CN101306353A

CN101306353A - 一种肝素亲和柱及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101306353A
Application number: CN 200810018999
Authority: CN
Inventors: 张春妮; 王相栋; 汪俊军; 李克
Original assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Current assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Priority date: 2008-02-02
Filing date: 2008-02-02
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2028-02-02
Also published as: CN101306353B

Abstract

本发明公开了一种肝素亲和柱及其制备方法和应用。该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。该亲和柱制备方法简单，时间短，效率高。采用肝素末端醛基与胺化琼脂糖的胺基结合，可使肝素的活性不受影响，保证了亲和柱有较高的亲和力；肝素偶联稳定，可多次反复使用；本方法所用试剂成本低、无环境污染，为普通实验室大规模分离、纯化与肝素有特异结合能力的物质奠定了基础，可促进国内相关领域的研究。

Description

一种肝素亲和柱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种肝素亲和柱及其制备方法和应用。

技术背景

肝素是一类糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物；可以作为亲和色谱与离子交换色谱的有效配体。其可以亲和许多生物分子，包括凝血因子和其它血浆蛋白如：脂蛋白、蛋白合成因子、核酸酶以及固醇类激素受体。2-O-硫酸-α-L艾杜糖醛酸及6-O-硫酸-N-硫酸-α-D葡萄糖胺是其中的主要单糖，由它们组成的三硫酸二糖的重复单位构成了肝素的所谓“规则区”，是肝素结构的主要部分，另外的单糖残基以很低的频率出现于“非规则区”。成品肝素中，只有三分之一的肝素分子能与A T III结合，这些结合的部分具有抗凝活性，而其余部分则活性很低。研究发现，肝素加速抗凝血酶-丝氨酸蛋白酶反应依赖于一个独特的五糖序列。

肝素亲和柱目前主要由国外Pharmacia公司生产，技术一直没有公布。国内外也有文献报道过多种肝素亲和柱的制备方法。最经典的是用溴化氰活化琼脂糖后连上肝素(如Phamacia公司的heparin sepharose CL 6B产品)，但此方法因溴化氰有剧毒而不宜在实验室中进行，并且形成的化学键易断裂，肝素的活性受偶联的影响也比较大。国内有人将琼脂糖环氧化后直接连接肝素，并用之成功分离纯化了肝生长因子，但这种偶联方式的产品在醇类溶液中不稳定。用还原胺化的方法将肝素偶联上琼脂糖类介质是比较理想的一种方法，原因是还原胺化法偶联的是肝素的末端醛基与胺化琼脂糖上的胺基，不影响肝素的活性中心，从而可以保证所得产品具有较高的亲和性能。国外早在1983年就有人用3种方法将肝素联上琼脂糖进行对比，3种方法中以还原胺化法消耗的肝素量最少，但亲和能力最高；然而当时的方法也有一定的缺陷，就是还原剂氰基硼氢化钠的反应产物有剧毒，对环境有污染以及反应周期长达16天等。国内近期也有人采用不同的方法法制备了肝素琼脂糖凝胶6FF亲和柱(非间接还原胺化)，成功分离纯化了抗凝血酶III(Antithrombin III，AT III)。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、效果好的肝素亲和柱。

本发明的另一个目的是提供上述肝素亲和柱的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述肝素亲和柱的应用。

本发明采用琼脂糖凝胶6FF介质(国产)作为固相载体，经过环氧化与胺化后与肝素相偶联制备亲和层析柱，降低亲和柱的制备成本，简化制备方法，用普通试剂代替传统制备过程使用的剧毒试剂，与此同时保证亲和柱的稳定性与亲和能力。

