PT107037B

PT107037B - Sonda de ácido péptido nucleico (pna), estojo e método para deteção de aspergillus fumigatus e respetivas aplicações

Info

Publication number: PT107037B
Application number: PT107037A
Authority: PT
Inventors: Filipe Ribeiro Pinto De Oliveira Azevedo Nuno; João Lopes Da Costa Vieira Maria; Manuela Fernandes Almeida Carina; Isabel Macieira Cerqueira Laura
Original assignee: Chromoperformance S A
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2017-09-13
Also published as: EP3017060A1; WO2015002560A1; US20160137693A1; PT107037A

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE À CONCEPÇÃO DE UMA SONDA DE ÁCIDO PÉPTIDO NUCLEICO (PNA) PARA A DETEÇÃO E DISTINÇÃO DE ESTIRPES DE ASPERGILLUS FUMIGATUS EM DIFERENTES TIPOS DE AMOSTRAS. PNA É UMA MOLÉCULA SINTÉTICA ANÁLOGA AO ADN. DEVIDO ÀS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS INERENTES À SUA ESTRUTURA, ESTAS SONDAS PERMITEM UMA ANÁLISE MAIS RÁPIDA E SENSÍVEL DO QUE USANDO SONDAS DE ADN. ESTA SONDA É APLICADA A UM PROCESSO BASEADO EM TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR, NOMEADAMENTE DE HIBRIDAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH), APLICÁVEIS NA DETEÇÃO DE ASPERGILLUS FUMIGATUS EM DIVERSOS TIPOS DE AMOSTRAS CLÍNICAS INCLUINDO SANGUE, SORO, EXPETORAÇÃO, LAVADOS BRONCOALVEOLARES E BIOPSIAS. A COMBINAÇÃO DESTAS DUAS TECNOLOGIAS TORNA O PROCEDIMENTO DO FISH MAIS RÁPIDO, SIMPLES E EFICAZ. OUTRO DOS ASPECTOS DA PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM O DESENVOLVIMENTO DE UM ESTOJO PARA DETECÇÃO E NO REFERIDO PROCESSO, QUE TEM COMO OBJECTIVO A IDENTIFICAÇÃO DE ASPERGILLUS FUMIGATUS EM AMOSTRAS CLÍNICAS.

Description

DESCRIÇÃO

SONDA DE ÁCIDO PÉPTIDO NUCLEICO (PNA), ESTOJO E MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ASPERGILLUS FUMIGATUS E RESPECTIVAS APLICAÇÕES

Campo da Invenção

Esta invenção insere-se no âmbito de um processo de detecção de microrganismos clinicamente relevantes, tendo sido desenvolvida uma sonda de ácido péptico nucleico (PNA) para a detecção e distinção de estirpes de Aspergillus fumigatus.

Outro dos aspectos da presente invenção relaciona-se com a aplicação desta sonda e referido processo de detecção a um estojo para a detecção de Aspergillus fumigatus em amostras biológicas tendo, portanto, aplicação clinica.

Antecedentes da Invenção

Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso saprófito que se alimenta de matéria orgânica em decomposição e produz centenas de esporos (conidios) que pela sua estrutura celular podem sobreviver a ambientes agressivos. Esta estratégia de protecção confere ubiquidade ao Aspergillus fumigatus, podendo espalhar-se pelo ar e colonizar novos nichos ecológicos. Este fungo pode colonizar a mucosa das vias respiratórias humanas. Dependendo do estado do sistema imunológico do hospedeiro, os esporos inalados podem ser determinantes em doenças respiratórias. De facto, o Aspergillus fumigatus é o maior agente causador de doenças pulmonares como a Aspergilose invasiva, que assume contornos particularmente graves em doentes imunocomprometidos que precisam de um transplante de órgãos ou células estaminais, ou sofrem de asma, tuberculose ou sida.

Como este não é o único fungo filamentoso que se espalha pelo ar, esta espécie deverá ter algumas particularidades que o tornam patogénico. De facto a sua virulência pode ser em parte explicada pela sua termotolerância, já que o A. fumigatus consegue crescer numa gama de temperaturas muito variada. Cresce bem a 37° C mas consegue sobreviver a temperaturas mais elevadas (50° C). Além disso, o pequeno diâmetro dos conídios (2-3 pm) e a composição peculiar da sua parede celular permite-lhes viajar através do sistema respiratório para os alvéolos pulmonares, onde se podem depositar. Uma maior resistência perante condições ambientais adversas, tais como a resposta do sistema imunitário e o stress oxidativo, são outras características deste fungo que o distingue de outras espécies não tão frequentemente prejudiciais.

O desenvolvimento de Aspergilose Invasiva pode ser explicado pelo ciclo de vida infeccioso no hospedeiro humano. Depois do fungo se depositar na cavidade pulmonar, inicia um comportamento patogénico nos doentes vulneráveis pela adesão ao tecido epitelial e endocitose. Dentro das células epiteliais, os conídios começam a expandir e iniciam o processo de germinação. As hifas germinadas podem abandonar as células epiteliais e infiltrar-se nos vasos sanguíneos, provocando danos nas células endoteliais. Subsequentemente podem disseminar-se através da circulação sanguínea, espalhando a infecção por outros órgãos. A complexidade de todos estes mecanismos envolvidos e a grande capacidade de resistência deste fungo a antifúngicos faz com que a Aspergilose Invasiva seja uma doença difícil de tratar, o que leva a taxas de mortalidade elevadas.

Um diagnóstico precoce e preciso, usando amostras clínicas como lavados broncoalveolares, expetoração e sangue, entre outras, é crucial para que haja um tratamento de sucesso. Os métodos de diagnóstico mais utilizados, até ao presente, baseiam-se em técnicas não específicas como a visualização directa por microscopia, testes serológicos (ELISA) que visam os componentes da parede celular dos fungos (galactomanano e (l,3)-p-D glucano)ou os métodos de cultura que são, no entanto, bastante fastidiosos e demorados. Técnicas moleculares baseadas em PCR têm vindo a ser usadas como uma alternativa, mas devido à falta de padronização da metodologia e ao aparecimento frequente de resultados falso positivos, o uso alargado desta técnica como método de diagnóstico ainda não ocorreu.

A técnica de hibridação fluorescente iD situ (FISH) tem mostrado resultados prometedores, podendo ser aplicada directamente nas amostras. Esta técnica detecta com elevada especificidade os microrganismos de interesse pela ligação de sondas oligonucleotídicas a zonas específicas de ARN ribossomal (rARN) que se apresenta em elevado número nas células. Mais recentemente, têm sido desenvolvidas e optimizadas sondas de ácidos péptido nucleicos (PNA) para a detecção bacteriana. As moléculas de PNA são mímicas das de ADN, na qual a estrutura carregada negativamente de açúcar-fosfato é substituída por uma estrutura aquiral e eletricamente neutra formada por unidades repetidas de N -(2-aminoetil) glicina.

Embora a molécula de PNA não possua pentoses, ocorre hibridação específica entre as sequências de PNA e as sequências complementares de ácidos nucleicos, por pontes de hidrogénio. Esta hibridação obedece às regras de Watson-Crick (US5539082).

A natureza electricamente neutra do PNA é responsável pelas características de hibridação mais robustas desta molécula, no que respeita à alta estabilidade nas ligações PNA/sequência alvo (rARN ou ADN de cadeia dupla) , quando se compara com as sondas de ADN, tradicionalmente usadas. Assim, devido à sua afinidade elevada, as sondas de PNA têm sequências de nucleótidos relativamente curtas, preferivelmente entre 8 a 18 nucleótidos. Uma sonda de ADN tem, normalmente, pelo menos 18 nucleótidos (Lomakin, 1998), devido à sua fraca estabilidade e baixa temperatura de fusão (Tm), requerendo também processos adicionais de fixação e permeabilização com enzimas ou outros agentes. As moléculas de PNA apresentam também uma maior resistência a proteases e nucleases que a molécula natural de ADN.

Quando acopladas a um fluorocromo, as sondas de PNA podem ser detectadas por microscopia ou citometria de fluxo. Esta técnica produz resultados mais céleres em amostras clinicas, quando comparados com os métodos de cultivo tradicionais, tendo sido provadas a sua eficácia, rapidez, sensibilidade e especificidade. A sua aplicação é também muito abrangente, podendo ser usada em diversas áreas da microbiologia, incluindo a detecção de microrganismos patogénicos em amostras de origem humana, alimentares e ambientais.

Diversas sondas de PNA foram anteriormente desenvolvidas e optimizadas para alguns microrganismos, incluindo bactérias, espécies de Candida e fungos filamentosos (Perry-0'Keefe et al, 2001; Cerqueira, et al, 2011; Almeida et al, 2010; Oliveira et al, 2001; Teertstra et al, 2004; Shinozaky et al, 2010) .

É importante referir que, embora seja um teste muito robusto após a sua optimização, o desenvolvimento de métodos de FISH com sondas de PNA são, tal como o desenvolvimento dos métodos de PCR, extremamente exigentes e requerem um grande conhecimento das características químicas e físicas dos diferentes parâmetros envolvidos. Para além disso, o facto de se ter um método de PNA FISH a funcionar para um determinado organismo não é garantia de que outras sequências que se ligam ao mesmo organismo vão funcionar do mesmo modo. Relativamente ao A. fumlgatus ainda não foi desenvolvido até agora nenhum método de PNA-FISH.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a uma sonda de ácido péptido nucleíco (PNA) para a detecção (identificação ou quantificação) de Aspergillus fumigatus.

A sonda descrita na presente invenção reconhece o 28S rARN do microrganismo correspondentes sequências genomicas sondas de PNA têm à sua estrutura que, em questão ou as ao rARN mencionado. As caracteristicas físico-químicas inerentes quando aplicadas a um método baseado na tecnologia FISH, permitem uma análise mais rápida, robusta e específica do que usando uma sonda de ADN. Uma das vantagens deste método é que a sonda funciona de um modo robusto numa variedade de amostras biológicas, o que usualmente não acontece com os outros métodos de detecção molecular.

Outro aspecto relevante é o tempo requerido para a detecção. 0 método aqui descrito possui os melhores tempos de execução descritos comparando com os outros métodos moleculares, mesmo quando as amostras necessitam de um período de germinação anterior à análise. A rapidez e a consistência do método podem determinar o tratamento adequado e atempado de infecções, numa perspectiva clínica.

Outro dos aspectos da presente invenção relaciona-se com o desenvolvimento de um estojo, baseado na aplicação desta sonda à técnica de hibridação fluorescente in situ (FISH), que permite a detecção do Aspergillus fumigatus em amostras biológicas, de uma forma simples e rápida.

Numa das concretizações preferenciais da presente invenção, a sonda de PNA aqui descrita permite a detecção da sequência alvo no rARN, rADN ou em sequências complementares do rARN do Aspergillus fumigatus.

Outro aspecto da presente invenção é a descrição de uma sonda de PNA usada para a detecção e/ou quantificação de Aspergillus fumigatus caracterizada por ter pelo menos 86% de homologia com a sequência SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3' , preferencialmente 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de similaridade com a sequência:

SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3'.

Numa concretização preferível da presente invenção as sequências descritas anteriormente estão ligadas a pelo menos uma fracção detectável. O tipo de fracção detectável a ser usado pode ser seleccionado de um dos seguintes grupos: conjugados, sistema de cromóforos, fluoróforos, radioisótopos, enzimas, haptenos, composto quimioluminescente, entre outros.

Como exemplo, entre a classe dos fluoróforos são preferíveis para utilização (mas não limitados a: fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7' diclorofluoresceína, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio).

Também é objecto da presente invenção um kit para a detecção da presença ou ausência e/ou quantificação de Aspergillus fumigatus em amostras clínicas.

Num objecto preferencial da presente invenção, o kit poderá apresentar, adicionalmente, pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução fixadora, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.

Em outro objecto preferencial da presente invenção, a solução fixadora pode conter paraformalderdo e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformalderdo e 25-90% (vol/vol) etanol e/ou a solução de hibridação pode conter formamida.

É ainda objecto da presente invenção a descrição do método de detecção de Aspergillus fumigatus ou para a detecção de A. fumigatus em amostras biológicas, que usam a sonda de PNA mencionada antes e que é composta pelos seguintes passos:

- Contacto com a sonda de PNA com amostras biológicas

Hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo do microrganismo presente na amostra biológica

Detecção da hibridação como indicação da detecção e quantificação nas amostras biológicas, sendo que a hibridação pode ser feita preferencialmente por fluorescência.

As amostras biológicas podem ser retiradas do sangue, expetoração, lavados broncoalveolares, biopsias, ar, comida, água, entre outras.

É também objecto da presente invenção o uso da sonda de PNA descrita anteriormente, o uso do estojo descrito anteriormente e a metodologia para detecção de A. fumigatus ou detecção de A. fumigatus em amostras biológicas.

Descrição geral da invenção

A presente invenção engloba uma sonda de PNA, reagentes, métodos e estojo destinados à detecção de estirpes de Aspergillus fumigatus. A maior especificidade das sondas de PNA (relativamente às sondas de ADN) permite uma melhor discriminação de sequências de nucleótidos relacionadas com um ou dois nucleótidos de diferença. Na presente invenção este aspecto assume particular relevância, uma vez que a diferença entre estirpes de A. fumigatus e de algumas outras espécies é de precisamente uma base, para esta região nucleotidica.

De acordo com a invenção, a sonda de PNA aqui descrita permite a detecção da sequência alvo no rARN, rADN ou em sequências complementares no rARN do Aspergillus fumigatus.

A sonda desta invenção é usada para análise por hibridação in situ de A. fumigatus opcionalmente presente na amostra, preferivelmente através da técnica de hibridação in situ fluorescente.

A sonda de PNA descrita nesta invenção tem 15 nucleótidos com a seguinte sequência nucleotidica:

SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3'

No entanto, a sonda a ser usada na detecção poderá apresentar pelo menos 86% de similaridade com a sequência SEQ ID No. 1.

Esta sonda é aplicada por hibridação in situ de fluorescência (FISH) . 0 desenho desta sonda de PNA FISH foi efetuado primeiramente in silico usando softwares específicos. A selecção da sequência foi feita pelo alinhamento de sequências de rADN do microrganismo alvo o que permitiu a identificação de regiões potencialmente úteis posteriormente avaliadas através de outros parâmetros como a especificidade, temperatura de hibridação, conteúdo de guaninas e citosinas, energia livre de ligação e estruturas secundárias.

Depois do desenho e sintese da sonda, foi necessário optimizar, para a sonda escolhida, os três passos do procedimento do FISH, fixação/permeabilização, hibridação e lavagem. Este processo envolve alguns parâmetros como temperatura, concentração de formamida e de etanol e tempos de hibridação e de lavagem.

Uma hibridação bem sucedida permite depois, por exemplo, por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou PCR em tempo real, aferir da presença/ausência, concentração e caracterização do microrganismo em questão.

sinal detectado é geralmente o resultado de ligações específicas entre as moléculas de sonda com as centenas de cópias de rARN presentes no citoplasma da célula bacteriana.

Para tal também é importante considerar a fracção da sonda de PNA que permita a detecção/ identificação da existência de um complexo estável formado pela sonda e o alvo. Essa fracção detectável da sonda é seleccionada a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de detecção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente.

No âmbito da presente invenção podem ser também usadas sondas bloqueadoras sem fracção detectável para reduzir ou eliminar a hibridação da sonda de PNA a sequências não desejáveis.

método descrito na presente invenção compreende o contacto de uma amostra com a sonda de PNA descrita anteriormente. De acordo com o método, os microrganismos numa amostra são detectados, identificados ou quantificados, correlacionando a hibridação, realizada nas condições de hibridação adequadas, da sequência de PNA com a sequência alvo. Consequentemente, a análise é baseada num único ensaio com um parecer definitivo. Em contraste, os métodos de rotina actuais para a análise de microrganismos são baseados em caracteristicas fenotípicas múltiplas envolvendo múltiplos testes.

