JP4425354B2 - Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 - Google Patents
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4425354B2 JP4425354B2 JP54827598A JP54827598A JP4425354B2 JP 4425354 B2 JP4425354 B2 JP 4425354B2 JP 54827598 A JP54827598 A JP 54827598A JP 54827598 A JP54827598 A JP 54827598A JP 4425354 B2 JP4425354 B2 JP 4425354B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- aspergillus
- probe
- nucleic acid
- species
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 title claims abstract description 23
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 83
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 34
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 34
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 34
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims description 9
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 claims description 9
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 9
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 8
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 claims description 8
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 4
- 241000235395 Mucor Species 0.000 abstract description 15
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 abstract description 14
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 abstract description 10
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 abstract description 9
- 241000223598 Scedosporium boydii Species 0.000 abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 8
- 241001149962 Sporothrix Species 0.000 abstract description 7
- 241000235389 Absidia Species 0.000 abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 241000235555 Cunninghamella Species 0.000 abstract description 4
- 241000223596 Pseudallescheria Species 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 11
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 10
- 241000852049 Scedosporium apiospermum Species 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000144128 Lichtheimia corymbifera Species 0.000 description 7
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000235556 Cunninghamella elegans Species 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 2
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 2
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000378861 Rhizopus circinans Species 0.000 description 2
- 241000593344 Rhizopus microsporus Species 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000132889 Scedosporium Species 0.000 description 2
- 101100073099 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) its3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001149963 Sporothrix schenckii Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000585703 Adelphia <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001149952 Amylomyces rouxii Species 0.000 description 1
- 241000293035 Apophysomyces Species 0.000 description 1
- 241000335423 Blastomyces Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241001221732 Mucor circinelloides f. circinelloides Species 0.000 description 1
- 241000908234 Mucor indicus Species 0.000 description 1
- 241000378863 Mucor plumbeus Species 0.000 description 1
- 241000235526 Mucor racemosus Species 0.000 description 1
- 241001507755 Neosartorya Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235525 Rhizomucor pusillus Species 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 241001523006 Talaromyces marneffei Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、合衆国政府の機関である、the Centers for Disease Control Mycotic Diseases Laboratoriesにおいて成された。
技術分野
本出願は、一般的に診断微生物学の分野に関する。詳細には、本発明は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix種の種特異的な検出に関する。
発明の背景
近年、血液学的悪性疾患に対する化学療法および器官移植レシピエントに対する高用量コルチコステロイド処置は、AIDSの流布と共に、免疫無防備状態の患者の数を非常に増加した（１、12、14、43）。環境中に見出され、そして低ビルレンスであると考えられている腐生性糸状菌（例えば、Aspergillus、RhizopusおよびMecor種）が、今や、免疫無防備状態宿主で数の増加している感染症の原因である（17、20、43）。さらに、これらの感染症はしばしば、免疫無防備状態の患者において、劇症および急性致死性である（７、11、12、20、44）。罹患率および死亡率は非常に高い；例えば、aspergillosisは約90％の死亡率を有する（８、11）。
問題を複雑にすることに、診断は困難であり、そしてしばしば、症状は特殊なものではない（18、27、29、42、44）。抗体に基づく試験は、免疫無防備状態の患者の弱まったまたは可変的な免疫応答に起因して、信頼できるものであり得ない（２、９、18、46）。今までに開発された抗原検出試験は所望の感度にはおよばない範囲にあった（２、９、38）。放射線検査証拠は非特異的および非決定的であり得るが（５、29、36）、診断におけるいくらかの進歩はコンピューター化断層撮影法の出現と共に成されてきた（40）。しかし、最終的な診断は、さらにポジティブな血液または組織培養物あるいは組織病理学的な確認のいずれかを必要とする（３、21）。追加される複雑な問題は、生体組織検査材料を得るために必要な侵襲性手順は、しばしば、血小板減少性患者集団には推奨されていない、ということである（37、41）。
血液、肺または嗅脳室性組織の培養がポジティブである場合でさえ、糸状菌の形態学的および生化学的同定は適切な増殖および胞子形成が生じるために数日を必要とし得、これにより標的化した薬物治療を遅らせる。いくつかの異型単離物は決して胞子形成し得ず、これによりさらにより同定を困難にし得る（23）。組織病理学が組織生体組織検査切片上で行われる場合、組織中の種々の糸状菌の形態形成学的類似性により区別は困難となる（16）。交差反応（cross-reactive）エピトープ（これは得られる抗体反応を弱くし得る）が吸収されない限り、組織病理学的組織切片の蛍光抗体染色は特異的ではない（14、19）。治療的選択は変化して（７、41、44）、適切な標的化治療の完成が至急必要とされる、迅速および特異的に糸状菌を同定する試験を作成する。早期および正確な診断および処置は罹患率を減少させ、そして患者が生存する機会を増加し得る（6、27、39）。さらに、少なくとも種のレベルまでの糸状菌の同定は疫学的に有用である（24、31、43、47）。
PCRに基づく検出方法（これは感染を迅速に感度良く診断する手段の見込みがある）が、Candida種（13、15、30）およびいくつかの他の真菌（特にAspergillus種）（31、33、45）由来のDNAの同定に使用されてきた。しかし、これらの試験のほとんどは単に属特異的（28、38）であるか、または単一コピーの遺伝子の検出のみに関する（４、35）。他のものは、試験の感度を増加するように多重遺伝子コピー遺伝子を検出するプローブを設計してきているが（31、33）、そのようにする場合は試験の特異性を失っている。なぜならばそれらは高度に保存された遺伝子を使用しており、これは１つかまたはいくつかの種を検出するが、また、ヒト、真菌またはウイルス性DNAに対してさえ交差反応性を有し、このことは悩みのもとである（25、31、33）。
