CN101573454A - 用于荧光原位杂交和芯片技术的核酸信标 - Google Patents

用于荧光原位杂交和芯片技术的核酸信标 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于荧光原位杂交和芯片技术的核酸信标。

Description

用于荧光原位杂交和芯片技术的核酸信标
本发明涉及用于荧光原位杂交和芯片技术的核酸信标。
背景/现有技术
因为聚合酶链式反应(PCR)技术已经取得广泛的成功，微生物学实验室一直亟待将分子生物学应用于传统微生物学当中。这却为分子生物学固有本质的问题所阻碍。由于其精确性，因此需要知道选择哪种工具(探针)。前提是要根据待检测的生物体对需求进行详细说明。然而在临床样本中却无法得知超过2000多种临床相关的病原体中的哪一个才是某个感染的致病物质。一种理论方法可解决此问题。
●必须聚焦在95％的致害生物体上。
●如果知道样本来源并有临床数据，可将生物体数量减至2到16种
●大多数临床样本中覆盖95％的生物体数量大约为100数量级。
此理论使在常规基础上进行基于DNA探针的测定法在经济上变为可行。
将微生物分组并快速测试特定或一类微生物的存在/缺乏，也涉及微生物学测试的其他领域：血液库、制药工业、化妆品工业以及食品工业。相同的生物体在各种学科中频繁相关，因此则需要就所有探针对反应条件进行标准化。
通过荧光原位杂交(FISH)或使用芯片技术检测核糖体RNA代表了利用了DNA探针的灵敏性和特异性，而不必须使用酶扩增步骤的高效方法。FISH依赖两种方法，以原位检测靶标，所述靶标产生强到足以被标准测量设备如表面荧光显微镜探测到的信号：
1、细胞内相同分子的数量足够结合到一个特定寡核苷酸或核苷酸类似物探针上，每个探针带一个荧光基团。
2、大的探针上带有多个荧光基团，如标记的黏端质粒
用于在其各自环境种鉴定微生物的FISH技术是本领域内公知的。FISH应用于检测病原体对于临床微生物学和传染病学有特别的兴趣，因为这些领域中FISH在速度和效率成本方面优秀。
使用芯片技术检测rRNA也不再需要扩增靶标。从样本中提取总的rRNA并置于芯片上。将特异性探针浓缩到一个小的表面区域，并且其吸附各自的rRNA分子，以发出特定的信号/缺乏信号。为使该所述的芯片经济上可行，需要它们能够重复使用，并且操作尽量少。而且，探针特性的标准化对于产生可重复结果起极其重要。
为了在常规环境中得到认可，探针必须如下方式设计，对于某个疾病状态的所有探针都能在相同条件下，在一个容器(如芯片、微流设备或微量滴定板)内或上同时进行。设计探针并使之经济上可行，必须考虑到一个探针可能和不同疾病状态相关。因此不仅是一套探针，而是所有探针都必须能在相同杂交条件下工作。相应的，这些工作探针的序列和长度也需要经过测试。
对工作探针的选择并定义不能只是通过简单序列比对和测定理论的Tm值来进行。根据已应用的算法，能得出很多套数值，其无法指导选择适合于标准化杂交条件的探针序列。
选择影响探针质量的算法和因素在本领域已经被广泛讨论(1-7)。进一步的指导可来自比较序列和其在核糖体三维结构中的具体位置。Behrens等(8)尝试将探针设计理论化，他们在核糖体
Figure A20078004527200081
三维结构模型的帮助下研究杂交位点和实际可用性之间的关系。他们的发现证明原位操作中SDS有突出的变性效果，而预测二级结构的算法没有考虑到这点。
FISH和芯片技术中的另一个问题在于此操作中需要严格洗涤步骤以去除未结合的探针，其中需要其他操作步骤、试剂和时间。杂交的成功主要依赖洗涤步骤的精确性和技巧，然而常规应用需要最少的步骤和操作时间(hand-on time)，而最重要的是它们必须与个人技术无关。
减少步骤的一个解决办法是在寡核苷酸或核酸类似物形成发卡构造(分子信标)中应用荧光共振能量转移(FRET)。几种开发信标的方法是本领域已知的，其构建的概括描述也可以免费获得(13)。实时PCR中广泛应用了信标，其中信标在溶液中与扩增酶产生的数量不断增多的模板相退火(15)。产生用于膜上细菌的检测/鉴定的信标只有过少量尝试(14)。已经构建了一种成功的信标以使用肽核酸(PNA)探针来检测全细胞中的大肠杆菌。相应的DNA探针却不能产生令人满意的作用(16)。制造其他PNA-信标却受到限制，这是因为基于PNA的寡核苷酸在设计推荐的条件下下沉从而很难溶解(17)。
专利CA 2176266/EP 0745690指导了构建用于实时PCR的通用茎干(universal stem)(9)。惊人的是，在工作信标和经设计用于原位鉴定微生物的探针联合时这些推荐条件不会有助于工作信标。实时PCR是在溶液中进行的，而ISH(原位杂交)和芯片都需要固定的靶标。它们的热力学细节与原位杂交和FRET的要求不相容。这样，无法对使用固定靶标的应用预测通用工作茎干。因此有必要凭经验找到适合各个寡核苷酸或核苷类似物的特定信标，以得到能在相同ISH条件下工作的大量信标。
选择ISH信标时必须小心茎干不能扰乱与缠绕在大的蛋白/RNA复合体(如核糖体)中的RNA杂交的精确平衡。本领域对于结合位点的可用性已有广泛讨论，并在(1)中加以总结。
设计信标探针的进一步限制是ISH过程中，在细胞壁上产生的孔的大小。向不同探针添加相同茎干产生不同的各个信标。大量的探针已经形成了发卡环，并且加入茎干不会产生“信标”形式。另外，仅仅加入碱基以形成互补对可能提高Tm值到在热力学上更优先形成发卡环而不是形成杂交体的程度。必须设计特定的茎干，使得拉动序列进入信标形式，同时将Tm值维持在或低于杂交体的Tm值。有关信标设计的教导(13)表明，茎干长度增加一个碱基对Tm值将升高5℃，此茎干的Tm值应当比杂交序列对Tm值高10℃。
对单个微生物如细菌采用基于特定rRNA序列的FISH可能比较困难，这是因为核糖体中rRNA的空间阻碍。换言之，形成发卡结构的信标可能与包埋的rRNA靶序列退火不充分。
因此本项发明的目标是提供至少能部分克服上述缺陷的分子信标。本发明提供的解决方法及其优选实施方式均描述在权利要求中。
本项发明的目标是提供核酸，其能与靶核酸序列形成杂交体，而与靶序列不形成杂交体时则能形成茎环结构，所述核酸包含：
(a)核酸部分，其包含
(a1)与靶核酸序列互补的序列，
(a2)一对能够形成茎干的2个互补序列，
(b)效应子和抑制子，当核酸形成茎环结构时，抑制子抑制效应子，而当核酸不形成茎环结构时，效应子是有活性的。
本项发明的核酸能与靶核酸序列形成杂交体，而与靶序列不形成杂交体时则能形成茎环结构，本文中也称此核酸为“信标”、“分子信标”、“发卡”或“发卡环”，其中包括“开放”形式(不形成茎干)和“关闭”形式(信标形成茎干)。开放形式包括与靶序列不形成杂交体的信标和与靶序列形成杂交体的信标。
特别地，2个互补序列(a2)位于序列(a1)的邻侧，即第一序列(a2)与序列(a1)的3′末端结合，第二序列(a2)与序列(a1)的5′末端结合。
序列(a1)与靶序列形成的杂交体在本文中也称作“与同源序列的杂交体”或“同源杂交体”。
本发明中，效应子可以结合在能形成茎干的2个互补链当中1个上，而抑制子可以结合在所述2个互补序列的另1个上，这样当形成茎干时，抑制子基本上抑制效应子的活性，而当发卡是开放的时，效应子是有活性的。优选地，将效应子分别结合在信标的5′末端或3′末端，或者分别结合在距离5′末端或3′末端1、2、3、4或5个碱基远的位置。优选地，将抑制子结合在不被效应子盖住的另一端，即分别在3′末端或5′末端，或者分别在距离3′末端或5′末端1、2、3、4或5个碱基远的位置。
因此本文公开的发卡环设计从根本上不同于本领域熟知的信标。
本发明的信标与靶序列的杂交是在环打开的条件下发生的。例如，杂交时不形成茎干的信标能与靶rRNA序列退火，并因此实现成功的杂交。
比如，通过信标的Tm值(即茎干的Tm值)基本上等同或低于同源杂交体(即信标与靶序列的杂交体)的Tm值来实现这个目标。因此，当茎干开放时发生与靶序列的杂交，如在基本无Mg2+的条件下发生杂交。
同源杂交体和信标的茎环“基本上相等的Tm”指的是解链温度差异低于5℃，优选地低于3℃，更优选地低于2℃，更优选地低于1℃，更优选地低于0.5℃，甚至更优选地低于0.2℃，最优选地低于0.1℃。
为实现抑制子对效应子的抑制(二者都形成信标的部分)，在与靶序列不杂交的信标分子中，杂交反应后必须诱导形成茎干。例如，ΔG＜0的信标能达到这个效果，这样发卡就能自发形成。另外，通过如本文描述的含Mg2+缓冲液的洗涤来引入形成茎干。
具体而言，发卡环以这种方式构建：在标准杂交条件下(如基本无Mg2+条件)，信标茎干是开放的使得可能的空间限制不会阻扰杂交过程。比如当靶序列是rRNA序列时会存在空间限制。如果效应子是荧光基团，该荧光基团不会因核糖体蛋白的紧密接近而淬灭。
杂交后诱导茎干形成的合适条件包括含Mg2+的缓冲液，如含有大约1到大约20mM的Mg2+，更具体地是大约5到大约15mM的Mg2+，甚至更具体地是大约8到大约12mM的Mg2+，最具体地是大约10mM的Mg2+。缓冲液pH＞8。
此外，信标是以其整体而发挥作用的，不能将其分解为作为最近的邻居的茎干和环，而且堆积效应(stacking effect)在其热力学属性上有重大影响。本发明的优选信标总结于表1中。它们清楚显示了优选茎干序列不依赖ΔG、Tm、GC含量或用来鉴定物种所选序列的长度。
在本发明中，提供了用于适于标准化条件的信标的各个构建体的热动力学规格：用于信标形成的吉布斯自由能(ΔG)必须以如下方式设计
●信标能在杂交条件下，不存在同源靶序列时自发形成(ΔG＜0)。
●同源杂交体的ΔG明显低于(即负的更多)信标的ΔG。
●信标各自的ΔG低于错配或非同源序列。
●信标形成的Tm值必须以这种方式设计，即信标的Tm值低于或基本上等于同源杂交体的Tm值。
在杂交条件下，同源杂交体的ΔG优选的是大约-17到大约-25kcal/mol，优选地大约-18到大约-24kcal/mol之间，更优选地大约-19到大约-23kcal/mol，最优选地大约-20到大约-22kcal/mol。
在杂交条件下，同源杂交体的ΔG还优选地变化不大于5kcal/mol，优选地不大于3kcal/mol，更优选地不大于2kcal/mol，最优选地不大于1kcal/mol。
偶尔地，同源序列会形成自发的发卡环，其中只需要补充一个臂以实现信标的形成。如果靶序列是一段rRNA序列，这却会致使效应子(如荧光基团)非常接近核糖体的潜在淬灭蛋白质。在一个优选的构型中，茎干是延展的。为与本文所描述的热力学规格、甚至与延展的茎干相一致，设计了一种方法将Tm和ΔG都保持在该规格之内。根据本发明，这可以通过引入至少一个不配对核苷酸或核苷类似物而实现。在本发明中，通过引入额外的核苷酸或核苷类似物可增强至少一个非配对核苷酸的引入，这样2个互补序列长度不同，茎干产生“弯折”(例如见SEQ ID NO：1的位置36)，或/和可以通过用非配对核苷酸或核苷类似物取代配对核苷酸或核苷类似物来实现(例如见SEQ IDNO：7中的位置5)。因此，在本发明中，“能形成茎干的互补序列”可能也包含至少一个非配对核苷酸，优选地1、2、3、4或5个非配对核苷酸。
如从表2中所示，本文公开的序列中没有按照PNA信标设计的，这是因为PNA寡核苷酸的构建体中的上述限制。主要限制在于寡核苷酸的长度需要有足够特异性，并且茎干的长度足以保证环在不杂交时重折叠。因此有必要设计DNA信标，其能够以足够的亲和力和速度杂交从而能够原位鉴定微生物。
本发明的信标不是PNA信标。所述信标的骨架优选是核酸骨架。信标可包含核酸部分中的核酸类似物(例如脱氧核糖核酸类似物或核糖核苷酸类似物)，和/或连接子(如果有连接子存在时)。该类似物优选是在糖基部分、碱基或/和磷酸基团上被修饰的核苷酸类似物。所述核苷酸类似物优选不是PNA的构件。
根据所述95％的临床样本，病原体可以被划分为多种疾病相关组。针对这些生物体的探针必须在所述条件下同时工作，尤其是如果所有探针要在一个芯片上使用时。芯片应用需要对同源和茎干特征的严格标准化。如果使用多于一个探针的组合物，即至少两个探针，则所有探针都必须设计成能同时在同一张载玻片/芯片上工作。
本发明的另一个目标是提供包含至少2个，优选地至少10个，至少20个，至少30个，至少40个，或至少50个信标的组合物。所述组合物可包含但也不限于表1中的所有信标，优选地最多100个，最多80个，最多70个，最多60个，最多50个，最多40个，最多30个或最多20个信标。
本发明的组合物中，所述信标可以具有相同或不同的靶序列。优选地，个体信标的靶序列氏不同的。
本发明的组合物中，(a2)序列与靶序列形成的杂交体或/和(a1)序列与靶序列形成的杂交体的各个信标对于同源序列的ΔG差异最大为大约4kcal/mol，优选地最大为大约3kcal/mol，更优选地最大为大约2kcal/mol，和最优选地最大为大约1kcal/mol。
在组合物中，个体信标对于其各自同源序列的Tm值相差最大为大约3℃，优选地最大为大约2℃，更优选地最大为大约1℃。
优选的是在本发明的组合物中，个体核酸一致地发挥功能。“一致地发挥功能”指在相同杂交条件下，如标准化杂交条件下，使用本发明的不同核酸探针能实现成功的杂交。换句话说，本发明的一致地发挥功能的核酸不需要杂交条件的个别优化。
根据疾病状态，某些病原体最经常就是致病剂，因此能归集入诊断组。根据区域流行病学可能需要加入或去掉某些病原体来达到95％。表1的优选列表涵盖了欧洲和北美大部分的需要。
本发明还有一个方面是提供试剂盒或芯片，它们可含有检测所列生物体所需的表1中的至少两个信标，以及可选的所需的杂交试剂。优选地，所述芯片或试剂盒含有至少10个，至少20个，至少30个，至少40个或至少50个信标。所述试剂盒或芯片可最多含有表1中所有的信标，优选地最多100个、最多80个、最多70个、最多60个、最多50个、最多40个、最多30个或最多20个。
分组的列表和用于检测、计数和鉴定所列生物体的所得试剂盒的收录于表1中。
所述信标可用于经设计在试管、微量滴定板、微量滤孔、载玻片和芯片中进行的测定法。检测可以通过多种荧光基团及使用电化学酶类的荧光、时差分辨荧光来进行。
FISH的优选实施方式中，在经设计以放置并分离几个样本的玻璃载玻片上进行所述测定法。
此项发明的另一个目的是提供一种杂交方法，其包括
(a)将至少一种本发明的任意核酸或本发明的核酸的组合物与生物学样品接触，
(b)在核酸的茎干是开放的条件下，使(a)的核酸或核酸组合物与样品杂交，如用基本上没有Mg2+的缓冲液杂交，以及
(c)诱导使与样品不形成杂交体的(a)的那些核酸分子形成茎干的条件，如，用含镁的缓冲液洗涤，例如在pH＞8或/及室温下。
