CZ2009253A3 - Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu - Google Patents
Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2009253A3 CZ2009253A3 CZ20090253A CZ2009253A CZ2009253A3 CZ 2009253 A3 CZ2009253 A3 CZ 2009253A3 CZ 20090253 A CZ20090253 A CZ 20090253A CZ 2009253 A CZ2009253 A CZ 2009253A CZ 2009253 A3 CZ2009253 A3 CZ 2009253A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- seq
- patient
- pcr
- aspergillus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy pomocí izolace a detekce DNA Aspergillus fumigatus v biologických vzorcích odebraných z tela pacienta spocívající v tom, že se z biologického vzorku izoluje DNA a poté se provede detekce množství genu ITS2 (internal transcribed spacer 2) pro ribozomální DNA Aspergillus fumigatus metodou kvantitativní PCR. Predmetem rešení jsou i nové oligonukleotidy, zejména pro použití v diagnostice invazivní aspergilózy.
Description
Způsob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití při tomto způsobu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu diagnostiky invazivní aspergilózy pomocí kvantitativní PCR z biologických vzorků odebraných z těla imunokompromitovaných pacientů, zejména ze vzorků bronchoalveolární laváže. Dále se týká nových oligonukleotidů, vhodných pro použití při tomto způsobu.
Dosavadní stav techniky
Aspergillus sp. je saprofytická plíseň, jejíž přirozenou nikou je půda, kde roste na organickém debrisu. V rámci svého reprodukčního cyklu produkuje každý organismus tisíce konidií, které se uvolňují do prostředí. Inhalace konidií jedinci se zdravým imunitním systémem nevede k žádnému klinickému projevu, k jejich vyloučení z dýchacích cest stačí běžné tkáňové obranné mechanismy a mechanismy vrozené buněčné imunity. Ještě v nedávné době byly infekce způsobené vláknitými plísněmi spojovány spíše s alergickými projevy u osob dlouhodobě vystavených prostředí s velkým výskytem plísní (např. pracující v zemědělství). Spolu s tím, jak přibývá onkologických nemocných a imunosupresivní léčba se stává agresivnější, se však situace dramaticky změnila a incidence invazivních mykotických infekcí (IFI, z angl, invasive fungal infections) vzrůstá (Marr, K.A., et al., Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients: changes in epidemiology and risk factors. Blood, 2002. 100(13): p. 4358-4366.; Jordanides, N.E., et al., A prospective study of real-time panfungal PCR for the early diagnosis of invasive fungal infection in haematooncology patients. Bone Marrow Transplant, 2005. 35(4): p. 389-95.; Ráčil, Z., et al., Invazivní mykotické infekce u onkologických nemocných: změny v epidemiologii a diagnostice. Postgrad Med, 2007. 9(3): p. 240-252.).
Za více než 90 % aspergilových infekcí je zodpovědný druh A. fumigatus. Pro prognózu nemocných má zásadní význam časné zahájení antimykotické léčby a tedy i časné stanovení diagnózy. Vzhledem k tomu, že konvenční diagnostické metody (kultivace, cytologie, zobrazovací metody) často ve své senzitivitě a časnosti selhávají, došlo v posledních letech k rozvoji nekultivačních diagnostických metod. Mezi tyto, vedle metod sérologických (detekujících antigeny mykotických patogenů), patří právě i PCR diagnostika. V současné době pro detekci DNA Aspergillus spp. v tělních tekutinách stále neexistuje žádný standardizovaný postup.