それゆえ、本発明の目的は、臨床的および実験的な設定において、Aspergillusおよび他の糸状菌種を検出および区別するための、改善された材料および方法を提供することである。
発明の要旨
本発明は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria（Scedosporium）およびSporothrix種を検出するための核酸に関する。独特な内部転写スペーサー２コード領域は、５個の異なるAspergillus種（A.flavus、A.fumigatus、A.niger、A.terreusおよびA.nidulans）に特異的なプローブの開発を可能にする。それによって、本発明は、被験体におけるAspergillus感染の種特異的な検出および診断のための方法を提供する。さらに、３つのFusarium、４つのMucor、２つのPenicillium、５つのRhizopusおよび１つのRhizomucor種に対する種プローブ、ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix schenckiiに対するプローブが開発されている。Aspergillus、FusariumおよびMucor種に対する属プローブもまた、開発されている。
本開示の実施態様の以下の詳細な説明および添付の請求の範囲の再検討の後、本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点が明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明は、糸状菌種を、互いに、および他の医学的に重要な真菌から区別する、簡単で、迅速および有用な方法を提供する。本発明は、宿主サンプルから真菌DNAを単離する迅速、簡単および有用な方法を可能にし、そして疾患の診断のために種特異的プローブおよび属特異的プローブを適用する方法を可能にする。最終的に、これらのプローブは、宿主組織および微生物の形態学が無傷のままであるように、インサイチュハイブリダイゼーションまたはインサイチュPCR診断に使用され得る。
本発明は５つのAspergillus、３つのFusarium、４つのMucor、２つのPenicillium、５つのRhizopusおよび１つのRhizomucor種に特異的な領域を含む核酸ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospremum）およびSporothrix schenckiiのプローブを提供する。これらの核酸は上述の糸状菌のゲノムのリボソームデオキシリボ核酸（rDNA）の内部転写スペーサー２（「ITS2」）領域由来である。ITS2領域は5.8S rDNA領域と28S rDNA領域との間に配置される。
詳細には、本発明は以下に記載されるもの由来の核酸を提供する：
これらの配列はAspergillus、Fusarium、Mucor、RhizopusおよびPenicilliumのそれぞれの種を同定ならびに区別するために使用され得、そしてこれらの種を互いから、ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothix schenkiiから同定および区別するために使用され得る。
さらに、本発明はGenBank核酸配列由来（Penicillium marneffeiおよびFusarium oxysporumのみについて）、または上記の核酸配列由来（これは以下の種特異的な識別名として使用され得る：
）由来の単離された核酸プローブを提供する。このようなプローブは、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Rhizopus（またはRhizomucor）、Penicillumの種、あるいはAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix schenkii由来の核酸を含むサンプルと選択的にハイブリダイズするために使用され得る。これらの真菌は、真菌DNAのポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応増幅、ならびに増幅されたDNAの、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび比色基質で標識された抗ジゴキシゲニン抗体と反応する、ジゴキシゲニンで標識されたDNAプローブでの特異的プロービングの後に検出され得る。日常的に、さらなるプローブは、配列番号１〜29（これらは個々の種に特異的である）に示される配列由来であり得る。それゆえ、配列番号30〜57に示されるプローブは、単に種特異的なプローブ（これらは配列番号１〜29由来であり得る）の例として提供される。
Aspergillus（配列番号５８）、Fusarium（配列番号５９）およびMucor（配列番号６０）種に対する属プローブもまた、上記に列挙されるそれらのそれぞれの種のすべてのメンバーを同定するために開発され、ならびに上記に列挙されるすべての種特異的および属プローブをそれらの検出のために捕獲するために全真菌ビオチン化プローブ（配列番号６１）が開発された。
「単離された」は、少なくとも、それとともに天然に存在するいくつかの成分を含まない核酸を意味する。「選択的」または「選択的に」は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、RizopusまたはRhizomucor属または種、あるいはAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）、またはSporothrix schenckii種、の適切な決定を妨害する他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。
ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％の相補性を有するべきである。核酸を記載するため本明細書で用いられるように、用語「選択的にハイブリダイズする」は、しばしばランダムにハイブリダイズする核酸を排除し、そしてそれ故「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味をもつ。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％の相補性を有し得る。
本発明は、本明細書に詳細に提供されるようなＤＮＡの相補的鎖、または反対鎖に選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーを予期する。核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、機能的な種特異的または属特異的ハイブリダイゼーション能力が維持される限り、核酸における小さな改変または置換とともに生じ得る。「プローブ」は、それらの検出または増幅用の相補的核酸配列との選択的ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る核酸配列を意味し、このプローブは、長さが、約５から１００ヌクレオチド、または、好ましくは約１０から５０ヌクレオチド、または最も好ましくは約１８ヌクレオチドで変化し得る。本発明は、種特異的核酸と、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし、そして目的の配列と相補的な少なくとも５ヌクレオチドを有するべきてある単離された核酸を提供する。Maniatis（26）を一般に参照のこと。
プライマーとして用いられる場合、本発明は、所望の領域を増幅するために異なる領域とハイブリダイズする少なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さに依存して、標的領域は、７０％の相補的塩基と完全な相補性との間の範囲であり得、かつストリンジェントな条件下でなおハイブリダイズし得る。例えば、Aseprgillusの存在を診断する目的には、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列（例えば試料からのAspergillus ＤＮＡ）との間の相補性の程度は、少なくとも他の酵母および糸状菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを区別するに十分である。本発明は、列挙された配列中の各糸状菌に特有の核酸の例を提供し、その結果ストリンジェントな条件下、非選択的にハイブリダイズする核酸から選択的にハイブリダイズする核酸を区別するために必要な相補性の程度が、各核酸について明瞭に決定され得る。
あるいは、核酸プローブは、上記に列挙された真菌の１つより多いの種において存在するヌクレオチド配列と相同性を有するように設計され得る。このような核酸プローブは、Aspergillus（配列番号５８）、Fusarium（配列番号５９）、およびMucor（配列番号６０）ならびに列挙されたすべての真菌（配列番号６１）について列挙された属プローブのような一群の種を選択的に同定するために用いられ得る。さらに、本発明は、核酸を用いて、他の糸状菌およびCandida種のような酵母から概して列挙された糸状菌を鑑別し得ることを提供する。このような測定は臨床的に重要である。なぜなら、これらの感染に対する治療は異なるからである。
本発明はさらに、核酸を用いて、列挙された糸状菌、またはその特定の種の存在を検出および同定する方法を提供する。この方法は、糸状菌を含むと疑われる試料を得る工程を包含する。この試料は、個体から採取され得るか（例えば、血液、唾液、肺洗浄液、膣粘膜、組織など）、または環境から採取され得る。次いで糸状菌の細胞は、溶解され、そしてＤＮＡを抽出しかつ沈澱させ得る。好ましくは、ＤＮＡは、糸状菌ｒＤＮＡの内部転写スペーサー領域１８Ｓ、５．８Ｓおよび２８Ｓ領域由来のユニバーサルプライマーを用いて増幅される。このようなユニバーサルプライマーの例は、以下にＩＴＳ１（配列番号６２）、ＩＴＳ３（配列番号６３）、ＩＴＳ４（配列番号６４）として示される。糸状菌ＤＮＡの検出は、増幅されたＤＮＡを、このＤＮＡと選択的にハイブリダイズする種特異的プローブとハイブリダイズすることにより達成される。ハイブリダイゼーションの検出は、糸状菌の特定の属（属プローブについて）または種（種プローブについて）の存在の指標である。
好ましくは、核酸（例えばプローブまたはプライマー）ハイブリダイゼーションの検出は、検出可能部分の使用により容易にされ得る。例えば、種特異的または属プローブが、ジゴキシゲニンで標識され得、そして配列番号６１に記載のような全真菌プローブがビオチンで標識され得、そしてストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートアッセイで用いられ得る。その他の検出可能部分は、例えば、放射能標識、酵素標識、および蛍光標識を含む。
本発明は、試料中の特定の糸状菌の種および属の検出のために用いられ得る１つ以上の種特異的プローブを含むキットをさらに意図する。このようなキットはまた、試料にプローブをハイブリダイズし、そして結合したプローブを検出するための適切な試薬を備え得る。本発明は、以下の非制限的な実施例によりさらに実証され得る。
