CN102140527A - 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（jxa1-r株）实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（jxa1-r株）实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测的核苷酸引物、探针序列及方法，以及该方法在检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)中的应用。本发明的方法克服了传统检测技术中存在的不足，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的快速检测及疫苗生产的质量监控。

Description

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR检测方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年我国暴发了由猪繁殖与呼吸综合征高致病性变异毒株(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)引起的以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenicPRRS，HP-PRRS)，给我国养猪业造成了极其严重的打击。HP-PRRS被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定传染病之一，是我国《一、二、三类动物疫病病种名录》中的一类动物疫病。目前防控本病的主要措施是疫苗免疫接种。而今高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)已在国内得到广泛应用，它以其良好的免疫保护效力和安全性对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的防控起到了重要作用。
传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)等，它们在病毒诊断与进出口检验检疫中发挥了重要作用，但各自在敏感性、特异性或时效性等方面存在不足，且难以将疫苗株(JXA1-R)与野毒株区分从而达到检测疫苗株(JXA1-R)的目的。目前，高致病性PRRSV变异株的实时荧光定量RT-PCR等检测方法虽然已经建立，但是仍然无法特异性针对疫苗株(JXA1-R)进行检测。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的检测方法意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)免疫效果及疫苗生产的质量监控提供强有力的技术支持。
本发明是通过以下技术方案实现的：
中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供活疫苗及如下病毒：高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(制备用毒株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，CGMCC No.2467)；高致病性猪繁殖与呼吸综合征2006-2010年不同时期野毒株；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，及各自活疫苗；其他猪源病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)。
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)特异性引物和探针设计：所述的特异性引物，指的是：长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；所述的特异性探针，指的是：长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5’端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groovebinder，MGB)分子，与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。
本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。
用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的寡核苷酸引物对特征如下：由序列为TCCACGCATCCTCGGG的上游引物LV-HP-PRRSV-F3和序列为TGCTCTCGTCAGACTCCCGT的下游引物LV-HP-PRRSV-R2组成；
用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的探针序列特征如下，该探针为LV-HP-PRRSV-P，其序列为CCTCGGCTCCCTCCA。
本发明还涉及一种用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的寡核苷酸引物对和探针的组合物。
此外，还可将上述组合物制备成试剂盒。
进一步，本发明还涉及试剂盒在检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)中的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。
一种利用上述寡核苷酸引物对和探针的组合物检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR方法，包括：
(1)针对PRRSV Nsp2基因设计能够检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的特异性引物和探针序列；
(2)采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一种荧光素标记高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的探针序列；
(3)将用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的引物和探针置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。
本发明的显著特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对样本进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的检测，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率等优点。
附图说明
图1高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR引物与探针优化组合筛选；
图2高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测特异性试验扩增曲线；
图3高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测敏感性试验扩增曲线。图中曲线依次代表高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)在浓度为TCID50 107.5～100.5时的扩增结果；
图4高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测重复性试验扩增曲线；
图5-1不同厂家高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)半成品实时荧光RT-PCR扩增曲线；
图5-2不同厂家高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)成品实时荧光RT-PCR扩增曲线。
具体实施方式
下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。
实施例1
标准品RNA的构建
(1)实验试剂
限制性酶Pst I及其缓冲液，DL2000 Marker购自TaKaRa公司；
Figure BSA00000398024700031
连接试剂盒、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs购自Promega公司；
DNA胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；
高效大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
(2)实验仪器
TGRANDIENT PCR仪：购自HYBAID公司；DYFIII2型电泳仪：购自Bio-Rad公司；
UVP凝胶成像分析系统：购自Gene公司；Steril
Figure BSA00000398024700041
生物安全柜：购自BAKER公司；恒温水浴锅：购自pHaramacia公司；恒温培养箱：购自Kendro公司。
(3)实验步骤
①在GenBank上查找高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(GenBank：FJ548853.1)及其他已知PRRSV基因组序列，通过序列比对确定高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的Nsp2基因的特异性高度保守区。设计包含高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR扩增核苷酸片段的引物，引物序列见表1。以高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的RNA为模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增体系和扩增条件见表2，将通过扩增得到的含高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的保守序列的核苷酸片段称为基因LV-HP-PRRSV-Nsp2；
②将扩增得到的基因LV-HP-PRRSV-Nsp2核苷酸片段纯化回收，连接到
Figure BSA00000398024700042
Easy载体(10μL连接体系：3μL基因扩增产物，1μLpGEM-T Easy载体，1μL T4 DNA连接酶，5μLT4 DNA连接缓冲液；4℃过夜)，然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞。通过质粒的纯化和鉴定，得到含有基因LV-HP-PRRSV-Nsp2片段的标准品质粒；
③用Pst I将LV-HP-PRRSV-Nsp2重组质粒酶切线形化，再以线性化片段为模板进行体外转录(用Promega RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒)，反应结束后向体外转录产物中加入RQ1 DNA酶除去残余的DNA分子。经提取和纯化，得到标准品RNA分子。
表1 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)标准品的扩增引物序列
Figure BSA00000398024700043
表2-1 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)标准品的RT-PCR扩增体系
Figure BSA00000398024700044
Figure BSA00000398024700051
附：*所用引物与表1中的引物相对应。
表2-2高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)标准品的RT-PCR扩增条件
Figure BSA00000398024700052
实施例2
样本RNA的提取
按照常规方法，利用QIAGEN
Figure BSA00000398024700053
Mini Kit试剂盒(购自QIAGEN公司)，或者根据GTC法(异硫氰酸胍法)(Total RNA Isolation System试剂盒购自Promega公司)提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的RNA。
实施例3
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR方法特异性引物和探针组合筛选试验
(1)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(2)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(3)实验过程
①高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的引物与探针设计
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的特异性引物，指的是：长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的特异性探针，指的是：长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5’端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团同时另增加了小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子；与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补。
根据获得的Nsp2基因特异性高度保守区域，利用Primer Express3.0软件设计针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的TaqMan MGB探针，在探针靶位置两侧设计多对引物以供筛选。引物对与探针的具体序列见表3。
表3高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR引物筛选与探针
Figure BSA00000398024700061
②高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR反应体系与扩增条件
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR反应体系与扩增条件参考TaKaRa One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒说明书，具体反应体系见表4-1，扩增条件见表4-2。
表4-1高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR反应体系
Figure BSA00000398024700062
Figure BSA00000398024700071
表4-2高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR扩增条件
Figure BSA00000398024700072
(4)结果判定
①结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
②结果描述及判定
对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则、敏感性原则和最高效扩增原则，选定特异性好、敏感性高、可靠性好的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)检测用引物对与探针最佳组合。
(5)筛选试验方法与结果
引物与探针的优化筛选方法如下：
任意选择一对引物与各条探针进行组合，做平行试验，以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。
通过多次重复、对比试验，选定高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)检测用引物对与探针的最佳组合，组合筛选结果如图1，具体序列见表5。
表5高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR方法的引物和探针序列
Figure BSA00000398024700073
实施例4
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法的建立
(1)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(2)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(3)实验过程
①高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR反应体系的优化
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR反应体系的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。
a、最佳荧光引物浓度的确定：荧光引物浓度在400nM到720nM之间进行筛选。
b、最佳探针浓度的确定：探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。
c、最佳镁离子浓度的确定：Mg2+浓度在3mM到8nM之间进行筛选。
d、反转录酶的用量确定：反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。
e、Taq DNA聚合酶的用量确定：Taq聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。
f、最佳dNTPs浓度确定：dNTPs浓度在100μM到500μM之间进行筛选。
②高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR扩增条件的优化
以55℃、58℃、60℃、62℃为退火温度进行荧光RT-PCR，选择最佳退火和延伸温度。
(4)结果判定
①结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
②结果描述及判定
对比不同条件下的扩增情况，遵循扩增曲线达到最小Ct值和最大扩增效率的优化原则，选定高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR的最优反应体系与扩增条件。
(5)反应条件优化试验结果
通过多次重复、对比试验，选定高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR的最优反应体系与扩增条件，分别见表6-1与表6-2，从而建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法。
表6-1高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)荧光RT-PCR检测的反应体系
Figure BSA00000398024700091
表6-2高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)荧光RT-PCR检测的扩增条件
Figure BSA00000398024700092
实施例5
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法特异性试验
(1)实验活疫苗与毒株
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)；高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株：2006年分离株JXA1，2007年分离株HUB2、GD、SHH、07BJ、07TJ，2008年分离株SQ、HN，2009年分离株KT2009004、HLJ、JL、E2，以及2010年分离株KT20100003、KT20100009、KT20100013、KT20100015、KT20100016、KT20100022、KT20100029；
美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株VR-2332、VR2386、VR2549株，欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒LV、DX、NM191株，以及美洲型PRRSV经典株活疫苗
Figure BSA00000398024700093
PRRSMLV、CH-1R和欧洲型PRRSV活疫苗AMERVAC AC-PRRS；
其他猪源病毒：马动脉炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)Aus株，猪瘟病毒(Classicalswine fever virus，CSFV)HEBGA08株、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)BJCP08株、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)XJ03株、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)NADL-2株、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)TJ08-1株。
以上活疫苗与病毒均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供。
(2)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(3)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(4)实验过程
①实验活疫苗及病毒的核酸提取
使用实施例2中的RNA提取方法提取以下活疫苗及病毒的RNA：
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)；高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株：2006年分离株JXA1，2007年分离株HUB2、GD、SHH、07BJ、07TJ，2008年分离株SQ、HN，2009年分离株KT2009004、HLJ、JL、E2，以及2010年分离株KT20100003、KT20100009、KT20100013、KT20100015、KT20100016、KT20100022、KT20100029；
美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株VR-2332、VR2386、VR2549株，欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒LV、DX、NM191株，以及美洲型PRRSV经典株活疫苗
Figure BSA00000398024700101
PRRSMLV、CH-1R和欧洲型PRRSV活疫苗AMERVAC AC-PRRS；
以及其他猪源病毒，包括EAV Aus毒株、CSFV HEBGA08毒株、JEV BJCP08毒株；另外，使用
Figure BSA00000398024700102
DNA Mini kit按照试剂盒说明书提取PPV NADL-2毒株、PCV2TJ08-1毒株、PRV XJ03毒株的DNA。
②高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法特异性试验
使用实施例4中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法，对上述活疫苗及病毒的核酸进行检测，以确定该方法的特异性。
(5)结果判定
①结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
②质控标准
阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；
阳性对照的Ct值应≤38，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
③结果描述及判定
阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)。
阳性样本Ct值≤38，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)。
有效原则：样本Ct值在38-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值≤38时样品为阳性，否则为阴性。
(6)样本检测结果
只有高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)得到特异性的荧光扩增曲线(图2)。
实施例6
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法敏感性试验
(1)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(2)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(3)实验过程
①高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)RNA样品制备
使用实施例2中的RNA提取方法提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(107.5TCID50/mL)的RNA，并对所得RNA进行10倍连续稀释，得到9个稀释度的待检样品。
②高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法敏感性试验
使用实施例4中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法，对上述RNA样品进行检测，以判定该方法的敏感性。
(4)结果判定
①结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
②质控标准
空白对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；
阳性对照的Ct值应≤38，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
(5)梯度稀释样本检测结果
由试验结果可见，高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的敏感性达到100.5(3.2)TCID50/mL(图3)。
实施例7
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法重复性试验
(1)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(2)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(3)实验过程
使用实施例4中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法，对5个10倍连续稀释的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(105.5TCID50/mL～101.5TCID50/mL)的RNA在同一反应条件下进行5次独立检测，以确定此方法的批内重复性；连续5天对同样的稀释样品进行检测，以确定此方法的批间重复性。
(4)实验结果
分析每个反应的Ct值，可见该方法针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的批内变异系数及批间变异系数分别为0.22％-0.68％和0.64％-1.47％。批内及批间重复试验结果见表7，批内重复试验如图4。
表7 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法重复性试验
Figure BSA00000398024700121
实施例8
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法与病毒分离方法的对比试验
(1)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(2)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(3)实验过程
收集已采用Marc-145细胞从中分离出高致病性猪繁殖与呼吸综合征JXA1-R疫苗株的128份特定临床样品，使用实施例2中的RNA提取方法提取RNA，利用实施例4中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法进行检测，比较二者的符合率。
(4)实验结果
分析检测结果可见，在128份高致病性猪繁殖与呼吸综合征JXA1-R疫苗株阳性临床样品中，实时荧光RT-PCR方法可检出126份JXA1-R疫苗株阳性，与病毒分离方法符合率为98.4％。
实施例9
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法应用
(1)实验活疫苗及其样品
高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗株：JXA1-R基础种毒；中牧实业股份有限公司成都药械厂、吉林省元亨生物技术有限公司、广东大华农动物保健品股份有限公司和扬州威克生物工程有限公司生产的JXA1-R活疫苗半成品及成品，批准文号分别为农医药便函【2009】208号、农医药便函【2009】209号、农医药便函【2009】210号与农医药便函【2009】211号；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)免疫后28天攻毒效检试验临床试验猪在攻毒前和攻毒后7天、14天、21天的血清，以及攻毒后21天的猪肺脏和扁桃体；
以上均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供。
(2)实验试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司；
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。
(3)实验仪器
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System
(4)实验过程
①高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)基础种毒、半成品及成品的检测
取高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)基础种毒，以及中牧实业股份有限公司成都药械厂、吉林省元亨生物技术有限公司、广东大华农动物保健品股份有限公司和扬州威克生物工程有限公司生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)半成品及成品，其中活疫苗成品按照说明书将其稀释成1mL/头份，使用实施例2中的RNA提取方法提取RNA，利用实施例4中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法进行检测。
②高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)效检试验临床试验猪的检测
用企业生产的连续三个批号的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)，批号分别为1001002-1、1001002-2、1001003，每批疫苗免疫5头临床健康的猪，另取5头PRRSV抗原、抗体均为阴性的猪，不接种疫苗，作为对照。在疫苗接种后28天对以上四组共20头试验猪用JXA1强毒攻毒，攻毒前和攻毒后7天、14天、21天采血，并于21天宰杀，取猪肺脏和扁桃体。使用实施例2中的RNA提取方法对血清和组织样品提取RNA，利用实施例4中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)实时荧光RT-PCR检测方法进行检测。
(5)结果判定
①结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
②质控标准
阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；
阳性对照的Ct值应≤38，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
③结果描述及判定
阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)。
阳性样本Ct值≤38，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)。
有效原则：样本Ct值在38-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值≤38时样品为阳性，否则为阴性。
(6)样本检测结果
分析四个企业生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)半成品及成品实时荧光RT-PCR扩增曲线(见图5-1，图5-2)，可见检测结果均为阳性，且五条荧光扩增曲线(包括基础种毒)Ct值变异系数分别为1.84％、1.58％，表明各个厂家所生产的疫苗所含病毒量接近且符合要求(表9-1，表9-2)。
分析企业生产的1001002-1、1001002-2、1001003三批高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)效检试验猪实时荧光RT-PCR检测结果可见，在疫苗免疫28天攻毒前，血液中仅含有疫苗株且含量已经很低，部分猪已转阴，这符合临床上JXA1-R活疫苗病毒血症持续时间为19天～39天的情况。攻毒后7天血液中检测不到疫苗株，第21天组织中疫苗株检测为阴性，见表10。
表9-1不同厂家高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)半成品实时荧光RT-PCR检测结果
Figure BSA00000398024700151
表9-2不同厂家高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)成品实时荧光RT-PCR检测
Figure BSA00000398024700152
表10高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)疫苗效检试验临床试验猪血清和组织样品实时荧光RT-PCR检测(一)
Figure BSA00000398024700153
表10高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)疫苗效检试验临床试验猪血清和组织样品实时荧光RT-PCR检测(二)
Figure BSA00000398024700162
注：“/”表示试验猪死亡。

Claims (7)

1.一种能够检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的实时荧光RT-PCR方法，其特征包括：
(1)针对PRRSV Nsp2基因设计能够检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的特异性引物和探针序列；
(2)采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一种荧光素标记高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的探针序列；
(3)将用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的引物和探针置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。
2.根据权利要求1所述的用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的实时荧光RT-PCR方法，其特征在于所述的特异性引物为：由序列为TCCACGCATCCTCGGG的上游引物LV-HP-PRRSV-F3和序列为TGCTCTCGTCAGACTCCCGT的下游引物LV-HP-PRRSV-R2组成的引物对。
3.根据权利要求1所述的用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的实时荧光RT-PCR方法，其特征在于所述的探针序列为：CCTCGGCTCCCTCCA。
4.一种用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株的寡核苷酸引物对和探针的组合物。
5.一种包括权利要求4所述组合物的试剂盒。
6.权利要求5的试剂盒在检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株中的用途。
7.权利要求6的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。
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