Výzkumu detekce nukleových kyselin Aspergillus spp. v tělních tekutinách, zvláště pak v periferní krvi a tekutině získané bronchoalveolámí laváží (výplachem dolních cest dýchacích fyziologickým roztokem, dále zkracováno jako BAL), je v současnosti věnována velká pozornost. Senzitivita a negativní prediktivní hodnota PCR Aspergillus sp. v BAL, tedy podíl „zdravých“ pacientů ze všech pacientů s negativním výsledkem testu, dosahuje 90 100%, ale pozitivní prediktivní hodnota, tj. podíl pacientů, u nichž skutečně jde o aspergilovou infekci, z celkového počtu pacientů s pozitivním výsledkem testu, je jen 3252 % (Raad, I., et al., Diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis using polymerase chain reaction-based detection of aspergillus in BAL. Chest, 2002. 121(4): p. 1171 - 1176). Falešně pozitivní výsledky jsou tedy poměrně časté. Detekce Aspergillus sp. v BAL totiž může odrážet nejen probíhající infekci, ale i kolonizaci dýchacích cest. Jestliže však předpokládáme, že množství patogena je při kolonizaci nižší než při aktivní infekci, mohlo by pokrok v tomto směru znamenat zavedení kvantitativní PCR, která umožňuje stanovit množství aspergilové DNA např. na 1 ml BAL (Rantakokko-Jalava, K., et al., Semiquantitative detection by real-time PCR of Aspergillus fumigatus in bronchoalveolar lavage fluids and tissue biopsy specimens from patients with invasive aspergillosis. J Clin Microbiol, 2003. 41(9): p. 4304 - 4311). Nastavení vhodné hranice pozitivity (x kopií v ml BAL) by umožnilo rozdělit pacienty do skupin s větším či menším rizikem rozvojem IFL
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého řešení je způsob diagnostiky invazivní aspergilózy pomocí izolace a detekce DNA Aspergillus fumigatus v biologických vzorcích odebraných z těla pacienta, zejména ve vzorcích bronchoalveolámí laváže nebo periferní krve. Podstata způsobu spočívá v tom. že se izoluje DNA z biologického vzorku a poté se provede detekce množství genu ITS2 (internal transcribed spacer 2) pro ribozomální DNA Aspergillus fumigatus pomocí metody kvantitativní PCR. Před prováděním detekce množství genu ITS2 lze ještě provést předamplifíkaci plísňové DNA metodou PCR.
Výchozím materiálem pro provádění způsobu podle vynálezu je biologický vzorek odebraný z těla pacienta, zejména vzorek bronchoalveolámí laváže nebo periferní krve, s výhodou vzorek bronchoalveolámí laváže. Jestliže není vzorek ihned zpracován, je možné ho skladovat v zamraženém stavu.
Prvním krokem způsobu podle vynálezu je izolace DNA z klinického vzorku. Tu lze provést např. metodou mechanické disrupce s použitím komerčně dostupného kitu.
Poté se případně provede předamplifikace DNA plísní s pomocí páru primerů, které ohraničují sekvenci ITS2 pro kvantitativní PCR a jsou specifické pro genom plísní. Usek amplifikovaný primery pro externí kolo (předamplifikaci) s vyznačením forward a reverse primeru (SEQ ID NO. 1): ctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctc ccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctt tgtcacctgctctgtaggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttctaaggtt gacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga
V dalším kroku způsobu podle vynálezu se detekuje množství genu ITS2 pomocí amplifikace jeho části metodou kvantitativní PCR, s výhodou real-time PCR s využitím TaqMan MGB (minor groove binder - modifikace zaručující silnější vazbu do malého žlábku DNA šroubovice než běžné sondy) sondy, přičemž jako primery a sonda pro PCR se použijí oligonukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující sekvence mající alespoň 85% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
| Cust-fum-F (SEQ ID NO.2) | GGCTTTGTCACCTGCTCTGTAG |
| Cust-fum-R (SEQ ID NO.3) | CTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAA |
| Cust-fum-son (SEQ ID NO.4) | CCGACACCCAACTTT |
Úsek amplifikovaný primery pro interní kolo s vyznačením forward primeru, reverse primeru a sondy (SEQ IDN0.5):
ggctttgtcacctgctctgtaggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttcta aggttgacctcggatcag
V genomu A. fumigatus je přítomno asi 40 kopií rDNA genů a skládají se ze tří podjednotek: 18S rRNA, 5,8S rRNA a 28S rRNA. Mezi jednotlivými podjednotkami se pak nacházejí oblasti ITS1 (internal transcribed spacer 1) a ITS2 (internal transcribed spacer 2). Úsek tohoto genu je používán proto, že je tento gen v genomu Aspergillus fumigatus přítomen v několika desítkách kopií, což zvyšuje senzitivitu reakce. Zároveň je tento úsek genu specifický pouze pro Aspergillus fumigatus, což zajišťuje vysokou specificitu reakce (nebyla zjištěna zkřížená reakce s jinými druhy plísní) (Schabereiter-Gurtner, C., et al., Development of novel real-time PCR assays for detection and differentiation of eleven medically important Aspergillus and Candida species in clinical specimens. J Clin Microbiol, 2007. 45(3): p. 90614).