実施例
この実施例では、ユニバーサルな真菌特異的プライマー、およびアンプリコン検出のための単純迅速ＥＩＡを基礎にしたフォーマットを利用するＰＣＲアッセイを用いた。
糸状菌ＤＮＡの抽出
機械的破壊方法を用いて糸状菌種からＤＮＡを得、そして先に記載（13）の酵素的破壊方法を用いて酵母からＤＮＡを得た。糸状菌は、Sabouraudデキストロース寒天スラント（ＢＢＬ、Becton Dickinsonの部門、Cockeysville、ＭＤ）において、３５℃で４〜５日増殖させた。次いで２つのスラントを、５mlの0.01Ｍのリン酸カリウム緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を各スラントの表面上に激しくピペッティングすることにより洗浄し、そして洗浄液を２５０ｍｌのSabouraudデキストロースブロス（ＢＢＬ）を含む500mlのErlenmeyerフラスコに移した。次いで、フラスコをロータリーシェーカー（140rpm）において、周囲温度で４〜５日間インキュベートした。次いで、増殖物を、２Ｌのサイドアームフラスコに取り付けた滅菌Buchner濾斗中に置かれた滅菌Whatman＃１濾紙を通す真空濾過により回収した。得られた細胞マットを、濾過装置上で滅菌蒸留水を用いて３回洗浄し、ゴムポリスマンを用いて穏やかに掻き取ることにより濾紙から取り出し、そして滅菌Petriプレート中に置き、次いでパラフィルムでシールし、そして使用するまで−２０℃で凍結した。
使用直前に、凍結細胞マットのサイズで等しく４等分した一部分を、取り出し、そして冷乳鉢（直径６インチ）中に置いた。液体窒素を添加してマットを覆い、次いで乳棒で粉末にすりつぶした。粉砕の間にマットの凍結を保つために必要に応じてさらなる液体窒素を添加した。
次いでＤＮＡを、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅ処理、複数回のフェノール抽出、およびエタノール沈澱を用いて従来手段（26）によって精製した。
ＰＣＲ増幅
真菌特異的なユニバーサルプライマーペアＩＴＳ３（5’-ＧＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣ-3’）（配列番号６３）およびＩＴＳ４（5’-ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ-3’）（配列番号６４）を用いて、先に記載のように（13、34）、各種について、５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分、全ＩＴＳ２領域、および２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分を増幅した。ＤＮＡ配列決定には、このプライマーペアを、そしてまた真菌特異的ユニバーサルプライマーペアＩＴＳ１（5’-ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＣＧ Ｇ-3’）（配列番号６２）および１８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分全５．８Ｓ領域、全ＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域、ならびに２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分を増幅するためのＩＴＳ４、を用いた。
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅には、ＤＮＡ試薬キット（TaKaRa Biomedicals、Shiga、Japan）を用いた。ＰＣＲは、２μlの試験試料を用いて、１０μlの１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、８μl中の各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．２μＭの各プライマー、ならびに０．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼからなる１００μlの全ＰＣＲ反応容量中で実施した。３０サイクルの増幅を、９５℃５分間におけるＤＮＡの初期変性後、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ９６００サーマルサイクラー（Emeryville、CA）中で実施した。各サイクルは、９５℃における３０秒間の変性工程、５８℃における３０秒間のアニーリング工程、および７２℃における１分間の伸長工程からなった。７２℃における５分間の最終伸長工程を最終サイクル後に行った。増幅後、使用するまで試料を−２０℃で貯蔵した。
ＤＮＡ配列決定
初期ＤＮＡ増幅を上記のように実施した。初期ＰＣＲ反応の水相を、QIAquick Spin Columns（Quiagen、Chatsworth、CA）を用いて精製した。ＤＮＡを、各カラムから、５０μlの熱滅菌Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて溶出した。
精製ＤＮＡを、色素ターミネーターサイクル配列決定キット（ABI PRISM、Perkin Elmer、Foster City、CA）を用いて標識した。１つの混合物をプライマーの各々について作成し、その結果、配列決定は、前方向および逆方向の両方で行うことができた。反応容量（２０μl）は、９．５μlのTerminator Premix、２μl（１ng）のＤＮＡテンプレート、１μlのプライマー（３．２ｐｍｏｌ）および７．５μlの熱滅菌蒸留Ｈ2Ｏを含んだ。次いで混合液を、予備加熱した（９６℃）Perkin Elmer 9600サーマルサイクラー中に置き、９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分の２５サイクルを行った。次いでＰＣＲ産物を、配列決定の前に、CentriSepスピンカラム（Princeton Separations、Adelphia、NJ）を用いて精製した。次いでＤＮＡを真空乾燥し、６μlのホルムアミド-ＥＤＴＡ（５μlの脱イオン化ホルムアミド＋１μlの５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、そして９０℃で２分間変性した後、自動化キャピラリーＤＮＡシークエンサー（ABI Systems、Model 373、Bethesda、MD）を用いて配列決定した。
配列決定結果は以下の通りであった：
Aspergillus flavus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
Aspergillus fumigatus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
Aspergillus niger ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
Aspergillus terreus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
Aspergillus nidulans ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
Fusarium solani（ATCC 62877株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Fusarium moniliforme（ATCC 38519株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Mucor rouxii（ATCC 24905株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Mucor racemosus（ATCC 22365株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Mucor plumbeus（ATCC 4740株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Mucor indicus（ATCC 4857株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Mucor circinelloides f．circinelloides（ATCC 1209B株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizopus oryzae（ATCC 34965株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizopus oryzae（ATCC 11886株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizopus microsporus（ATCC 14056株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizopus microsporus（ATCC 12276株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizopus circinans（ATCC 34106株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizopus circinans（ATCC 34101株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizous stolonifer（ATCC 14037株および6227A株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Rhizomucor pusillus（ATCC 36606株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Absidia corymbifera（ATCC 46774株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Absidia corymbifera（ATCC 46773株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Cunninghamella elegans（ATCC 42113株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Pseudallescheria boydii（ATCC 44328株）内部転写スペーサー２および隣接領域（Scedosporium apiospermumの完全世代（teleomorph））。
Pseudallescheria boydii（ATCC 36282株）内部転写スペーサー２および隣接領域（Scedosporium apiospermumの完全世代）。
