CN108559740A - 重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用 - Google Patents

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Abstract

涉及重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用。具体地，该重组安克洛酶具有说明书所示氨基酸序列单链，该安克洛酶是平均分子量39～41KDa、分子量范围33～52KDa、修饰糖含量>19％的糖蛋白。还涉及该重组安克洛酶的制备方法，细胞培养方法以及纯化方法和其治疗急性脑梗的应用。本发明重组安克洛酶呈现与天然安克洛酶显著更优异的性能。本发明方法能够以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg。本发明重组安克洛酶具有更复杂和更完整的糖基化水平，稳定性显著增强，解决了安克洛酶表达量低、产业化困难的问题。

Description

重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用
技术领域
本发明涉及一种重组安克洛酶、其制备方法及应用。更具体地，本发明涉及采用基因工程技术，利用哺乳动物CHO细胞培养生产方法制备重组蛋白，接着通过纯化工艺，可以容易的以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg。本发明获得的重组安克洛酶具有更复杂和更完整的糖基化水平，稳定性显著增强，解决了现有该类产品表达量低、产业化困难的问题，本发明还涉及重组安克洛酶在治疗急性脑梗中的应用。
背景技术
安克洛酶(Ancrod)特指从马来西亚红口蝮蛇(Malayan pit viper，Calloselasmarhodostoma)蛇毒中分离纯化出的类凝血酶，为丝氨酸蛋白水解酶。能够水解哺乳动物的血浆纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，从而影响动物的出血凝血过程。蛇毒类凝血酶特异性作用底物是纤维蛋白原，与凝血酶不同的是，它只切割纤维蛋白原的α链，而不作用于β链。当它水解血浆纤维蛋白原α链中的Arg16-GLy位键时，能够释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，由于蛇毒类凝血酶不激活凝血因子ⅩⅢ，这些生成的纤维蛋白单体不交联形成坚固的纤维蛋白网状结构，易于被体内的纤维蛋白水解酶所水解，因此可以抑制血栓形成，具有降低血粘度、抑制红细胞凝集、沉降、增强红细胞的血管通过性及变形能力、降低血管阻力以及改善微循环等作用。使溶栓作用快速，缺血部位功能恢复，从而达到治疗和防止复发的效果。
蛇毒类凝血酶制剂上市的品种有：来源于马来西亚红口蝮蛇蛇毒的安克洛酶(Ancrod，Viprinex，Arwin)；来源于巴西矛头蝮蛇(Bothrops moojeni)蛇毒的巴曲酶(Batroxobin)；来源于尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的降纤酶(Defibrase)。1985年至2000年，我国有不同蛇毒来源的含有蛇毒类凝血酶的多组分制剂流通，大多数称为蝮蛇抗栓酶。从1997年起，国产降纤酶替代了蝮蛇抗栓酶。
天然的蛇毒类凝血酶均为糖蛋白，糖基化水平的高低与比活性成正相关，与活性稳定性成正相关。
由于蝮蛇已经列入属国家二级濒危保护动物，天然蛇毒的资源极其有限，因此采用基因工程技术表达蛇毒类凝血酶具有现实意义。日本学者最早于1987年(J.Biol.Chem.262:3132-3135)将巴曲酶基因在大肠杆菌中表达成功，中国学者李招发等(中国专利授权公告号CN100564532C)在酵母菌中表达出生物活性高的巴曲酶蛋白，产量达到每毫升发酵液14巴曲酶单位(14BU/ml)，比活性为1400BU/mg。
天然安克洛酶的氨基酸序列早在1992年由美国学者William Burkhart等(William Burkhart,et al,Amino acid sequence determination of Ancrod,thethrombin-likeα-fibrinogenase from the venom of Akistrodon rhodostoma，Federation of European Biochemical Societies，1992，Vol 297(3):297-301)在其研究论文中进行了详细报道，其是一种含有234个氨基酸的糖蛋白。该蛋白的234个氨基酸序列已记载在该William Burkhart的文献中，并且已收录在本领域公知的全球蛋白质资源库http://www.uniprot.org中，具体参见该库网址http://www.uniprot.org/uniprot/P26324所记载的信息。这种234个氨基酸组成的天然来源的安克洛酶Ancrod是从Akistrodon rhodostoma蛇毒中纯化得到的，由于众所周知的原因，例如蛇的生长环境、蛇龄、采毒季节等与蛇毒原材料变异有关的因素以及蛇毒中杂质等的影响和原材料产量的限制，对于以稳定的规模来工业化生产这种天然的安克洛酶以使其以安全、有效、可控的药剂顺利应用于临床是极端困难的。
因此，本领域仍然期待有制备安克洛酶的方法，特别是以工业生产规模稳定的获得高表达量的安克洛酶特别是重组安克洛酶的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种重组安克洛酶、制备方法及其应用，特别是提供一种以工业生产规模稳定的获得高表达量的重组安克洛酶的方法。该重组蛋白具有更复杂和更完整的糖基化水平，解决了现有该类产品表达量低产业化难的问题。本发明另一目的还在于提供一种重组安克洛酶在治疗急性脑梗中的应用。本发明的重组安克洛酶具有较强的体外活性和较高的稳定性。
本发明的第一方面，提供了一种重组安克洛酶，该重组安克洛酶是由N-末端和C-末端氨基酸残基分别为缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的234个氨基酸残基组成的一条具有如下序列的单链：
根据本发明第一方面的重组安克洛酶，其是一种平均分子量为39～41KDa的糖蛋白，包含的5个N-Link糖基化结合位点分别位于Asn23-Trp24-Thr25，Asn79-Lys80-Thr81，Asn99-Asn100-Ser101，Asn148-Phe149-Thr150和Asn229-Ala230-Thr231处的天冬酰胺残基上，且该糖蛋白的等电点为4.5-5.5。
根据本发明第一方面的重组安克洛酶，其是一种分子量分布范围为33～52KDa的糖蛋白。
根据本发明第一方面的重组安克洛酶，其是一种修饰糖含量为19～49％的糖蛋白。经细致分析测定，已经知晓连接于糖基化位点上的修饰糖包括半乳糖、海藻糖、唾液酸等数种，它们在氨基酸链上的结合方式显示呈多层天线状结构。
需要说明的是，由234个氨基酸残基组成的安克洛酶单链的分子量为26570Da；本发明方法制备得到的重组安克洛酶糖蛋白，经液相色谱-质谱法(LC-MS)测定，其平均分子量为39～41kDa，分子量分布范围为33～52kDa(分布跨度达17kDa以上)。另外，本发明人参照William Burkhart文献Fig.1之A之lane 3所示天然安克洛酶糖蛋白的获取方法，采用马来西亚红口蝮蛇蛇毒为原料，获得天然糖基化蛋白即天然安克洛酶，经用本发明LC-MS法测定/计算，其平均分子量为37.5～38kDa，分子量分布范围为32～41kDa(分布跨度约9kDa)；该LC-MS测定结果与William Burkhart文献所示结果有差异的原因在于采用的检测方法不同，文献方法是一种在当时技术条件下所能达到的相对准确的结果。由此，本发明制备得到的重组安克洛酶糖蛋白的234个氨基酸残基组成的安克洛酶单链与天然安克洛酶的氨基酸残基单链相同，但是由于其上连接的糖基化修饰糖不同(可能是接入糖的量以及接入的结构/方式不同造成)，本发明重组蛋白比之于天然蛋白具有更复杂和更完整的糖基化水平，能够呈现显著增强的稳定性以及生物学活性，因此本质上讲本发明所得重组安克洛酶完全区别于天然安克洛酶。安克洛酶糖基化的复杂性和完整性能够在糖蛋白的分子量及分布上反映出来：分子量越大，则糖基化程度越高、糖基化分支及侧链的复杂程度亦越高，相应的糖蛋白稳定性和生物学活性亦更高；而更高稳定性的糖蛋白使得以高产量、高表达量的工业规模和水平制备糖蛋白成为可能。在本发明中，如未特别说明，涉及的分子量及与此相关的参数例如分子量分布范围、平均分子量等，是通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定并计算得到的或者说是质谱法测定并计算得到的。
进一步的，本发明第二方面提供了一种制备重组安克洛酶的方法，该方法包括如下步骤：
(1)构建编码重组安克洛酶的基因表达载体和重组质粒：
构建用于在哺乳动物细胞中分泌性表达重组蛋白质的载体(例如ATK-V03-aSP载体，这种基因表达载体的构建方法是常规的、亦是本领域技术人员知晓的，亦可通过商业途径获得；在本发明一个实施方案中，其是通过商业途径构建获得的ATK-V03-aSP载体，在本发明一个实例中，是由AutekBio构建的；在一个实施方案中，该ATK-V03-aSP载体含有一个CMV启动子、一个BGH pA加尾信号及用于在真核细胞中筛选稳定表达细胞的Neo筛选标记基因；在一个实施方案中，该ATK-V03-aSP载体还含有来源于质粒pMB1的复制起始位点及氨苄青霉素抗性基因，能够在大肠杆菌中筛选和复制)，并据此构建安克洛酶重组质粒(例如ATK-V03-aSP-Ancrod，例如通过商业途径构建)；
(2)重组安克洛酶在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：
将含有安克洛酶蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株；
(3)细胞培养生产重组安克洛酶：
将筛选到的稳定细胞株转入反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到最大时，收获培养物。
通常而言，本步骤中，采用无血清培养基(SFM)悬浮培养的CHO(ATK-CHO-SX)作为宿主细胞，培养条件为37℃、5％CO2、120rpm(在本发明中，此条件下，每2-3天传代培养时，细胞倍增时间(PDT)约17小时；批次培养时最高活细胞密度可达1×107个细胞/mL)；
(4)重组安克洛酶的纯化：
(41)上层析柱前预处理：将上一步骤所得含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液，接着进行超滤浓缩，截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8～1/10；
(42)亲和层析柱：采用亲和层析柱进行纯化(例如，本发明一个实施方中，采用Heparin Sepharose Fast Flow，GE)纯化，使用盐浓度0.1～0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HCl pH7.0～7.5缓冲液的洗脱条件，洗脱并收集活性组分；
(43)反相液相色谱纯化：采用制备型反相液相色谱技术，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质；
(44)亲和柱层析：将上一步骤收集的重组蛋白采用亲和层析柱((例如，本发明一个实施方中，采用Heparin Sepharose Fast Flow，GE)纯化，去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(43)中，使用C4制备型色谱柱，采用下表所示梯度洗脱：
时间/min A B
0～50 90→30 10→70
50～60 30 70
61.～71 90 10
其中流动相A为pH2.3的磷酸水溶液，流动相B为乙醇，检测波长为214nm，洗脱流速为20mL/min。在一个实施方案中，所述流动相A和流动相B中还均额外添加1％丙二醇。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(44)中的亲和柱层析与步骤(42)操作条件相同。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(1)中，构建编码重组安克洛酶的基因表达载体的步骤还包括：化学合成法完成安克洛酶糖蛋白的DNA编码序列，用T4DNA连接酶将此合成的DNA编码序列连接入ATK-V03-aSP载体，得到基因重组表达质粒ATK-V03-aSP-Ancrod，通过DNA测序进行验证重组质粒中插入序列的正确性。
根据本发明第二方面的方法，其中所述的哺乳动物细胞表达载体为ATK-V03-aSP。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)中所述转染的方法为细胞的电穿孔转染方法(electroporation)。
根据本发明第二方面的方法，其中所述的哺乳动物宿主细胞选自：CHO(ChineseHamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293、BHK、NS0和Sp2/0细胞。优选的是CHO细胞；更优选，已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞(DHFR-CHO)。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)中，所述无血清培养基(SFM)的组成为：葡萄糖0.6％、谷氨酰胺2mM、3mM的NaHCO3、5mM的Hepes、胰岛素2.5μg/ml、转铁蛋白100ng/ml、丁二胺60μM、硒酸钠30nM、青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、DF12加至100ml。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)中细胞培养生产重组安克洛酶的步骤为：将前面筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，特别是，通过对细胞培养条件的优化，获得高表达重组安克洛酶的细胞培养液。本发明的细胞培养方法可实现高密度细胞培养、质量和产量提升以及重组蛋白的糖基化复杂程度提高。在一个实施方案中，所述细胞培养条件的优化包括降温培养法，具体来说，当细胞密度达到1×107个/mL的最大密度时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加(在细胞密度达到最大化的1×107个/mL时，在37℃条件下继续培养无助于产量的继续增加；但是，已经发现，在达到此最大密度情况下，将培养温度37℃降至33℃，能够继续增加产量直至细胞密度增加约1.8倍的水平到约2.8×107个/mL以上)。该方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。因此，在本发明的一个实施方案中，步骤(3)中当培养至细胞密度达到最大时，使培养温度由37℃降至33℃，继续培养直至细胞密度不再增加。