Postup podle vynálezu je kombinací izolace DNA pomocí komerčního kitu, s výhodou s mírně optimalizovaným protokolem, jak je dále ukázáno v příkladech, které však mají za úkol pouze ilustrovat provedení vynálezu a nijak neomezují jeho rozsah, a originálně navržené kombinace oligonukleotidů pro PCR amplifikaci a reakčních podmínek PCR amplifikace. Na rozdíl od dosud dostupných komerčních řešení nevyžaduje řešení dle vynálezu žádné investice do přístrojového vybavení nad rámec vybavení pro běžnou realtime PCR s použitím TaqMan sond.
Předmětem vynálezu jsou dále oligonukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující sekvence mající alespoň 85% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující GGCTTTGTCACCTGCTCTGTAG (SEQ ID NO. 2), CTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAA (SEQ ID NO. 3), CCGACACCCAACTTT (SEQ ID NO. 4). Snížení homologie na 85 % ve srovnání s originální sekvencí nukleotidů může být dosaženo zejména prodloužením nebo zkrácením primerů a/nebo sondy o několik nukleotidů na 5' a/nebo 3' konci. Předmětem vynálezu jsou také tyto oligonukleotidy pro použití v diagnostice invazivní aspergilózy.
Seznam sekvencí
SEQ ID NO. 1: Úsek DNA amplifíkovaný pro externí kolo.
SEQ ID NO. 2: Forward primer pro amplifikaci v interním kole.
SEQ ID NO. 3: Reverse primer pro amplifikaci v interním kole.
SEQ ID NO. 4: Sonda pro kvantitativní PCR.
SEQ ID NO. 5: Úsek DNA amplifíkovaný pro interní kolo.
Příklady provedeni
Příklad 1
U pacienta s diagnózou akutní myeloidní leukémie (AML) byla provedena bronchoalveolámí laváž pro podezření na invazivní aspergilózu. 2 ml tekutiny získané BAL byly odebrány do sterilní zkumavky a centrifugovány 10 minut při otáčkách 4000-6000xg, při laboratorní teplotě. Po této centrifugaci byl veškerý supernatant odebrán mikropipetou. Pomocí mikropipety byl k peletu přidán lyzační roztok, který je součástí ZR Fungal Bacterial Kitu od firmy Zymo Research, a směs byla promíchána. Lyzát byl poté přenesen do zkumavky se skleněnými kuličkami. V následujících krocích byl vzorek se skleněnými kuličkami vortexován 15 minut při laboratorní teplotě. Následovalo promytí a izolace DNA na kolonce podle pokynů výrobce. DNA byla poté eluována do 50 mikrolitrů elučního pufru.
mikrolitrů odizolované DNA bylo přidáno do reakční směsi s párem primerů, které ohraničují cílovou sekvenci pro real-time PCR a jsou specifické pro genom plísní a reakční směs byla podrobena PCR amplifikaci.
PCR amplifikace:
mikrolitrů izolované DNA bylo amplifikováno v následující reakční směsi:
| ABsolute™ QPCR Mix (2x konc.) | (Thermo Scientific) | 12,5 μΐ |
| Primer Asp-F (25 μΜ)* | (Generi Biotech) | 0,4 μΐ |
| Primer ITS-R (25 μΜ)** | (Generi Biotech) | 0,4 μΐ |
| MilliQ voda | 6,7 μΐ | |
| DNA | 5μ1 | |
| Celkový objem | 25 μΐ |
Při tomto reakčním profilu: l:95°C/15min
2: 95°C /15s
3:60°C/lmin
4: jdi na krok 2, 19x *,** - podle Schabereiter-Gurtner, C., et al., Development of novel real-time PCR assays for detection and differentiation of eleven medically important Aspergillus and Candida species in clinical specimens. J Clin Microbiol, 2007. 45(3): p. 906-14.
V této reakční směsi byla tedy po 20 cyklech PCR předamplifíkována plísňová DNA, která je ve vzorku přítomna. Jeden mikrolitr PCR produktu z této reakce byl použit pro další amplifikaci v real-time PCR reakci, ve které byly použity primery a TaqMan MGB sonda specifická pro Aspergillus fumigatus. Při této real-time PCR reakci byla amplifikována část genu pro ribozomální DNA - internal transcribed spacer 2 (ITS2).