本发明的技术方案如下：

一种肝素亲和柱，该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。

所述的肝素亲和柱，该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：

a.琼脂糖凝胶6FF首先用环氧氯丙烷进行活化，即在水中分别以终浓度为20～30％(v/v)的琼脂糖凝胶6FF、5～10％(v/v)的环氧氯丙烷、0.3～0.5mol/L的NaOH进行混合，37℃反应1-2h，得到环氧化琼脂糖凝胶6FF；

b.取20g环氧化琼脂糖凝胶6FF加1～2倍体积浓氨水(通常为25％-28％)37℃反应1-2h，获得胺化琼脂糖凝胶6FF；

c.胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素钠混合物在甲醇中预处理：按1g胺化琼脂糖凝胶6FF中加入30～50mg肝素钠与1～2ml甲醇混合，在氮气环境下室温振摇36-52h，形成醛亚胺；

d.按1g胺化琼脂糖凝胶6FF加20～30mg硼氢化钠比例，将硼氢化钠加入醛亚胺，对醛亚胺还原，得到肝素琼脂糖凝胶6FF。

所述肝素亲和柱的制备方法，该方法包括下列步骤：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。

所述的肝素亲和柱的制备方法，该方法为：

b.取20g环氧化琼脂糖凝胶6FF加1～2倍体积浓氨水37℃反应1-2h，获得胺化琼脂糖凝胶6FF；

所述肝素亲和柱在分离纯化与肝素有特异结合能力的物质中的应用。

所述的应用，其中与肝素有特异结合能力的物质为载脂蛋白H(Apolipoprotein H，Apo H)、抗凝血酶III(Antithrombin III)、肝生长因子等，还用于重组产品的纯化如人碱性成纤维细胞生长因子、蛇毒类凝血酶安克洛等。

对于未结合的胺基可进行乙酰化修饰：按1g粗制肝素亲和柱加入1ml 0.2mol/L醋酸钠、0.5ml醋酸酐的比例混合，冰浴30分钟后，再加入0.5ml醋酸酐室温放置另一个30分钟，然后交替用水、0.1mol/LNaOH和水进行清洗，最后用含20％(体积/体积)乙醇的0.05mol/L的醋酸钠溶液乙醇的或含0.01％(质量/体积)硫柳汞的0.15mol/LNaCl溶液保存在4℃进行保存。

肝素琼脂糖凝胶6FF亲和柱的使用方法：

将制备好的亲和柱从4℃中取出，室温平衡后使用。

(1).上样：放掉柱内溶液，用上样缓冲液(0.02mol/L Tris-HCl)淋洗柱子进行平衡，将提取的样品用上样缓冲液溶解并充分透析，上样；

(2).针对不同的样品分别用含有不同浓度NaCl的上样缓冲液进行洗脱；

(3).用含有1.0-2.0mol/L NaCl的上样缓冲液淋洗进行再生，也可以用0.1-0.5mol/LNaOH进行清洗；

(4).用含20％乙醇的0.05mol/L的醋酸钠溶液保存或含0.01％硫柳汞的0.15mol/LNaCl溶液置换柱内液体，4℃进行保存，以待重复使用。

本发明有益效果：

本发明采用琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，与肝素相偶联制备可重复使用的肝素亲和柱，用于载脂蛋白质H等的分离纯化，解决了传统溴化氰法制备的毒性产物问题。采用肝素末端醛基与胺化琼脂糖的胺基结合，可使肝素的活性不受影响，保证了亲和柱有较高的亲和力；肝素偶联稳定，可多次反复使用；本发明所用试剂成本低、无环境污染，方法便捷，时间短，效率高，为普通实验室大规模分离纯化与肝素有特异结合能力的物质奠定了基础，可促进国内相关领域的研究。

亲和柱性能的评价：包括肝素结合量的测定、柱容量的测定、柱空白的测定、重复性与稳定性评价。

1、肝素结合量的测定：采用电位滴定法进行测定。首先制作肝素的标准曲线，分别配制含有3.91、5.33、7.83、9.65、10.65、14.43、15.65、21.30、31.30、42.60mg肝素钠的0.1mol/L KCl溶液各10ml，用浓盐酸(36-38％)将它们的pH调到2.50±0.01，然后用0.5mol/L KOH进行滴定，记录到终点时消耗的KOH量，并制作标准曲线。肝素琼脂糖凝胶6FF(在真空度约为-30千帕时进行抽干，下同)亲和柱与琼脂糖凝胶6FF预先用0.1mol/L KCl置换溶液。同法测定0.1mol/L KCl溶液中加入1.10、2.77、3.64、3.39、5.21、5.79、5.98、6.92、10.45g肝素琼脂糖凝胶6FF抽干胶后滴定消耗的KOH量；以0.1mol/L KCl溶液中加入3.5、5.0、7.0、8.0、11.0g琼脂糖凝胶6FF抽干胶时消耗的KOH量作为空白对照。测定原理是：A＝A_heparin+A_solution+A_Sepharose。(A为达到滴定终点时所要消耗的KOH量，A_heparin、A_solution、A_Sepharose分别为肝素、KCl溶液、琼脂糖凝胶6FF达滴定终点时所要消耗的KOH量)

