CN104846089A

CN104846089A - 一种孕妇外周血中胎儿游离dna比例的定量方法

Info

Publication number: CN104846089A
Application number: CN201510225771.5A
Authority: CN
Inventors: 陈洪亮; 郑海灵; 祝兴强; 段利朋
Original assignee: XIAMEN VANGENES BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Xiamen Vangenes Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2035-05-06
Also published as: CN104846089B

Abstract

本发明公开一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法。本发明利用设计的引物将血浆中包含设计SNP的DNA提取出来，经过一系列处理后上机，将测序产物比对到人类基因组序列后确定每个SNP位点的碱基。通过分析SNP中各碱基的比例来定量胎儿游离DNA浓度。本发明还可通过多个SNP来校正引入的误差，用统计学的方法对多个SNP同时计算，提高计算出的胎儿游离DNA浓度准确性。

Description

一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法

技术领域

本发明涉及DNA定量领域，尤其涉及一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法。

背景技术

无创产前基因检测是通过采集孕妇外周血(5ml)，提取其中的游离DNA，采用高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍体（21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体）的风险。研究发现，从孕4周开始，在孕妇外周血中即可检测到胎儿的游离DNA。随着孕周增大，胎儿游离DNA含量也随之增加。孕12周后，通过抽取孕妇外周血并从中提取出胎儿游离DNA，利用新一代基因测序技术并结合生物信息学分析手段，便可准确判断胎儿是否患有染色体病。该方法最佳检测时间为孕早、中期，具有无创取样、无流产风险、高灵敏度，准确性高的特点。

无创产前基因检测技术通过分析孕妇外周血中DNA来判断胎儿是否存在染色体非整倍体，而不是针对性的分析胎儿的DNA，因此当胎儿DNA比例过低时（<3%）,可能因为胎儿DNA量太少而不能被检测出来染色体是否有异常，所以胎儿DNA的含量对检测结果的准确性和敏感性都起到了重要的作用。

在一份检测结果中，如果知道胎儿DNA的比例将是对一份结果准确性的最好的复核。通过准确的定量胎儿DNA的比例，设定该DNA比例下三体所对应的阈值，对检测结果的准确性起到复核作用，同时能够避免孕周大但胎儿游离DNA浓度低造成的假阴性。虽然现在行业内都通过接收孕12周以后的孕妇来减少这种情况的发生，但孕妇个体之间的差异还是可能存在胎儿DNA比例较低（2%的孕妇会因为胎儿DNA含量低而被要求重新抽血）。现有技术通过对男胎中含有的Y染色体信息来判断男胎的浓度，对女胎还没有有效的方法。

现有技术中，甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法被很多研究证实可以用来定量胎儿游离DNA浓度。采用该方法抽取外周血后，经 DNA 分离、甲基化敏感限制性内切酶消除样本中母源性( 非甲基化) DNA ，未分解的胎儿 DNA 在PCR扩增，最后定量胎儿DNA量。通过计算胎儿DNA量占外周血DNA量的比例来计算胎儿游离DNA浓度。

但该方法还存在以下两个缺点：

1、被确定的稳定的甲基化标志基因较少，它需要具备两个条件：1）孕妇和胎儿甲基化的差异要大，孕妇要完全不甲基化，胎儿要完全甲基化。2）甲基化差异必须保持稳定, 不会因为个人之间在数量或在怀孕期不同时期存在差异。

2、甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法是通过一个基因，因为量少的原因需要经过PCR来扩增，其中引入的误差不好被校正。

另外，还有一种方法是荧光定量PCR或者绝对定量PCR法，其也被用来定量胎儿游离DNA浓度，但其有个共同的缺点就是可用的目标基因数据少，且能获得DNA量也少，很容易有偏差。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定量孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的方法，旨在解决现有的孕妇外周血DNA定量方法准确性低、容易有偏差的问题。

本发明的技术方案如下：

一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，包括步骤：

A、设计位点：在人类基因组中，找出突变频率在0.4-0.6的SNP位点；

B、设计引物：根据设计的SNP位点，设计出覆盖SNP位点的SNP引物；

C、提取样品DNA；

D、扩增含有SNP位点的DNA片段：将样品DNA、多重PCR反应酶和SNP 引物混匀后，进行PCR反应得到PCR产物；

E、纯化扩增到的PCR产物；

F、末端修复：将PCR产物、末端修复酶与末端修复酶缓冲液混合，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；

G、片段筛选：对步骤F所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到平末端DNA片段；

H、接头连接：将所得的平末端DNA片段与连接酶、连接酶缓冲液、及指定接头混合后，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；

I、片段筛选：对步骤H所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到加接头的DNA片段；

J、PCR扩增：对所得加接头的DNA片段进行PCR 扩增及纯化，得到小片段文库；

K、文库检测：对小片段文库检测浓度和片段大小；

L、高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序；

M、数据预处理：将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤，筛选出长度大于100bp的序列；

N、序列比对：将预处理后的序列与人类基因组序列进行比对；

O、序列筛选：根据比对的结果，筛选出unique read的序列；

P、SNP数据统计：根据比对结果及SNP位点的位置统计出SNP位点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目；