Scedosporium apiospermum（ATCC 64215株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Scedosporium apiospermum（ATCC 46173株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Penicillium notatum（ATCC 10108株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
Sporothrix schenckii（ATCC 14284株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
夾雑予防
FujitaおよびKwok（13、22）のガイドラインに従って、PCRサンプルの可能性のある夾雑を避けるための予防を行った。PCRアッセイに用いる全ての緩衝液および滅菌水をオートクレーブし、そして新鮮なPCR試薬を使用前に等分した。PCRアッセイの調製およびPCR産物の分析に使用するために研究室領域を物理的に分離し、そして噴霧耐性（aerosol-resistant）ピペットチップを使用して噴霧によるサンプルの交叉夾雑の可能性を減少させた。PCRアッセイの間、プライマーまたはDNAテンプレートのいずれかを含まないコントロールを含む、適切なネガティブコントロールを各試験の実施に含めた。
アガロースゲル電気泳動
ゲル電気泳動をTBE緩衝液（0.1M Tris，0.09Mホウ酸、1mM EDTA、pH8.4）中で、80Vで1〜2時間、１％（w/vol）アガロース（International Technologies，New Haven，CT）および１％（w/vol）NuSieveアガー（FMC Bioproducts，Rockland，ME）からなるゲルを使用して行った。ゲルを0.5μgエチジウムブロマイド（EtBr）/1ml蒸留水で10分間染色し、次いで３つの連続洗浄を10分間、各々蒸留水H2Oで洗浄した。
PCR産物の検出のためのマイクロタイタープレート酵素イムノアッセイ
アンプリコンを、ジゴキシゲニンで標識化した種特異的かつ属プローブ、およびビオチンで標識した全ての糸状の真菌プローブを使用して、ストレプトアビジンコートしたマイクロタイタープレートフォーマットにおいて検出した（13,34）。10μlのPCR産物を各1.5mlのエッペンドルフチューブに添加した。次いで、一本鎖DNAを、チューブを95℃5分間加熱し、そして氷上で即座に冷却することにおよって調製した。各50ng/mlの全-Aspergillusビオチン化プローブおよび種特異的ジゴキシゲニン標識化プローブで補充した１mlのハイブリダイゼーション溶液[20mM Hepes、2mM EDTA、および0.15%（vol/vol）Tween 20含有4×SSC（クエン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液、0.6M NaCl、0.06クエン酸三ナトリウム、pH7.0）]の2/10を、変性したPCR産物を含む各チューブに添加した。チューブを転倒攪拌し、そして37℃での水浴中に配置してプローブをPCR産物DNAにアニールさせた。1時間後、100μlの各サンプルを、市販の調整されたストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の二連のウェルに添加した。プレートを、マイクロタイタープレートシェーカー（CLTI，Middletown，NYからDynatechに製造された）を使用して、周辺温度で1時間、振盪しながらインキュベートした。プレートを、0.05％Tween 20を含む0.01Mリン酸カリウム緩衝化生理食塩水（PBST）（pH7.2）で、6回洗浄した。次いで各ウェルに、ハイブリダイゼーション緩衝液で1：1000に希釈した100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合化抗ジゴキシゲニンFabフラグメント（Boehringer Mannheim）を添加した。30分間の周辺温度での振盪しながらのインキュベーション後、プレートをPBSTで6回洗浄した。１容量の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersberg，MD）と１容量のペルオキシダーゼ溶液（Kirkegaard and Perry Laboratories）との混合物の100μlを各ウェルに添加し、そしてプレートを周辺温度で10分間、発色のために配置した。各ウェルのA650nmをマイクロタイタープレートリーダーで測定した（UV Max，Molecular Devices，Inc.，Menlo Park，CA）。DNAは入っていないが滅菌H2Oで置換した試薬ブランクの吸光値を、各試験サンプルから減じた。
統計学的分析
Studentのｔ検定を使用して、サンプル平均間の差異を決定した。平均を、平均プラス平均からの標準誤差または平均マイナス平均からの標準誤差として表した。差異を、P<0.05の場合に有意であると考えた。
以下のプローブを使用して、各種を検出および区別した。
Aspergillus fumigatus（配列番号32）、A．flavus（配列番号31）、A．niger（配列番号33）、A．terreus（配列番号34）、およびA．nidulans（配列番号35）のrDNAのITS2領域に対する種特異的プローブは、各それぞれの種を正確に同定し（P<0.001）、そしてRhizopus、Mucor、Fusarium、Penicillium、またはCandida種とは偽陽性反応を示さなかった。A．flavusプローブはまた、A．flavus群に属するA．oryzaeを認識した。同定時間を従来の方法の平均5日から8時間に減らした。
Fusarium oxysporum，F．solani、およびF．moniliformeについてのrDNAのITS2領域に対する種特異的プローブは、各それぞれの種を正確に同定し（P<0.001）そしてBlastomyces、Apophysomyces、Candida、Aspergillus、Mucor、Penecillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria、Sporothrix、またはNeosartoryaとの偽陽性反応はなかった。表４における空欄は、０プローブ反応性を示す。
種々の他の接合菌（zygomyce）に対する種特異的プローブを表５に示し、これは、各種の正確な同定および偽陽性のないことを示す。例外は、M．circinelloidesプローブがM．rouxii DNAにハイブリダイズし、そしてM．plumbeusプローブがM．racemosus DNAにハイブリダイズしたことである。しかし、M．rouxiiプローブはM．circinelloides DNAにハイブリダイズせず、そしてM．racemosusプローブもまたM．plumbeus DNAにハイブリダイズしなかった。従って、除去工程によって、各種は正確に同定され得る。表５における空欄は、０プローブ反応性を示す。
種々の他の真菌に対する種特異的プローブを表６に示し、これは、各種の正確な同定および偽陽性のないことを示す。表６における空欄は、０プローブ反応性を示す。
本明細書中に記載された全ての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
参考文献
技術分野
本出願は、一般的に診断微生物学の分野に関する。詳細には、本発明は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix種の種特異的な検出に関する。
発明の背景
近年、血液学的悪性疾患に対する化学療法および器官移植レシピエントに対する高用量コルチコステロイド処置は、AIDSの流布と共に、免疫無防備状態の患者の数を非常に増加した（１、12、14、43）。環境中に見出され、そして低ビルレンスであると考えられている腐生性糸状菌（例えば、Aspergillus、RhizopusおよびMecor種）が、今や、免疫無防備状態宿主で数の増加している感染症の原因である（17、20、43）。さらに、これらの感染症はしばしば、免疫無防備状態の患者において、劇症および急性致死性である（７、11、12、20、44）。罹患率および死亡率は非常に高い；例えば、aspergillosisは約90％の死亡率を有する（８、11）。
問題を複雑にすることに、診断は困難であり、そしてしばしば、症状は特殊なものではない（18、27、29、42、44）。抗体に基づく試験は、免疫無防備状態の患者の弱まったまたは可変的な免疫応答に起因して、信頼できるものであり得ない（２、９、18、46）。今までに開発された抗原検出試験は所望の感度にはおよばない範囲にあった（２、９、38）。放射線検査証拠は非特異的および非決定的であり得るが（５、29、36）、診断におけるいくらかの進歩はコンピューター化断層撮影法の出現と共に成されてきた（40）。しかし、最終的な診断は、さらにポジティブな血液または組織培養物あるいは組織病理学的な確認のいずれかを必要とする（３、21）。追加される複雑な問題は、生体組織検査材料を得るために必要な侵襲性手順は、しばしば、血小板減少性患者集団には推奨されていない、ということである（37、41）。
血液、肺または嗅脳室性組織の培養がポジティブである場合でさえ、糸状菌の形態学的および生化学的同定は適切な増殖および胞子形成が生じるために数日を必要とし得、これにより標的化した薬物治療を遅らせる。いくつかの異型単離物は決して胞子形成し得ず、これによりさらにより同定を困難にし得る（23）。組織病理学が組織生体組織検査切片上で行われる場合、組織中の種々の糸状菌の形態形成学的類似性により区別は困難となる（16）。交差反応（cross-reactive）エピトープ（これは得られる抗体反応を弱くし得る）が吸収されない限り、組織病理学的組織切片の蛍光抗体染色は特異的ではない（14、19）。治療的選択は変化して（７、41、44）、適切な標的化治療の完成が至急必要とされる、迅速および特異的に糸状菌を同定する試験を作成する。早期および正確な診断および処置は罹患率を減少させ、そして患者が生存する機会を増加し得る（6、27、39）。さらに、少なくとも種のレベルまでの糸状菌の同定は疫学的に有用である（24、31、43、47）。
PCRに基づく検出方法（これは感染を迅速に感度良く診断する手段の見込みがある）が、Candida種（13、15、30）およびいくつかの他の真菌（特にAspergillus種）（31、33、45）由来のDNAの同定に使用されてきた。しかし、これらの試験のほとんどは単に属特異的（28、38）であるか、または単一コピーの遺伝子の検出のみに関する（４、35）。他のものは、試験の感度を増加するように多重遺伝子コピー遺伝子を検出するプローブを設計してきているが（31、33）、そのようにする場合は試験の特異性を失っている。なぜならばそれらは高度に保存された遺伝子を使用しており、これは１つかまたはいくつかの種を検出するが、また、ヒト、真菌またはウイルス性DNAに対してさえ交差反応性を有し、このことは悩みのもとである（25、31、33）。
それゆえ、本発明の目的は、臨床的および実験的な設定において、Aspergillusおよび他の糸状菌種を検出および区別するための、改善された材料および方法を提供することである。
発明の要旨
本発明は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria（Scedosporium）およびSporothrix種を検出するための核酸に関する。独特な内部転写スペーサー２コード領域は、５個の異なるAspergillus種（A.flavus、A.fumigatus、A.niger、A.terreusおよびA.nidulans）に特異的なプローブの開発を可能にする。それによって、本発明は、被験体におけるAspergillus感染の種特異的な検出および診断のための方法を提供する。さらに、３つのFusarium、４つのMucor、２つのPenicillium、５つのRhizopusおよび１つのRhizomucor種に対する種プローブ、ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix schenckiiに対するプローブが開発されている。Aspergillus、FusariumおよびMucor種に対する属プローブもまた、開発されている。
本開示の実施態様の以下の詳細な説明および添付の請求の範囲の再検討の後、本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点が明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明は、糸状菌種を、互いに、および他の医学的に重要な真菌から区別する、簡単で、迅速および有用な方法を提供する。本発明は、宿主サンプルから真菌DNAを単離する迅速、簡単および有用な方法を可能にし、そして疾患の診断のために種特異的プローブおよび属特異的プローブを適用する方法を可能にする。最終的に、これらのプローブは、宿主組織および微生物の形態学が無傷のままであるように、インサイチュハイブリダイゼーションまたはインサイチュPCR診断に使用され得る。
本発明は５つのAspergillus、３つのFusarium、４つのMucor、２つのPenicillium、５つのRhizopusおよび１つのRhizomucor種に特異的な領域を含む核酸ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospremum）およびSporothrix schenckiiのプローブを提供する。これらの核酸は上述の糸状菌のゲノムのリボソームデオキシリボ核酸（rDNA）の内部転写スペーサー２（「ITS2」）領域由来である。ITS2領域は5.8S rDNA領域と28S rDNA領域との間に配置される。
詳細には、本発明は以下に記載されるもの由来の核酸を提供する：
さらに、本発明はGenBank核酸配列由来（Penicillium marneffeiおよびFusarium oxysporumのみについて）、または上記の核酸配列由来（これは以下の種特異的な識別名として使用され得る：
Aspergillus（配列番号５８）、Fusarium（配列番号５９）およびMucor（配列番号６０）種に対する属プローブもまた、上記に列挙されるそれらのそれぞれの種のすべてのメンバーを同定するために開発され、ならびに上記に列挙されるすべての種特異的および属プローブをそれらの検出のために捕獲するために全真菌ビオチン化プローブ（配列番号６１）が開発された。
「単離された」は、少なくとも、それとともに天然に存在するいくつかの成分を含まない核酸を意味する。「選択的」または「選択的に」は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、RizopusまたはRhizomucor属または種、あるいはAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）、またはSporothrix schenckii種、の適切な決定を妨害する他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。
ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％の相補性を有するべきである。核酸を記載するため本明細書で用いられるように、用語「選択的にハイブリダイズする」は、しばしばランダムにハイブリダイズする核酸を排除し、そしてそれ故「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味をもつ。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％の相補性を有し得る。
本発明は、本明細書に詳細に提供されるようなＤＮＡの相補的鎖、または反対鎖に選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーを予期する。核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、機能的な種特異的または属特異的ハイブリダイゼーション能力が維持される限り、核酸における小さな改変または置換とともに生じ得る。「プローブ」は、それらの検出または増幅用の相補的核酸配列との選択的ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る核酸配列を意味し、このプローブは、長さが、約５から１００ヌクレオチド、または、好ましくは約１０から５０ヌクレオチド、または最も好ましくは約１８ヌクレオチドで変化し得る。本発明は、種特異的核酸と、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし、そして目的の配列と相補的な少なくとも５ヌクレオチドを有するべきてある単離された核酸を提供する。Maniatis（26）を一般に参照のこと。
プライマーとして用いられる場合、本発明は、所望の領域を増幅するために異なる領域とハイブリダイズする少なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さに依存して、標的領域は、７０％の相補的塩基と完全な相補性との間の範囲であり得、かつストリンジェントな条件下でなおハイブリダイズし得る。例えば、Aseprgillusの存在を診断する目的には、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列（例えば試料からのAspergillus ＤＮＡ）との間の相補性の程度は、少なくとも他の酵母および糸状菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを区別するに十分である。本発明は、列挙された配列中の各糸状菌に特有の核酸の例を提供し、その結果ストリンジェントな条件下、非選択的にハイブリダイズする核酸から選択的にハイブリダイズする核酸を区別するために必要な相補性の程度が、各核酸について明瞭に決定され得る。
あるいは、核酸プローブは、上記に列挙された真菌の１つより多いの種において存在するヌクレオチド配列と相同性を有するように設計され得る。このような核酸プローブは、Aspergillus（配列番号５８）、Fusarium（配列番号５９）、およびMucor（配列番号６０）ならびに列挙されたすべての真菌（配列番号６１）について列挙された属プローブのような一群の種を選択的に同定するために用いられ得る。さらに、本発明は、核酸を用いて、他の糸状菌およびCandida種のような酵母から概して列挙された糸状菌を鑑別し得ることを提供する。このような測定は臨床的に重要である。なぜなら、これらの感染に対する治療は異なるからである。
本発明はさらに、核酸を用いて、列挙された糸状菌、またはその特定の種の存在を検出および同定する方法を提供する。この方法は、糸状菌を含むと疑われる試料を得る工程を包含する。この試料は、個体から採取され得るか（例えば、血液、唾液、肺洗浄液、膣粘膜、組織など）、または環境から採取され得る。次いで糸状菌の細胞は、溶解され、そしてＤＮＡを抽出しかつ沈澱させ得る。好ましくは、ＤＮＡは、糸状菌ｒＤＮＡの内部転写スペーサー領域１８Ｓ、５．８Ｓおよび２８Ｓ領域由来のユニバーサルプライマーを用いて増幅される。このようなユニバーサルプライマーの例は、以下にＩＴＳ１（配列番号６２）、ＩＴＳ３（配列番号６３）、ＩＴＳ４（配列番号６４）として示される。糸状菌ＤＮＡの検出は、増幅されたＤＮＡを、このＤＮＡと選択的にハイブリダイズする種特異的プローブとハイブリダイズすることにより達成される。ハイブリダイゼーションの検出は、糸状菌の特定の属（属プローブについて）または種（種プローブについて）の存在の指標である。
好ましくは、核酸（例えばプローブまたはプライマー）ハイブリダイゼーションの検出は、検出可能部分の使用により容易にされ得る。例えば、種特異的または属プローブが、ジゴキシゲニンで標識され得、そして配列番号６１に記載のような全真菌プローブがビオチンで標識され得、そしてストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートアッセイで用いられ得る。その他の検出可能部分は、例えば、放射能標識、酵素標識、および蛍光標識を含む。
本発明は、試料中の特定の糸状菌の種および属の検出のために用いられ得る１つ以上の種特異的プローブを含むキットをさらに意図する。このようなキットはまた、試料にプローブをハイブリダイズし、そして結合したプローブを検出するための適切な試薬を備え得る。本発明は、以下の非制限的な実施例によりさらに実証され得る。
実施例
この実施例では、ユニバーサルな真菌特異的プライマー、およびアンプリコン検出のための単純迅速ＥＩＡを基礎にしたフォーマットを利用するＰＣＲアッセイを用いた。
糸状菌ＤＮＡの抽出
機械的破壊方法を用いて糸状菌種からＤＮＡを得、そして先に記載（13）の酵素的破壊方法を用いて酵母からＤＮＡを得た。糸状菌は、Sabouraudデキストロース寒天スラント（ＢＢＬ、Becton Dickinsonの部門、Cockeysville、ＭＤ）において、３５℃で４〜５日増殖させた。次いで２つのスラントを、５mlの0.01Ｍのリン酸カリウム緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を各スラントの表面上に激しくピペッティングすることにより洗浄し、そして洗浄液を２５０ｍｌのSabouraudデキストロースブロス（ＢＢＬ）を含む500mlのErlenmeyerフラスコに移した。次いで、フラスコをロータリーシェーカー（140rpm）において、周囲温度で４〜５日間インキュベートした。次いで、増殖物を、２Ｌのサイドアームフラスコに取り付けた滅菌Buchner濾斗中に置かれた滅菌Whatman＃１濾紙を通す真空濾過により回収した。得られた細胞マットを、濾過装置上で滅菌蒸留水を用いて３回洗浄し、ゴムポリスマンを用いて穏やかに掻き取ることにより濾紙から取り出し、そして滅菌Petriプレート中に置き、次いでパラフィルムでシールし、そして使用するまで−２０℃で凍結した。
使用直前に、凍結細胞マットのサイズで等しく４等分した一部分を、取り出し、そして冷乳鉢（直径６インチ）中に置いた。液体窒素を添加してマットを覆い、次いで乳棒で粉末にすりつぶした。粉砕の間にマットの凍結を保つために必要に応じてさらなる液体窒素を添加した。
次いでＤＮＡを、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅ処理、複数回のフェノール抽出、およびエタノール沈澱を用いて従来手段（26）によって精製した。
ＰＣＲ増幅
真菌特異的なユニバーサルプライマーペアＩＴＳ３（5’-ＧＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣ-3’）（配列番号６３）およびＩＴＳ４（5’-ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ-3’）（配列番号６４）を用いて、先に記載のように（13、34）、各種について、５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分、全ＩＴＳ２領域、および２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分を増幅した。ＤＮＡ配列決定には、このプライマーペアを、そしてまた真菌特異的ユニバーサルプライマーペアＩＴＳ１（5’-ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＣＧ Ｇ-3’）（配列番号６２）および１８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分全５．８Ｓ領域、全ＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域、ならびに２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分を増幅するためのＩＴＳ４、を用いた。
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅には、ＤＮＡ試薬キット（TaKaRa Biomedicals、Shiga、Japan）を用いた。ＰＣＲは、２μlの試験試料を用いて、１０μlの１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、８μl中の各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．２μＭの各プライマー、ならびに０．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼからなる１００μlの全ＰＣＲ反応容量中で実施した。３０サイクルの増幅を、９５℃５分間におけるＤＮＡの初期変性後、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ９６００サーマルサイクラー（Emeryville、CA）中で実施した。各サイクルは、９５℃における３０秒間の変性工程、５８℃における３０秒間のアニーリング工程、および７２℃における１分間の伸長工程からなった。７２℃における５分間の最終伸長工程を最終サイクル後に行った。増幅後、使用するまで試料を−２０℃で貯蔵した。
初期ＤＮＡ増幅を上記のように実施した。初期ＰＣＲ反応の水相を、QIAquick Spin Columns（Quiagen、Chatsworth、CA）を用いて精製した。ＤＮＡを、各カラムから、５０μlの熱滅菌Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて溶出した。
精製ＤＮＡを、色素ターミネーターサイクル配列決定キット（ABI PRISM、Perkin Elmer、Foster City、CA）を用いて標識した。１つの混合物をプライマーの各々について作成し、その結果、配列決定は、前方向および逆方向の両方で行うことができた。反応容量（２０μl）は、９．５μlのTerminator Premix、２μl（１ng）のＤＮＡテンプレート、１μlのプライマー（３．２ｐｍｏｌ）および７．５μlの熱滅菌蒸留Ｈ2Ｏを含んだ。次いで混合液を、予備加熱した（９６℃）Perkin Elmer 9600サーマルサイクラー中に置き、９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分の２５サイクルを行った。次いでＰＣＲ産物を、配列決定の前に、CentriSepスピンカラム（Princeton Separations、Adelphia、NJ）を用いて精製した。次いでＤＮＡを真空乾燥し、６μlのホルムアミド-ＥＤＴＡ（５μlの脱イオン化ホルムアミド＋１μlの５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、そして９０℃で２分間変性した後、自動化キャピラリーＤＮＡシークエンサー（ABI Systems、Model 373、Bethesda、MD）を用いて配列決定した。
配列決定結果は以下の通りであった：
Aspergillus flavus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
FujitaおよびKwok（13、22）のガイドラインに従って、PCRサンプルの可能性のある夾雑を避けるための予防を行った。PCRアッセイに用いる全ての緩衝液および滅菌水をオートクレーブし、そして新鮮なPCR試薬を使用前に等分した。PCRアッセイの調製およびPCR産物の分析に使用するために研究室領域を物理的に分離し、そして噴霧耐性（aerosol-resistant）ピペットチップを使用して噴霧によるサンプルの交叉夾雑の可能性を減少させた。PCRアッセイの間、プライマーまたはDNAテンプレートのいずれかを含まないコントロールを含む、適切なネガティブコントロールを各試験の実施に含めた。
アガロースゲル電気泳動
ゲル電気泳動をTBE緩衝液（0.1M Tris，0.09Mホウ酸、1mM EDTA、pH8.4）中で、80Vで1〜2時間、１％（w/vol）アガロース（International Technologies，New Haven，CT）および１％（w/vol）NuSieveアガー（FMC Bioproducts，Rockland，ME）からなるゲルを使用して行った。ゲルを0.5μgエチジウムブロマイド（EtBr）/1ml蒸留水で10分間染色し、次いで３つの連続洗浄を10分間、各々蒸留水H2Oで洗浄した。
PCR産物の検出のためのマイクロタイタープレート酵素イムノアッセイ
アンプリコンを、ジゴキシゲニンで標識化した種特異的かつ属プローブ、およびビオチンで標識した全ての糸状の真菌プローブを使用して、ストレプトアビジンコートしたマイクロタイタープレートフォーマットにおいて検出した（13,34）。10μlのPCR産物を各1.5mlのエッペンドルフチューブに添加した。次いで、一本鎖DNAを、チューブを95℃5分間加熱し、そして氷上で即座に冷却することにおよって調製した。各50ng/mlの全-Aspergillusビオチン化プローブおよび種特異的ジゴキシゲニン標識化プローブで補充した１mlのハイブリダイゼーション溶液[20mM Hepes、2mM EDTA、および0.15%（vol/vol）Tween 20含有4×SSC（クエン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液、0.6M NaCl、0.06クエン酸三ナトリウム、pH7.0）]の2/10を、変性したPCR産物を含む各チューブに添加した。チューブを転倒攪拌し、そして37℃での水浴中に配置してプローブをPCR産物DNAにアニールさせた。1時間後、100μlの各サンプルを、市販の調整されたストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の二連のウェルに添加した。プレートを、マイクロタイタープレートシェーカー（CLTI，Middletown，NYからDynatechに製造された）を使用して、周辺温度で1時間、振盪しながらインキュベートした。プレートを、0.05％Tween 20を含む0.01Mリン酸カリウム緩衝化生理食塩水（PBST）（pH7.2）で、6回洗浄した。次いで各ウェルに、ハイブリダイゼーション緩衝液で1：1000に希釈した100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合化抗ジゴキシゲニンFabフラグメント（Boehringer Mannheim）を添加した。30分間の周辺温度での振盪しながらのインキュベーション後、プレートをPBSTで6回洗浄した。１容量の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersberg，MD）と１容量のペルオキシダーゼ溶液（Kirkegaard and Perry Laboratories）との混合物の100μlを各ウェルに添加し、そしてプレートを周辺温度で10分間、発色のために配置した。各ウェルのA650nmをマイクロタイタープレートリーダーで測定した（UV Max，Molecular Devices，Inc.，Menlo Park，CA）。DNAは入っていないが滅菌H2Oで置換した試薬ブランクの吸光値を、各試験サンプルから減じた。
統計学的分析
Studentのｔ検定を使用して、サンプル平均間の差異を決定した。平均を、平均プラス平均からの標準誤差または平均マイナス平均からの標準誤差として表した。差異を、P<0.05の場合に有意であると考えた。
以下のプローブを使用して、各種を検出および区別した。
参考文献
Claims (22)
- アスペルギウス族（Aspergillus）を種特異的に同定するための単離された核酸プローブであって、該プローブが、Aspergillus flavus（配列番号１）、Aspergillus fumigatus（配列番号２）、Aspergillus niger（配列番号３）、Aspergillus terreus（配列番号４）およびAspergillus nidulans（配列番号５）のうちのいずれか一つの内部転写スペーサー２の核酸配列またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズする、プローブ。
- 配列番号１に記載のAspergillus flavus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
- 配列番号２に記載のAspergillus fumigatus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
- 配列番号３に記載のAspergillus niger核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
- 配列番号４に記載のAspergillus terreus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
- 配列番号５に記載のAspergillus nidulans核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
- サンプルにおいて、Aspergillus flavus（配列番号１）、Aspergillus fumigatus（配列番号２）、Aspergillus niger（配列番号３）、Aspergillus terreus（配列番号４）またはAspergillus nidulans（配列番号５）の種を検出する方法であって、該サンプルと、配列番号１〜５のうちのいずれか一つの内部転写スペーサー２の核酸配列またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸プローブとを組み合わせる工程を包含し、該核酸プローブのサンプルとのハイブリダイゼーションの存在が、該サンプル中のアスペルギウス属（Aspergillus）の種の検出を示す、方法。
- 前記プローブが、配列番号１に記載のAspergillus flavus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
- 前記プローブが、配列番号２に記載のAspergillus fumigatus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
- 前記プローブが、配列番号３に記載のAspergillus niger核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
- 前記プローブが、配列番号４に記載のAspergillus terreus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
- 前記プローブが、配列番号５に記載のAspergillus nidulans核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
- 配列番号３０または３１のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus flavusを同定するためのプローブ。
- 配列番号３２のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus fumigatusを同定するためのプローブ。
- 配列番号３３のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus nigerを同定するためのプローブ。
- 配列番号３４のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus terreusを同定するためのプローブ。
- 配列番号３５のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus nidulansを同定するためのプローブ。
- プローブが配列番号３０または３１のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus flavusを検出するための方法。
- プローブが配列番号３２のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus fumigatusを検出するための方法。
- プローブが配列番号３３のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus nigerを検出するための方法。
- プローブが配列番号３４のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus terreusを検出するための方法。
- プローブが配列番号３５のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus nidulansを検出するための方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4540097P | 1997-05-02 | 1997-05-02 | |
| US60/045,400 | 1997-05-02 | ||
| PCT/US1998/008926 WO1998050584A2 (en) | 1997-05-02 | 1998-05-01 | Nucleic acids for detecting aspergillus species and other filamentous fungi |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009206668A Division JP2010042005A (ja) | 1997-05-02 | 2009-09-08 | Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001525665A JP2001525665A (ja) | 2001-12-11 |
| JP4425354B2 true JP4425354B2 (ja) | 2010-03-03 |
Family
ID=21937654
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54827598A Expired - Fee Related JP4425354B2 (ja) | 1997-05-02 | 1998-05-01 | Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
| JP2009206668A Pending JP2010042005A (ja) | 1997-05-02 | 2009-09-08 | Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009206668A Pending JP2010042005A (ja) | 1997-05-02 | 2009-09-08 | Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6372430B1 (ja) |
| EP (1) | EP0979312B1 (ja) |
| JP (2) | JP4425354B2 (ja) |
| AT (1) | ATE320506T1 (ja) |
| AU (1) | AU733810B2 (ja) |
| CA (2) | CA2288965C (ja) |
| DE (1) | DE69833853T2 (ja) |
| WO (1) | WO1998050584A2 (ja) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6902887B1 (en) * | 1999-03-22 | 2005-06-07 | Novozymes Biotech, Inc. | Methods for monitoring multiple gene expression |
| AU782305B2 (en) * | 1999-05-28 | 2005-07-21 | Enterprise Ireland Trading As Bioresearch Ireland | Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens |
| ES2336657T3 (es) | 2001-09-26 | 2010-04-15 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Acidos nucleicos para la identificacion de hongos y procedimientos para usarlos. |
| WO2003080866A1 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-02 | Council Of Scientific And Industrial Research | Novel primers for identifying aflatoxinogenic aspergilli and an improved use thereof |
| EP2108707A3 (en) | 2002-05-17 | 2010-04-14 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Molecular identification of Aspergillus Species |
| WO2004029216A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Diagnosis of invasive mold infection |
| JP2004290171A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-10-21 | Akira Hiraishi | 微生物の分子生物学的同定技術 |
| DE10344057B3 (de) * | 2003-09-23 | 2005-06-09 | Vermicon Ag | Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis getränkeschädlicher Mikroorganismen |
| US9182398B2 (en) * | 2006-04-01 | 2015-11-10 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for detecting fungi and mycotoxins |
| WO2007132589A1 (ja) * | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出用プライマーセット |
| GB0621864D0 (en) | 2006-11-02 | 2006-12-13 | Univ Manchester | Assay for fungal infection |
| JP5196848B2 (ja) * | 2007-05-14 | 2013-05-15 | キヤノン株式会社 | プローブセット、プローブ担体、検査方法及びｄｎａ検出用キット |
| JP5317430B2 (ja) * | 2007-05-14 | 2013-10-16 | キヤノン株式会社 | プローブセット、プローブ担体、及び真菌の判別同定方法 |
| EP2130928A1 (en) * | 2008-06-02 | 2009-12-09 | Omya Development AG | Nucleic acids and methods for detecting turfgrass pathogenic fungi |
| US20100068718A1 (en) | 2008-08-22 | 2010-03-18 | Hooper Dennis G | Methods and Compositions for Identifying Yeast |
| US20100075322A1 (en) * | 2008-08-22 | 2010-03-25 | Hooper Dennis G | Methods and Compositions for Identifying Mycotoxins and Fungal Species |
| CZ302670B6 (cs) * | 2009-04-21 | 2011-08-24 | Masarykova Univerzita | Zpusob diagnostiky invazivní aspergilózy a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
| WO2011030091A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Myconostica Limited | Assay for candida species |
| US8962251B2 (en) * | 2009-10-08 | 2015-02-24 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for identifying sulfur and iron modifying bacteria |
| PL2536850T3 (pl) | 2010-02-15 | 2017-09-29 | Council Of Scientific & Industrial Research | Sposób wykrywania patogenów grzybiczych |
