CN106434580A - 一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法 - Google Patents

一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法 Download PDF

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王莹
闫立新
刘凤霞
程艳杰
荆鹏程
王鹏
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Abstract

本发明涉及一种植物超氧化物歧化酶提取方法，具体的说是在植物鲜果或鲜叶原料中加入生理盐水、保护剂及溶膜剂冷提细胞内的超氧化物歧化酶，经预处理后的料液用截留分子量为10万和1万的中空纤维膜浓缩后，得到超氧化物歧化酶浓缩液，经过有机溶剂除杂、丙酮沉淀、冷冻干燥，可得到活性在1300~1800 U/mg的超氧化物歧化酶产品。该发明可为植物超氧化物歧化酶资源开发利用提供参考。

Description

一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法
技术领域
本发明涉及植物超氧化物歧化酶的提取领域，具体的说是涉及一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一种酸性的金属酶，在生物体内能够催化自由基发生歧化反应，并且能够消除机体内超氧阴离子自由基(O2 -)保护机体的细胞过快衰老。到目前为止，人们已经从包括细菌、真菌、藻类、植物和动物等多种生物体内分离出SOD。自上世纪三十年代首次从牛的红血球中分离得到SOD，人们曾一直致力于从动物肝脏和血液中提取并分离SOD，并已取得了显著的成果，在医学等众多方面都有应用。但是由于动物血液中提取得到的SOD容易被病毒感染，且动物的饲养过程中易受到饲料、疾病等的因素影响。
植物中的SOD多属植物天然蛋白，不仅可以避免发生病毒交叉感染，而且不含有对人体有害的物质。含有SOD的植物的来源广泛，一般价格都比较低廉，目前大多研究是从大蒜、玉米、番茄、猕猴桃等日常蔬菜、瓜果中提取SOD。天然的超氧化物歧化酶存在稳定性差、活性易损失等问题，而目前研究报道的植物SOD提取工艺中，大多是利用热变性原理，这一处理会使酶蛋白分子发生亚基的解聚、变性或其他方面的构象变化，导致酶活性的下降或丧失，产品稳定性差、活性难保存；而且生产过程中需要使用大量的有机溶剂，提取程序复杂，使得产品的成本较高，生产周期较长，产率不高，因此，植物SOD的生产还只停留在实验室阶段，尚未实现工业化生产。
发明内容
本专利提供了一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法。通过样品预处理、粗酶液的制备、脱色和激活、有机溶剂除杂、丙酮沉淀SOD和冷冻干燥等处理过程。
本发明采用的技术方案：一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法，其特征在于按下述步骤操作：
称取一定质量的植物鲜果或鲜叶，加入生理盐水冷冻后用打浆机打浆，加入保护剂和溶膜剂置于冰箱中一定时间，冷冻离心，上清液即为原材料的预处理酶液，预处理的酶液先过截留分子量为10万 Dal后过1万 Dal的膜，所得浓缩液加入适量激活剂、木质活性炭和活性白土脱色离心后，置于冰箱冷冻一定时间，加入混合有机溶剂进行除杂，经丙酮沉淀后获得活性在1300~1800 U/mg的超氧化物歧化酶产品。
所述植物鲜果或鲜叶原料预处理酶液的制备具体步骤如下：将鲜果或鲜叶洗干净，准确称取一定质量的原料，加入1.5~2倍体积的生理盐水、0.1倍的聚乙二醇保护剂和0.05倍的曲拉通溶膜剂，冷冻至有冰晶，然后用打浆机打浆，放入冰箱中1小时，冷冻离心，所得上清液即为预处理酶液。
所述膜过滤的具体操作步骤如下：将预处理酶液先用截留分子量为10万的膜过滤，透过液再经截留分子量为1万的膜过滤，浓缩至1/5时得到超氧化物歧化酶粗提液。
所述加入适量激活剂、木质活性炭和活性白土脱色的具体操作步骤如下：每100mL超氧化物歧化酶粗提液中加入2.5 g木质活性炭、1.25 g活性白土和适量激活剂，置于120 rpm/min的摇床上进行摇荡脱色。
所述除杂处理的具体操作步骤如下：将权利要求4所述脱色后的粗提液离心，加入粗提液体积1/3倍的混合有机溶剂，混合有机溶剂由乙醇：氯仿质量比为5:3混合而成，充分混匀，冷冻离心，将清液和氯仿分离，向得到的清液中加入其总体积0.6倍的丙酮，冷冻离心，除去杂蛋白。
所述丙酮沉淀的具体操作步骤如下：将权利要求5所述上清液放在冰箱中冷冻，然后加入其1.2倍体积的冷丙酮溶液，离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥，得粉末状超氧化物歧化酶产品。
本发明具有以下优点：
（1）加入保护剂、溶膜剂和激活剂，可延长SOD的半衰期、破膜及使SOD酶蛋白处于活性状态。
（2）采用膜过滤浓缩法获得SOD粗品，首先用10万膜过滤，去除了多糖和大分子量的蛋白质，为后续除杂减轻了压力。后经1万膜过滤，去除了单糖、小分子的有机酸和维生素C，有效避免了维生素C对微量连苯三酚测定SOD活性时的影响，同时SOD酶液大大浓缩，降低了溶剂的使用量，有效节约了经济成本。
（3）加入活性白土和木质活性炭，以除去色素，有助于SOD活性的提高。
(4) 该工艺去除了超氧化物歧化酶传统工艺中的热变处理过程。
附图说明
图1 本发明工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但它并不是对本发明的限定。
实施例1：
从神州草中提取超氧化物歧化酶，具体按下述步骤操作：
1、准确称取1000 g神州草，放入小桶中，然后加入2000 mL生理盐水，100 mL保护剂（千分之3浓度的聚乙二醇）和10 mL溶膜剂（曲拉通），用打浆机打浆，放入冰箱中冷冻至有冰晶。
2、将含有冰晶的神州草浆进行冷冻离心，将上清液约2100 mL放入冰箱中冷冻1小时后，先过截留分子量为十万的膜过滤设备，透过液进入截留分子量为一万的膜过滤设备，浓缩至200 mL用于SOD的提取。
3、神州草浓缩液200 mL中加入5g木质活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同时加入0.2 mL激活剂（饱和氯化铜溶液）放在120 rpm/min的摇床上振荡1小时进行脱色。
4、将激活脱色后的浆液离心，约180 mL清液加入混合有机溶剂55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混匀，冷冻1小时，离心，将清液和氯仿相分离。
5、向清液235 mL中加入150 mL的丙酮，冷冻1小时，离心，除去杂蛋白。
6、将上清液放在冰箱中冷冻20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分摇匀后冷冻1小时。
7、离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥得约0.12克SOD产品，检测其活性为1380 U/mg。
实施例2：
从野生猕猴桃中提取超氧化物歧化酶，具体按下述步骤操作：
1、准确称取1000 g野生猕猴桃果，放入小桶中，然后加入2000mL生理盐水，100 mL保护剂（千分之3浓度的聚乙二醇）和10 mL溶膜剂（曲拉通），用打浆机打浆，冷冻至有冰晶。放入冰箱中一小时。
2、将含有冰晶的野生猕猴桃果浆进行冷冻离心，将上清液约2600 mL放入冰箱中冷冻1小时后，先过截留分子量为十万的膜过滤设备，透过液进入截留分子量为一万的膜过滤设备，浓缩至200 mL用于SOD的提取。
3、野生猕猴桃果浓缩液200 mL中加入5g木质活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同时加入0.2 mL激活剂（饱和氯化铜溶液）放在120 rpm/min的摇床上振荡1小时进行脱色。
4、将激活脱色后的浆液离心，约180 mL清液加入混合有机溶剂55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混匀，冷冻1小时，离心，将清液和氯仿相分离。
5、向清液235 mL中加入150 mL的丙酮，冷冻1小时，离心，除去杂蛋白。
6、将上清液放在冰箱中冷冻20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分摇匀后冷冻1小时。
7、离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥得约0.25克SOD产品，检测其活性为1670 U/mg。
实施例3：
从沙棘果中提取超氧化物歧化酶，具体按下述步骤操作：
1、准确称取1000 g沙棘果，放入小桶中，然后加入2000mL生理盐水，100 mL保护剂（千分之3浓度的聚乙二醇）和10 mL溶膜剂（曲拉通），用打浆机打浆，冷冻至有冰晶。放入冰箱中一小时。
2、将含有冰晶的沙棘果浆进行冷冻离心，将上清液约2400 mL放入冰箱中冷冻1小时后，先过截留分子量为十万的膜过滤设备，透过液进入截留分子量为一万的膜过滤设备，浓缩至200 mL用于SOD的提取。
3、沙棘果浓缩液200 mL中加入5g木质活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同时加入0.2 mL激活剂（饱和氯化铜溶液）放在120 rpm/min的摇床上振荡1小时进行脱色。
4、将激活脱色后的浆液离心，约180 mL清液加入混合有机溶剂55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混匀，冷冻1小时，离心，将清液和氯仿相分离。
5、向235 mL清液中加入150 mL的丙酮，冷冻1小时，离心，除去杂蛋白。
6、将上清液放在冰箱中冷冻20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分摇匀后冷冻1小时。
7、离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥，得约0.11克SOD产品，检测其活性为1310 U/mg。