Q、根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数进行排序，然后计算出SNP位点的覆盖深度Depth，并根据排序结果求出SNP位点的测序错误率Error；根据每行的覆盖深度Depth和测序错误率Error，求出SNP位点的平均覆盖度和测序错误率的较大值ErrorUp；根据平均覆盖度或者用户自定的覆盖深度，对SNP位点进行过滤；或根据每个SNP位点的测序错误率Error是否大于ErrorUp来过滤；

R、计算每个SNP距离：对每一个SNP位点，计算出可能的胎儿游离DNA浓度Conc在四种SNP组合类型下所有SNP位点到相应胎儿游离DNA浓度的距离TypeDistance；

U、计算出总距离：找出每一SNP位点在四种SNP组合类型下对应最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei），i=1…N，N为SNP位点总个数；

V、选择最优的总距离：在Conc范围内计算出的AllDistance中选出其中最小的，其所对应的Conc即为实际的胎儿游离DNA浓度。

所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤O中，筛选出错配碱基在4个以下，且只比对到一处的序列，作为unique read。

所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤Q中，ErrorUp= (ErrorMean+ErrorSD*2), Errormean（Errori）i=1…N，N为SNP位点个数。

所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤U中，四种SNP组合类型为：类型1：母亲和胎儿都是纯合SNP；类型2：母亲纯合SNP，胎儿杂合SNP；类型3：母亲杂合SNP，胎儿纯合SNP；类型4：母亲和胎儿都是杂合SNP。

所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤A中，在1-13、18及21这15条染色体上共选出1035个SNP位点。

所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，Conc的范围为0.025-0.5。

所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤R具体包括：

按以下公式计算SNP距离Distance，Distance=abs(Major * A + Minor * B) / (A**2 + B**2)**0.5,其中A，B是参数，具体如下：

Type=1,A=Err/3,B=-(1-Err);

Type=2,A=Conc/2*(1-Err)+(1-Conc/2)*Err/3,B= -((1-Conc/2)*(1-Err)+Conc/2*Err/3)；

Type=3,A=(1/2-Conc/2)*(1-Err)+(1/2+Conc/2)*Err/3,B= -((1/2+Conc/2)*(1-Err)+(1/2-Conc/2)*Err/3)；

Type=4,A=1,B=-1，每个SNP位点在四种SNP类型下对应有四个距离值，记作TypeDistance=Distance*C，C是一个参数，其在四种SNP类型下分别是：2，1,1,2；根据计算得到的四种类型对应的距离判断该SNP位点所对应的类型；其中Typej（j=1,2,3,4）表示四种类型的SNP组合，Major、Minor分别为SNP位点中四种碱基出现次数排第一及第二的值，Err=mean（Errori）i=1…1035且Errori小于ErrorUp。

有益效果：本发明利用设计的引物将血浆中包含设计SNP位点的DNA提取出来，经过一系列处理后上机，将测序产物比对到人类基因组序列后确定每个SNP位点的碱基。通过分析SNP中各碱基的比例来定量胎儿游离DNA浓度。本发明还可通过多个SNP来校正引入的误差，用统计学的方法对多个SNP同时计算，提高计算出的胎儿游离DNA浓度准确性。

附图说明

图1为本发明一种定量孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的方法较佳实施例的流程图。

具体实施方式

本发明提供一种定量孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，图1为本发明所提供的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法较佳实施例的流程图，如图1所示，其包括步骤：

一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，包括步骤：

S1、设计位点：在人类基因组中，找出突变频率在0.4-0.6的SNP位点；

在人类基因组中，找出突变频率（MAF）在0.4-0.6的SNP位点，在1-13,18,21这15条染色体上共选出1035个SNP位点，每条染色体上SNP位点数目相近。设计过程中位点数目可变，染色体的分布可变。SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）指单个碱基上的变异。

本发明的SNP位点数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP位点，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。本发明选择1035个SNP位点，这样避免了某一条染色体异常对定量胎儿游离DNA浓度的影响。过多个SNP位点来校正引入的误差。后续可用统计学的方法对多个SNP位点同时计算，胎儿游离DNA浓度计算的准确性更高。

S2、设计引物：根据设计的SNP位点，设计出覆盖SNP位点的SNP引物；

具体可利用ION AMPLISEQ DESIGNER在线设计网站设计出覆盖目标SNP位点的引物，设计引物也可以用其他软件代替。

S3、提取样品DNA；步骤S3也可以与S1同步执行，或者调整顺序。

S4、扩增含有SNP位点的DNA片段：将样品DNA、多重PCR反应酶和SNP 引物混匀后，进行PCR反应得到PCR产物；

S5、纯化扩增到的PCR产物；

S6、末端修复：将PCR产物、末端修复酶与5X 末端修复酶缓冲液混合，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；