样品可以是生物来源的任何样品，例如临床或食物样品，其被怀疑含有可被信标检测到的核酸。所述样品可以是含有微生物，如细菌、酵母和霉菌，尤其是革兰氏阳性或/和革兰氏阴性细菌的样品。
本文描述的试剂盒或芯片还可用于本发明的杂交方法中。
“几乎没有Mg2+指Mg2+”浓度低于1mM，优选地低于0.1mM，更优选地低于0.05mM，最优选地低于0.01mM。
步骤(c)中的缓冲液可以含有大约1到大约20mM的Mg2+，更优选地约5到大约15mM的Mg2+，甚至更优选地约8到大约12mM的Mg2+，最优选地大约10mM的Mg2+。
可以应用包括应用如上所述的基本无Mg2+溶液或含Mg2+溶液的任何合适的杂交操作规程。例如，可以使用以下操作规程：将临床样品的等份试样应用到载玻片上的规定区域。优选的是应用10ul的规定量，并干燥。
1、样品被热固定到载玻片上
2、依照已发表的说明书将革兰氏阳性生物体进行溶菌酶/溶葡萄球菌酶消化。在优选的具体实施方式中，在湿润的小室内，在46℃下进行7分钟的消化。
3、然后例如通过将载玻片在100％甲醇或乙醇中浸没几分钟，形成孔。在一个优选具体实施方式中，甲醇或乙醇是冰冷的，并且浸没时间对于革兰氏阴性生物体是7分钟，对于革兰氏阳性生物体是3分钟。
4、接着将载玻片在载玻片加温器上干燥，如在55℃下。
5、将信标溶解于杂交缓冲液(其可以基本上不含Mg2+)中，然后将其应用到正在载玻片加温器上的载玻片的每个区域。
6、将载玻片置于杂交小室内，用杂交缓冲液湿润。在优选的具体实施方式中，载玻片上盖有疏水的盖片，并置于一个盖着的载玻片加温器上，在46℃放置12分钟。
7、再用含镁的缓冲液洗涤载玻片，如在在pH＞8或/及室温下。所述缓冲液主要含有大约1到大约20mM的Mg2+，更具体地大约5到大约15mM的Mg2+，甚至更具体地大约8到大约12mM的Mg2+，最具体地10mM的Mg2+。
8、然后干燥载玻片，用固定液固定，并在表面荧光显微镜下以总放大倍数例如400×、600×或1000×下读取。
如果其他容器用于杂交，检测则可以通过本领域熟知的流式细胞仪或自动荧光读取仪来进行。
本发明的另一个具体实施方式涉及本发明的信标的芯片应用。对于芯片应用，所述信标需要共价结合至载体表面。为促进结合，所设计信标的3′末端碱基可能是生物素化的，或者使用蛋白质和核酸化学领域熟知的方法通过异型双功能试剂将其连接到酶上。随后可以将生物素化的信标加到链霉亲和素包被的芯片上，所述芯片可以免费从商业资源中获得(19)。在该应用中，将各自的生物素化的发卡环结合至一个芯片的多个不同区域，例如至少10个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个区域，或最多500个，最多400个或最多300个区域。可以用商购可得试剂盒(20)从样品中提取总RNA并在杂交条件下将其应用于芯片。杂交后，芯片可以用含镁的缓冲液简短洗涤，例如在pH＞8。区域上的荧光标记了特定靶序列的存在，例如特定的RNA指示了样品中有各自生物体的存在。
为将杂交测定法扩大到大规模常规应用，需要在一个可重复使用的芯片上依次分析大量的样品。芯片的设计必须允许大规模生产、有效质量控制和长储存期。
为满足这些规格，在本发明的另一具体实施方式中，本发明的信标共价结合到酶上，此酶通过催化特定的反应发出信号。具体而言，该酶可以发出电化学信号。合适的酶包括但不限于酪氨酸酶、过氧化物酶、亚硫酸盐氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、鸟嘌呤氧化酶。在一个优选的具体实施方式中，酶是由嗜热或超嗜热生物体的基因组序列重组得到，以使其在杂交条件和升高的温度下稳定(21)。可将所述酶在信标分子的一端结合至信标上。在所述分子的另一端，可以结合上能抑制酶活性的抑制子。当所述发卡环没有同源序列时，抑制子抑制该酶，并且不产生信号。同源序列存在时，环维持非折叠，抑制子从酶上完全移除，并且酶会产生电化学信号，此信号可以用领域中详细描述的设备检测。连接子可用于酶或/和抑制子的结合，尤其是用于抑制子的结合抑制子。
在另一个优选的具体实施方式中，将葡萄糖氧化酶结合到所述发卡环的一端，而将葡萄糖氧化酶抑制子，例如将腺嘌呤核苷酸或腺嘌呤核苷酸类似物结合到发卡环的另一端。腺嘌呤核苷酸是葡萄糖氧化酶已知的抑制子(22、23)。连接子可用于葡萄糖氧化酶或/和葡萄糖氧化酶抑制子的结合，尤其是用于葡萄糖氧化酶抑制子的结合。当所述发卡环没有同源序列时，抑制子，特别是腺嘌呤核苷酸抑制该酶，并且不产生信号。同源序列存在时，环维持非折叠，抑制子从酶上完全移除，酶会产生电化学信号，此信号可以用领域中详细描述的设备检测。
为实施这种测定法，已经开发了很多有相同特征的序列(表1)，这些序列可以分别用于检测设备(芯片)的规定位置。使用提取方法和市场上容易得到的试剂盒从样品中提取总RNA(20)，并在杂交条件下置于芯片上。杂交之后，用底物缓冲液于46℃下洗涤芯片，然后读取信号。在循环结束时，在升高的温度下用杂交缓冲液洗脱下所有杂交的RNA。优选地，洗涤温度选择为高于各自Tm值10℃。在一个优选的具体实施方式中，在60℃下用杂交缓冲液洗涤芯片。然后温度降到46℃以平衡用于下一个分析循环。
图例
表1描述了本发明的信标序列。缩写：R&G：红色或/和绿色荧光染料可结合到信标上，如Cy3或FITC或其衍生物。
表2描述了PNA信标不适合于本发明。假定信标是PNA信标，使用表1的序列进行计算。与DNA信标相反，必须满足所有下面的5条标准：GC含量＜60％，＜3碱基的自我互补，一行中4个嘌呤，最大长度为18，反向序列回文或重复或发卡。表2中“是”(“否”)指示所述标准是满足的(不满足的)。“总结”一栏指示如果PNA信标适合于本发明(“是”)或不适合(“否”)。“否”在总结栏指示5个标准之一不满足。“是”指示所有标准都满足。表2的所有序列都被判定为“否”。因此，表1的序列中没有适合于PNA信标的序列。
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Claims (58)

1.一种能够与靶核酸序列形成杂交体并且如果与靶序列不形成杂交体时能够形成茎环结构的核酸，所述核酸包含
(a)核酸部分，其包含
(a1)与所述靶核酸序列互补的序列，
(a2)一对能够形成茎干的2个互补序列，
(b)效应子和抑制子，其中当所述核酸形成茎环结构时，所述抑制子抑制效应子，而其中当所述核酸不形成茎环结构时，所述效应子是有活性的。
2.权利要求1的核酸，其中所述核酸适合于原位杂交，尤其是FISH。
3.权利要求1或2的核酸，其中所述杂交在细胞内进行。
4.权利要求1的核酸，其中当与固相共价连接时，所述核酸适合与所述靶核酸序列的杂交，其中所述靶核酸序列优选是在无细胞样品中提供。
5.上述权利要求中任一项的核酸，其中(a1)的靶核酸序列是微生物的核酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的核酸，其中(a1)的靶核酸序列是DNA序列或者RNA序列，特别是rRNA序列。
7.上述权利要求中任一项的核酸，其中基本上是(a2)的2个互补序列形成茎干。
8.上述权利要求中任一项的核酸，其中基本上是与(a1)的靶核酸序列互补的序列形成环。
9.上述权利要求中任一项的核酸，其中与(a1)的靶核酸序列互补的序列和(a2)的2个互补序列中至少1个是重叠的，优选地重叠1、2、3、4或5个核苷酸或/及核苷酸类似物。
10.上述权利要求中任一项的核酸，其中，(a2)序列与靶序列形成的杂交体的Tm值基本等于或低于(a1)序列与靶序列形成的杂交体的Tm值，例如，低最多大约5℃、大约4℃、大约3℃、大约2℃或大约1℃。
11.上述权利要求中任一项的核酸，其中，在基本上没有Mg2+的条件下，(a2)序列与靶序列形成的杂交体的Tm值基本等于或低于(a1)序列与靶序列形成的杂交体的Tm值。
12.上述权利要求中任一项的核酸，其中，(a2)序列的杂交体的ΔG小于0，优选是在没有靶序列存在下。
13.上述权利要求中任一项的核酸，其中，(a2)序列与靶序列形成的杂交体的ΔG高于(a1)序列与靶序列形成的杂交体的ΔG。
14.上述权利要求中任一项的核酸，其中，(a2)序列与错配序列或/和与靶序列不同的序列形成的杂交体的ΔG低于所述核酸与错配序列或/和与靶序列不同的序列所形成的杂交体的ΔG。
15.上述权利要求中任一项的核酸，其中，在杂交条件下，(a1)序列与其靶序列形成的杂交体的ΔG在大约-17到大约-25kcal/mol的范围内。
16.上述权利要求中任一项的核酸，其中，在存在Mg2+，尤其是存在大约1到大约20mM的Mg2+，更尤其是存在大约5到大约10mM的Mg2+，最尤其是存在大约8到大约10mM的Mg2+的条件下，发生茎干的形成。
17.上述权利要求中任一项的核酸，其中，所述抑制子共价地连接至所述核酸部分的一端，而所述效应子连接至所述核酸部分的另一端。
18.上述权利要求中任一项的核酸，其中，所述效应子或/和所述抑制子通过连接子偶联至所述核酸部分，所述连接子优选地包含选自核苷酸、核苷酸类似物、氨基酸和氨基酸类似物的构件。
19.上述权利要求中任一项的核酸，其中，所述抑制子和所述效应子不形成茎干的部分。
20.权利要求1-19中任一项的核酸，其中所述效应子是发光标签，特别是荧光标签，而所述抑制子是淬灭剂。
21.权利要求20的核酸，其中所述效应子和所述抑制子适合于荧光共振转移技术。
22.权利要求1-19中任一项的核酸，其中所述效应子是酶而所述抑制子是该酶的抑制剂。
23.权利要求22的核酸，其中所述酶产生电化学信号。
24.权利要求22或23的核酸，其中所述酶是报告子酶，优选地选自酪氨酸酶、过氧化物酶、亚硫酸盐氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和鸟嘌呤氧化酶。
25.权利要求22-24中任一项的核酸，其中所述酶来自嗜热或/和超嗜热生物体。
26.权利要求22-25中任一项的核酸，其中所述酶是重组酶。
27.权利要求22-26中任一项的核酸，其中所述酶是葡萄糖氧化酶，并且所述抑制子是腺嘌呤核苷酸。
28.上述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸部分(a)由核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、脱氧核糖核苷酸或/和脱氧核糖核苷酸类似物构成，所述核苷酸类似物不同于PNA构件。
29.上述权利要求中任一项的核酸，其中(a2)的2个互补序列中至少1个含有至少一个非配对核苷酸。
30.上述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸部分(a)选自表1的信标序列。
31.一种组合物，其包含至少两种上述权利要求中任一项所要求保护的核酸。
32.权利要求31的组合物，其中(a2)序列与各个核酸的靶序列形成的杂交体的ΔG值或/和(a1)序列与各个核酸的靶序列形成的杂交体的ΔG值差别最大为大约4kcal/mol。
33.权利要求31或32的组合物，其中(a2)序列与各个核酸的靶序列形成的杂交体的Tm值或/和(a1)序列与各个核酸的靶序列形成的杂交体的Tm值差别最大为大约3℃。
34.权利要求31-33中任一项的组合物，其中各个核酸在原位杂交条件下杂交所要求的杂交条件下一致地发挥功能。
35.权利要求31-34中任一项的组合物，其中当与无机固相共价连接时，各个核酸在杂交DNA或RNA所要求的杂交条件下一致地发挥功能，其中DNA或/和RNA优选地在无细胞样品中提供。
36.权利要求31-35中任一项的组合物，其中当与蛋白质共价连接时，各个核酸在杂交DNA或RNA所要求的杂交条件下一致地发挥功能，其中DNA或/和RNA优选地在无细胞样品中提供。
37.权利要求36的组合物，其中各个核酸在杂交条件下一致地发挥功能，其中所述蛋白质是连接至所述核酸部分一端的酶而酶抑制剂连接至所述核酸部分的另一端。
38.权利要求36或37的组合物，其中各个核酸在杂交DNA或RNA所要求的杂交条件下一致地发挥功能，其中所述酶是来自嗜热或超嗜热生物体的酶。
39.权利要求37或38的组合物，其中所述酶产生电化学信号。
40.一种杂交方法，其包括
(a)将至少一种权利要求1-30中任一项的核酸，或权利要求31-39中任一项的组合物与生物学样品接触，
(b)在核酸茎干是开放的条件下，将(a)的核酸或核酸组合物与所述样品杂交，以及
(c)诱导使与所述样品不形成杂交体的(a)的那些核酸分子形成茎干的条件。
41.权利要求40的方法，其是原位杂交，特别是FISH。
42.权利要求40或41的方法，其中杂交在细胞内发生。
43.权利要求40-42中任一项的方法，其中所述样品包含待检测的微生物。
44.权利要求40-43中任一项的方法，其中所述核酸的靶核酸序列是微生物的核酸序列。
45.权利要求40-44中任一项的方法，其中所述靶核酸序列是DNA序列或RNA序列，尤其是rRNA序列。
46.权利要求40-45中任一项的方法，其中至少一种核酸共价地连接至固相，且其中所述靶核酸优选地在无细胞样品中提供。
47.权利要求40-46中任一项的方法，其中步骤(b)包括用基本上无Mg2+的缓冲液进行杂交。
48.权利要求40-47中任一项的方法，其中步骤(c)包括用含Mg2+的缓冲液进行洗涤。
49.权利要求40-48中任一项的方法，其中步骤(c)包括在pH＞8或/和在室温下进行洗涤。
50.一种试剂盒，其包括权利要求1-30中任一项的核酸或权利要求31-39中任一项的组合物。
51.一种芯片，其包括权利要求1-30中任一项的核酸或权利要求31-39中任一项的组合物。
52.权利要求51的芯片，其包括至少一种权利要求22-27中任一项的核酸。
53.权利要求51的芯片，其包括至少一种权利要求27的核酸。
54.权利要求50-53中任一项的芯片，其是电化学芯片。
55.至少一种权利要求1-30中任一项的核酸、权利要求31-39中任一项的组合物、权利要求50的试剂盒或/和权利要求51-54中任一项的芯片的用途，用于在生物学样品如人、动物或/和食物来源的大量活的或死的物质中鉴定一种或多种生物体，尤其是微生物的存在或不存在。
56.权利要求55的用途，其包括ISH或/和FISH。
57.权利要求55或56的用途，其是诊断用途。
58.权利要求55-57中任一项的用途，其中至少两种核酸在相同条件下同时发挥功能。
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