| US9290817B2 (en) | 2010-08-19 | 2016-03-22 | Council Of Scientific & Industrial Research | Diagnostic assays for the detection and identification of aspergilli |
| US20130116344A1 (en) * | 2011-02-10 | 2013-05-09 | Nicola Di Maiuta | Nucleic acids and methods for detecting turfgrass pathogenic fungi |
| EP2734280A4 (en) * | 2011-07-22 | 2015-04-15 | Bio Merieux Inc | METHOD AND NECESSARY INSULATING MICROORGANISMS OF A CULTURE |
| ES2399862B1 (es) * | 2011-09-15 | 2014-01-22 | Universidad Del País Vasco | Métodos y reactivos para la detección de aspergillus sp. |
| US8956821B2 (en) | 2013-02-06 | 2015-02-17 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for detecting Aspergillus terreus, Aspergillus niger, and mycotoxins |
| WO2014148455A1 (ja) * | 2013-03-19 | 2014-09-25 | 第一三共株式会社 | テルペノイド誘導体 |
| EP3129503A4 (en) * | 2014-04-11 | 2018-02-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for metagenome biomarker detection |
| CN104450937A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-03-25 | 天津宝瑞生物技术有限公司 | 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 |
| JP6880554B2 (ja) * | 2016-03-09 | 2021-06-02 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | カビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット |
| CN114908084B (zh) * | 2022-04-07 | 2024-06-14 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 尖端赛多孢子菌、土曲霉、构巢曲霉的引物探针及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5426027A (en) * | 1993-05-20 | 1995-06-20 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary | Nucleic acid probes and methods for detecting Candida DNA cells in blood |
| US5585238A (en) * | 1994-04-25 | 1996-12-17 | Ciba-Geigy Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US5763169A (en) | 1995-01-13 | 1998-06-09 | Chiron Diagnostics Corporation | Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi |
-
1998
- 1998-05-01 EP EP98920939A patent/EP0979312B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 CA CA002288965A patent/CA2288965C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-01 AU AU73660/98A patent/AU733810B2/en not_active Ceased
- 1998-05-01 US US09/423,233 patent/US6372430B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 AT AT98920939T patent/ATE320506T1/de active
- 1998-05-01 DE DE69833853T patent/DE69833853T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 JP JP54827598A patent/JP4425354B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-01 CA CA2658320A patent/CA2658320C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-01 WO PCT/US1998/008926 patent/WO1998050584A2/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-01-14 US US10/046,955 patent/US7052836B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-09-08 JP JP2009206668A patent/JP2010042005A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030129600A1 (en) | 2003-07-10 |
| CA2658320A1 (en) | 1998-11-12 |
| JP2010042005A (ja) | 2010-02-25 |
| ATE320506T1 (de) | 2006-04-15 |
| EP0979312B1 (en) | 2006-03-15 |
| EP0979312A2 (en) | 2000-02-16 |
| WO1998050584A2 (en) | 1998-11-12 |
| CA2288965C (en) | 2009-07-07 |
| DE69833853T2 (de) | 2007-03-15 |
| JP2001525665A (ja) | 2001-12-11 |
| CA2288965A1 (en) | 1998-11-12 |
| US6372430B1 (en) | 2002-04-16 |
| WO1998050584A3 (en) | 1999-02-18 |
| CA2658320C (en) | 2012-11-20 |
| DE69833853D1 (de) | 2006-05-11 |
| AU7366098A (en) | 1998-11-27 |
| AU733810B2 (en) | 2001-05-24 |
| US7052836B2 (en) | 2006-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4425354B2 (ja) | Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸 | |
| JP4963765B2 (ja) | 臨床的に重要な真菌病原体を検出するための核酸プローブおよび方法 | |
| JP4997277B2 (ja) | Ｃａｎｄｉｄａｓｐｐ．の検出のための方法および組成物 | |
| US7871779B2 (en) | Molecular identification of Aspergillus species | |
| JP2002504817A (ja) | 真菌の検出および同定のための核酸プローブ | |
| JP2010075203A5 (ja) | ||
| US7427472B2 (en) | Methods for the differentiation and identification of medically important endemic fungi | |
| JP2001512035A (ja) | Ｃａｎｄｉｄａ種を検出するための核酸プローブ | |
| US5693501A (en) | Compounds and methods to determine presence of Histoplasma capsulatum | |
| US5811240A (en) | Species-specific mitochondrial sequences for identification of Tilletia indica, the karnal bunt wheat fungus and methods of using said sequences |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050404 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071113 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080213 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080324 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080513 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080722 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081022 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090310 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090609 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090717 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090902 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091110 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091209 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121218 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131218 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |