CN111471688A - 一种家蚕类肌动蛋白6a基因及检测其甲基化水平的应用 - Google Patents

一种家蚕类肌动蛋白6a基因及检测其甲基化水平的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种家蚕类肌动蛋白6A基因及检测其甲基化水平的应用，该基因1884‑2071bp核苷酸区域中CG甲基化水平在感染核型多角体病毒的家蚕细胞中显著高于正常细胞，该区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了特异性检测该区域中CG甲基化水平的引物对、试剂盒和检测方法，该引物正向序列为SEQ ID NO.2，反向序列为SEQ ID NO.3，本发明为研究家蚕DNA甲基化与核型多角体病毒的互作机制提供了新的研究方向，本发明公开的用于检测该基因甲基化水平的引物及检测试剂盒对家蚕核型多角体病毒的检测具有重要的实际应用价值。

Description

一种家蚕类肌动蛋白6A基因及检测其甲基化水平的应用
技术领域
本发明涉及一种家蚕基因及检测其甲基化水平的应用，尤其涉及一种家蚕类肌动蛋白6A基因及检测其甲基化水平的应用，属于生物技术领域。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传的一种重要修饰途径广泛参与包括胚胎发育、基因组印迹、性别分化、衰老以及病毒感染等一系列重要的生命过程。大量研究发现病毒感染尤其是导致肿瘤生成的病毒可诱导宿主基因组DNA的异常甲基化，从而产生免疫应答或免疫逃逸。不同阶段的癌症患者和健康个体相比，DNA甲基化模式和甲基化水平均存在显著差异，并且在癌症发生早期，体液中的DNA甲基化水平会出现变化。因此，准确且定量地检测DNA甲基化水平对于癌症的早期诊断和长时间监测具有十分重要的意义。
家蚕核型多角体病毒,Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV)属昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)，核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)，病毒粒子为杆状，基因组大小约为128kb,编码约100多个基因。该病毒传染性极强，难以控制，暴发频繁，给养蚕业造成了巨大的经济损失。在宿主昆虫细胞内,BmNPV DNA的复制及基因的表达是一种有序发生的级联事件，其感染过程依赖于其基因的阶段性调节和依次表达，即前一阶段的基因产物直接或间接的反式作用于下一阶段的基因转录。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的旨在提供一种在感染家蚕核型多角体病毒的家蚕细胞中呈现高甲基化的家蚕类肌动蛋白6A基因，本发明的第二目的旨在提供检测该基因甲基化水平的应用。
技术方案：本发明的家蚕类肌动蛋白6A基因(基因号：NW_004582034)的1884-2071bp核苷酸区域中CG甲基化水平在感染核型多角体病毒的家蚕细胞中显著高于正常家蚕细胞，所述区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明特异性检测家蚕类肌动蛋白基因甲基化水平的引物对，引物对包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明含有该引物对的用于检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的试剂盒。
进一步地，试剂盒还包括亚硫酸氢盐处理试剂、Taq酶、dNTPs、缓冲液和ddH2O。
本发明利用该试剂盒检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的方法，包括如下步骤：
(1)家蚕基因组DNA提取；
(2)家蚕基因组DNA亚硫酸氢盐处理；
(3)使用试剂盒对经过亚硫酸氢盐处理的家蚕基因组DNA进行PCR扩增反应，得PCR扩增反应产物；
(4)对PCR扩增反应产物进行甲基化水平分析。
进一步地，步骤(3)中，PCR扩增反应条件为：95℃预变性3-5min；
94℃变性30-45s，58℃退火30-45s，72℃延伸40-60s，35个循环；最后，72℃修复延伸5-7min。
进一步地，步骤(4)中，将PCR扩增反应产物纯化后进行克隆测序，要求每个测序样本的阳性克隆数不低于10个。
进一步地，检测测序样本的甲基化水平的方法如下：分析测序样本的所有测序片段中每个CG位点的甲基化情况，测序样本的所有测序片段中所有CG位点发生甲基化的个数与所有CG位点的个数比值视为该测序样本的平均甲基化水平。
类肌动蛋白6A基因对胚胎发生和分化至关重要，在肝癌细胞和结肠癌细胞转移中发挥关键作用。该基因涉及Hippo signaling信号通路，在多种癌症细胞中高表达，可促进恶性神经胶质瘤的形成，类肌动蛋白可被作为新型的骨肉瘤生物标志物及治疗靶标。它也是肝细胞癌预后不良的生物指标。发明人进行全转录组测序分析及全基因组DNA甲基化测序分析显示，类肌动蛋白6A基因在感染家蚕核型多角体病毒后被诱导表达，其第二外显子区域呈高甲基化。因此，检测类肌动蛋白6A基因的甲基化水平可协助诊断家蚕核型多角体病毒。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明提供了一种通过BSP技术特异性检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的引物、试剂盒和检测方法，利用该引物和试剂盒可准确检测家蚕感染BmNPV细胞中特异基因CG位点的甲基化水平，进而作为家蚕核型多角体病毒诊断的依据之一，本发明的引物具有特异性强，稳定性高等优点。本发明中提供的家蚕类肌动蛋白6A基因可作为潜在治疗靶点以及为开展家蚕抗病毒分子育种提供线索。
附图说明
图1本发明的家蚕类肌动蛋白6A基因BSP扩增图；
图2BmNPV感染细胞(T)与对照细胞(C)部分单克隆测序结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1DNA提取
使用Ezup Column Animal Genomic DNAPurification Kit提取DNA，具体步骤如下：
(1)实验组为添加了家蚕核型多角体病毒的BmN细胞，对照组为正常的BmN细胞，每孔细胞加入200μl Buffer PBS和20μl Proteinase K，轻轻晃动培养瓶，收集细胞，转移至新的离心管中，再加入200μl Buffer CL，震荡混匀，56℃水浴10min；
(2)加入200μl Buffer CL，充分颠倒混匀；
(3)加入200μl的无水乙醇，充分颠倒混匀；
(4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；
(5)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl CW1 Solution，10,000rpm离心30s，倒掉收集管废液；
(6)重复步骤(5)一次；
(7)将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的CW2Solution；
(8)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入200μl CE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。
实施例2DNA亚硫酸氢盐处理
使用试剂盒中提供的亚硫酸氢盐处理试剂将步骤一中提取的DNA进行亚硫酸氢盐修饰，具体步骤如下：
(1)在PCR单管中加入130μL的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品(如样品少于20ul，用水补齐)；
(2)将上述样品置于水浴锅上水浴(98℃10min；64℃2.5h)；
(3)将600μL的M-Binding Buffer加入Zymo-SpinTMIC Column中，并将其放入收集管中；
(4)将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-SpinTMIC Column中，关上盖子并颠倒混匀；
(5)12000rpm离心30s，弃收集管中的液体；
(6)加入100μL的M-Wash Buffer，12000rpm离心30s；
(7)加入200μL的M-Desulphonation Buffer，在室温下(20℃～30℃)静置15-20min，12000rpm离心30s；
(8)加入200μL的M-Wash Buffer，12000rpm离心30s，重复一次；
(9)将Zymo-SpinTMIC Column置入1.5mL离心管中，加入10μL的M-Elution Buffer(尽量靠近柱子中心)，12000rpm离心30s。
实施例3PCR扩增反应
采用试剂盒中提供的扩增试剂以步骤二中经亚硫酸氢盐修饰的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如表1所示。
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0002442453970000041
PCR反应条件如表2所示。
表2 PCR反应条件
Figure BDA0002442453970000042
PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示如图1，表明本发明中的引物可扩增出特异性目的片段。
实施例4目的片段甲基化水平检测
对PCR产物切胶回收之后进行连接转化，实验组和对照组各随机挑选10个单克隆进行测序，部分测序结果见图2。使用线上软件(http://quma.cdb.riken.jp)对两组目的片段的甲基化水平进行比对，CG位点如下所示：
Figure BDA0002442453970000043
带框为设计的引物位置，中间部分为待测序列。PCR扩增片段中含有10个CG位点。在序列中的位置如下：28，42，56，71，76，78，82，100，113，122。
比对结果如表3所示。
表3感染组和对照组甲基化水平
Figure BDA0002442453970000051
结果表明本发明引物所扩增出的目的片段在BmNPV感染家蚕细胞中的平均甲基化水平为81％，显著高于对照组53％。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种家蚕类肌动蛋白6A基因及检测其甲基化水平的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 188
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 1
aaatcactgc tctatattcc caagataaca tgttattatt tccttaacag gcagtaaaac 60
gggcagtgag ctgcgacact acatagacgt cacagagctc cacgttccgc gtccgggaat 120
ggaagtgcag acgtacatga aagacggaca agtcgacaac tgggatctgt ttgagaagat 180
gcttgatt 188
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 2
aaattattgt tttatatttt taagataata tg 32
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 3
aatcaaacat cttctcaaac aaatc 25

Claims (8)

1.一种家蚕类肌动蛋白6A基因，其特征在于：所述家蚕类肌动蛋白6A基因的1884-2071bp核苷酸区域中CG甲基化水平在感染核型多角体病毒的家蚕细胞中显著高于正常家蚕细胞，所述区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种特异性检测权利要求1所述家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的引物对，其特征在于：所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种含有权利要求2所述引物对的用于检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的试剂盒。
4.根据权利要求3所述用于检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括亚硫酸氢盐处理试剂、Taq酶、dNTPs、缓冲液和ddH2O。
5.一种利用权利要求3或4所述试剂盒检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)家蚕基因组DNA提取；
(2)家蚕基因组DNA亚硫酸氢盐处理；
(3)使用所述试剂盒对经过亚硫酸氢盐处理的家蚕基因组DNA进行PCR扩增反应，得PCR扩增反应产物；
(4)对所述PCR扩增反应产物进行甲基化水平分析。
6.根据权利要求5所述检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性3-5min；
94℃变性30-45s，58℃退火30-45s，72℃延伸40-60s，35个循环；最后，72℃修复延伸5-7min。
7.根据权利要求5所述检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的方法，其特征在于：步骤(4)中，将所述PCR扩增反应产物纯化后进行克隆测序，要求每个测序样本的阳性克隆数不低于10个。
8.根据权利要求7所述检测家蚕类肌动蛋白6A基因甲基化水平的方法，其特征在于，检测所述测序样本的甲基化水平的方法如下：分析所述测序样本的所有测序片段中每个CG位点的甲基化情况，所述测序样本的所有测序片段中所有CG位点发生甲基化的个数与所有CG位点的个数比值视为该测序样本的平均甲基化水平。
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