CN109266787A

CN109266787A - 一种检测5型牛腺病毒的核酸组合、试剂盒及应用与检测方法

Info

Publication number: CN109266787A
Application number: CN201811452016.0A
Authority: CN
Inventors: 安微; 陈世界; 李丹丹; 林华; 车颖欣; 张婧; 杨苗
Original assignee: INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: CN109266787B

Abstract

本发明提供了一种检测5型牛腺病毒的核酸组合、试剂盒及应用与检测方法，属于生物技术及分子生物技术领域。本发明提供的检测5型牛腺病毒的核酸组合，针对5型腺病毒设计，针对性强，特异性强，灵敏度高；将上述核酸组合用于检测的试剂盒中，能方便检测，提高检测的稳定性；通过利用该核酸组合进行检测，提高检测结果的可信度，具有较好的实际应用价值。

Description

一种检测5型牛腺病毒的核酸组合、试剂盒及应用与检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种检测5型牛腺病毒的核酸组合、试剂盒及应用与检测方法。

背景技术

牛腺病毒(Bovine adenovirus，BAV)，为腺病毒科哺乳动物腺病毒属的成员。目前已报道牛腺病毒总共有10个血清型，BAV-1、-2、 -3、-9、-10型牛腺病毒属于哺乳动物腺病毒属，而BAV-4、-5、-6、-7和-8型属于腺胸腺病毒属。牛腺病毒5型的基因组是双链的DNA 分子，感染牛的临床症状主要包括结膜炎、肺炎、腹泻和多发性关节炎，被感染犊牛出现发热和食欲不振等症状及肺脏实变的肉眼病变。近年来，我国许多地区牛群中爆发了牛呼吸道传染病，死亡率达 10％-50％，造成严重的经济损失。对该疫情进行流行病学调查和分析，表明牛腺病毒在其中起了很重要的作用。牛腺病毒的快速检测是控制和消灭该病的前提，但腺病毒的常规检测方法一般分为免疫学方法、生物学试验、分子生物学诊断技术等方法，但是都存在难以早期诊断、敏感度第等缺点。

发明内容

一方面，本申请实施例提供了一种检测5型牛腺病毒的核酸组合，该核酸组合能较为灵敏的识别5型牛腺病毒，特异性较强；还提供一种检测5型牛腺病毒的试剂盒，方便检测；将试剂盒应用于检测，能提高检测效率，检测精度和准确性和稳定性都能得到提高。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种检测5型牛腺病毒的核酸组合，核酸组合包括检测引物对和检测探针；检测引物对的碱基序列如SEQ ID No.1-2所示；检测探针的碱基序列如SEQ ID No.3所示；检测探针5’端包括荧光报告基团，检测探针3’端包括荧光淬灭基团。

一种检测5型牛腺病毒的试剂盒，试剂盒包括上述的检测5型牛腺病毒的核酸组合。

上述的检测5型牛腺病毒的试剂盒在检测5型牛腺病毒中的应用。

一种5型牛腺病毒的检测方法，包括以下步骤：

构建5型牛腺病毒的阳性模板，并梯度稀释后利用上述的检测5 型牛腺病毒的核酸组合分别进行扩增，建立标准曲线；

提取待检样本的基因组，利用上述的检测5型牛腺病毒的核酸组合进行扩增，根据扩增结果结合标准曲线，结算得到待检样品Ct值，根据Ct值判断检测结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供的检测5 型牛腺病毒的核酸组合，针对5型腺病毒设计，针对性强，特异性强，灵敏度高；将上述核酸组合用于检测的试剂盒中，能方便检测，提高检测的稳定性；通过利用该核酸组合进行检测，提高检测结果的可信度，具有较好的实际应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例提供阳性模板验证结果图；

图2为本发明实验例提供的标准曲线示意图；

图3为本发明实验例提供的特异性实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种检测5型牛腺病毒的核酸组合、试剂盒及应用与检测方法进行具体说明。

本发明一方面一种检测5型牛腺病毒的核酸组合，核酸组合包括检测引物对和检测探针；检测引物对的碱基序列如SEQ ID No.1-2所示；检测探针的碱基序列如SEQ IDNo.3所示；检测探针5’端包括荧光报告基团，检测探针3’端包括荧光淬灭基团。

通过针对5型牛腺病毒设计的检测引物和探针，通过引物的扩增以及探针的识别，并且通过探针的荧光基团的配合，提高检测精度和准确性。

检测引物的上游引物如SEQ ID No.1所示：

BAV-5-F：5’-CATCACTGCCACACAAAGCTTT-3’；

检测引物的下游引物如SEQ ID No.2所示：

BAV-5-R：5’-TGTATCGGCACAATACGAAGTTGTA-3’；

探针的碱基序列如SEQ ID No.3所示：

BAV-5-P：5’-TCCAACATCTGGAGTAACTACCGACCGCT-3’。

目的片段的长度为123bp。

在本发明的一些可选的实施例中，核酸组合还包括阳性模板，阳性模板的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

阳性模板的碱基序列如SEQ ID No.4所示：

ccccagcgggagttttttcacattgcgggtagaaatgcgagggaatatctgtctgaaaatctggtgcagtt catcactgccacacaaagcttttttaatcttggagagaaatttagagatccttttgtagctccaacatctggagtaactaccgaccgctctcaaaaactacaacttcgtattgtgccgatacaagtagaagataatgaaaactt ttataaagctaggtttatactaaatgttggagataatcgaatagctgacctaggaagtgctttttttgacatagaaggatttgtt

本发明实施例中，选用牛腺病毒5型Hexon基因保守序列的 300bp片段作为阳性模板序列，具有较好的特异性。通过设计阳性模板，能方便进行定量检测，并且方便进行对比实验，避免污染。

在本发明的一些可选的实施例中，荧光报告基团为MGB、VIC、 TET、JOE、HEX、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED、 FAM、CY3、CY5、TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

通过在探针的5’端设置荧光基团，通过荧光基团的发光等，可以方便的检测。

在本发明的一些可选的实施例中，荧光淬灭基团为MGB、VIC、 TET、JOE、HEX、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED、 FAM、CY3、CY5、TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种；荧光报告基团不同于荧光淬灭基团。

同理，通过在探针的3’端设置淬灭基团，方便在扩增的时候，进行检测；同时在5’端和3’端分别设置不同的基团，避免相互的干扰，提高识别度，提高检测的精度。

本发明一方面体用一种检测5型牛腺病毒的试剂盒，试剂盒包括上述的检测5型牛腺病毒的核酸组合。

由于检测的核酸组合针对性较强，试剂盒也具有较高的特异性；通过试剂盒，方便检测。

在本发明的一些可选的实施例中，试剂盒还包括基因组提取试剂、 PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs或Mg²⁺中的至少一种。

试剂盒中提供基因组提取试剂，方便进行检测的时候，直接提取基因组，省去准备相关试剂的麻烦，提高检测效率。

通过基因组提取试剂提取基因组后，通过PCR缓冲液、Taq DNA 聚合酶、dNTPs和Mg²⁺可以进行PCR扩增反应，方便快捷；适于批量的进行试验。

Mg²⁺可以是MgSO₄或MgCl₂。

在本发明的一些可选的实施例中，基因组提取试剂包括蛋白酶K。

基因组提取试剂加入蛋白酶K，通过蛋白酶K的消化，可以消除一些蛋白的影响，提高提取的基因组的纯度。

本发明一方面提供一种5型牛腺病毒的检测方法，包括以下步骤：

提取待检样本的基因组，利用上述的检测5型牛腺病毒的核酸组合进行扩增，根据扩增结果结合标准曲线，计算得到待检样品Ct值，根据Ct值判断检测结果。

通过阳性模板建立标准曲线，然后将待检样品进行检测，根据待检样品的扩增结果，并结合标准曲线换算待检样品Ct值，根据待检样品Ct值就能判断待检样品是否是阳性。

在本发明的一些可选的实施例中，扩增的程序为94.3-96.1℃预变性3min，94.3-96.1℃变性15s，59.5-61.3退火延伸30s，40个循环。

通过两步法快速检测，方便实验，节约反应时间。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种检测5型牛腺病毒的核酸组合，核酸组合包括检测引物对和检测探针；检测引物对的碱基序列如SEQ ID No.1-2所示；检测探针的碱基序列如SEQ IDNo.3所示；检测探针5’端包括荧光报告基团，检测探针3’端包括荧光淬灭基团。

检测引物的上游引物如SEQ ID No.1所示：

BAV-5-F：5’-CATCACTGCCACACAAAGCTTT-3’；

检测引物的下游引物如SEQ ID No.2所示：

BAV-5-R：5’-TGTATCGGCACAATACGAAGTTGTA-3’；

目的片段的长度为123bp。

本实施例中探针的5’端的荧光报告基团为MGB、VIC、TET、 JOE、HEX、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED、FAM、 CY3、CY5、TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种，本实施例中5’端的荧光报告基团选择FAM；探针3’端的荧光淬灭基团为 MGB、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、 NED、FAM、CY3、CY5、TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种，本实施例中3’端的荧光淬灭基团选择BHQ1，当然5’端的荧光报告基团和3’端的荧光淬灭基团还有多种选择，满足探针5’端的荧光报告基团和3’端的荧光淬灭基团不相同即可。因此探针如下所示：

BAV-5-P：5’ -FAM-TCCAACATCTGGAGTAACTACCGACCGCT-BHQ1-3’。

实施例2

本实施例提供一种检测5型牛腺病毒的试剂盒，试剂盒包括实施例1提供的检测5型牛腺病毒的核酸组合，核酸组合包括检测引物对和检测探针；检测引物对的碱基序列如SEQ ID No.1-2所示；检测探针的碱基序列如SEQ ID No.3所示；检测探针5’端包括荧光报告基团，检测探针3’端包括荧光淬灭基团。

检测引物的上游引物如SEQ ID No.1所示：

BAV-5-F：5’-CATCACTGCCACACAAAGCTTT-3’；

检测引物的下游引物如SEQ ID No.2所示：

BAV-5-R：5’-TGTATCGGCACAATACGAAGTTGTA-3’；

目的片段的长度为123bp。

BAV-5-P：5’ -FAM-TCCAACATCTGGAGTAACTACCGACCGCT-BHQ1-3’。

本实施例提供的试剂盒还包括5型牛腺病毒的阳性模板，阳性模板的碱基序列如SEQ ID No.4所示：

ccccagcgggagttttttcacattgcgggtagaaatgcgagggaatatctgtctgaaaatctggtgcagtt catcactgccacacaaagcttttttaatcttggagagaaatttagagatccttttgtagctccaacatctggagtaactaccgaccgctctcaaaaactacaacttcgtattgtgccgatacaagtagaagataatgaaaactt ttataaagctaggtttatactaaatgttggagataatcgaatagctgacctaggaagtgctttttttgacatagaaggatttgtt。

本实施例提供的试剂盒还包括还包括基因组提取试剂、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs或Mg²⁺中的至少一种。

基因组提取试剂包括蛋白酶K。

因此可以将本实施例提供的试剂盒应用于检测5型牛腺病毒。

实验例

本实验例以实施例2的检测5型牛腺病毒的试剂盒对样品进行检测分析并提供检测分析5型牛腺病毒的方法。

阳性模板的构建

根据SEQ ID No.4的序列，进行人工合成；并将合成的SEQ ID No.4的序列连接到pUC57载体上，转化DH5α感受态细胞进行克隆，并提取质粒和测序验证，得到阳性模板。

利用检测引物进行PCR检测，PCR扩增的反应体系为PCR反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液4μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、 MgCl₂(2.5mmol/L)3μL、rTaq酶(5Μ/μL)0.2μL、上下游引物 (10pmol/μL)各0.5μL、探针(10pmol/μL)0.5μL、模板DNA1μL 进行扩增，PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃15s；60℃30s；后两步进行40个循环，在60℃进行荧光信号检测，荧光通道选择FAM；反应结束后PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，泳道1中的片段的大小与实际符合。

标准曲线的建立

根据构建的阳性模板的重组质粒，转化DH5α感受态细胞，经质粒提取试剂盒提取重组质粒，测得抽提的重组质粒浓度为105ng/μL， OD260/280为1.886，表明该重组质粒的纯度较高；根据公式计算出的重组质粒的拷贝数为3.2×10¹⁰拷贝/μL。对获得阳性模板进行10 倍的梯度稀释，一共进行7个梯度稀释(10⁷-10¹)，以不同浓度的重组质粒作为模板进行荧光定量PCR，记录各梯度标准品的Ct值，建立质粒拷贝数与其对应关系的定量标准曲线。

利用优化好的荧光定量PCR反应体系对7个稀释度(3.2× 10⁷～3.2×10¹)的定量标准品进行检测，标准曲线在3.2×10²-3.2×10⁷拷贝数之间有较好的线性关系，相关系数为0.9752，得到标准品拷贝数与Ct值的线性方程为：

Ct＝-3.1732x+35.562，R²＝0.9752；

标准曲线如图2所示。

根据荧光定量PCR反应收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到扩增曲线、Ct值。

结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≦35时，同时扩增曲线为平滑的S型，则可以判定待测样品中含有牛腺病毒5型。

根据荧光定量标准曲线，可以对样品中牛腺病毒5型进行定量测定。

特异性实验

参考天根生化科技有限公司病毒基因组DNA提取试剂盒进行病毒基因组DNA的提取。

基因组DNA提取步骤如下：

1.1取1.5mL离心管加入20μL的蛋白酶K；

1.2加入200μL的样本，并加入200μLBuffer GL，涡旋震荡15s；

1.3在56℃条件下孵育15min，短暂离心，将管壁液体收集与管底；加入250μL的无水乙醇，涡旋15s，室温放置5min，短暂离心；

1.4将1.3中的溶液加入到装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；

1.5向吸附柱中加入500μL的Buffer GW1,12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；

1.6向吸附柱中加入500μL的Buffer GW2,12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；

1.7向吸附柱中加入500μL的无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管；12000rpm离心3min，倒掉废液，将吸附柱室温放置晾干；

1.8将晾干的吸附柱放入新的收集管，加入80μL的灭菌水，室温放置2-5min，12000rpm离心3min，得到病毒基因组DNA。

根据上述方法，提取牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒的基因组DNA并进行PCR反应，以去离子水作为无模板空白对照检验本方法的特异性。

结果显示：以提取的牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒等相应DNA样本以及pUC57-BAV5重组质粒样本进行特异性试验，并设立阴性对照，按照优化后的荧光定量PCR体系和条件进行扩增，结果显示，仅pUC57-BAV5重组质粒样本为阳性，其他病毒以及阴性对照样本未出现任何明显的扩增曲线，检测结果均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。

敏感性实验

用ddH₂O将标准品10倍系列稀释成10个梯度(3.2×10⁸～3.2× 10^-1拷贝/μL)分别作为模板，以前述PCR反应体系及反应程序进行 PCR扩增检测，确定建立的荧光定量PCR检测方法的最小检出量，用来评价方法的敏感性。

结果如图3所示，发现通过本方法，在3.2×10¹拷贝/μL的情况下依然能检测到，可以看出本发明提供的检测引物及探针具有较高的敏感性。

综上所述，本发明实施例提供的检测5型牛腺病毒的核酸组合特异性强，灵敏度较高，能够准确快速的对5型牛腺病毒进行检测并进行定量分析；提高检测的准确性和可靠性。将该核酸组合应用于试剂盒中，方便进行检测。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种检测5型牛腺病毒的核酸组合、试剂盒及应用与检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Bovine adenovirus

<400> 1

catcactgcc acacaaagct tt 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Bovine adenovirus

<400> 2

tgtatcggca caatacgaag ttgta 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Bovine adenovirus

<400> 3

tccaacatct ggagtaacta ccgaccgct 29

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> Bovine adenovirus

<400> 4

ccccagcggg agttttttca cattgcgggt agaaatgcga gggaatatct gtctgaaaat 60

ctggtgcagt tcatcactgc cacacaaagc ttttttaatc ttggagagaa atttagagat 120

ccttttgtag ctccaacatc tggagtaact accgaccgct ctcaaaaact acaacttcgt 180

attgtgccga tacaagtaga agataatgaa aacttttata aagctaggtt tatactaaat 240

gttggagata atcgaatagc tgacctagga agtgcttttt ttgacataga aggatttgtt 300

Claims

1.一种检测5型牛腺病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括检测引物对和检测探针；所述检测引物对的碱基序列如SEQ ID No.1-2所示；所述检测探针的碱基序列如SEQ ID No.3所示；所述检测探针5’端包括荧光报告基团，所述检测探针3’端包括荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的检测5型牛腺病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括阳性模板，所述阳性模板的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求2所述的检测5型牛腺病毒的核酸组合，其特征在于，所述荧光报告基团为MGB、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED、FAM、CY3、CY5、TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

4.根据权利要求3所述的检测5型牛腺病毒的核酸组合，其特征在于，所述荧光淬灭基团为MGB、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED、FAM、CY3、CY5、TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种；所述荧光报告基团不同于所述荧光淬灭基团。

5.一种检测5型牛腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的检测5型牛腺病毒的核酸组合。

6.根据权利要求5所述的检测5型牛腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因组提取试剂、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs或Mg²⁺中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的检测5型牛腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述基因组提取试剂包括蛋白酶K。

8.如权利要求5-7任一项所述的检测5型牛腺病毒的试剂盒在检测5型牛腺病毒中的应用。

9.一种5型牛腺病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建5型牛腺病毒的阳性模板，并梯度稀释后利用如权利要求1-4任一项所述的检测5型牛腺病毒的核酸组合分别进行扩增，建立标准曲线；

提取待检样本的基因组，利用如权利要求1-4任一项所述的检测5型牛腺病毒的核酸组合进行扩增，根据扩增结果结合所述标准曲线，计算得到待检样品Ct值，根据所述Ct值判断检测结果。

10.根据权利要求9所述的5型牛腺病毒的检测方法，其特征在于，所述扩增的程序为94.3-96.1℃预变性3min，94.3-96.1℃变性15s，59.5-61.3退火延伸30s，40个循环。