CN114540494A - 一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，包括RPA单元，所述RPA单元包括用于检测circ_0001649的第一子单元和用于检测circ_0009910的第二子单元。本技术方案采用重组酶聚合酶扩增技术对作为肝癌标志物的circRNA进行检测，可在较短的时间内且在室温环境下可完成反应，并提升了检测灵敏度和特异性。本方案的试剂盒同时对circ_0001649和circ_0009910两种circRNA进行检测，进一步提升检测的准确程度。除此之外，本技术方案对血液中的干扰物的抗干扰性强，不需要对样品进行复杂的除杂质处理，具有良好的应用前景。

Description

一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒。
背景技术
环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA(linear RNA，含5’和3’末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。目前针对circRNA检测常用方法主要有RT-PCR、Northern blot和Co-IP等，但这些检测方法均存在不同程度的缺陷，难以满足临床以及床旁检测对肝癌早期诊断的需求，使得检测技术很难在中小医院推广。另外，circRNA不同于普通mRNA，这对引物和探针的设计提出了非常高的要求。综上，临床和实验室都迫切需要开发新的高敏、特异、简便、快速的circRNA检测新技术和新方法，以提升肝癌检测的准确度和拓展circRNA检测方法的适应范围。
发明内容
本发明意在提供一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，以解决现有的对circRNA的检测技术灵敏度、特异性和简便快捷程度不能满足应用需求的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，包括RPA单元，所述RPA单元包括用于检测circ_0001649的第一子单元和用于检测circ_0009910的第二子单元。
采用上述技术方案的原理以及优点在于：
本技术方案采用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)这一新型恒温核酸扩增技术，对作为肝癌标志物的circRNA进行检测。其基本原理是由单链结合蛋白(SSB)置换DNA双链形成单链，代替常规PCR热变性的双链打开功能。其扩增循环转换极快，可高速度指数扩增，在较短的时间内可完成RPA反应，并且RPA反应在室温下进行。本方案使用RPA技术解决了现有的对circRNA的检测技术灵敏度、特异性和简便快捷程度不能满足应用需求的技术问题。
circ_0001649和circ_0009910均为可作为肝癌标志物的circRNA，发明人通过大量实验研究发现单一种类circRNAs的灵敏度和特异性存在各自不足。在实验过程中发现，采用本方案的试剂盒检测circ_0001649，其检测特异性比检测circ_0009910高；但是，其检测灵敏度比检测circ_0009910稍低(详见实验例3和实验例4)。因此，对circ_0001649和circ_0009910的检测如果单独进行，则很容易出现假阳性或者假阴性的结果。所以，需要设置试剂盒对circ_0001649和circ_0009910进行同时检测，在同时阳性的情况下，提示肝癌风险，再进行下一步检测确诊，以提升检测结果的准确程度。
综上所述，本技术方案的有益效果在于：使用RPA技术，在检测circRNA标志物时，反应7-10min信号即达到平台期，本技术具有快速简便、不依赖变温仪器的优点；针对两种circRNA，本试剂盒的最低检测限较低，检测灵敏度高；本试剂盒只对阳性样品产生显著信号，对其他物质无信号，特异性优异；本试剂盒对血液中主要干扰物血红蛋白抗干扰性很强，体系能较好的对靶标分子进行检测，抗干扰性较好，这就降低了样品预处理的难度，拓宽了检测方法的应用范围。
进一步，所述第一子单元和所述第二子单元均包括反义引物、正义引物和探针；所述探针含有一个四氢呋喃修饰的碱基，四氢呋喃修饰的碱基的两侧分别修饰有6-羧基荧光素和黑洞淬灭基团1；所述探针的3’末端的block基团为C3Spacer。
进一步，6-羧基荧光素和黑洞淬灭基团1之间间隔2-3个碱基。荧光基团和荧光淬灭基团之间相隔距离短，可实现对荧光强度的有效控制，并准确反映出RPA反应进行的程度，进而判断样品中是否存在circ_0001649或circ_0009910，以及计算两种目标物质的含量。
进一步，所述第一子单元包括序列如SEQ ID NO.1所示的、序列如SEQ ID NO.2所示的和序列如SEQ ID NO.3所示的反义引物，序列如SEQ ID NO.4所示的、序列如SEQ IDNO.5所示的和序列如SEQ ID NO.6所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.7所示的和序列如SEQ ID NO.8所示的探针。
进一步，所述第二子单元包括序列如SEQ ID NO.9所示的、序列如SEQ ID NO.10所示的和序列如SEQ ID NO.11所示的反义引物，序列如SEQ ID NO.12所示的、序列如SEQ IDNO.13所示的和序列如SEQ ID NO.14所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的和序列如SEQ ID NO.16所示的探针。
采用上述的引物对以及探针均能实现目标序列的扩增以及检测，实现对circ_0001649和circ_0009910的快速检测。
进一步，所述第一子单元包括序列如SEQ ID NO.1所示的反义引物，序列如SEQ IDNO.4所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.7所示的探针。
进一步，所述第二子单元包括序列如SEQ ID NO.9所示的反义引物，序列如SEQ IDNO.12所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的探针。
采用上述的引物对以及探针可以实现对circ_0001649和circ_0009910的高效扩增，在较短的时间内进入信号平台期，获得理想的荧光强度，并且避免对应的阴性对照中产生非特异性峰，增加检测的准确程度、灵敏性以及缩短检测时间。
进一步，所述第一子单元的最低检测限为10拷贝。
进一步，所述第二子单元的最低检测限为11拷贝。
本试剂盒针对circ_0001649的线性范围为108-5拷贝，针对circ_0009910的线性范围108-10拷贝，且针对两种检测目标物质检测限度低，检测灵敏度高。
进一步，所述第一子单元和第二子单元的工作温度均为36-42℃。
本试剂盒针对circ_0001649和circ_0009910标志物的RPA扩增温度范围是36-42℃，采用上述温度范围均能正确扩增。其中，在39℃反应最佳，在此温度下，扩增曲线以较快的速度起峰，缩短检测时间。
附图说明
图1为本发明实验例1的针对circ_0001649的引物筛选实验结果。
图2为本发明实验例1的针对circ_0009910的引物筛选实验结果。
图3为本发明实验例2的最佳反应温度测试结果。
图4为本发明实验例3的针对circ_0001649的线性范围和灵敏度测试结果。
图5为本发明实验例3的针对circ_0009910的线性范围和灵敏度测试结果。
图6为本发明实验例4的针对circ_0001649的RPA系统的特异性测试结果。
图7为本发明实验例4的针对circ_0009910的RPA系统的特异性测试结果。
图8为本发明实验例5的RPA系统的抗干扰性测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：探针和引物设计
针对肿瘤circRNA标志物circ_0001649(接收号：NM_173082)(后文简称为circA)设计RPA引物和探针，具体如下：
反义引物(Anti-sense，下游引物)：
1号：5'-GAAAGGTTCTCCTGAAATGTCTTAACACGA-3'(R1，SEQ ID NO.1)；
2号：5'-GTGCAAATTCCATGTTGTTGTCAGTAAGAG-3'(R2，SEQ ID NO.2)；
3号：5'-GTTGAGAAAACGAGTGCTTTGGCCCCTGGA-3'(R3，SEQ ID NO.3)。
正义引物(Sense，上游引物)：
1号：5'-TCATTGAAGCAACTCATGTTCTCTTGGTGG-3'(F1，SEQ ID NO.4)；
2号：5'-CTCTTGGTGGAGCCCATATTGAACCCTGCC-3'(F2，SEQ ID NO.5)；
3号：5'-GCACCGAATTGGACAGACAAAACCTACTAT-3'(F3，SEQ ID NO.6)。
探针：
1号：5'-CAGAGTTCTGACCACAGCTTCCAC[FAM-dT]T[THF]TG[BHQ1dT]AGAATGGCTGCCCTTC-(C3Spacer)-3'(circA-P1，SEQ ID NO.7)；
2号：5'-CCACAGCTTCCACTTTTGTAGAATGGC[FAM-dT][THF]CCC[BHQ1dT]TCTCTCAGCAGTT-(C3Spacer)-3'(circA-P2，SEQ ID NO.8)；
针对SEQ ID NO.7，第27位碱基T标记四氢呋喃(THF)，形成dSpacer作为核酸外切酶的识别位点；第25位碱基T上标记荧光基团FAM(6-羧基荧光素)，第29位碱基T上标记荧光淬灭基团BHQ1(黑洞淬灭基团1)；3'末端标记修饰基团C3Spacer(即在探针的3’端引入一个C3烷烃的间臂，以阻断PCR链延伸)。
针对EQ ID NO.8，第29位碱基C标记四氢呋喃(THF)，形成dSpacer作为核酸外切酶的识别位点；第28位碱基T上标记荧光基团FAM(6-羧基荧光素)，第31位碱基T上标记荧光淬灭基团BHQ1(黑洞淬灭基团1)；3'末端标记修饰基团C3Spacer(即在探针的3’端引入一个C3烷烃的间臂，以阻断PCR链延伸)。
针对肿瘤circRNA标志物circ_0009910(接收号：NM_014874)(后文简称为circB)设计RPA引物和探针，具体如下：
反义引物(Anti-sense，下游引物)：
1号：5'-ATCGAGAGAAGAGCAGGGACATTGCGCGGCCA-3'(1A，SEQ ID NO.9)；
2号：5'-GCCATGTGTCTCTTATTTTTCTTGACTGTG-3'(2A，SEQ ID NO.10)；
3号：5'-TCACCTCAGCCATGTGTCTCTTATTTTTCT-3'(3A，SEQ ID NO.11)。
正义引物(Sense，上游引物)：
1号：5'-CGTACAGGAATGCAGAACTGGACCCCGTTA-3'(1S，SEQ ID NO.12)；
2号：5'-AAAGGTTACCTATCCAAAGTGAGAGGCATC-3'(2S，SEQ ID NO.13)；
3号：5'-AGTGGCTTTTTTTGGCCGCGCAATGTCCCT-3'(3S，SEQ ID NO.14)。
探针：
1号：5'-CATTGCGCGGCCAAAAAAAGCCACT[FAM-dT]TT[THF]A[BHQ1-dT]GTGCCTCCGAGCCAGC-(C3Spacer)-3'(circB-P1，SEQ ID NO.15)；
2号：5'-CCACTTTCATGTGCCTCCGAGCCAGCACC[FAM-dT]C[THF]C[BHQ1-dT]GATGCCTCTCAC-(C3Spacer)-3'(circB-P2，SEQ ID NO.16)；
针对SEQ ID NO.15，第29位碱基A标记四氢呋喃(THF)，形成dSpacer作为核酸外切酶的识别位点；第26位碱基T上标记荧光基团FAM(6-羧基荧光素)，第30位碱基T上标记荧光淬灭基团BHQ1(黑洞淬灭基团1)；3'末端标记修饰基团C3Spacer(即在探针的3’端引入一个C3烷烃的间臂，以阻断PCR链延伸)。
针对EQ ID NO.16，第32位碱基C标记四氢呋喃(THF)，形成dSpacer作为核酸外切酶的识别位点；第30位碱基T上标记荧光基团FAM(6-羧基荧光素)，第33位碱基T上标记荧光淬灭基团BHQ1(黑洞淬灭基团1)；3'末端标记修饰基团C3Spacer(即在探针的3’端引入一个C3烷烃的间臂，以阻断PCR链延伸)。
实施例2：RPA扩增检测
本技术方案使用TwistAmp DNA Amplification exo Kits进行RPA检测，按照表1制备再水合缓冲液体系，然后将47.5μL再水合缓冲液体系转移至反应微球中，反复颠倒或震荡混匀直到整个微球重悬。管盖中加入2.5μL醋酸镁并充分混匀(终浓度14mM/μL)，离心以激活反应。短暂震荡并再次快速离心，获得RPA混合液，然后在指定温度下反应指定时间。
表1：再水合缓冲液体系
Figure BDA0003507561420000061
在本方案中，使用的模板是将circ_0001649和circ_0009910的基因片段按照现有技术的常规手段插入空质粒中，构建在空质粒上的标准模板。
实验例1
对设计的RPA体系中的引物和探针的最佳反应组合筛选，按照实施例2中的RPA扩增体系的配制方法进行实验，将设计的前后引物和探针按规律分别组合，加入反应体系反应，正向引物和反向引物在RPA扩增体系中的终浓度分别为0.48μM、0.48μM；探针在RPA扩增体系中的终浓度为0.2μM；模板在RPA扩增体系中的拷贝数为104个，RPA扩增体系的温度为38℃。实验结果参见图1(使用circA-P1，即SEQ ID NO.7，NTC表示不加入模板的对照组，探针使用circA-P1，引物对使用R1和F1)和图2(circB-P1，即SEQ ID NO.15，NC表示不加入模板的对照组，探针使用circB-P1，引物对使用1A和1S)。将图1的的实验中所使用的探针更换为circA-P2(SEQ ID NO.8)，并将图2的实验中所使用的探针更换为circB-P2(SEQ IDNO.16)，条件均不变再进行circA-P2探针和circB-P2的实验，同一对引物所获得的扩增曲线的信号进入平台期的时间相对较长(相对于使用circA-P1或者circB-P1)，信号强度不理想。在图1中，F1R1和F3R2、F3R3相比，荧光信号强度相似，但是使用F3R2和F3R3在阴性对照(仅不含模板的对照组)中也会起峰，非常容易造成假阳性。使用在图2中，最佳引物对选择了1A1S而不是荧光强度信号更好的3A2S和3A1S，是因为采用3A2S、3A1S、2A2S和2A1S等引物对的时候，荧光信号虽然符合要求，但是其阴性对照(仅不含模板的对照组)也出现了起峰的情况，非常容易造成假阳性。对所有引物和探针的筛选结果表明，针对肿瘤circRNA标志物circ_0001649，最佳引物和探针的组合为：SEQ ID NO.1(R1)、SEQ ID NO.4(F1)和SEQ IDNO.7(circA-P1)；针对肿瘤circRNA标志物circ_0009910，最佳引物和探针的组合为：SEQID NO.9(1A)、SEQ ID NO.12(1S)和SEQ ID NO.15(circB-P1)。故选择上述引物对和探针进行后续实验。
实验例2
对RPA体系中的引物和探针的最佳反应温度优化检测，采用实验例1中获得的最佳引物对和探针组合(针对circ_0001649进行测试)，正向引物和反向引物在RPA扩增体系中的终浓度分别为0.48μM、0.48μM；探针在RPA扩增体系中的终浓度为0.2μM；模板在RPA扩增体系中的拷贝数为104个。将反应体系反应温度分别设定为36℃-42℃，实时荧光结果表明，引物和探针的特异性很好，36-42℃均能正确扩增，在39℃反应最先起峰(参见图3)，故选39℃进行后期实验。
实验例3
对RAP检测的线性范围和灵敏度进行了实验，circ_0001649线性范围为108-5拷贝，circ_0009910线性范围108-11拷贝。选择实验例1中的最佳引物对和探针的组合，正向引物和反向引物在RPA扩增体系中的终浓度分别为0.48μM、0.48μM；探针在RPA扩增体系中的终浓度为0.2μM；以及选择实验例2中的最佳温度。对质粒浓度对比稀释后扩增，扩增曲线明显未进入明显平台期，浓度为当前体系的最低检出限。circ_0001649最低检测限为10拷贝，circ_0009910最低检测限为11拷贝，实验结果参见图4和图5(图中的NTC和NC均为不加模板，其他条件同测试组的检测结果)。
实验例4
为了确认鉴定本技术的特异性指标。选择了如下干扰物质：整合有HULC基因的质粒(104拷贝)、整合有H19的质粒(104拷贝)、整合有circ_0001649的质粒(103拷贝)和整合有circ_0009910的质粒(103拷贝)，及如上质粒的混合物，其他RPA条件同实验例3。circ_0001649特异性实验中，circ_0001649质粒的RPA扩增荧光信号则很强，而单独的HULC、H19和circ_0009910质粒的RPA扩增曲线均分别接近水平，与空白试验类似。而在加入了circ_0001649质粒后，荧光信号明显回复至很高水平(图6)。荧光信号差异，根据使用SPSS19.0进行的计算，该差异具有统计学意义(P<0.05)。同样的情况也出现在circ_0009910特异性实验中，只是circ_0009910质粒作为模板比circ_0001649荧光信号强度要高50000a.u.左右(图7)。结果结果表明，RPA在检测circ_0001649和circ_0009910时具有理想的特异性。
实验例5
为验证当前体系的抗干扰性，在反应体系中添加不同浓度人血红蛋白检测，根据扩增曲线初步验证体系的抗干扰性。本实验例的RPA参数设置参见实验例4(针对circ_0001649进行测试)，并在此基础上加入了0.14g/L-140g/L的人血红蛋白，实验结果详见图8。从扩增结果看，当前体系已能较好的对目的基因进行检测，抗干扰性较好。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Figure BDA0003507561420000081
Figure BDA0003507561420000091
Figure BDA0003507561420000101
Figure BDA0003507561420000111
Figure BDA0003507561420000121
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒
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<213> 人工序列
<400> 13
aaaggttacc tatccaaagt gagaggcatc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agtggctttt tttggccgcg caatgtccct 30
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cattgcgcgg ccaaaaaaag ccacttttat gtgcctccga gccagc 46
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccactttcat gtgcctccga gccagcacct cctgatgcct ctcac 45

Claims (10)

1.一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：包括RPA单元，所述RPA单元包括用于检测circ_0001649的第一子单元和用于检测circ_0009910的第二子单元。
2.根据权利要求1所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第一子单元和所述第二子单元均包括反义引物、正义引物和探针；所述探针含有一个四氢呋喃修饰的碱基，四氢呋喃修饰的碱基的两侧分别修饰有6-羧基荧光素和黑洞淬灭基团1；所述探针的3’末端的block基团为C3Spacer。
3.根据权利要求2所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：6-羧基荧光素和黑洞淬灭基团1之间间隔2-3个碱基。
4.根据权利要求3所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第一子单元包括序列如SEQ ID NO.1所示的、序列如SEQ ID NO.2所示的和序列如SEQ IDNO.3所示的反义引物，序列如SEQ ID NO.4所示的、序列如SEQ ID NO.5所示的和序列如SEQID NO.6所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.7所示的和序列如SEQ ID NO.8所示的探针。
5.根据权利要求4所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第二子单元包括序列如SEQ ID NO.9所示的、序列如SEQ ID NO.10所示的和序列如SEQID NO.11所示的反义引物，序列如SEQ ID NO.12所示的、序列如SEQ ID NO.13所示的和序列如SEQ ID NO.14所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的和序列如SEQ IDNO.16所示的探针。
6.根据权利要求5所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第一子单元包括序列如SEQ ID NO.1所示的反义引物，序列如SEQ ID NO.4所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.7所示的探针。
7.根据权利要求6所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第二子单元包括序列如SEQ ID NO.9所示的反义引物，序列如SEQ ID NO.12所示的正义引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的探针。
8.根据权利要求7所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第一子单元的最低检测限为10拷贝。
9.根据权利要求8所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第二子单元的最低检测限为11拷贝。
10.根据权利要求9所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒，其特征在于：所述第一子单元和第二子单元的工作温度均为36-42℃。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108034763A (zh) * 2017-12-21 2018-05-15 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN111471797A (zh) * 2020-04-16 2020-07-31 广东省实验动物监测所 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法
CN112239794A (zh) * 2020-07-20 2021-01-19 上海伯豪医学检验所有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN113278718A (zh) * 2021-06-09 2021-08-20 湛江海关技术中心 一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用
CN113846167A (zh) * 2021-12-01 2021-12-28 苏州艾米森生物科技有限公司 一种原发性肝癌的分子标记物检测试剂盒、核酸组合及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108034763A (zh) * 2017-12-21 2018-05-15 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN111471797A (zh) * 2020-04-16 2020-07-31 广东省实验动物监测所 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法
CN112239794A (zh) * 2020-07-20 2021-01-19 上海伯豪医学检验所有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN113278718A (zh) * 2021-06-09 2021-08-20 湛江海关技术中心 一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用
CN113846167A (zh) * 2021-12-01 2021-12-28 苏州艾米森生物科技有限公司 一种原发性肝癌的分子标记物检测试剂盒、核酸组合及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H.-W. LI等: "Circ_0009910 promotes proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma cells through miR-335-5p/ROCK1 axis", EUROPEAN REVIEW FOR MEDICAL AND PHARMACOLOGICAL SCIENCES, pages 1 - 11 *
KAI-FENG HUNG等: "Identification of plasma hsa_circ_0000190 and 0001649 as biomarkers for predicting the recurrence and treatment response of patients with oral squamous cell carcinoma", J CHIN MED ASSOC, pages 431 - 438 *
MEILIN QIN等: "Hsa_circ_0001649: A circular RNA and potential novel biomarker for hepatocellular carcinoma", CANCER BIOMARKERS 16, pages 161 - 169 *

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