肝素结合量的计算：见图2。以肝素亲和柱消耗掉的KOH量，利用回归方程求出对应的肝素含量，平均值即为制备的肝素亲和柱的肝素结合量，约为4mg/g抽干胶。

2、柱容量的测定：将不同剂量的载脂蛋白H溶液(0.5、1、1.5、2、2.5ml，浓度为1mg/ml)上0.2ml体积肝素亲和柱亲和，经平衡、洗脱后分别收集平衡峰与洗脱峰。将平衡峰上另一个肝素亲和柱亲和，检查亲和柱的饱和情况。

结果表明：在1mg/ml的载脂蛋白H溶液浓度下，1.5ml/ml介质为肝素亲和柱亲和柱的饱和点，超过此量，亲和就不完全。

3、重复性与稳定性评价：制备的亲和柱在防菌和用含1.0-2.0mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl或0.1-0.5mol/L NaOH的再生处理情况下，在使用中发现半年、30次以上柱容量未明显下降。亲和柱放于70％乙醇中1月以上，测定其肝素结合量未下降，说明其在较高浓度的醇溶液中是比较稳定的。

附图说明

图1：肝素琼脂糖凝胶6FF的合成线路。

图2：肝素琼脂糖凝胶6FF中肝素结合量的电位滴定结果。

肝素标准(◆)，琼脂糖结合肝素(○)，空白琼脂糖凝胶6FF(■)，以及0.1mol/L KCl溶液(▲)分别用不同的符号表示。下横座标表示肝素标准的浓度，上横座标表示肝素亲和柱或空白琼脂糖凝胶6FF的加入量，纵座标表示达到滴定终点时KOH的消耗量。所有测量物均以0.1mol/L KCl作为溶剂，终体积为10ml，在室温下测量。

图3：肝素琼脂糖凝胶6FF对载脂蛋白H的亲和层析图谱。

图4：SDS-PAGE结果(实施例1)。泳道1为Marker，泳道2为粗制品，泳道3为肝素琼脂糖凝胶6FF提纯之后的产品。

图5：Western-blotting结果。

图6：SDS-PAGE结果(实施例2)。

图7：SDS-PAGE结果(实施例3)。

具体实施方案：

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

所需试剂：DEAE-纤维素-52，琼脂糖凝胶6FF，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，肝素钠，蛋白Marker，考马斯亮兰R250，硼氢化钠，兔抗人载脂蛋白H多克隆抗体，HClO₄(72％-74％)，(NH4)₂SO₄，TPB(0.039mol/LTris-0.005mol/L H3PO4，pH8.6)，0.02mol/L Tris-HCl等其它相关试剂。

亲和柱的制备：

取抽干琼脂糖凝胶6FF 20g加环氧氯丙烷3ml，2mol/LNaOH 13ml，蒸馏水30ml混合，37℃摇床2h，得到环氧化琼脂糖凝胶6FF；

用蒸馏水清洗得到的环氧化琼脂糖凝胶6FF，抽干后称重，得胶约18.5g。

取18g环氧化琼脂糖凝胶6FF加入27ml浓氨水37℃反应2h，获得胺化琼脂糖凝胶6FF；

用蒸馏水清洗胺化琼脂糖凝胶6FF，抽干后称重，得胶17.1g。与肝素钠混合先在甲醇中预处理，按1g胺化琼脂糖凝胶6FF中加入30mg肝素钠与1.5ml甲醇混合，在氮气环境下室温振摇48h，形成混合体系；

按1g胺化琼脂糖凝胶6FF加25mg硼氢化钠比例，将硼氢化钠直接加入上面的混合体系中进行还原，反应4小时，得到粗制肝素琼脂糖凝胶6FF。用清水进行清洗，然后对未结合的胺基进行乙酰化修饰：按1g胶加入1ml 0.2mol/L醋酸钠、0.5ml醋酸酐的比例混合，冰浴30分钟后，再加入0.5ml醋酸酐室温放置另一个30分钟，然后交替用水、0.1mol/L NaOH和水进行清洗，抽干后称重，得成品肝素琼脂糖凝胶6FF约16.3g。最后用含20％乙醇的0.05mol/L的醋酸钠溶液在4℃进行保存。

肝素亲和柱用于对载脂蛋白H的纯化：

载脂蛋白H粗提品的制备：150mL人混合血清加入3.75mL 70％HClO₄(体积/体积)，1000g离心15分钟，弃去沉淀。收集上清并用4mol/LNaOH调pH至中性(pH7.0-7.2)后，加入380g/L(NH₄)₂SO₄，过夜，离心收集沉淀。将沉淀以最小体积TPB(0.039mol/L Tris-0.005mol/L H₃PO₄，pH 8.6)缓冲液溶解，并对TPB缓冲液透析后，上预先用TPB平衡的DEAE-纤维素-52离子交换柱(1.7cm×32cm)，深凹面梯度洗脱，收集第二峰OD＞0.1的各管合并，再用终浓度为0.2mol/L HClO₄4℃处理2小时，然后离心弃去沉淀，对TPB缓冲液透析以除去HClO₄。

用亲和柱进一步纯化：制备好的亲和柱从冰箱中取出与室温平衡后使用。粗提样品经过0.02mol/L Tris-HCl透析，上预先用0.02mol/L Tris-HCl平衡的自制肝素亲和柱，先用平衡液洗柱，再用0.15mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl洗柱，最后用0.35mol/LNaCl-0.02mol/L Tris-HCl洗脱并收集。

纯化载脂蛋白H的鉴定：用SDS-PAGE、Western-blotting、氨基酸组成分析分别对纯化样品的性质与纯度进行鉴定。具体方法如下：

SDS-PAGE与Western-blotting法鉴定：配制12％分离胶与3％浓缩胶，装板，样品与Marker同时上样，100V稳压。同时跑两块胶，其中一块电泳完后行考马斯亮兰R250染色，用来鉴定蛋白质纯度和测定分子量。另一块转膜，用0.45μm NC膜，100mA恒流150分钟。固定液配方：含5％磺基水杨酸、10％三氯醋酸、0.15mol/L的Tris以及0.12mol/L的甘氨酸。封闭液配方：2g脱脂奶粉用20ml马来酸钠溶液(0.1mol/L马来酸钠-0.15mol/LNaCl，PH7.5)煮沸溶解，再加入180ml PBS(0.01mol/L)与200μl NP-40。

氨基酸组成分析：一定量载脂蛋白H置水解管中，用终浓度6mol/L的HCl 110℃水解24小时，经异硫氰酸苯酯(PITC)衍生后，以高效液相色谱仪分析。流动相：A液为三水醋酸钠，B液为水、乙醇、甲醇。

鉴定结果：Western-blotting结果说明提纯物质为载脂蛋白H，SDS-PAGE与氨基酸组成分析结果说明用制备的肝素亲和柱提纯的载脂蛋白H具有很高的纯度。最终获得的纯化载脂蛋白H总蛋白量约4mg。

表1：提纯的载脂蛋白H的氨基酸组成分析结果

实施例2

亲和柱的制备：方法同于实施例1，用30g琼脂糖凝胶6FF制备，最终得到肝素琼脂糖凝胶6FF 26.3g在4℃保存于含0.01％硫柳汞的0.15mol/L NaCl溶液。

肝素亲和柱用于对载脂蛋白H的纯化：

载脂蛋白H粗提品的制备：200mL人混合血清加入5.0mL 70％HClO₄(体积/体积)，4℃搅拌15分钟，性状由稀到稠再到稀，1000g离心15分钟，弃去沉淀。收集上清并用4mol/LNaOH调pH至中性(pH 7.0-7.2)后，加入380g/L(NH₄)₂SO₄，过夜，离心收集沉淀。将沉淀以最小体积TPB(0.039mol/L Tris-0.005mol/L H₃PO₄，pH8.6)缓冲液溶解，并对TPB缓冲液透析后，上预先用TPB平衡的DEAE-纤维素-52离子交换柱(1.7cm×32cm)，深凹面梯度洗脱，收集第二峰OD＞0.1的各管合并，再用终浓度为0.2mol/L HClO₄4℃处理10小时，然后离心弃去沉淀，对TPB缓冲液透析以除去HClO₄。

用亲和柱进一步纯化：制备好的亲和柱从冰箱中取出在室温平衡后使用。粗提样品经过0.02mol/L Tris-HCl透析，上预先用0.02mol/L Tris-HCl平衡的肝素亲和柱，先用平衡液洗柱，再用0.15mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl洗柱，最后用0.35mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl洗脱并收集。

纯化载脂蛋白H的鉴定：用SDS-PAGE、Western-blotting、氨基酸组成分析分别对纯化样品的性质与纯度进行鉴定。具体方法鉴定方法同于实施例1。

鉴定结果：最终获得的纯化载脂蛋白H总蛋白量约5.1mg。

实施例3：

亲和柱为实施例2所用亲和柱活化再生后使用，再生方法为先用含有1.5mol/LNaCl的0.02mol/L Tris-HCl淋洗，再用0.1mol/L NaOH进行清洗；

肝素亲和柱用于对载脂蛋白H的纯化：

载脂蛋白H粗提品的制备：175mL人混合血清加入4.375mL 70％HClO₄(v/v)，4℃搅拌15分钟，性状由稀到稠再到稀，约1500g离心15分钟，弃去沉淀。收集上清并用4mol/L NaOH调pH至中性(pH7.0-7.2)后，加入380g/L(NH₄)₂SO₄，过夜，离心收集沉淀。将沉淀以最小体积TPB(0.039mol/L Tris-0.005mol/L H₃PO₄，pH8.6)缓冲液溶解，并对TPB缓冲液透析后，上预先用TPB平衡的DEAE-纤维素-52离子交换柱(1.7cm×32cm)，深凹面梯度洗脱，收集第二峰OD＞0.1的各管合并，再用终浓度为0.2mol/L HClO₄4℃处理10小时，然后离心弃去沉淀，对TPB缓冲液透析以除去HClO₄。

用亲和柱进一步纯化：制备好的亲和柱从冰箱中取出与室温平衡后使用。粗提样品经过0.02mol/L Tris-HCl透析，上预先用0.02mol/L Tris-HCl平衡的肝素亲和柱，先用平衡液洗柱，再用0.15mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl洗柱，最后用0.35mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl洗脱并收集。

鉴定结果：最终获得的纯化载脂蛋白H总蛋白量4.2mg。说明按实施例1中的方法再生的亲和柱可以重复使用)。

Claims

1、一种肝素亲和柱，其特征在于该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。

2、根据权利要求1所述的肝素亲和柱，其特征在于该肝素亲和柱是通过下列方法制备得到的：

3、权利要求1所述肝素亲和柱的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：琼脂糖凝胶6FF作为固相载体，载体先进行活化，偶联上环氧基团后，再进行胺化偶联上胺基，胺化琼脂糖凝胶6FF与肝素在甲醇中形成中间产物醛亚胺，再进一步还原胺化形成稳定化学键即得肝素琼脂糖凝胶6FF。

4、根据权利要求3所述的肝素亲和柱的制备方法，其特征在于该方法为：

5、权利要求1所述肝素亲和柱在分离纯化与肝素有特异结合能力的物质中的应用。

6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于与肝素有特异结合能力的物质为载脂蛋白H(Apolipoprotein H，Apo H)、抗凝血酶III(Antithrombin III)、肝生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或蛇毒类凝血酶安克洛。