Claims (6)

1.一种植物超氧化物歧化酶提取方法，其特征在于按下述步骤操作：称取一定质量的植物鲜果或鲜叶，加入生理盐水冷冻后用打浆机打浆，加入保护剂和溶膜剂置于冰箱中一定时间，冷冻离心，上清液即为原材料的预处理酶液，先过截留分子量为10万 Dal后过1万Dal的膜，所得浓缩液加入适量激活剂、木质活性炭和活性白土脱色离心后，置于冰箱冷冻一定时间，加入混合有机溶剂进行除杂，经丙酮沉淀后获得活性在1300~1800 U/mg的超氧化物歧化酶产品。
2.根据权利要求1所述的一种植物超氧化物歧化酶提取方法，其特征在于所述植物鲜果或鲜叶原料预处理酶液的制备具体步骤如下：将鲜果或鲜叶洗干净，准确称取一定质量的原料，加入1.5~2倍体积的生理盐水、0.1倍的聚乙二醇保护剂和0.05倍的曲拉通溶膜剂，冷冻至有冰晶，然后用打浆机打浆，放入冰箱中1小时，冷冻离心，所得上清液即为预处理酶液。
3.根据权利要求1所述的一种植物超氧化物歧化酶提取方法，其特征在于所述膜过滤的具体操作步骤如下：将预处理酶液先用截留分子量为10万的膜过滤，透过液再经截留分子量为1万的膜过滤，浓缩至1/5时得到超氧化物歧化酶粗提液。
4.根据权利要求1所述的一种植物超氧化物歧化酶提取方法其特征在于所述加入适量激活剂、木质活性炭和活性白土脱色的具体操作步骤如下：每100 mL超氧化物歧化酶粗提液中加入2.5 g木质活性炭、1.25 g活性白土和适量激活剂，置于120 rpm/min的摇床上进行摇荡脱色。
5.根据权利要求1所述的一种植物超氧化物歧化酶提取方法，其特征在于所述除杂处理的具体操作步骤如下：将权利要求4所述脱色后的粗提液离心，加入粗提液体积1/3倍的混合有机溶剂，混合有机溶剂由乙醇：氯仿质量比为5:3混合而成，充分混匀，冷冻离心，将清液和氯仿分离，向得到的清液中加入其总体积0.6倍的丙酮，冷冻离心，除去杂蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种植物超氧化物歧化酶提取方法，其特征在于所述丙酮沉淀的具体操作步骤如下：将权利要求5所述上清液放在冰箱中冷冻，然后加入其1.2倍体积的冷丙酮溶液，离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥，得粉末状超氧化物歧化酶产品。
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