在另外的一个实施方案中，所述细胞培养条件的优化方法还包括在基础培养基即无血清培养基中增补加入特殊的添加剂，优选，在无血清培养基中还加入氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)2mM、焦磷酸钾50μM。该方法可使重组安克洛酶的糖基化程度显著增加，糖基化分支及侧链等复杂程度明显增加。因此，在本发明的一个实施方案中，步骤(3)中所用的无血清培养基中增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖2mM、焦磷酸钾50μM。本发明在方法学考察试验中发现，当向无血清培养基中，增补上述三者任意之一或者任意之二或者三者全部不增补时，无法有效的增加重组安克洛酶的糖基化程度和复杂程度，唯有上述三者以上述量同时增加时，才能有效的增加重组安克洛酶的糖基化程度和复杂程度，进而提高糖蛋白的性能。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)的方法为：将筛选到的稳定细胞株转入反应罐，用增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)2mM、焦磷酸钾50μM的无血清培养基，在培养条件37℃、5％CO2、120rpm条件下培养至细胞密度不再增加，接着使培养温度由37℃降至33℃后继续培养至细胞密度不再增加后，收获培养物。
本发明方法中步骤(4)中，本发明重组安克洛酶的纯化制备步骤中，本发明采用特定的层析法纯化制备得到重组安克洛酶，该层析方法工艺简单，易于放大生产，条件温和，所得到的重组安克洛酶纯度达到98.5％以上，稳定性好，活性高。
进一步的，本发明第三方面提供了本发明重组安克洛酶在治疗急性脑梗塞性疾病中的应用。例如用于急性脑梗死和改善各种闭塞性血管病。
进一步的，本发明第四方面提供了一种生产重组安克洛酶时进行细胞培养的方法，该方法包括如下步骤：
将筛选到的稳定细胞株转入反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到最大时，收获培养物。通常而言，本步骤中，采用无血清培养基(SFM)悬浮培养的CHO(ATK-CHO-SX)作为宿主细胞，培养条件为37℃、5％CO2、120rpm(在本发明中，此条件下，每2-3天传代培养时，细胞倍增时间(PDT)约17小时；批次培养时最高活细胞密度可达1×107个细胞/mL)；
根据本发明第四方面的方法，其中所述无血清培养基(SFM)的组成为：葡萄糖0.6％、谷氨酰胺2mM、3mM的NaHCO3、5mM的Hepes、胰岛素2.5μg/ml、转铁蛋白100ng/ml、丁二胺60μM、硒酸钠30nM、青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、DF12加至100ml。
根据本发明第四方面的方法，其步骤为：将前面筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，特别是，通过对细胞培养条件的优化，获得高表达重组安克洛酶的细胞培养液。本发明的细胞培养方法可实现高密度细胞培养、质量和产量提升以及重组蛋白的糖基化复杂程度提高。在一个实施方案中，所述细胞培养条件的优化包括降温培养法，具体来说，当细胞密度达到1×107个/mL的最大密度时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加(在细胞密度达到最大化的1×107个/mL时，在37℃条件下继续培养无助于产量的继续增加；但是，已经发现，在达到此最大密度情况下，将培养温度37℃降至33℃，能够继续增加产量直至细胞密度增加约1.8倍的水平到约2.8×107个/mL以上)。该方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。因此，在本发明的一个实施方案中，步骤(3)中当培养至细胞密度达到最大时，使培养温度由37℃降至33℃，继续培养直至细胞密度不再增加。
根据本发明第四方面的方法，其中所述细胞培养条件的优化方法还包括在基础培养基即无血清培养基中增补加入特殊的添加剂，优选，在无血清培养基中还加入氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)2mM、焦磷酸钾50μM。该方法可使重组安克洛酶的糖基化程度显著增加，糖基化分支及侧链等复杂程度明显增加。因此，在本发明的一个实施方案中，步骤(3)中所用的无血清培养基中增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖2mM、焦磷酸钾50μM。本发明在方法学考察试验中发现，当向无血清培养基中，增补上述三者任意之一或者任意之二或者三者全部不增补时，无法有效的增加重组安克洛酶的糖基化程度和复杂程度，唯有上述三者以上述量同时增加时，才能有效的增加重组安克洛酶的糖基化程度和复杂程度，进而提高糖蛋白的性能。
根据本发明第四方面的方法，其步骤为：将筛选到的稳定细胞株转入反应罐，用增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)2mM、焦磷酸钾50μM的无血清培养基，在培养条件37℃、5％CO2、120rpm条件下培养至细胞密度不再增加，接着使培养温度由37℃降至33℃后继续培养至细胞密度不再增加后，收获培养物。
进一步的，本发明第五方面提供了一种对重组安克洛酶进行纯化的方法，该方法包括如下步骤：
(41)上层析柱前预处理：将上一步骤所得含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液，接着进行超滤浓缩，截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8～1/10；
(42)亲和层析柱：采用亲和层析柱进行纯化(例如，本发明一个实施方中，采用Heparin Sepharose Fast Flow，GE)纯化，使用盐浓度0.1～0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HCl pH7.0～7.5缓冲液的洗脱条件，洗脱并收集活性组分；
(43)反相液相色谱纯化：采用制备型反相液相色谱技术，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质；
(44)亲和柱层析：将上一步骤收集的重组蛋白采用亲和层析柱((例如，本发明一个实施方中，采用Heparin Sepharose Fast Flow，GE)纯化，去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩。
根据本发明第五方面的方法，其中步骤(43)中，使用C4制备型色谱柱，采用下表所示梯度洗脱：
时间/min A B
0～50 90→30 10→70
50～60 30 70
61.～71 90 10
其中流动相A为pH2.3的磷酸水溶液，流动相B为乙醇，检测波长为214nm，洗脱流速为20mL/min。在一个实施方案中，所述流动相A和流动相B中还均额外添加1％丙二醇。
根据本发明第五方面的方法，其中步骤(44)中的亲和柱层析与步骤(42)操作条件相同。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与本发明其它任一实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于本发明其它任一实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“分子量分布范围”是指在质谱法测定分子量时，糖蛋白最小分子量至最大分子量的范围，例如对于本发明图8质谱图中，主峰起始位置对应的分子量(33980Da)至主峰终止位置对应的分子量(51840Da)的范围。类似地，提及的术语“分布跨度”是指分子量分布范围中大端值与小端值之间的差值。
本发明采用大规模培养条件和纯化方法，得到的重组安克洛酶的糖基化更复杂更完整，活性增强稳定性提高，动物体内抗急性脑梗疗效显著，安全评价结果表明该重组蛋白对心脏、呼吸系统、循环系统没有影响，具有良好临床应用前景。
重组安克洛酶是采用基因工程技术将安克洛酶的基因在CHO细胞中表达出来的糖蛋白，活性中心为丝氨酸，具有类凝血酶活性。采用质谱分析其平均分子量为39K-41kDa，碳水化合物含量约19％～49％。
众所周知，从天然蛇毒提取的产品可能具有不可预测杂质，从而产生抗原性，且生产质量不可控，相比而言，重组蛋白在其纯度、质量可控性、抗原性、安全性等方面具有天然安克洛酶无法比拟的优点，展示出广阔的医用前景，但迄今国内外尚未有重组安克洛酶药物上市。
用基因重组技术来获得重组安克洛酶成为更好的选择，而要制备具有体内活性的重组糖蛋白，现有的原核细胞(如大肠杆菌)和酵母细胞表达系统均无法实现产业化，只有在哺乳动物宿主细胞中表达重组蛋白才能实现较完整的糖基化，事实上，蛋白的糖基化程度与蛋白体内活性和半衰期等功能密切相关，重组蛋白糖基化水平又取决于细胞培养条件和纯化工艺。
哺乳动物细胞表达系统中，采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是目前最适合工业生产的宿主细胞。CHO细胞表达的产品如重组人促红素注射液，重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)，重组人血小板生成素注射液，注射用重组人尿激酶原已经应用于临床。
用本发明方法制备的重组安克洛酶具有下列特征：
(1)通过质谱测定，本发明重组安克洛酶平均分子量为39～41Kda；(2)本发明重组安克洛酶含有19～49％的糖；(3)本发明重组安克洛酶含有的5个N-linked糖基化位点且糖型复杂。
附图说明
图1：ATK-V03-aSP-Ancrod质粒图谱。
图2：克隆CIA8-64-33-95在10升生物反应器中的批次培养工艺(细胞生长；vc-活细胞密度，via-细胞活率)。
图3：克隆CIA8-64-33-95在10升生物反应器中的批次培养工艺(目的蛋白表达)。
图4：克隆CIA8-64-33-95在50L生物反应器中的批次培养工艺(细胞生长；vc-活细胞密度，via-细胞活率)。
图5：克隆CIA8-64-33-95在50L生物反应器中的批次培养工艺(目的蛋白表达)。
图6：第一步Heparin Sepharose 6Fast Flow凝胶亲和柱层析色谱图。
图7：第二步反相液相色谱纯化色谱图。
图8：重组安克洛酶糖蛋白的LC-MS图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
天然安克洛酶的制备：本发明人参照William Burkhart文献Fig.1之A之lane 3所示天然安克洛酶糖蛋白的获取方法，采用马来西亚红口蝮蛇蛇毒为原料，获得天然糖基化蛋白即天然安克洛酶，其在本发明中用于比照试验。
实施例1：构建编码安克洛酶重组蛋白的基因表达载体
本发明通过商业途径(AutekBio)获得基因表达载体，尽管这类基因表达载体的构建方法是本领域公知、通用的，本发明仍然详述如下，但是这些详述的目的并不是要限制本发明。
(1)宿主细胞
采用无血清悬浮培养的CHO细胞(ATK-CHO-SX)作为宿主细胞，培养条件为37℃，5％CO2，120rpm。每2-3天传代培养时，细胞倍增时间(PDT)约17小时。批次培养时最高活细胞密度可达1×107个细胞/mL。
(2)基因工程质粒
ATK-V03-aSP载体是AutekBio自主构建的用于在哺乳动物细胞中分泌性表达重组蛋白质的载体。ATK-V03-aSP载体含有一个CMV启动子、一个BGH pA加尾信号及用于在真核细胞中筛选稳定表达细胞的Neo筛选标记基因。ATK-V03-aSP载体还含有来源于质粒pMB1的复制起始位点及氨苄青霉素抗性基因，可在大肠杆菌中筛选和复制。ATK-V03-aSP载体主要组成元件的来源、功能及目的基因插入部位两侧各控制区的核苷酸序列等信息见表1至表3。
表1：ATK-V03-aSP载体主要组成元件
组成元件 来源 功能
pUC复制起始位点 pMB1 起始质粒在原核系统中复制
CMV启动子 人巨细胞病毒 启动目的基因转录
polyA信号 人工合成 稳定mRNA
Neo基因编码区 人工合成 真核筛选
氨苄青霉素抗性编码区 pBR322 原核筛选
表2：ATK-V03-aSP载体目的基因插入位点两侧控制区的核苷酸序列
表3：ATK-V03-aSP载体酶切位点分析
# Name Recognition Site No Position(s)
1 AgeI A^CCGGT 1 1192.
2 ApaLI G^TGCAC 3 170,4241,5487.
3 AvaI C^YCGRG 2 1308,2416.
4 BamHI G^GATCC 1 1321.
5 BglII A^GATCT 1 150.
6 EcoRI G^AATTC 1 1258.
7 EcoRV GAT^ATC 2 1275,2430.
8 HindIII A^AGCTT 1 1183.
9 KpnI GGTAC^C 1 1193.
10 MluI A^CGCGT 1 1198.
11 MunI C^AATTG 1 299.
12 NcoI C^CATGG 4 867,1208,2302,3037.
13 NdeI CA^TATG 1 741.
14 NheI G^CTAGC 1 1294.
15 NotI GC^GGCCGC 1 1314.
16 NsiI ATGCA^T 2 2145,2217.
17 PstI CTGCA^G 1 2658.
18 PvuI CGAT^CG 1 5190.
19 SacI GAGCT^C 1 1075.
20 SacII CCGC^GG 2 1162,1320.
21 SalI G^TCGAC 2 136,3553.
22 SmaI CCC^GGG 1 2418.
23 StuI AGG^CCT 1 2394.
24 XhoI C^TCGAG 1 1308.
25 XmaI C^CCGGG 1 2416.
安克洛酶糖蛋白的编码DNA序列由化学合成法完成，用T4DNA连接酶将此合成的DNA编码序列连接入ATK-V03-aSP载体，得到基因重组表达质粒ATK-V03-aSP-Ancrod，通过DNA测序进行验证重组质粒中插入序列的正确性。质粒构造图谱如图1所示。
实施例2：重组安克洛酶在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达
安克洛酶糖蛋白高表达高产出基因工程细胞株的建立和克隆筛选
利用电击转染的方法将V03-aSP-Ancrod和V07-DHFR-neo质粒共同转入宿主细胞ATK-CHO-S2中。转染后将细胞放置在37℃，5％CO2培养箱中进行培养。培养24小时后，将细胞接种至筛选培养基(配方：胰蛋白胨5.0g/L、多价胨5.0g/L、牛肉粉3.0g/L、葡萄糖1.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钠1.0g/L、甘氨酸10.0g/L、氯化锂0.5g/L、苯乙醇2.5g/L、琼脂15.0g/L，pH值7.3)中进行筛选。共获得表达安克洛酶糖蛋白的细胞株27个。
根据批次培养的结果，选取表达安克洛酶糖蛋白较高的五株单克隆细胞株CIAS1、CIA-P4、CIA-P8、CIA-P33和CIA-P48进行继续筛选，按照每孔小于5个细胞的接种密度接种至96孔板中进行亚克隆筛选。将获得的亚克隆转入24孔板中培养4-6天后，进行活性测定。根据活性测定结果，选取表达活性较高的克隆转入6孔板中继续培养3天后，进行活性测定。根据活性测定结果，选取表达活性较高的克隆转入50mL摇瓶中进行培养。根据批次培养结果选取CIA8-64克隆。将CIA8-64克隆进一步进行亚克隆筛选，最终获得稳定高表达的单克隆细胞株CIA8-64-33-95。活性检测采用凝血仪进行，按凝血速度考量活性高低。
实施例3：重组安克洛酶蛋白的细胞生产
本实施例描述细胞培养及规模化生产工艺。
(1)小试工艺：CIA8-64-33-95在赛多利斯(Sartorius)BIOSTAT B PLUS 10升生物反应器中培养，工艺条件如下：
起始培养体积：5升
基础培养基：SFM
培养条件：37℃、5％CO2、120rpm
接种密度：0.3×106个/毫升。
无血清培养基(SFM)的组成为：葡萄糖0.6％、谷氨酰胺2mM、3mM的NaHCO3、5mM的Hepes、胰岛素2.5μg/ml、转铁蛋白100ng/ml、丁二胺60μM、硒酸钠30nM、青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖2mM、焦磷酸钾50μM、DF12加至100ml。
生物反应器参数设置如下：
DO(空气饱和)：50％
pH范围：6.8～7.2
搅拌转速：120转/分钟
通气方式：表面通气(空气)和深层通气(空气，氧气和二氧化碳)。
(2)中试工艺
CIA8-64-33-95细胞株在50升生物反应器中的培养工艺如下：
起始培养体积：50升
基础培养基：同上文
培养条件：37℃、5％CO2、120rpm
接种密度：0.3×106个/毫升。
生物反应器参数设置：
DO(空气饱和)：50％
pH范围：6.8～7.2
搅拌转速：120转/分钟
通气方式：表面通气(空气)和深层通气(空气，氧气和二氧化碳)。
在上述(1)小试工艺和(2)中试工艺中，在无血清培养基中添加了氯化铜、N-乙酰基-D-氨基甘露糖和焦磷酸钾三者，在37℃条件下培养至第6～7天时，能够达到1.0～1.2×107个细胞/mL的水平；然后使温度由37℃降至33℃，继续培养(约3～4天)至细胞密度不再增加后，收获培养物，此时细胞密度最大可达到2.8～3.0×107个细胞/mL的水平。
补充试验：参照实施例3之“(1)小试工艺”和“(2)中试工艺”，不同的仅是在培养至第7天达到最高活细胞密度后，生物反应器不调整继续在37℃培养至12天，发现在第6～7天细胞密度达到约1.0～1.2×107个细胞/mL的水平之后无法再增加密度，甚至在第8～9天时细胞密度有降低的趋势。在此不改变(降低)培养温度的试验中，小试工艺的细胞生长和目的蛋白表达情况如图2和图3所示，中试工艺的细胞生长和目的蛋白表达情况如图4和图5所示。
(3)安克洛酶糖蛋白的定量分析方法
由于安克洛酶糖蛋白引起血浆凝集，安克洛酶糖蛋白的定量分析方法采用血浆凝集法。
仪器：普利生C2000-1血凝仪，一次性测定杯及血凝仪专用钢珠。
步骤：将冷冻人血浆放置于37±0.5℃恒温水浴中融化并轻轻摇匀。将血凝仪及测定杯预热至37±0.5℃。向测定杯中加入200μl血浆和钢珠。将待测样品100μl加入测定杯并开始计时。使钢珠停止摆动的时间为凝集时间。待测样品应根据安克洛酶糖蛋白的含量浓度进行适量稀释。
本定量分析方法，能够监控工艺过程中重组安克洛酶的产量、收率、物料的凝血活性等。例如在上述实施例中已经发现本发明方法能够容易的以工业生产规格获得高表达量的重组安克洛酶，产量能够达到每毫升发酵液200IU/ml以上，比活性能够达到1000IU/mg以上。
实施例4：重组安克洛酶的纯化
(1)重组安克洛酶发酵液的浓缩
将上一步骤所得含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液；每次收获50L发酵液，需要纯化的样品体积大，内有大量小分子物质，不利于纯化。先用截留分子量为30K的超滤膜包超滤发酵液，初始发酵液的凝血活性为10-20S，浓缩至膜上液体积5-6L，膜下液的凝血活性大于200S，弃去。膜上液进行下一步超滤膜纯化直至体积缩减为原体积的1/8～1/10。
发酵液浓缩工艺流程示例如下：发酵液50L(凝血活性为10-20S)——>30K的超滤膜——>膜上液10L，膜下液弃去，膜下液的凝血活性大于200S——>膜上液进行下一步纯化。
(2)Heparin Sepharose 6Fast Flow凝胶亲和柱层析
层析柱(柱直径50mm，长度12cm)，填料为Heparin Sepharose 6Fast Flow，平衡缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl pH7.0-7.5缓冲液，样品为(1)步骤中的膜上液1000ml，用平衡缓冲液稀释至2000ml，上样，柱流速为24mL/min。上样后，用平衡缓冲液平衡至基线，用0.25mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.0-7.5缓冲液洗脱，收集活性组分。用1.0mol/LNaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.0-7.5缓冲液洗脱杂质组分，再用平衡缓冲液冲洗层析柱1000ml，再生，备用。纯化处理第一步Heparin Sepharose 6Fast Flow凝胶亲和柱层析的色谱图如图6。
(3)反相液相色谱纯化
采用制备型反相液相色谱技术，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质。样品采用制备型高效液相色谱仪进行分离制备，色谱柱为Dubbe C4色谱柱(10μm，Φ20×250mm，)。首先用500mL纯水清洗系统流路内的乙醇并平衡色谱柱，流速为10mL/min，然后将步骤(2)中收集的活性组分，通过液相色谱输液泵上样，上样流速为10mL/min，上样完成后，用100mL纯水清洗管路及色谱柱。
按照表4进行梯度洗脱，其中流动相A为磷酸水溶液(pH2.3)，流动相B为乙醇，且流动相A、B中均额外添加1％丙二醇，检测波长为214nm，洗脱流速为20mL/min。
表4：洗脱条件表
时间/min A B
0～50 90→30 10→70
50～60 30 70
61.～71 90 10
收集活性主峰，用水稀释10倍。进行下步纯化。
纯化处理第二步反相液相色谱纯化色谱图见图7。如图7所示，在2000～2200ml范围内即可将目标糖蛋白洗脱出来。本发明人在补充的试验中发现，如果在流动相A、B中未添加丙二醇则将目标糖蛋白洗脱出来所需要体积达2500～2900范围，不但洗脱时间延长而且所用流动相体积更大，所得洗脱液中蛋白浓度更低。
(4)Heparin Sepharose 6Fast Flow凝胶亲和柱层析
层析柱(柱直径50mm，长度12cm)，填料为Heparin Sepharose 6Fast Flow，平衡缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl pH7.0-7.5缓冲液，样品为步骤(3)中的活性主峰，用平衡缓冲液稀释至1000ml，上样，柱流速为2mL/min。上样后，用平衡缓冲液平衡至基线，用0.25mol/LNaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.0-7.5缓冲液洗脱，收集活性组分。用1.0mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl pH7.0-7.5缓冲液洗脱杂质组分，再用平衡缓冲液冲洗层析柱1000ml，再生，备用。
本实施例4的纯化方法可有效分离出重组蛋白，经反相色谱分析，其糖蛋白纯度均大于99％。
实施例5：重组安克洛酶结构分析
(1)N-末端和C-末端15个氨基酸残基测定：
采用LTQ-MS鉴定蛋白质序列，对实施例4所得重组安克洛酶进行了N-末端1-15个氨基酸残基的序列测定，序列为：VIGGDECNINEHRFL与已知序列一致；C端217-234位氨基酸序列DYRDWVNNVIAGNATCSP与已知序列一致。经完整的氨基酸序列测定，结果表明，重组安克洛酶序列与http://www.uniprot.org所载安克洛酶的氨基酸序列相同。
(2)二硫键：
经测定，重组安克洛酶的一级结构为含有234个氨基酸残基的单链，有6对二硫键，分别位于C7-141，C28-44，C78-232，C120-C188，C152-167，C178-203，与已知序列一致。
(3)糖基化结构：
通过蛋白酶酶解蛋白质得到糖基化修饰肽段、高精度LC-MS质谱检测以及质谱数据分析软件Pepfinder TM进行糖肽水平的定性定量分析。
结果表明，本发明重组安克洛酶含有5个N-Link糖基化位点，分别位于：Asn23-Trp24-Thr25，Asn79-Lys80-Thr81，Asn99-Asn100-Ser101，Asn148-Phe149-Thr150和Asn229-Ala230-Thr231处，与http://www.uniprot.org所载已知安克洛酶的糖基化位点相同。
本发明各个试验中制备得到的重组安克洛酶，经测定，其等电点均在4.5-5.5范围内。
糖蛋白分子量的测定：采用液相色谱-质谱法对本发明方法制得的重组安克洛酶糖蛋白以及天然安克洛酶糖蛋白进行分子量的测定，结果显示本发明所得各批次的重组安克洛酶糖蛋白的平均分子量均在39～41kDa范围内，分子量分布范围均在33～52kDa范围内(分布跨度均达17kDa以上)；例如本发明批次为20140509的重组安克洛酶糖蛋白样品的平均分子量为40544Da，分子量分布范围为33980～51841Da(分布跨度达17.9kDa)，该试样的LC-MS图见图8；而天然安克洛酶糖蛋白的平均分子量为37.7kDa，分子量分布范围为32.1～40.8kDa(分布跨度为8.7kDa)，其分布跨度远小于本发明重组糖蛋白(天然安克洛酶糖蛋白的LC-MS图未出示)。
工艺条件对糖基化程度影响的补充试验：参照上文实施实施例1～4的方法，不同的仅是在实施例3的小试工艺和中试工艺中，改变所用的无血清培养基组成，即取消其中氯化铜、N-乙酰基-D-氨基甘露糖、焦磷酸钾三者或者任意二者或者任意之一，各种条件下(无论是小式还是中试)，如此条件所得糖蛋白经测定，其平均分子量均在38.3～39.1kDa范围内，分子量分布范围均在34～45kDa范围内(分布跨度不超过11kDa)，表明这些糖蛋白的糖基化水平比较低。另外，照实施例6所记载的比活性的测定方法，测定本补充试验所得较低糖基化的糖蛋白的比活性，结果均在883～976IU/mg的较低比活性的范围。另外，照实施例6所记载的稳定性考察方法，测定本补充试验所得较低糖基化的糖蛋白的稳定性，结果相对活性均在74～88％范围内。本补充试验提示，在进行细胞培养时，使用添加了氯化铜、N-乙酰基-D-氨基甘露糖、焦磷酸钾三者的无血清培养基对于获得性能更优异的糖蛋白是有益的。
实施例6：重组安克洛酶体外活性测定
样品：实施例4各批次所得重组安克洛酶、各种补充试验所得重组安克洛酶、天然安克洛酶等。
活性测定方法：
原理：由于重组安克洛酶可以降解血中纤维蛋白原为纤维蛋白，使血液凝固，可以通过测定血浆或纤维蛋白原的凝固时间来确定重组安克洛酶的活性。
仪器与材料：
血凝仪、三羟甲基氨基甲烷、氢氧化钠、氯化钙、浓盐酸为国产分析纯试剂；水为双蒸馏水。牛纤维蛋白原(牛血)(88mg可溶蛋白/支)，批号：140607-201137；牛血白蛋白为进口分装试剂。
试液配制
2mol/L Tris-盐酸稀释液储备液：取三羟甲基氨基甲烷12.1g，加水80ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.4后，加水至100ml，摇匀即得。
20mmol/L Tris-盐酸稀释液：取上述储备液0.5mL，加水定容至50mL，混匀即得。
磷酸盐稀释液(pH6.0)：取磷酸氢二钠0.17g，氯化钠0.85g，溶于80mL水中，1mol/L氢氧化钠调pH至6.0后，加水至100mL，摇匀即得。
0.5％牛血白蛋白-20mNTris-盐酸稀释液：取牛血白蛋白0.05g，加20mNTris-盐酸稀释液溶解、定容至10mL，摇匀即得。
0.5％牛血白蛋白-磷酸盐稀释液(pH6.0)：取牛血白蛋白0.05g，加20mNTris-磷酸盐稀释液溶解、定容至10mL，摇匀即得。
牛纤维蛋白原工作液：取中国食品药品检定研究院牛纤维蛋白原标准试剂1支，加稀释液11mL，制备成浓度为8mg/mL的储备液，再用稀释液稀释为4mg/mL的工作液。
测定法：
对照品溶液的制备：取重组安克洛酶工作对照品1支，加入适量稀释液，配成10IU/mL的对照品母液，然后分别取800μL、600μL、400μL、200μL标准溶液，加稀释液定容至1mL，准确稀释成浓度为6.0、4.0、2.0、1.0IU/ml的溶液，临用时置血凝仪的保温孔中，37℃下保温。
供试品溶液的制备：精密量取本品适量，加稀释液制成每1ml中约含2～6IU的溶液。
标准曲线的制备：取牛纤维蛋白原工作液0.2mL，分别置于血凝仪的测样孔内的3个测定杯中，在37℃下保温3分钟，分别精密量取已预热的对照品溶液各0.1mL，迅速加入纤维蛋白原溶液的各杯中，仪器自动记录凝固时间。每种浓度平行测定3次，计算平均值及标准偏差(当标准偏差大于3.0秒时，需再行测定)。以对照品溶液浓度的对数与其凝固时间平均值的对数计算回归方程。
测定法：精密量取本品0.1ml，置血凝仪37℃水浴中预热后，按标准曲线的制备项下方法，测定凝固时间，计算3次测定结果的平均值及标准偏差(标准偏差同标准曲线的制备要求)，由回归方程计算重组安克洛酶的效价，即得。
样品测定：取本发明实施例4方法获得的四批重组安克洛酶原液，依法测定，结果如表5所示，效价均大于270IU/mL以上。
表5：重组安克洛酶原液效价测定结果
批号 效价/(IU/mL)
20140509 362.11
20140521 271.29
20140610 503.15
20140524 649.40
比活性的测定：本发明实施例不同批次制备得到的重组安克洛酶，测定其蛋白含量，然后测定其活性，以IU/mg来表征糖蛋白的比活性，结果显示本发明制得的重组安克洛酶糖蛋白的比活性均达1135～1462IU/mg的高比活性的范围；令人遗憾的是，类似地测定天然安克洛酶糖蛋白的比活性仅为865IU/mg。这种比活性的差异可能是由于氨基酸链外被修饰糖的差异造成的，并且提示修饰糖越复杂越完整则糖蛋白的活性越高。
稳定性考察：本发明实施例不同批次制备得到的重组安克洛酶(表5四批)以及天然安克洛酶，使其溶解于pH6.5的缓冲液中，不加保护剂，在2～6℃冷藏条件下放置36个月，结果显示，重组安克洛酶在此稳定性考察条件下的体外活性基本未见下降，相对于0月而言6月相对活性为93～96％；出人意料的是天然安克洛酶的相对活性仅为61.5％，远低于重组糖蛋白。术语“相对活性”是指某一样品在6月测定的活性除以0月测定的活性再乘以100％所得百分数。这种稳定性的差异可能是由于重组安克洛酶与天然安克洛酶外被的修饰糖不同而造成的，并且提示修饰糖越复杂越完整则糖蛋白的稳定性越高。
实施例7：重组安克洛酶对犬大脑中动脉血栓性血块的溶解及脑局部缺血损伤的 影响
目的：观察重组安克洛酶对犬中动脉血栓的溶解和脑局部缺血损伤的保护作用以及犬血栓后凝血和纤溶作用。
方法：犬大脑中动脉注入血栓性血块致持久性局部脑缺血模型。试验分为5组，模型对照组、重组安克洛酶高剂量组(0.68IU/kg)、中剂量组(0.34IU/kg)、低剂量组(0.17IU/kg)和巴曲酶组(0.34BU/kg)。按体重吸取受试药物，注入100ml生理盐水中，在术后10min静脉输注给药，给药时间控制在35～45min。对照组静脉滴注等量生理盐水。
结果：重组安克洛酶高、中、低剂量对犬大脑中动脉血栓性血块均有很好的溶解作用，脑梗塞面积分别比模型组对照组减少了89.9％、82.5％和59.2％。重组安克洛酶小剂量组和巴曲酶组，在缩小脑梗面积作用相近。药后24小时右颈内动脉血流恢复率分别为42.7％、36.2％、23.6％。
重组安克洛酶有显著减少神经肌肉功能行为症状，降低神经行为指标评分，对梗死犬大脑中动脉血栓性血块致局部脑缺血损伤有明显的保护作用。
静脉滴注重组安克洛酶高、中、低剂量6h后，大脑中动脉血栓形成犬血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血酶时间(APTT)有显著的延长。重组安克洛酶高、中、低剂量组和巴曲酶组对犬血浆FIB延长大于60s和FIB含量低于0.5g/L的发生率为100％、83.3％、100％、66.7％。高剂量组药后24h，犬血浆凝血酶时间(TT)显著延长，犬血浆FIB延长大于60s和FIB含量低于0.5g/L的发生率为83.3％。
静脉输注重组安克洛酶高、中、低剂量后，犬手术伤口有大量血液渗出，给药后6h伤口血液渗出发生率为100％、66.7％、50％，给药后24h伤口血液渗出发生率为66.7％、16.7％、0。伤口渗血量估值在20ml～100ml之间，伤口渗血量与给药剂量有关，高剂量组伤口渗血量多，持续时间也长。巴曲酶组在在药后6h血液渗出发生率为50％。
实施例8：SD大鼠静脉注射给予重组安克洛酶单次给药毒性试验
本试验通过SD大鼠单次静脉注射给予重组安克洛酶，观察重组安克洛酶引起的急性毒性反应情况。
本试验设3组，每组10只动物，雌雄各半，分别单次静脉注射给予溶媒对照品(0μg/kg，0.9％氯化钠注射液)、160和320μg/kg重组安克洛酶，给药容量为5mL/kg，观察期14天。试验期间对以下指标进行观察或检测：动物死亡和濒死情况、临床征状、体重。观察期末对动物进行大体解剖检查。因大体解剖未见异常，故未进行组织病理学检查。
320μg/kg组和160μg/kg组分别有1例动物于给药当天死亡，死亡前见活动减少、不能站立、双后肢瘫痪，上述动物死亡与供试品相关。
320和160μg/kg组自给药后约1分钟起至给药后5分钟内动物见活动减少、不能站立、双后肢瘫痪或僵硬、呼吸急促、翻正反射消失，且呈一定的剂量相关性。320和160μg/kg组存活的雌性动物给药后约10分钟和30分钟观察时均见尿液呈深红色。另外，320μg/kg组存活的3例雄性动物给药后30分钟观察时仍见活动减少，其中2例雄性还见竖毛，并持续至给药后2小时。160μg/kg组给药后30分钟观察时仅1例雄性见活动减少。320和160μg/kg组存活的雌雄动物分别自给药后4和2小时起至观察期末临床观察均未见异常。试验期间0μg/kg组雌雄动物均未见异常。
试验期间，供试品组动物体重和病理学检查均未见与供试品相关的异常。
综上所述，本试验条件下，SD大鼠单次静脉注射给予160和320μg/kg重组安克洛酶。剂量≥160μg/kg重组安克洛酶可致动物出现活动减少、不能站立、双后肢瘫痪或僵硬、呼吸急促、翻正反射消失、尿液呈深红色，在320μg/kg剂量下还可至动物出现竖毛，上述改变给药后2～4小时内可恢复。因此，在本试验条件下，SD大鼠单次静脉注射给予重组安克洛酶的最大耐受剂量(Maximal Tolerance Dose，MTD)小于160μg/kg。
实施例9：SD大鼠静脉注射给予重组安克洛酶四周恢复期四周重复给药毒性试验
本试验的目的是通过SD大鼠连续四周静脉注射给予重组安克洛酶，隔天给药1次，恢复期四周，观察重组安克洛酶引起的毒性反应并研究其毒代动力学特点，提供重组安克洛酶的毒性反应的靶器官，恢复期四周后观察损害的可逆情况，为临床试验提供参考。
本试验使用SD大鼠144只，每组30只，雌雄各半；另设TK组，6只/组，雌雄各半。静脉注射给予重组安克洛酶，剂量为20、40、80μg/kg。隔天给药1次，给药容量为5mL/kg，给药期为29天(D1～D29)，同时设置恢复期28天(R1～R28)。
试验期间进行如下观察或检测：死亡和濒死情况观察、临床征状观察、体重称量、摄食量检测、眼科检查、毒代动力学分析、尿液分析、血液学和凝血指标检查、血清生化学指标检查、大体解剖、脏器重量和组织病理学检查。
毒代动力学结果显示：首末次给药后相同剂量下雌性和雄性大鼠血浆重组安克洛酶暴露量未见差异，暴露量呈线性相关，且连续给药29天后，重组安克洛酶的暴露量未见蓄积。
试验结果显示：实验期间，80μg/kg剂量组雄性动物于D3给药后约5分钟左右发现1例死亡，死亡前主要见活动减少、不能站立及尿变色(深红)，大体解剖及组织病理学检查未见与供试品相关异常。
40μg/kg组雌性动物在第一周给药期间的给药日均见尿变色(浅红)。80μg/kg组雌雄动物在给药期间的给药日均见尿变色(深红)及给药后约2～5分钟见活动减少，另外，雄性动物给药期给药日出现一过性的不能站立、软便及肛周污染。以上动物在给药期非给药日及恢复期临床观察均未见明显异常。
80μg/kg组雄性动物给药期第一周见摄食量下降，体重未见异常。
给药期末，与0mg/kg组相比，80μg/kg组雌性动物平均RBC显著下降及雌雄动物平均％RETIC显著性升高。恢复期以上异常均见恢复。
给药期末，80μg/kg组雌雄动物尿液呈褐色到深红色、血尿及尿蛋白，雄性动物还见尿液浑浊。恢复期末均见恢复。
组织病理学检查可见，给药期末，80μg/kg组雄性动物脾脏髓外造血。恢复期末可见恢复。
实验期间，所有剂量组动物体重、眼科检查、血清生化均未见明显异常。
综上所述，在本试验条件下，SD大鼠连续四周静脉注射给予重组安克洛酶，剂量为0(0.9％氯化钠注射液)、20、40、80μg/kg，每两天一次，恢复期四周。剂量为40μg/kg时，可见雌性动物出现一过性的尿变色(浅红)；剂量为80μg/kg时，雌雄动物尿变色加重(深红)、活动减少、％RETIC升高、血尿及尿蛋白，雌性动物还见RBC下降，雄性动物还见一过性的不能站立及摄食量下降、软便及肛周污染、组织病理学检查见脾脏髓外造血。恢复期以上所有异常均见恢复。各剂量组血浆重组安克洛酶的暴露量未见性别差异，且暴露量呈线性相关性，连续给药29天后，未见蓄积。雌雄动物未观察到毒性反应剂量(NOAEL，No observedadverse effect level)分别为20和40μg/kg。
以上通过本发明较佳实施例对本发明的精神作了详细阐述。本领域技术人员理解，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种重组安克洛酶，该重组安克洛酶是由N-末端和C-末端氨基酸残基分别为缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的234个氨基酸残基组成的一条具有如下序列的单链：
2.根据权利要求的重组安克洛酶，其特征在于：
其是一种平均分子量为39～41KDa的糖蛋白，包含的5个N-Link糖基化结合位点分别位于Asn23-Trp24-Thr25，Asn79-Lys80-Thr81，Asn99-Asn100-Ser101，Asn148-Phe149-Thr150和Asn229-Ala230-Thr231处的天冬酰胺残基上，且该糖蛋白的等电点为4.5-5.5；
其是一种分子量分布范围为33～52KDa的糖蛋白；
其是一种修饰糖含量为19～49％的糖蛋白；和/或
经液相色谱-质谱法(LC-MS)测定，其平均分子量为39～41kDa，分子量分布范围为33～52kDa。
3.制备重组安克洛酶的方法，该方法包括如下步骤：
(1)构建编码重组安克洛酶的基因表达载体和重组质粒：
构建用于在哺乳动物细胞中分泌性表达重组蛋白质的载体；
(2)重组安克洛酶在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：
将含有安克洛酶蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株；
(3)细胞培养生产重组安克洛酶：
将筛选到的稳定细胞株转入反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到最大时，收获培养物；
(4)重组安克洛酶的纯化：
(41)上层析柱前预处理：将上一步骤所得含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液，接着进行超滤浓缩，截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8～1/10；
(42)亲和层析柱：采用亲和层析柱进行纯化纯化，使用盐浓度0.1～0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HCl pH7.0～7.5缓冲液的洗脱条件，洗脱并收集活性组分；
(43)反相液相色谱纯化：采用制备型反相液相色谱技术，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质；
(44)亲和柱层析：将上一步骤收集的重组蛋白采用亲和层析柱纯化，去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤(43)中，使用C4制备型色谱柱，采用下表所示梯度洗脱：
时间/min A B 0～50 90→30 10→70 50～60 30 70 61.～71 90 10
其中流动相A为pH2.3的磷酸水溶液，流动相B为乙醇，检测波长为214nm，洗脱流速为20mL/min；在一个实施方案中，所述流动相A和流动相B中还均额外添加1％丙二醇。
5.根据权利要求3的方法，其中：
步骤(44)中的亲和柱层析与步骤(42)操作条件相同；
步骤(1)中，构建编码重组安克洛酶的基因表达载体的步骤还包括：化学合成法完成安克洛酶糖蛋白的DNA编码序列，用T4DNA连接酶将此合成的DNA编码序列连接入ATK-V03-aSP载体，得到基因重组表达质粒ATK-V03-aSP-Ancrod，通过DNA测序进行验证重组质粒中插入序列的正确性；
所述的哺乳动物细胞表达载体为ATK-V03-aSP；
步骤(2)中所述转染的方法为细胞的电穿孔转染方法；
所述的哺乳动物宿主细胞选自：CHO、HEK293、BHK、NS0和Sp2/0细胞；
步骤(3)中，所述无血清培养基(SFM)的组成为：葡萄糖0.6％、谷氨酰胺2mM、3mM的NaHCO3、5mM的Hepes、胰岛素2.5μg/ml、转铁蛋白100ng/ml、丁二胺60μM、硒酸钠30nM、青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、DF12加至100ml；
步骤(3)中当培养至细胞密度达到最大时，使培养温度由37℃降至33℃，继续培养直至细胞密度不再增加；
步骤(3)中所用的无血清培养基中增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖2mM、焦磷酸钾50μM；
步骤(3)的方法为：将筛选到的稳定细胞株转入反应罐，用增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)2mM、焦磷酸钾50μM的无血清培养基，在培养条件37℃、5％CO2、120rpm条件下培养至细胞密度不再增加，接着使培养温度由37℃降至33℃后继续培养至细胞密度不再增加后，收获培养物。
6.权利要求1～2所述重组安克洛酶或者权利要求3～5制备的重组安克洛酶在治疗急性脑梗塞性疾病中的应用；例如用于急性脑梗死和改善各种闭塞性血管病。
7.生产重组安克洛酶时进行细胞培养的方法，该方法包括如下步骤：将筛选到的稳定细胞株转入反应罐，用增补了氯化铜100μM、N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)2mM、焦磷酸钾50μM的无血清培养基，在培养条件37℃、5％CO2、120rpm条件下培养至细胞密度不再增加，接着使培养温度由37℃降至33℃后继续培养至细胞密度不再增加后，收获培养物。
8.根据权利要求3的方法，所述无血清培养基的组成为：葡萄糖0.6％、谷氨酰胺2mM、3mM的NaHCO3、5mM的Hepes、胰岛素2.5μg/ml、转铁蛋白100ng/ml、丁二胺60μM、硒酸钠30nM、青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、DF12加至100ml。
9.对重组安克洛酶进行纯化的方法，该方法包括如下步骤：
(41)上层析柱前预处理：将含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片，收集滤液，接着进行超滤浓缩，截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8～1/10；
(42)亲和层析柱：采用亲和层析柱进行纯化纯化，使用盐浓度0.1～0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HCl pH7.0～7.5缓冲液的洗脱条件，洗脱并收集活性组分；
(43)反相液相色谱纯化：采用制备型反相液相色谱技术，纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白，利用极性大小的差别，采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法，进一步去除其他杂质；
(44)亲和柱层析：将上一步骤收集的重组蛋白采用亲和层析柱纯化，去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩。
10.根据权利要求9的方法，其中步骤(43)中，使用C4制备型色谱柱，采用下表所示梯度洗脱：
时间/min A B 0～50 90→30 10→70 50～60 30 70 61.～71 90 10
其中流动相A为pH2.3的磷酸水溶液，流动相B为乙醇，检测波长为214nm，洗脱流速为20mL/min；例如所述流动相A和流动相B中还均额外添加1％丙二醇。
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