。结果如图2所示，稳转株全部表达绿色荧光蛋白，过表达稳转株中P2X7R蛋白表达水平明显增加，图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。
过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的应用，所述稳转细胞株用于构建疾病模型，所述疾病模型用于肿瘤疾病的机制研究、靶向药物的研发或筛选。
本发明将LLC细胞株的P2X7R进行过表达，P2X7R过表达可以促进LLC细胞细胞迁移、侵袭能力等。本发明构建的过表达P2X7R的小鼠非小细胞肺癌细胞株，为深入研究非小细胞肺发生发展的作用及分子机制奠定基础。
实施例2：
采用细胞划痕实验检测P2X7R过表达对小鼠非小细胞肺癌LLC细胞迁移能力的影响。
具体过程如下：
培养LLC-Con、LLC-P2X7R细胞，细胞密度达80％～90％时，吸弃培养基，向细胞培养皿中滴加适量含EDTA胰酶，轻轻晃动混匀后移置显微镜观察，当细胞皱缩变圆时弃掉胰酶，用完全培养基终止胰酶消化后，1200rpm，离心3min收集细胞。按照密度为每孔5×105个细胞，接种至12孔细胞培养板，5％ CO2、37℃培养箱培养。当细胞生长至100％融合时，使用无菌PBS洗细胞3次，用100ul黄枪头沿无菌直尺在培养板正中央竖直均匀划痕，用无菌PBS清洗掉划下来的细胞碎片，加入1％FBS的DMEM培养基继续培养。将培养板放入5％CO2、37℃培养箱中继续培养24h。划痕后0h和24h分别置于倒置显微镜下拍照留存，使用Image J软件分析划痕面积后计算各组的细胞迁移率。结果如图3所示。从图中可以看出，与LLC-Con对照组相比，过表达P2X7R的LLC-P2X7R细胞迁移能力明显增加。图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。
实施例3：
采用Transwell实验检测P2X7R过表达对小鼠非小细胞肺癌LLC细胞迁移和侵袭能力的影响。具体过程如下：
(1)Transwell迁移实验：
将LLC-Con、LLC-P2X7R细胞，使用无血清的DMEM调整细胞密度，小室上室内加入200ul细胞悬液(3×104个细胞/孔)，小室下层加入600ul含10％血清的DMEM完全培养基。置于5％ CO2、37℃培养箱中继续培养。24h后将小室取出，PBS洗涤2次后，用棉签轻轻擦拭小室正面。使用甲醇避光固定小室15min，固定后，PBS洗涤小室2次。用0.1％结晶紫避光染色25min，PBS洗涤2遍。小室自然晾干后，倒置显微镜(200×)观察穿膜细胞，随机取上、下、左、右、中心5个视野拍照后进行统计分析。迁移结果如图4A所示。从图中可以看出，与LLC-Con对照组相比，过表达P2X7R的LLC-P2X7R细胞迁移率明显增加。图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。
(2)Transwell侵袭实验：
具体操作同Transwell迁移实验，不同的是小室提前使用200μg/mL的Matrigel基质胶处理(冷冻Matrigel基质胶放于4℃解冻，用无血清DMEM培养基稀释至浓度为200μg/mL，全程冰上操作进行。用预冷枪头吸取100ul滴加到小室内，静置于37℃细胞培养箱1h，待其凝固)。侵袭结果如图4B所示。从图中可以看出，与LLC-Con对照组相比，过表达P2X7R的LLC-P2X7R细胞侵袭能力明显增加。图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。
实施例4：
western blot检测P2X7R过表达对小鼠非小细胞肺癌LLC细胞迁移和侵袭能力影响的具体机制。具体过程如下：
分别在6孔板内培养LLC-Con、LLC-P2X7R细胞。然后置于5％ CO2、37℃培养箱，继续培养24h，收集各组细胞提取总蛋白。
(1)Western blot检测EMT标志物蛋白的表达
上皮-间充质细胞转换(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是肿瘤转移的经典机制之一，因此，我们探讨了P2X7R过表达对LLC细胞EMT过程的调控作用。Westernblot检测EMT标志蛋白(N-cadherin、E-cadherin及Vimentin蛋白)表达。结果如图5A所示。图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。从图中可以看出，与LLC-Con对照组相比，过表达P2X7R的LLC-P2X7R细胞中N-cadherin、Vimentin表达水平升高，E-cadherin表达水平下降。结果提示P2X7R参与调控LLC细胞EMT过程，P2X7R过表达促进癌细胞EMT过程。
(2)Western blot检测PI3K/Akt/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达
为探讨P2X7R在LLC细胞迁移和侵袭中的作用及其潜在机制，使用western blot检测PI3K/Akt/GSK-3β通路相关蛋白(Akt、pAkt、GSK-3β、pGSK-3β)的表达情况。结果如图5B所示。图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。从图中可以看出，与LLC-Con对照组相比，过表达P2X7R的LLC-P2X7R细胞中p-Akt与p-GSK-3β表达水平升高。结果表明P2X7R过表达可能通过下游PI3K/Akt/GSK-3β通路参与LLC细胞迁移和侵袭过程，有助与癌细胞侵袭和迁移。
实施例5：
为证明过表达P2X7R的LLC细胞的稳转株，在小鼠体内促进肿瘤生长和侵袭迁移，进行了小鼠成瘤实验，具体过程介绍如下。
取处于对数生长期且生长状态良好的LLC-Con、LLC-P2X7R；细胞达80-90％左右密度。细胞消化后用PBS洗涤两次，进行细胞计数，适量PBS调整细胞密度为每只小鼠5×106个/200ul(LLC-Con、LLC-P2X7R)，分别注射入野生型C57BL/6小鼠右侧腋下靠近背部处皮肤皮下成瘤。小鼠成瘤期间正常饮食、作息，每两天测量小鼠肿瘤长、短径，绘制肿瘤生长曲线；根据瘤体大小及时结束实验。实验结束后，摘取小鼠瘤体称重后，瘤体组织提取总蛋白，用于western blot检测。
结果如图6所示，图6为实验结束时荷瘤小鼠(6A)和从小鼠皮下取出的肿瘤图片(6B)，可见P2X7R过表达组肿瘤体积明显增大；图7为肿瘤生长曲线，结果表明与对照相比，P2X7R过表达组肿瘤体积增长速度明显增快；图8为肿瘤取出后测得的肿瘤的重量，P2X7R过表达组肿瘤重量明显增加；图9为瘤体组织EMT和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路相关蛋白western blot检测结果，结果表明P2X7R基因过表达促进EMT(9A)和P2X7R下游PI3K/Akt/GSK-3β信号通路激活(9B)，进而促进癌细胞侵袭和迁移。图中LLC-Con：对照；LLC-P2X7R：过表达P2X7R的稳转细胞。
本发明构建的过表达P2X7R基因的小鼠非小细胞肺癌细胞株，为深入研究非小细胞肺癌发生发展的作用及分子机制奠定基础。
上述实施例使用的主要试剂、药品及样品：
小鼠非小细胞肺癌LLC细胞购自广州豪地华拓生物科技有限公司(中国广东深圳)；转染试剂LipofectamineTM2000购自Thermo Fisher公司；)嘌呤霉素购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Transwell小室购自Corning公司；P2X7R,Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β,E-cadherin,Vimentin和N-cadherin一抗体均购自美国Santa Cruz公司；GAPDH抗体购自美国Proteintech公司。凝胶回收试剂盒和无内毒素质粒中量提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株，其特征是：所述稳转细胞株的保藏编号为CCTCC NO.202410。
2.根据权利要求1所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株，其特征是：所述P2X7R来源于小鼠，所述稳转株的出发细胞为LLC细胞。
3.根据权利要求1所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株，其特征是：所述P2X7R基因序列的NCBI登录号为NM_011027。
4.根据权利要求1-3任一项所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，其特征在于：所述方法包括：
(1)构建过表达P2X7R基因的质粒；
(2)将构建的过表达质粒GV658-P2X7R进行扩增；
(3)将步骤(2)所得的质粒使用lip2000转染LLC细胞后，使用嘌呤霉素筛选获得过表达P2X7R基因的细胞株LLC-P2X7R。
5.根据权利要求4所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，其特征是：
所述步骤(1)中，构建过表达P2X7R基因的质粒使用的引物为：
上游引物：5'-GTGGATCCGAGCTCGGTACCCGCCACCATGCCGGCTTGCTGCAGCTG-3'，其为SEQ IDNO:1序列；
下游引物：5'-ATATTTTATTACCGGTTTAATTAATCAGTAGGGATACTTGAAGCCAC-3'，其为SEQ IDNO:2序列。
6.根据权利要求4所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，其特征是：
所述(1)的步骤包括：
a目的基因的模板来自吉凯基因文库，依据Genbank上已公布的小鼠P2X7R基因序列NM_011027，设计合成引物用于扩增P2X7R基因编码序列全长，引物含交换配对碱基、限制性核酸内切酶Kpn I和Pac I酶切位点，在ATG前增加Kozak序列GCCACC，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。PCR扩增得到目的基因P2X7R；
b使用核酸限制性内切酶Kpn I和Pac I对GV658载体和a中的P2X7R目的基因的PCR产物同时进行双酶切，GV658载体酶切后形成线性化载体，所述GV658载体原件顺序：CMVenhancer-MCS-polyA-EF1A-zsGreen-sv40-puromycin，酶切后产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后使用凝胶回收试剂盒回收纯化酶切后的PCR产物和线性化的载体；
c使用T4连接酶将步骤b中目的基因P2X7R的酶切产物与酶切后线性化GV658载体，进行连接构建GV658-P2X7R过表达质粒。
7.根据权利要求4所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，其特征是：所述(3)中，使用lip2000将质粒转染LLC细胞的步骤包括：
消化LLC细胞后分别接种至12孔板，放置于5％CO2、37℃培养箱内过夜培养，转染时细胞密度达到80％以上且细胞状态良好，取无菌1.5ml EP管标记为A管：加入100ul的DMEM培养基与10ul lip2000，轻轻混匀；另取无菌1.5ml EP管标记为B管：分别加入50ul DMEM培养基与1.5ug GV658-P2X7R；然后分别取A管中55ul混匀液加入B管，轻轻混匀，室温静置5min，培养24h；
从培养箱中取出已接种细胞的12孔培养板，将上述B管中的混合物加入到过表达组内，转染12h后细胞换液，48h倒置荧光显微镜观察到过表达组，细胞中有大量绿色荧光蛋白提示转染效率较高，可以用于后续体外瞬时转染实验。
8.根据权利要求4所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的构建方法，其特征是：所述(3)中，使用嘌呤霉素筛选获得过表达P2X7R基因的细胞株LLC-P2X7R的步骤包括：
a嘌呤霉素浓度的筛选：
当细胞密度达80％～90％时，按照密度为3×105个/孔，接种LLC细胞于24孔细胞培养板，然后置于5％CO2、37℃培养箱，当24孔板中细胞汇合度达50％～70％时，将配好的嘌呤霉素溶液，10mg/ml的嘌呤霉素用ddH2O稀释至1mg/ml，加入孔中，使各孔中嘌呤霉素浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml，24h后更换同等浓度的含有嘌呤霉素的新鲜DMEM完全培养基，继续培养；72h后，观察到LLC细胞全部死亡时的最低嘌呤霉素浓度分别为1ug/ml和5ug/ml，将嘌呤霉素的筛选浓度提高为原来的两倍，即2ug/ml为LLC细胞稳定转染的筛选浓度，后续维持浓度同筛选浓度。
b将转染P2X7R基因过表达质粒GV658-P2X7R的LLC细胞，于5％CO2、37℃培养箱继续培养48h，分别使用含2ug/ml和10ug/ml嘌呤霉素的DMEM完全培养基筛选，每2～3d更换培养基，14天左右，直到未转染细胞全部杀死，然后用含与上述筛选浓度相同的维持浓度的DMEM完全培养基维持筛选并扩增培养，筛选获得稳转株LLC-P2X7R。
9.根据权利要求1-3任一项所述的过表达P2X7R的小鼠Lewis肺癌稳转细胞株的应用，或，所述稳转细胞株由权利要求4-8任一项所述的方法构建，其特征是：所述稳转细胞株用于构建疾病模型，所述疾病模型用于肿瘤疾病的机制研究、靶向药物的研发或筛选。
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