CN100385015C - 西尼罗病毒荧光定量rt-pcr检测试剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以西尼罗病毒E基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够直接对西尼罗病毒进行快速检测的试剂以及这种试剂的制备方法和在试剂盒中的应用。本发明系选择西尼罗病毒特异而各型病毒间比较保守的E基因片段为靶目标，经过精心设计、合成一大批引物和探针。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到最适合的引物和探针。本发明所述的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为71bp。本试剂可直接对西尼罗病毒核酸进行快速检测。

Description

西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种以西尼罗病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对西尼罗病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。

背景技术

西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)病是一种烈性人畜共患传染病。该病病原与日本脑炎病毒、摩莱河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒同属黄病毒(Flavivirus)属的日本脑炎病毒血清群，它们在血清学反应上有交叉。黄病毒科病毒所引起的疾病是能够导致严重的公共卫生问题。WNV可以通过蚊或蜱等吸血媒介传播，大多缺乏有效的治疗和预防措施，给疾病控制提出了严峻的挑战。西尼罗病毒在近20年之内全球范围人畜间的暴发流行，特别近年来西尼罗病毒感染在欧洲、中东、西亚和俄罗斯等地区和国家频频发生，造成了严重的经济损失。最令人瞩目的是1999年在美国纽约首次发生，尔后几乎扩散至全美各州，成为近年来影响美国最大的传染病，截止2003年10月22日全美已有7386人感染发病，有155人死亡(CDC)。

西尼罗病毒属于黄病毒科黄病毒属，具有黄病毒成员的典型特征，WNV是有包膜的RNA病毒，为不分节段的单股正链RNA，约10000～11000bp。基因组编码三个结构蛋白即核衣壳蛋白(C)、包膜蛋白(E)和膜蛋白(prM/M)，编码七个非结构蛋白。编码区含有一个开放读码框(ORF)，前1/3区段编码三种结构蛋白，后2/3编码非结构蛋白。西尼罗病毒在细胞内的复制繁殖过程中，病毒基因组首先翻译为一个多聚蛋白，从N端到C端依次为C-prM/M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5，然后经病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白酶切割成为成熟形式的病毒蛋白。核衣壳蛋白(C)，为一个碱性蛋白能够结合到病毒基因组并形成二十面体结构；prM是成熟病毒颗粒中M蛋白的前体形式，被蛋白酶切割成pr+M两段，pr部分被分泌至细胞外，M部分嵌合在病毒的脂质双分子层中。E蛋白(55kDa)以同源二聚体的形式并通过一定的结构阈锚定在病毒包膜中，是西尼罗病毒的主要抗原性结构蛋白，具有血凝素活性，能够诱导机体产生中和抗体；E蛋白参与病毒与宿主细胞亲和、吸附以及细胞融合过程，是病毒亲嗜性以及毒力的主要决定蛋白。一般情况根据E蛋白基因绘制的分子进化树。禽类的病毒分布则有多样性，包括心脏、脑、肠道都能分离到病毒。从禽类中分离病毒样本要容易得多。西尼罗病毒可在易感细胞中生长，如兔肾细胞(RK-13)、非洲绿猴肾细胞(Vero)以及鸡胚。近几次流行的WNV毒株E蛋白基因进行序列分析，可将WNV分成I系和II系。大多数WNV流行株属于I系，包括1999年和2000年美国株、1996年罗马尼亚株、1999年俄罗斯株。II系包括在非洲中部流行的大多数地方流行病毒株。

WNV血清学诊断方法较多，最重要的是美国疾控中心(CDC)建立的检测人、马和禽血清、脑脊液中西尼罗病毒抗体的IgM酶联免疫吸附试验(MAC-ELISA)。ELISA已取代了常规的血凝抑制试验、补体结合试验和中和试验。该法所用抗原有两种，一种是从病毒感染的乳鼠脑中用蔗糖丙酮提取精制的；另一种是C6P36细胞培养的上清液。但ELISA不是特异诊断方法，只能用于黄病毒抗体的筛检，不能进行确诊。在美国，为了鉴别诊断西尼罗病毒与圣路易斯脑炎病毒感染所诱发的抗体，一般采用特异的蚀斑减少中和试验(PRNT)来加以区分。虽然PRNT技术特异性较好，但由于中和试验操作较繁，费时费力，难以应用于大规模普查。

病毒核酸检测方法主要是RT-PCR，其敏感性和特异性都很高，但用于扩增马脑组织病料时，该方法的敏感性较差，常扩增不出特异性条带。其原因可能是病毒在马的脑组织中复制数量较低，其核酸含量未达到能被检出的水平。为此，美国农业部动植物检疫局于2001年建立了从马的脑脊髓组织中检测病毒核酸的巢式RT-PCR。常规方法提取病毒RNV，然后进行2次RT-PCR。PCR扩增的区域是西尼罗河病毒E蛋白基因区，将扩增产物电泳，见到248bp的DNA条带者判为阳性。用RT-PCR来监测组织、蚊虫血浆混合物中的WNV被证明是非常可靠。RT-巢式PCR能可靠的从马脑组织中检测到WNV的核苷酸，但是，非特异性污染常常使RT-巢式PCR获得假阳性结果。

因此，研究建立特异、敏感、可对低含量WNV病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种利用西尼罗病毒E基因序列设计合成的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。

本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。

本发明系选择西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。

本发明所述的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为71bp，引物和探针序列为：

引物：WNV-E-F：5’-CCACACGCCACGAAGCA-3’

WNV-E-R：5’-CCAGCCAAAGCTTGATGCA-3’

探针：(FAM)5’-CTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGG-3’(TAMRA)。

本发明所述的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成：

一、选择WNV E基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

CCACACGCCACGAAGCAGTCTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGGAGCTCTGCATCAAGCTTTGGCTGG；

二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；

五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；

六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。

本发明研制的TaqMan实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，克服了RT-PCR费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的WNV进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。本发明的优点和积极效果为：

1、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。西尼罗病毒荧光定量RT-PCR可对样品中低含量的WNV病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种WNV检测的良好方法。

2、本试剂可对细胞培养物、分泌物、血液、组织等多种样品中的WNV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。

3、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和RT-巢式PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。

4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为30.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是荧光定量RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。

5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测临床样品中WNV的敏感和可靠的方法。

具体实施方式

1、WNV E基因重组质粒的构建

按照黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，中国科学出版社，2003年1月，第1217页至第1259页，进行西尼罗病毒E基因克隆和测序，构建WNVE基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-E。

2、设计引物和探针

本发明选择WNV E基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的WNV各流行毒株病毒基因的DNA序列和上述1克隆和测序的西尼罗病毒WNV基因DNA序列进行同源性分析比较，选定WNV基因的保守片段(71bp)，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为71bp。

3、RNA提取

西尼罗病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID₅₀。取100μ L病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID₅₀的每个反应管。组织、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。荧光RT-PCR和常规RT-PCR试验用同批次提取的RNA。

4、WNV荧光定量RT-PCR

WNV荧光定量RT-PCR采用50μL体积反应液，在7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：42℃30min反转录；95℃预变性5min；95℃变性15sec，60℃1min，扩增40个循环。

引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的C_T值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立相当于1000、100、10、1TCID₅₀/每反应管的FMDV标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

5、常规RT-PCR

常规RT-PCR的上游引物和下游引物与荧光定量RT-PCR相同，扩增目标片段长度为71bp，按常规方法进行扩增。检测用3％琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条71bp特异性条带。

6、WNV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性

用NDV、IBDV、BVD、AKAV以及正常非洲绿猴肾细胞(Vero)以及鸡胚、野外采集鸡和马的组织样品和血清进行特异性比较检测。对WNV细胞培养物、动物组织样品进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测，比较它们的敏感性。

7、荧光定量RT-PCR稳定性和重复性试验

在评估WNV荧光定量RT-PCR检测WNV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行荧光定量RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

8、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算

上述1构建的重组质粒pBAD-E，转化大肠杆菌TOP10，LB培养基(含Amp100μg/mL)增殖，碱裂解法提取，经试剂盒纯化，质粒浓度用分光光度计测OD260定量。模板浓度的计算：在作绝对定量时，首先制备标准曲线。对标准品进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4～10^-7稀释，通过测OD知道质粒原液(标准品)的浓度后，可换算出每个PCR管中模板的数量。例如，已知pBAD/Thio TOPO载体长4436bp，插入的WNV E基因片段长1503bp，每个碱基的平均分子量是330，(每对碱基/bp是660，)质粒原液约132μg/mL，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6.02×10²³/mol。那么每2μL的绝对模板数量是：(132μg/mL×2μL×6.02×10²³/mol)/[(4436+1503)bp×660g/(mol×bp)]＝4×10¹⁹。据此，10^-4～10^-7质粒的模板分子数是4×10¹⁵～10¹²。做荧光定量RT-PCR检测，以拷贝数的对数为X轴，C_T值为Y轴作回归曲线，获得标准曲线。

9、引物和探针及其浓度的筛选

选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量RT-PCR反应的最低C_T值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品和WNV RNA，经系列稀释，制备DNA和RNA不同含量的检测样品。对设计的二对引物和各自的探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。

10、对样品的检测

用荧光定量RT-PCR对WNV细胞培养物、组织、NDV、IBDV、BVD、AKAV、正常非洲绿猴肾细胞(Vero)以及鸡胚、野外采集鸡和马的组织样品和血清进行检测。提取的RNA稀释后检测，阳性样品的C_T值均小于或等于28.0，阴性对照样品的C_T值均大于30.0，试验特异性强。C_T值30可作为是阳性和阴性的临界值。C_T值大于30可判为阴性，C_T值小于或等于28.0可判为阳性，在28.0-30之间为可疑，须重新试验。荧光定量RT-PCR检测WNV的特异性强，敏感性高，重复性很好。

11、WNV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序

11.1试剂盒组成(50μl反应×50次)：根据上述1～10试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份：

溶液I(TrizoL)	50ml
		溶液II(三氯甲烷)	10ml
溶液III(异丙醇)	25ml
		溶液IV(75％乙醇)	50ml
溶液V(2×一步法RT-PCR混合液，含引物和探针)	1.25ml
		溶液VI(RT酶，200U/μl)	25μl
溶液VII(Taq DNA聚合酶，5U/μl)	50μl
		溶液VIII(Rnase抑制剂，40U/μl)	50μl
溶液IX(DEPC-H<sub>2</sub>O)	20ml
		溶液X(WNV阳性RNA或cDNA)	50μl
溶液XI(WNV阴性RNA或cDNA)	50μl
		溶液XII(定量用标准品，10<sup>8</sup>个拷贝μl)	25μl

11.2操作方法

11.2.1总RNA提取

(1)取1ml-1.5ml组织样品研磨上清液或液体样品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清液。

(2)加入1ml溶液I，充分振荡混匀，置室温5min，彻底裂解。

(3)加200μl溶液II，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec，室温放置3min。

(4)12000rpm，4℃，离心15min。

(5)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混匀，室温放置10min。

(6)13000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。

(7)加1000μl溶液IV，充分振荡混匀，12000rpm，4℃，离心5min。小心充上清液。管底部可见有乳白色胶样RNA沉淀。

(8)小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA。

(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA。可直接用于反转录或-70℃保存备用。

11.2.2反应组份配制

(1)取一支200μl光学PCR反应管，反应总体积为50μl，向反应管中加入下列反应物：

(2)定量

按需要对标准品进行稀释后制作标准曲线，至少7个稀释度。

(3)设立对照

阳性对照和阴性对照各设2管。

11.2.3扩增

按下列参数设置反应条件：

11.2.4结果分析和判定

(1)结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

(2)质控标准

——阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。

——阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则，此次实验视为无效。

——定量用的标准品扩增曲线：出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.99以上。

(3)结果描述及判定

——阴性

Ct值应大于30.0或无扩增曲线，表示样品中无西尼罗病毒。

——阳性

Ct值小于等于28.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在西尼罗病毒。

——有效原则

Ct值在28.0～30.0的样本建议重做。重做结果Ct值大于30.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。

——定量：根据标准曲线作出定量。

Claims (3)

1.一种西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为71bp，所述引物和探针序列分别为：

引物：WNV-E-F：5’-CCACACGCCACGAAGCA-3’

WNV-E-R：5’-CCAGCCAAAGCTTGATGCA-3’

探针：FAM 5’-CTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGG-3’TAMRA。

2.权利要求1所述的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

(一)、选择西尼罗病毒特异而各型病毒间比较保守的E基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

CCACACGCCACGAAGCAGTCTGTGATAGCATTGGGCTCACAAGAGGGAGCTCTGCATCA

AGCTTTGGCTGG；

(二)、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计一系列引物和探针；

(三)、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

(四)、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA；

(五)、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；

(六)、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到权利要求1所述的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂中的特异性引物和特异性探针。

3.权利要求1所述的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR检测试剂在制备WNV荧光定量RT-PCR标准化试剂盒中的应用。