A invenção contempla um estojo adequado à execução do ensaio para detectar, identificar ou quantificar A. fumigatus presente em amostras. 0 estojo da invenção inclui uma ou mais sondas de

PNA e outros reagentes ou compostos seleccionados para a realização dos ensaios de hibridação íD situ

Preferivelmente, o método pretende ser um meio de diagnóstico coadjuvante para a decisão terapêutica, permitindo deste modo, a partir da obtenção de uma amostra do paciente e a determinação da presença de estirpes de A. fumigatus, ao clinico adequar o tratamento de acordo com os resultados do teste obtidos.

As sondas de PNA podem ser aplicadas directamente na amostra preparada numa lâmina (esfregaço), já que a aplicação destas sondas não envolve o uso de reagentes ou enzimas para a permeabilização das membranas celulares antes da hibridação. No entanto, necessita de alguns dos compostos mais utilizados nas hibridações. Assim, as sondas são normalmente incluídas em estojos que permitam um mais fácil manuseamento por parte dos utilizadores. Encontram-se já divulgados exemplos de estojos que utilizam sondas de PNA para a separação electroforética de amostras de ADN (US2005053944, WO9712995, EP1477572) . Se a abordagem necessária envolve a análise de PNA FISH por citometria de fluxo, a sonda poderá ser aplicada à amostra em suspensão usando os mesmos compostos de hibridação.

Descrição detalhada da invenção

I - Definições

a) Como usado neste documento, o termo nucleótido inclui moléculas naturais e não naturais normalmente conhecidas por quem utiliza tecnologia relacionada com ácidos nucleicos, para desse modo gerar polímeros que se ligam especificamente a ácidos nucleicos.

b) Quando usado o termo sequência de nucleótidos, é o mesmo que referir um segmento de um polímero que contém subunidades, neste caso os nucleótidos.

c) 0 termo sequência alvo significa uma sequência de nucleótidos de Aspergillus fumigatus que se pretende que seja detectada no ensaio, onde a porção de nucleótidos da sonda é desenhada para hibridar.

d) 0 termo sonda de PNA significa um polímero de subunidades de PNA que apresenta uma sequência de nucleótidos é específica para hibridar com uma sequência alvo do microrganismo de interesse. As moléculas de PNA são mímicas das de ADN, na qual a estrutura carregada negativamente de açúcar-fosfato é substituída por uma aquiral e eletricamente neutra formada por unidades repetidas de N (2-aminoetil) glicina.

e) Quando é usado o termo fracção detectável, este refere-se a moléculas que podem ser ligadas à sonda, para, assim, tornar a sonda detectável por um instrumento ou método.

f) 0 termo amostra refere-se a qualquer amostra biológica ou amostra clínica que pode conter o microrganismo ou sequência alvo para a detecção. Preferivelmente as amostras biológicas estão na forma líquida (exemplo: sangue, soro, lavados broncoalveolares, e mesmo expetoração) ou como amostra de tecido (exemplo: biopsia).

II - Breve descrição do desenho da sonda

A Figura 1 representa um alinhamento parcial do 28S rARN de sequências usadas para a selecção da sonda. A sequência complementar da FUM274 está representada na parte de cima da figura e as posições polimórficas estão também marcadas.

III - Descrição

Concepção das sondas de PNA:

De modo a encontrar uma sequência de oligonucleotidos de A. fumigatus que possa ser usada como sonda de PNA, foram usadas vinte e quatro sequências 28S do rARN disponíveis nas bases de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e SILVA (http://www.arbsilva.de/browser/). As sequências usadas foram compostas por onze sequências de Aspergillus fumigatus, 6 de PeD icilliumsp., 4 de Aspergillus terreus e 3 de Neosartorya fischeri. As regiões de interesse foram selecionadas usando o Clustal W (European Bioinformatics Institute; http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)(exemplo de algumas sequências usadas na Figura 1) . Outros critérios foram tidos em consideração, como a percentagem de guaninas e citosinas, o tipo de estruturas secundárias e a temperatura de hibridação. A sequência seleccionada que detectou o maior número de sequências de A. fumigatus e o menor número de sequências de não A. fumigatus foi o 5'-ACA GAG CAG GTG ACA-3'. A sequência liga-se no 28S rARN entre as posições 274 e 288 do A. fumigatus A1163 (número de acesso ABDBO1000088; base de dados do SILVA), e por isso foi designada de FUM274. A sonda não apresentava estruturas secundárias com auto-complementaridade e possuia 53% de conteúdo em guaninas e citosinas.

Avaliação teórica do desempenho da sonda de PNA:

Depois do desenho da sonda, o seu desempenho foi avaliado pela determinação dos valores teóricos de sensibilidade e especificidade. Para tal foi usado o software ProbeCheck da base de dados ARB-SILVA (http://www.arb-silva.de/fish-probes/probedesign/). A especificidade foi calculada pela fórmula nAfs/ (TnAf) X 100, onde nAfs é o número de sequências de não A. fumigatus que não reagiram com a sonda e TnAf é o número total de sequências de não A. fumigatus examinados. A sensibilidade foi calculada como Afs/ (TAfs) X 100, onde Afs é o número de sequências de A. fumigatus detectadas pela sonda e TAfs é o número total de sequências presentes na base de dados. A busca mostrou que a sonda FUM274 detectou 79 das 80 sequências de A. fumigatus 28S disponíveis na base de dados que cobrem a posição do alinhamento da sonda selecionada. Deste modo a sensibilidade teórica foi de 98.8% Nenhuma outra espécie testada revelou sequências complementares com a sonda e por isso a especificidade teórica foi de 100%. Posteriormente, a sequência foi sintetizada e o oligomero foi ligado, no terminal N, com o fluorocromo Alexa Fluor 594.

A sonda de PNA descrita nesta invenção é composta preferencialmente por 15 nucleótidos e poderá ser pelo menos 86% idêntica à sequência SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3', preferencialmente 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de similaridade com a sequência SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3' .

Alternativamente, esta invenção contempla também variações nas sequências nucleotidicas das sondas. Tais variações podem incluir deleções, inserções entre outras. Como exemplo, ver as seguintes sequências:

SEQ	ID	No .	2	- 5'-	CTA	CAG	AGC	AGG	TGA	-3
SEQ	ID	No .	3	- 5'-	CAG	AGC	AGG	TGA	CAA	-3
SEQ	ID	No .	4	- 5'-	CTA	CAG	AGC	AGG	TGA	CA

Fracção detectável da sonda de PNA:

Não limitado aos seguintes exemplos, a fracção detectável da sonda de PNA pode incluir diferentes tipos de moléculas, como conjugados de dextrano, cromóforos, fluoróforos, radioisótopos, enzimas, hapteno, composto quimioluminescente entre outros.

Como exemplo, entre a classe dos fluoróforos são preferíveis para utilização (mas não limitados a): fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7' diclorofluoresceína, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio) .

Método:

A presente invenção apresenta um método para a determinação da presença de A. fumigatus numa amostra usando uma sequência nucleotidica com pelo menos 86% de homologia com a região de 15 nucleótidos aqui descrita - SEQ ID No. 1.

As caracteristicas da sonda de PNA usada no método foram descritas anteriormente neste documento, com as sequências referidas.

método pode contemplar o contacto de uma amostra com a sonda de PNA descrita neste documento com a sequência alvo do fungo sob condições de hibridação adequadas ou condições de hibridação in situ adequadas. 0 método pode ser dividido em algumas fases: preparação da amostra, que, se necessário, pode incluir um passo de pré-germinação dos esporos; fixação; hibridação, lavagem e visualização dos resultados (ver exemplo 1) . 0 método pode ser efectuado tanto em lâminas (esfregaço) como em suspensão.

Condições de Hibridação:

Os passos seguintes descrevem uma possivel optimização das condições de hibridação mas não são uma limitação desta invenção.

Existem vários factores que impõem ou controlam o rigor da hibridação da sonda de PNA a sequências alvo. Estes incluem a percentagem de formamida usada (ou outro reagente quimico desnaturante), a concentração salina e consequentemente a força iónica, a temperatura de hibridação, a concentração de detergente, o pH, entre outros.

Para detectar as condições óptimas de hibridação, pode ser necessário fixar os diferentes factores e variar cada factor isoladamente até se encontrar um grau de discriminação desejado.

Quanto mais próxima se encontra uma sequência alvo de outra nãoalvo na amostra, maior terá que ser o grau de rigor na definição dos diferentes factores que influenciam a hibridação. Nesta invenção sequências não-alvo podem ter apenas um nucleótido de diferença em relação às sequências alvo, sendo necessário um elevado nivel de descriminação, para evitar hibridações não especificas da sonda de PNA a sequências não-alvo. Sondas de PNA bloqueadoras podem ser usadas neste método para suprimir essas ligações não especificas. Para tal dirige-se essas sondas às sequências não-alvo semelhantes às sequências alvo. É geralmente aceite que as sondas bloqueadoras actuam formando complexos termodinamicamente mais estáveis que aqueles formados entre a sonda de PNA e essas mesmas sequências não-alvo, evitando esta última ligação.

Para a sonda descrita neste documento, foram detectadas as seguintes condições:

- Temperaturas de hibridação entre 53 °C e 59 °C. 0 sinal mais forte foi detectado a 55 °C, tanto para hibridação em lâmina como em suspensão.

- No passo de fixação usaram-se concentrações de etanol que vão dos 50% aos 80% mas não se verificaram diferenças na intensidade de sinal quando se usaram as diferentes concentrações.

- O tempo de hibridação foi testado (30, 45, 60 e 90 minutos) mas os tempos entre 45 minutos e 60 minutos foram mais eficientes.

Depois da optimização de todos os parâmetros referidos acima, o procedimento que apresentou melhores resultados no que diz respeito a um mais forte sinal de fluorescência, foi o descrito a seguir:

Esfregaços de culturas de Aspergillus fumigatus foram preparados em lâminas apropriadas para visualização em microscopia de fluorescência. Os esfregaços foram então imersos em 4% (peso/vol) de paraformaldeído por 10 minutos, seguido de 50% (vol/vol) de etanol, também por 10 minutos. As amostras foram deixadas a secar e depois cobertas com 20 μΐ de solução de hibridação que contém: 10% (peso/vol) Sulfato de dextrano; 10 mM NaCl; 30% (vol/vol) formamida; 0.1% (peso/vol) Pirofosfato de sódio; 0.2%(peso/vol) polivinilpirrolidona; 0.2% (peso/vol) Ficoll; 5 mM EDTA dissódico; 0.1% (vol/vol) Triton X-100; 50 mM

Tris-HCl (pH 7.5) e 200nM da sonda de PNA. As amostras foram então cobertas com lamelas e colocadas em pequenas caixas humedecidas e protegidas da luz e incubadas durante 60 minutos a 55 °C. Subsequentemente, as lamelas foram removidas e as lâminas imersas em solução de lavagem pré-aquecida a 55 °C, que contém: 5 mM Tris Base, 15 mM NaCl and 1 % (vol/vol) Triton X-100 (pH 10). Este passo de lavagem demora 30 minutos a 55 °C. As lâminas são depois retiradas da solução de lavagem e colocadas a secar na mesma incubadora a 55 °C, por cerca de 5 minutos. Antes da observação ao microscópio coloca-se na lâmina uma gota de óleo de imersão não fluorescente e uma lamela. As lâminas foram guardadas no escuro por um máximo de 24 horas antes da visualização ao microscópio.

A hibridação pode também ser efectuada em suspensão. Em alguns casos, este procedimento ajuda a eliminar a quase totalidade da autofluorescência, nomeadamente a que está associada aos eritrócitos, no caso de amostras de sangue.

Neste caso, cerca de lml de cultura é centrifugada (10,000xg por 10 minutos) e homogeneizada em 500μ1 de paraformaldeído a 4% ficando à temperatura ambiente durante uma hora. As células são novamente centrifugadas para remover o paraformaldeído e homogeneizadas em 500 μΐ de etanol a 50% (vol/vol) . Após 30 minutos de incubação a -20°C, as células são homogeneizadas novamente em 100 μΐ de solução de hibridação que contém 200 nM da sonda de PNA e incubadas a 55 °C durante uma hora. Após o passo de hibridação, as células são centrifugadas e homogeneizadas em 500 μΐ de solução de lavagem (como descrito em cima) e incubadas a 55°C por 30 minutos.

No final as células são novamente centrifugadas para remover a solução de lavagem e homogeneizadas em 500 μΐ de água estéril. Cerca de 20 μΐ dessa suspensão celular são colocados numa lâmina de fluorescência ou 200 μΐ são filtrados numa membrana (tamanho do poro 0.2 pm, nitrato de celulose).

Para se verificar que o sinal observado no microscópio não estará relacionado com autofluorescência, todas as amostras foram observadas nos outros filtros disponíveis no microscópio. Foram também efectuados controlos negativos em cada ensaio seguindo o mesmo procedimento usado para as amostras, mas sem a adição de sonda na solução de hibridação.

Teste da especificidade e sensibilidade experimentais da sonda:

Depois da completa optimização do método de hibridação, foram testados experimentalmente os sensibilidade da sonda de PNA.

valores de especificidade e Para isso, o procedimento foi aplicado em oito estirpes de A. fumigatus, doze Aspergillus não fumigauts

Aspergillus (Aspergillus versicolor, ochraceus, Aspergillus var. echinulata e estirpes de fungos ibericus, Aspergillus Aspergillus terreus, tubingensis, Aspergillus oryzae, duas estirpes de Aspergillus flavus, duas estirpes de Aspergillus Niger, Emericella nidulans Neosartorya fisheri var. glabra), nove filamentosos e leveduras (Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum, Mucor hiemalis, Trichoderma viride, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida albicans) e quarto bactérias que podem estar relacionadas com doenças pulmonares (Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa CECT 111, Escherichia coli K12 e Staphylococcus aureus). A sonda apenas hibridou com as estirpes de Aspergillus fumigatus e deste modo tanto a especificidade como a sensibilidade são de 100%, demonstrando a boa qualidade da sequência seleccionada no que respeita à sua capacidade em descriminar estirpes de A. fumigatus de outras espécies.

Germinação do Aspergillus fumigatus·.

Como é conhecido que os fungos filamentosos têm diferentes estruturas morfológicas como hifas e conídios, e como estes últimos apresentam uma parede celular robusta que lhes confere protecção, foi necessário verificar se a sonda actua do mesmo modo nessas diferentes estruturas. Fez-se um ensaio com conidios sem uma pré-germinação e com hifas depois de crescerem overnight. Foi observado que o sinal fluorescente era mais facilmente observável nas hifas.

Como seria importante reduzir tempo de espera antes do processo de hibridação, foram feitos ensaios para testar a actuação da hibridação, em termos qualitativos, em diferentes estados de desenvolvimento do fungo. Os conidios começam a hidratar e aumentar de volume depois de apenas 2 horas, mas esta ocorrência é mais evidente a partir das 4 horas. De qualquer modo, nestes dois tempos testados, o sinal de fluorescência ainda é fraco. Às 6 horas e 8 horas verifica-se germinação parcial e crescimento apical das hifas. Nesta fase, o sinal de fluorescência é mais intenso, estendendo-se até às 12 horas, altura em que ocorre a germinação total. Como a intensidade de sinal começa a ser mais forte a partir das 6 horas, uma germinação com este período de tempo deverá ser suficiente para detecção de A. fumigatus.

Preparação das amostras:

As amostras a analisar podem ser provenientes de, sangue, soro, expetoração, lavados broncoalveolares, biopsias, água, entre outros. No caso das biopsias, as amostras são cortadas em fatias de 3 a 5 □ m e colocadas em lâminas. A hibridação seá feita diretamente na biopsia.

As amostras como sangue e expectoração podem ser adicionadas a frascos com meio de cultura BACTEC™ Plus Aerobic/F (Becton Dickinson bottles) e postas a incubar a 37°C, 120 rpm, por um mínimo de tempo de 6h, permitindo a germinação dos conídios. Algumas amostras, como a expectoração, poderão precisar de mais tempo de incubação. A hibridação poderá ser feita em lâmina ou em suspensão.

Visualização dos resultados:

A visualização das amostras pode ser efectuada em qualquer microscópio de epifluorescência com um filtro sensível para o fluorocromo usado. Outros filtros que estejam presentes no microscópio, que não consigam detectar o sinal de fluorescência da sonda, podem ser usados para confirmar a ausência de autofluorescência.

Estojo:

A presente invenção contempla um estojo que permite a realização do ensaio que testa a presença de estirpes de Aspergillus fumlgatus.

O estojo contemplado na presente invenção inclui uma sonda de PNA com pelo menos 86% similaridade com a SEQ ID No. 1 e outros reagentes ou composições que são seleccionados para realizar o ensaio.

A sonda de PNA a usar no estojo, as suas caracteristicas e o método envolvido foram anteriormente referidos neste documento. Esta invenção pode ser usada para análise do organismo ou análise dos ácidos nucleicos extraídos ou derivados do organismo de interesse, fazendo com que a fonte da sequência alvo não seja uma limitação nesta invenção.

Os seguintes exemplos ilustram os diversos passos de aplicação da invenção, sem ter a intenção de ser limitativo em qualquer um dos deles:

EXEMPLO 1: Distinção de estirpes de Aspergillus fumigatus de outros fungos filamentosos.

Sequência da sonda de PNA:

SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3' (ligada ao fluorocromo Alexa Fluor 594) .

As estirpes de A. fumigatus e de outros fungos filamentosos com capacidade de formar conídios, foram mantidas em Sabouraud dextrose agar ou Potato dextrose agar por aproximadamente 7 dias a temperatura ambiente. Findo esse tempo, os conídios foram colhidos inundando a superfície do agar com solução salina esterilizada [NaCl 8.00 g.L^-1; KC1 0.2 g.L^-1; Na₂HPO₄.2H₂O 1.44

g.L^-1; KH₂PO₄ 0.24g.L^-1 (pH 7.4)]. A biomassa foi suspendida nessa solução salina, recolhida com uma pipeta para um recipiente estéril e deixada a repousar (5-10 minutos) para que as os fragmentos de fungo mais pesados se depositassem no fundo. O sobrenadante foi recolhido para outro recipiente estéril. A suspensão é centrifugada (10 minutos; lO.OOOg) para lavar a amostra. Subsequentemente lxlO⁶ células ml^-1 dessa suspensão são ressuspendidos em peptona-extrato de levedura-glucose (PYG) que contem peptona 1 g.L^-1; extracto de levedura 1 g.L^-1 e glucose 3 g.L^-1 (pH 5). A suspensão é então posta a incubar (aproximadamente 16h) a 37°C, 120 rpm permitindo a germinação total dos conidios. No final a suspensão é centrifugada (10 minutos; lO.OOOg), sendo o sobrenadante substituido por solução salina. Este passo é repetido duas vezes para remover qualquer resíduo do meio de crescimento. Seguidamente uma gota de cultura foi colocada em lâminas apropriadas para fluorescência e colocadas a secar numa incubadora a 55 °C durante 5 minutos ou deixadas a secar ao ar.

Fixação:

Para prevenir a perda de 28S rRNA durante o processo de hibridação as amostras foram imersas em paraformaldeído 4% (peso/vol) e etanol a 50% (vol/vol) por 10 minutos cada.

Hibridação:

Após a fixação as amostras foram cobertas com 20 μΐ de solução de hibridação que contem: 10% (peso/vol) sulfato de dextrano; 10 mM NaCl; 30% (vol/vol) formamida; 0.1% (peso/vol) pirofosfato de sódio; 0.2%(peso/vol) polivinilpirrolidona; 0.2% (peso/vol) Ficoll; 5 mM EDTA dissódico; 0.1% (vol/vol) Triton X-100; 50 mM

Tris-HCl (pH 7.5) e 200nM da sonda de PNA. As amostras foram então cobertas com lamelas (para assegurar um espalhamento homogéneo da sonda) e colocadas em pequenas caixas humedecidas e protegidas da luz (para prevenir a evaporação da solução de hibridação) e incubadas durante 60 minutos a 55 °C.

Lavagem:

Subsequentemente, as lamelas foram removidas e as lâminas imersas em solução de lavagem pré-aquecida a 55 °C, que contém: 5 mM Tris Base, 15 mM NaCl and 1 % (vol/vol) Triton X-100 (pH 10). Este passo de lavagem demora 30 minutos a 55 °C. As lâminas foram depois retiradas das solução de lavagem e colocadas a secar na mesma incubadora a 55 °C, por cerca de 5 minutos. Antes da observação ao microscópio coloca-se na lâmina uma gota de óleo de imersão não fluorescente e uma lamela. As lâminas foram guardadas no escuro por um máximo de 24 horas antes da visualização ao microscópio.

Resultados:

Os resultados foram obtidos pela observação num microscópio de fluorescência com um filtro capaz de detetar o fluorocromo Alexa Fluor 594 ligado à sonda de PNA.

EXEMPLO 2: Detecção de A, fumigatus em diferentes amostras clínicas (sangue e expectoração).

Sequência da sonda de PNA:

SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3' (ligado ao fluorocromo Alexa Fluor 594) .

Preparação das amostras:

Dez mililitros de sangue ou 1 mililitro de expectoração são adicionados a garrafas com meio BACTEC™ Plus Aerobic/F e postas a incubar a 37°C, 120 rpm. Após 6 horas (tempo de germinação minimo requerido para haver emissão de sinal de fluorescência intenso) , 1 ml é retirado das culturas e colocado em lâminas próprias para fluorescência, para se efectuar a hibridação.

Fixação:

A fixação foi efectuada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.

Hibridação:

A hibridação foi efectuada como descrito no Exemplo 1 mas com a diferença de se ter usado água destilada em vez de solução salina, nos passos de hibridação, com o propósito de melhor romper as células (por exemplo de sangue).

Lavagem:

A lavagem foi efectuada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.

Resultados:

Os resultados foram obtidos pela observação fluorescência com um filtro capaz de detetar Fluor 594 ligado à sonda de PNA.

Lisboa, 1 de Novembro de 2013.

num microscópio de o fluorocromo Alexa

Referências :

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- Cerqueira L, Fernandes RM, Ferreira RM, Carneiro F, DinisRibeiro M, Figueiredo C, Keevil CW, Azevedo NF, Vieira MJ: PNA-FISH as a new diagnostic method for the determination of clarithromycin resistance of Helicobacter pylori. BMC Microbiol 2011, 11(1):101.

- Almeida C, Azevedo NF, Fernandes RM, Keevil CW, Vieira MJ: Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl Environ Microbiol 2010, 76(13) : 4476-4485

- Oliveira K, Haase G, Kurtzman C, Hyldig-Nielsen JJ, Stender

H: Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis by fluorescent in situ hybridization with peptide nucleic acid probes. J Clin Microbiol 2001, 39(11) :4138-4141.

- Teertstra WR, Lugones LG, Wosten HA: In situ hybridisation in filamentous fungi using peptide nucleic acid probes. Fungai Genet Biol 2004, 41(12):1099-1103.

- Shinozaki M, Okubo Y, Sasai D, Nakayama H, Murayama SY, Ide T, Wakayama M, Hiruta N, Shibuya K: Identification of Fusarium species in formalin-fixed and paraffin-embedded sections by in situ hybridization using peptide nucleic acid probes. J Clin Microbiol 2010, 49(3):808-813

- US 5539082 - Peptide Nucleic Acids

- US2005053944 / WO9712995 / EP1477572 - Methods and kit for hybridization anaylsis using peptide nucleic acid probes

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sonda de PNA para a deteção e/ou quantificação de Aspergillus fumigatus caracterizada por compreender pelo menos uma sequência com pelo menos 86% de similaridade com a SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3'.
2. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por compreender pelo menos uma das seguintes sequências:

SEQ ID No . 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3'; SEQ ID No . 2 - 5' - CTA CAG AGC AGG TGA -3' SEQ ID No . 3 - 5' - CAG AGC AGG TGA CAA -3' SEQ ID No . 4 - 5'- CTA CAG AGC AGG TGA CA -3'
3. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser capaz de detetar sequências alvo no rARN, rADN ou em sequências complementares de rARN de A. fumigatus.
4. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender, adicionalmente uma sequência com pelo menos 86% similaridade com a SEQ ID No. 1 - 5'- ACA GAG CAG GTG ACA -3'.
5. Sonda de PNA, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada por estar ligada a pelo menos um tipo de fração detetável.

Sonda de PNA, de acordo com reivindicação 5, caracterizada pelo tipo de fração detetável da sonda poder ser selecionado de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma luminescente.

enzima, um hapteno ou um composto

Ί. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação
6, caracterizada pelo grupo fluoróforo ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',
7'-diclorofluoresceína, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio) .
8. Estojo para deteção do A. fumigatus caracterizado por compreender pelo menos uma das sondas descritas em qualquer das reivindicações 1 a 7.
9. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de ainda poder conter uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.
10. Estojo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela solução de fixação conter paraformaldeído e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformaldeído e 25-90% (vol/vol) de etanol.
11. Estojo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela solução de hibridação conter formamida.
12. Um método de deteção de A. fumigatus, caracterizado por usar as sondas de PNA descritas nas reivindicações 1 a 7 e que compreende os seguintes passos:

a. Sonda de PNA em contacto com as amostras biológicas, retiradas previamente do corpo humano;

b. Hibridação da sonda de PNA com as sequências alvo dos microrganismos presentes nas referidas amostras biológicas;

c. Deteção da hibridação como indicação da referida deteção e quantificação das referidas amostras.
13. Um método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela amostra biológica poder ser derivada de sangue, expetoração, lavados broncoalveolares, biopsias, ar, alimentos ou água.
14. Um método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela hibridação ocorrer por fluorescência.
15. 0 uso de sondas de PNA, como descrito em qualquer um das reivindicações 1 a 7, caracterizado na medida em que são aplicadas numa metodologia para a detecção de A. fumigatus em amostras biológicas.
16. Uso do estojo, como descrito em cada uma das reivindicações 8 a 11 caracterizado por ser aplicado na detecção de A. fumigatus em amostras biológicas.