PCR amplifikace:
mikrolitr PCR produktu z předchozí amplifikace byl amplifikován v následující reakční směsi:
| ABsolute™ QPCR Mix (2x konc.) | Thermo Scientific | 12,5 μΐ |
| Primer Cust-fum-F (25 μΜ) | 0,4 μΐ | |
| Primer Cust-fum-R (25 μΜ) | 0,4 μΐ | |
| Sonda Cust-fum-son (25 μΜ) | 0,2 μΐ | |
| MilliQ voda | 10,5 μΐ | |
| DNA | 1 μΐ | |
| Celkový objem | 25 μΐ |
Při tomto reakčním profilu:
l:95°C/15min
2:95°C/I5s
3:60°C/lmin
4: jdi na krok 2, 45x
Současně kromě klinického vzorku byly také paralelně amplifikovány vzorky tzv. standardní DNA - tedy vzorky plazmidové DNA o známém počtu kopií naší cílové sekvence. Pomocí kalibrační přímky, která byla automaticky sestrojena pomocí Softwaru Rotorgene 6 z amplifikované standardní řady, byl určen počet kopií aspergilové DNA v PCR reakci a následně přepočtem počet kopií aspergilové DNA na 1 ml tekutiny získané bronchoalveolámí laváží.
Po provedeni PCR detekce bylo ve vzorku uvedeného pacienta zjištěno 46 576 259 kopií Aspergillus fumigatus v reakci. Toto číslo odpovídá 8,72 log kopií/ml (tj. 10 (exp 8,72) kopií/ml) tekutiny získané z BAL a jedná se tedy o vzorek velmi pozitivní. Další markéry pro invazivní aspergilózu - detekce galaktomannanu (GM) v BAL a periferní krvi - byly také velmi pozitivní. Výsledek testování GM je uváděn jako bezrozměrné číslo - tzv. index pozitivity (IP). GM v BAL - IP = 6,32 a GM v séru IP = 0,66 - přičemž hranice pozitivity je IP = 0,5. Pacient uváděný v tomto příkladu je shodný s pacientem č. 1 v Tabulce 1.
Příklad 2
Stejným postupem, jaký byl uveden v Příkladu 1, bylo zpracováno 74 vzorků BAL od 74 pacientů v riziku invazivní aspergilózy (IA). 12 vzorků (16,2 %) bylo pozitivních na A. fumigatus výše uvedenou PCR reakcí. Základní charakteristiky tohoto souboru pozitivních pacientů jsou uvedeny v Tabulce 1, V tabulce jsou uvedeny základní diagnózy pacientů a výsledky testování GM v BAL a periferní krvi jako markéru invazivní aspergilózy. Je patrné, že vysoký počet detekovaných kopií DNA A. fumigatus koreluje s vysokou pozitivitou GM (IP » 0.5). U pacientů č. 1 a 2 jsou vysoce pozitivní všechny nálezy - GM v BAL i séru, PCR v BAL - v periferní krvi byla DNA A. fumigatus detekována pouze u pacienta č. 1. U pacienta č. 3, který má jen nízkou hladinu pozitivity DNA A. fumigatus a negativní GM v séru došlo k rozvoji klinických příznaků a nárůstu pozitivity GM až během týdne od provedení BAL - zachycená pozitivita tedy odpovídá velmi ranému stádiu infekce. U pacientů 4-12 je velmi nízká úroveň pozitivity DNA A. fumigatus v BAL a GM v BAL i v séru je zcela negativní - tito pacienti také nebyli klinicky zhodnoceni jako invazivní aspergilóza.
Příklad 3
Stanovení hodnoty pozitivity
Z tabulky 1 a z námi získaných dat vyplývá, že po detekci tohoto markéru - DNA specifické pro A. fumigatus, lze v klinických vzorcích vypozorovat 3 skupiny nemocných. Pacienti, u nichž nejsou detekovány žádné kopie A. fumigatus - toto jsou pacienti zcela negativní. Pacienti, u nichž se množství detekovaných kopií pohybuje do 5 log kopií/ml BAL - u těchto pacientů patrně není A. fumigatus primární příčinou infekce a jeho záchyt ve vzorku odpovídá spíše kolonizaci nebo časné fázi infekce. A poslední skupinou jsou pacienti, u nichž je detekováno více než 7 log kopií/ml BAL a u nichž je tedy diagnóza invazivní aspergilózy jednoznačně potvrzena.
<nmmooooooooo
HHHHHHHHHHHH pciEqpMfabpqfaEqfahEuh HHHHHHHHHHHH
Φ •d e φ s φ υ
s Φ TJ
CMrtCJOfMHOHHHHO
HHHHHHHHHHHH tuERiEMEuEwhhbhCuhh HHHHHHHHHHHH
Φ H „OHHHHHHOH OH°OOOOOOOOO ti £
a
Ή •d & -M tn o
0 O Λ r π n 6i η o m
0 0 CO ω ω σ> h
0 o o o o
CO σι cu t a w 6 (*) CQ Λ Λ οι ω cn oi
H W (N
O O O O
H m
σι o ω
<n
O o 6|
O
O o 6| σι
61 o o
O o
6| <*)
O o 61
O
6| ro o 6| <0 o o 61
N
O o
6| rd
Ί· O O 61
6|
H 0 Jd Φ <H C o >1 o
ΙΓ)0Γ-Φ<Λ°3η
- ΛΟ *
Untitled.ST25
SEQUENCE LISTING < 110> Masarykova univerzita < 120> způsob diagnostiky invazivni aspergilozy a oligonukleotidy pro použiti pri tomto způsobů < 130> P1121CZ00 < 160> 5 < 170> Patentin version 3.3 < 210> 1 < 211> 242 < 212> DNA < 213> Aspergillus fumigatus < 400> 1 ctgtccgagc gtcattgctg ccctcaagca cggcttgtgt gttgggcccc cgtccccctc60 tcccggggga cgggcccgaa aggcagcggc ggcaccgcgt ccggtcctcg agcgtatggg120 gctttgtcac ctgctctgta ggcccggccg gcgccagccg acacccaact ttatttttct180 aaggttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag240 ga242 < 210> 2 < 211> 22 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> forward primer <400>
ggctttgtca cctgctctgt ag < 210> 3 < 211> 24 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> reverse primer < 400> 3 ctgatccgag gtcaacctta gaaa 24 < 210> 4 < 211> 15 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> probe <400>
ccgacaccca acttt <210> 5 <211> 80 stránka 1
Untitled.ST25 < 212> DNA < 213> Aspergillus fumigatus < 400> 5 ggttttgtca cctgctctgt aggcccggcc ggcgccagcc gacacccaac tttatttttc 60 taaggttgac ctcggatcag 80
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKYPV 200S - 15¾ 22 5841. Způsob diagnostiky invazivní aspergilózy pomocí izolace a detekce DNA Aspergillus fumigalus v biologických vzorcích odebraných z těla pacienta, vyznačený tím, že se z biologického vzorku odebraného z těla pacienta izoluje DNA a poté se provede detekce množství genu ITS2 pro ribozomální DNA Aspergillus fumigatus metodou kvantitativní PCR.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se před krokem detekce množství genu ITS2 provede předamplifikace plísňové DNA metodou PCR.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako biologický vzorek odebraný z těla pacienta použije vzorek bronchoalveolámí laváže nebo vzorek periferní krve.
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se krok izolace DNA z biologického vzorku odebraného z těla pacienta provede metodou mechanické disrupce.
- 5. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se krok předamplifikace plísňové DNA provede s použitím páru primerů, které ohraničují cílovou sekvenci pro kvantitativní PCR a jsou specifické pro genom plísní.
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako primery pro kvantitativní PCR použijí oligonukleotidy mající alespoň 85% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující GGCTTTGTCACCTGCTCTGTAG (SEQ ID NO. 2) a CTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAA (SEQ ID NO. 3), a jako sonda se použije oligonukleotid mající alespoň 85% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí CCGACACCCAACTTT (SEQ ID NO. 4).
- 7. Oligonukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující sekvence mající alespoň 85% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující GGCTTTGTCACCTGCTCTGTAG (SEQ ID NO. 2), CTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAA (SEQ ID NO. 3), CCGACACCCAACTTT (SEQ ID NO. 4).
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090253A CZ302670B6 (cs) | 2009-04-21 | 2009-04-21 | Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
| PCT/CZ2010/000052 WO2010121578A1 (en) | 2009-04-21 | 2010-04-20 | Method for in vitro diagnostics of invasive aspergillosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090253A CZ302670B6 (cs) | 2009-04-21 | 2009-04-21 | Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2009253A3 true CZ2009253A3 (cs) | 2010-11-03 |
| CZ302670B6 CZ302670B6 (cs) | 2011-08-24 |
Family
ID=42556997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090253A CZ302670B6 (cs) | 2009-04-21 | 2009-04-21 | Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302670B6 (cs) |
| WO (1) | WO2010121578A1 (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008051285A2 (en) | 2006-04-01 | 2008-05-02 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for detecting fungi and mycotoxins |
| US20100068718A1 (en) | 2008-08-22 | 2010-03-18 | Hooper Dennis G | Methods and Compositions for Identifying Yeast |
| US8962251B2 (en) | 2009-10-08 | 2015-02-24 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for identifying sulfur and iron modifying bacteria |
| PT107037B (pt) * | 2013-07-03 | 2017-09-13 | Chromoperformance S A | Sonda de ácido péptido nucleico (pna), estojo e método para deteção de aspergillus fumigatus e respetivas aplicações |
| CN107130015B (zh) * | 2016-02-29 | 2023-07-11 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种检测烟曲霉菌的荧光定量pcr试剂盒 |
| US20170369952A1 (en) * | 2016-06-17 | 2017-12-28 | Advatect Diagnostics, Llc | Methods and compositions for identifying and quantifying microbial dna |
| CN107164478A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-09-15 | 山西维尔生物乳制品有限公司 | 一种鉴别烟曲霉的探针、引物和基因芯片 |
| CN113106167B (zh) * | 2021-04-26 | 2022-09-20 | 北京大学第一医院 | 侵袭性曲霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4425354B2 (ja) * | 1997-05-02 | 2010-03-03 | ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
| WO2002079512A2 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-10 | University Of Nevada - Las Vegas | Method for detection and quantification of the fungus aspergillus fumigatus using quantitative pcr |
| WO2007101664A2 (de) * | 2006-03-08 | 2007-09-13 | Fungus Bioscience Gmbh | Verbesserter aspergillosetest in klinischen proben |
-
2009
- 2009-04-21 CZ CZ20090253A patent/CZ302670B6/cs unknown
-
2010
- 2010-04-20 WO PCT/CZ2010/000052 patent/WO2010121578A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ302670B6 (cs) | 2011-08-24 |
| WO2010121578A1 (en) | 2010-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2009253A3 (cs) | Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu | |
| CN107636172B (zh) | 用于诊断、预测或监测肺孢子菌肺炎的工具 | |
| O'Sullivan et al. | Development and validation of a quantitative real-time PCR assay using fluorescence resonance energy transfer technology for detection of Aspergillus fumigatus in experimental invasive pulmonary aspergillosis | |
| RU2420595C2 (ru) | СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ИНТЕРЕС БАКТЕРИИ В ЖИВОМ СОСТОЯНИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ рРНК В КАЧЕСТВЕ МИШЕНИ | |
| CN110129458B (zh) | 一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光pcr试剂盒和方法 | |
| Shipitsyna et al. | Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia | |
| Rahn et al. | A novel comprehensive set of fungal Real time PCR assays (fuPCR) for the detection of fungi in immunocompromised haematological patients—A pilot study | |
| CN114958837B (zh) | 一种快速精准检测耳念珠菌的引物组合物、试剂盒及方法 | |
| Cetinkaya et al. | Molecular detection and prevalence of feline hemotropic mycoplasmas in Istanbul, Turkey | |
| CN101586157B (zh) | 一种鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒及检测方法 | |
| EP2339026A1 (en) | Method for simultaneously detecting histoplasma capsulatum and paracoccidioides brasiliensis | |
| WO2016141370A2 (en) | Methods and compositions for identifying pathogenic vibrio parahaemolyticus | |
| CN103882140A (zh) | 结核分枝杆菌快速诊断试剂盒 | |
| Jiang et al. | Detection and identification of Mucorales and Aspergillus in paraffin-embedded samples by real-time quantitative PCR | |
| IE20060925A1 (en) | Nucleic acids probes for detection of yeast and fungal species | |
| CN102146452B (zh) | 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测的引物、探针及其应用 | |
| CN102146453B (zh) | 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN114807416A (zh) | 热带念珠菌的rpa-lfs检测引物探针组合及其应用 | |
| El-Morsy et al. | Allergic fungal rhinosinusitis: detection of fungal DNA in sinus aspirate using polymerase chain reaction | |
| De Groot et al. | Genotyping of Aspergillus fumigatus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues and serum samples from patients with invasive aspergillosis | |
| WO2022023564A1 (en) | Whole nucleic acids rt-qpcr method for detecting histoplasma capsulatum fungus pathogen(s), histoplasmosis diagnosis and treatment methods, means thereof | |
| CN111778343A (zh) | 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用 | |
| JP2018068261A (ja) | Ｌａｍｐ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法 | |
| RU2639498C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя бластомикоза blastomyces dermatitidis | |
| CN104745688A (zh) | 一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒 |