CN105039590A - 一种快速鉴别n1、n2亚型流感病毒的方法 - Google Patents

一种快速鉴别n1、n2亚型流感病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速测定N1、N2亚流感病毒的方法，本发明采用一步法荧光定量RT-PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance？solution预混成2X？one-step？buffer，将多种酶配比进行混合，使本发明的操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染，本发明操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1和N2鉴别检测荧光定量RT-PCR试剂盒，用于N1和N2亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。

Description

一种快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别流感病毒不同亚型的方法，具体涉及一种利用多重荧光定量PCR方法快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法。
背景技术
流感病毒（InfluenzaVirus）属正粘病毒科，为RNA病毒。根据病毒膜蛋白（M）和核蛋白（NP）的差异，将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三个大型。其中A型流感的流行时间最长，危害最大，流行宿主范围也最广。根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的结构及其基因特性的不同，又可分为不同亚型。目前A型流感病毒已发现的血凝素（HA）有16个亚型，分别用H1、H2…H16来表示；神经氨酸酶有9个亚型，分别用NI、N2…N9来表示。各亚型间的HA和NA交叉组成不同的亚型毒株，如H1N1、H5N2、H5N1、H9N2等。各亚型的基因序列有所不同，病毒特性和抗原性等亦有所不同。其中H5N1、H5N2、H9N2亚型禽流感病毒是目前感染肉鸡、蛋鸡的最常见的亚型，引起鸡群高死亡率的是H5N1、H5N2亚型，H9N2亚型的死亡率较低。因此根据临床鸡群发病死亡情况结合检测N1、N2亚型流感病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，使我们能在极短的时间内判断鸡群是由哪种亚型的病毒引起的感染，为临床预防治疗禽病提供理论基础。
流感病毒容易变异，变异形式有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围等方面的变异，但最主要的是抗原性变异。抗原性变异主要是表面抗原HA和NA易变异。流感病毒表面抗原变异幅度的大小，直接影响到病毒传播的能力。若变异幅度小，属于量变，称为抗原漂移。如果抗原变异幅度大，属于质变，称为抗原性转变，形成新的亚型，危害一般较大，往往引起较大的流行，甚至世界性流行。如甲型流感病毒的HA、NA基因容易发生抗原转变，导致HA和NA的部分或大部分氨基酸发生改变，出现抗原性完全不同的新亚型。
流感病毒的检测主要依靠实验室进行确切诊断，常规的诊断方法主要包括血清学检测及病原的分离鉴定两方面。病毒的分离是诊断该病最常用的方法之一，通常采用鸡胚接种分离流感病毒，经培养后的病毒经过血凝(HA)及血凝抑制(HI)实验，可初步鉴定出流感病毒。但是病毒分离无论是鸡胚接种还是细胞分离都存在周期过长、不能准确区分病毒亚型、准确性和敏感性差的问题。
随着分子生物学的飞速发展，分子生物学技术已广泛应用于流感病毒的测定。尤其是近年来快速发展的荧光定量RT-PCR方法。荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。反转录和PCR扩增又在同一管内完成，有助于减少操作污染，时间更短、灵敏度更高。在实时荧光定量PCR反应中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度的变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。最常用的探针是TaqMan探针，该探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。其序列与目标序列上游引物和下游引物之间的序列高度配对。其中，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。常用的荧光基团有FAM、TET、VIC、HEX等。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光基因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离。这样随着扩增循环数的不断增加，释放出来的荧光基团也在不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
目前，荧光定量PCR检测被广泛应用于病原微生物检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。
N1和N2亚型的AIVs是感染家禽并能致病的常见NA亚型（如H5N1、H5N2、H9N2等）。目前检测AIV的方法多是针对其HA亚型的检测，如H3、H4、H5、H7、H9等亚型，针对NA亚型的检测技术少有报道，尤其是针对多个NA亚型的鉴别诊断。因此，本研究建立了一种快速、敏感、特异的多重荧光定量RT-PCR方法，可同时检测N1、N2亚型的流感病毒。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的多重荧光定量PCR方法。
具体鉴别方法如下：
取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀：
2Xone-stepRT-PCRBuffer12.5μL；
三种混合酶：
RNaseinhibitor5U
M-MLV40U
TaqHS3U；
N1-fwd（浓度为20μM）0.5μL；
N1-rev（浓度为20μM）0.5μL；
N2-fwd（浓度为20μM）0.5μL；
N2-rev（浓度为20μM）0.5μL；
N1probe10μM0.5μL；
N2probe10μM0.5μL；
N1RNA模板10ng-1μg；
N2RNA模板10ng-1μg；
RNase-freeddH2O补至25μL；
启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中，RT-PCR反应条件：第一步20min42℃，第二步94℃1min，第三步95℃15s，60℃30s，进行45个循环，4℃保存；60℃采集荧光，检测扩增曲线，即得。
引物和探针的碱基序列如下：
所述N1probe5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2probe5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2；
所述RNA模板的制备方法如下：
取含N1或N2亚型的病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA：置于1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体；加入0.2mL的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后离心12,000×g，15min，4°C；离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相；RNA沉淀小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中，加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10min，离心12,000×g，15min，4°C；离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀；RNA洗涤去上清，向沉淀中加入1mL75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000×g，5min，4°C；RNA溶解去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μLDEPC水充分溶解RNA。
使用本发明提供的方法，可快速的鉴别检测N1、N2亚型的流感病毒。
附图说明
图1为N1的扩增曲线；
图2为N2的扩增曲线；
图3为N1和N2特异性扩增曲线；
图4为N1灵敏度检测扩增曲线；
图5为N1基因扩增的标准曲线；
图6为为N2灵敏度检测扩增曲线；
图7为N2基因扩增的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
材料与方法
一、材料
1、病毒模板：N1为已鉴定的两株H5N1等量进行混合提取的总RNA，N2为已鉴定的一株H5N2和一株H9N2样品等量进行混合提取的总RNA。
2、主要试剂：小量质粒提取试剂盒和One-stepReal-timeRT-PCRkit均购自TaKaRa公司。
3、引物和探针的设计与合成：选取以上毒株N1和N2基因的高度保守区，用PrimerExpress进行引物和探针的设计。N1探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2探针5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2，引物和探针均由Life公司合成，其中引物为PAGE级纯化，探针为HPLC级纯化。引物和探针的详细序列和未知，见表1。
4、主要仪器：荧光定量PCR仪为CFX384touchReal-timePCRdetectionsystems，购自美国BIO-RAD公司。
表1引物和探针的序列
二、方法
1、N1和N2引物进行单独扩增
一步法RT-PCR预混体系
2Xone-stepRT-PCRBuffer12.5μL；
三种混合酶
RNaseinhibitor5U
M-MLV40U
TaqHS3U；
N1-fwd/N2-fwd（浓度为20μM）0.5μL；
N1-rev/N2-rev（浓度为20μM）0.5μL；
N1probe/N2probe10μM0.5μL；
N1RNA模板/N12RNA模板10ng-1μg；
RNase-freeddH2O补至25μL；
2、多重荧光RT-PCR检测
加等量多套探针引物，具体如下：
2Xone-stepRT-PCRBuffer12.5μL；
混合酶
RNaseinhibitor5U
M-MLV40U
TaqHS3U；
N1-fwd20μM0.5μL；
N1-rev20μM0.5μL；
N2-fwd20μM0.5μL；
N2-rev20μM0.5μL；
N1probe10μM0.5μL；
N2probe10μM0.5μL；
N1RNA模板10ng-1μg；
N2RNA模板10ng-1μg；
RNase-freeddH2O补至25μL。
启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中。RT-PCR反应条件：第一步20min42℃，第二步94℃1min，第三步95℃15s，60℃30s，进行45个循环，4℃保存。注：60℃采集荧光。记录扩增曲线。
三、N1和N2基因的灵敏度实验和标准曲线
3.1质粒的提取
取过夜菌1-5ml，加入离心管中，12,000rpm离心1分钟收集细菌，弃上清。注意：尽量吸除全部上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μLSolutionⅠ（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液枪或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μLSolutionⅡ，轻轻颠倒离心管混匀5-10次，静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。向离心管中加入350μLSolutionⅢ，立即反转多次，至溶液充分混匀，出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱中，室温下12,000rpm离心1分钟过滤，收集滤液。向吸附柱中加入650μLWashingBuffer（确保已加入无水乙醇），室温下12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。重复上述步骤。将吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm室温离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5分钟。将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50μLddH2O（pH在7.0-8.5之间）或ElutionBuffer，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。
敏感性检测和标准曲线
模板分别为N1片段或N2片段连接的PMD19-T载体质粒，初始模板浓度为109copies/μL。观察对N1和N2单独扩增，同时扩增曲线，并将模板进行连续的10倍倍比稀释后进行荧光定量的扩增后曲线。
三、结果
N1基因的单独扩增曲线
图1中N1基因获得特异性的扩增（波浪线所示），而N2基因未获扩增（虚线所示）。黑色实线扩增为空模板对照。
N2基因的单独扩增曲线
图2中N2基因获得特异性的扩增（虚线），而N1基因未获扩增（黑色）。
N1和N2特异性检测—双重荧光定量RT-PCR（FAM/VIC）
从图3中可以看出N1和N2在双重荧光定量RT-PCR得到了预期相应的扩增，证明了反应的特异性，不存在交叉扩增（N1为波浪线、N2为实线）。
N1基因扩增的灵敏度实验
图4为N1基因敏感性检测的扩增曲线，图5为标准曲线。模板为N1片段连接的T载体质粒，初始模板浓度为109copies/μL。将模板进行10倍的倍比稀释，从图4中看出，进行8倍稀释的模板仍能获得扩增。标准曲线的计算公式为Cq=35.9-2.96log10（q），E=2.177，R2=0.9964,Error=0.406。注：q=模板copies。因此，本次实验检测灵敏度可达到10-100copies。
N2基因扩增的灵敏度实验
图6为N2基因敏感性检测的扩增曲线，图7为标准曲线。反应模板为N2片段连接的PMD19-T载体的重组质粒，初始模板浓度为109copies/μL。将模板进行10倍的倍比稀释，从图6中看出，进行8倍稀释的模板仍能获得有效的扩增。标准曲线的计算公式为Cq=37.72-3.12log10（q），E=2.09，R2=0.9948,Error=0.519。注：q=模板copies。因此本次实验检测灵敏度可达到10-100copies。
综合分析：
以上实验结果证明了该多重鉴别检测方法的特异性和准确性。常规的病毒分离方法需要3-5天的时间，而荧光定量PCR只需数小时，而且其具有良好的特异性和敏感性。而本发明采用的一步法荧光定量RT-PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhancesolution预混成2Xone-stepbuffer，将多种酶配比进行混合，使实验操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染。因此本发明方法建立了针对N1和N2亚型的快速检测方法，操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1和N2鉴别检测荧光定量RT-PCR试剂盒，用于N1和N2亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。

Claims (1)

1.一种快速鉴别检测N1、N2亚型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀：
2Xone-stepRT-PCRBuffer12.5μL；
三种混合酶
RNaseinhibitor5U
M-MLV40U
TaqHS3U；
N1-fwd20μM0.5μL；
N1-rev20μM0.5μL；
N2-fwd20μM0.5μL；
N2-rev20μM0.5μL；
N1probe10μM0.5μL；
N2probe10μM0.5μL；
N1RNA模板10ng-1μg；
N2RNA模板10ng-1μg；
RNase-freeddH2O补至25μL；
启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中；RT-PCR反应条件：第一步20min42℃，第二步94℃1min，第三步95℃15s，60℃30s，进行45个循环，4℃保存；60℃采集荧光，检测扩增曲线；
所述N1-fwd的碱基序列如SEQINNO:1所示；
所述N1-rev的碱基序列如SEQINNO:2所示；
所述N2-fwd的碱基序列如SEQINNO:3所示；
所述N2-rev的碱基序列如SEQINNO:4所示；
所述N1probe的碱基序列如SEQINNO:5所示；
所述N2probe的碱基序列如SEQINNO:6所示；
所述N1probe5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2probe5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2；
N1RNA模板或N1RNA模板的制备方法如下：取含N1或N2亚型的病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA，取在1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体；加入0.2mL的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后离心12,000×g，15min，4°C；
离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相;RNA沉淀小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中，加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10min，离心12,000×g，15min，4°C;离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀；RNA洗涤去上清，向沉淀中加入1mL75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000×g，5min，4°C；RNA溶解去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μLDEPC水充分溶解RNA。
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