S7、片段筛选：对步骤F所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到平末端DNA片段；

S8、接头连接：将所得的平末端DNA片段与ligase Enzyme（连接酶）、10X ligase Buffer（连接酶缓冲液）、及指定接头混合后，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；

S9、片段筛选：对步骤H所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到加接头的DNA片段；

S10、PCR扩增：对所得加接头的DNA片段进行PCR 扩增及纯化，得到小片段文库，具体可将加接头的DNA片段与Platinum PCR Super Mix High Fidelity与Library Amplification Primer Mix混合扩增纯化得到；

S11、文库检测：对小片段文库采用Qubit和Agilent Bioanalyzer2100检测浓度和片段大小；

S12、高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序；也可采用捕获的方法实现。

S13、数据预处理：将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤，筛选出长度大于100bp的序列；

进行筛选过滤是因为设计的引物加上目标序列长度都大于100bp。当然，过滤的长度可根据设计的目标区域调整。

S14、序列比对：将预处理后的序列与人类基因组序列进行比对；

具体可预处理后的序列与人类基因组序列（hg19）用bowtie2进行比对。S15、序列筛选：根据比对的结果，筛选出unique read的序列：

具体筛选出错配碱基在4个以下，且只比对到一处的序列，作为unique read。序列筛选也可采用其他标准，如允许错配的碱基数目是长度的百分之3且只比对到一处；或者允许的错配碱基数目是序列上设计的SNP数目加上1且只比对到一处。

S16、SNP数据统计：根据比对结果及SNP位点的位置统计出SNP位点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目；

具体可通过samtools软件进行统计。

S17、根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数进行排序，然后计算出SNP位点的覆盖深度Depth，并根据排序结果求出SNP位点的测序错误率Error；根据每行的覆盖深度Depth和测序错误率Error，求出SNP位点的平均覆盖度和测序错误率的较大值ErrorUp；根据平均覆盖度或者用户自定的覆盖深度，对SNP位点进行过滤；或根据每个SNP位点的测序错误率Error是否大于ErrorUp来过滤；

具体来说，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数排序后，按照从多到少的顺序分别称作Major、Minor、Third及Fourth。计算出覆盖深度Depth= Major+Minor+Third+Fourth，并利用下述公式求出测序错误率：Error=（Third+Fourth）/Depth。

测序错误率的较大值按以下公式计算：

ErrorUp= (ErrorMean+ErrorSD*2), Errormean（Errori）i=1…N，N为SNP位点个数，即Errormean为每一SNP位点的测序错误率平均值，ErrorSD是指每一个SNP位点测序错误率的方差，其中的参数2也可采用其他值，根据置信区间需要而定。

S18、计算每个SNP距离：对每一个SNP位点，计算出可能的胎儿游离DNA浓度Conc在四种SNP组合类型下所有SNP位点到相应胎儿游离DNA浓度的距离TypeDistance；

由于母亲和胎儿在一个SNP位点上可能出现四种情况，即具有四种SNP组合类型：类型1：母亲和胎儿都是纯合SNP；类型2：母亲纯合SNP，胎儿杂合SNP；类型3：母亲杂合SNP，胎儿纯合SNP；类型4：母亲和胎儿都是杂合SNP。对于每一个SNP位点，在不确定核型之前假设都存在上面四种可能。具体用Typej（j=1,2,3,4）来表示四种类型的SNP组合。

实际临床中可能的胎儿游离DNA浓度范围是0.025-0.5之间。具体用Conc来表示可能的胎儿游离DNA浓度，Conc的范围就是0.025-0.5。

按以下公式计算SNP距离Distance，Distance=abs(Major * A + Minor * B) / (A**2 + B**2)**0.5，其中A，B是参数，A**2是指A的2次方，Major与Minor在S17中提到，具体如下：

Type=1，A=Err/3,B=-(1-Err);

Type=4,A=1,B=-1；

这里Err=mean（Errori）i=1…1035，mean为求平均值，且Errori小于ErrorUp，Major、Minor分别为SNP位点中四种碱基出现次数排第一及第二的值。

每个SNP位点在四种SNP组合类型下对应有四个距离值，记作TypeDistance=Distance*C，C是一个参数，其在四种SNP类型下分别是：2（类型1），1（类型2），1（类型3），2（类型4）；根据计算得到的四种类型对应的距离判断该SNP位点所对应的类型；其中Typej（j=1,2,3,4）表示四种类型的SNP组合。

S19、计算出总距离：找出每一SNP位点在四种SNP组合类型下对应最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei），i=1…N，N为SNP位点总个数；

首先假设Conc是0.025，Err由实际数值计算得到，分别算出所有过滤后的SNP位点的四个距离值TypeDistance。找出四种类型对应下每个SNP位点最小的那个TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei）i=1…1035且Errori小于ErrorUp，这就是0.025这个胎儿游离DNA浓度下的最小距离值。对于其他胎儿游离DNA浓度也是如此计算。

S20、选择最优的总距离：在Conc范围内计算出的AllDistance中选出其中最小的，其所对应的Conc即为实际的胎儿游离DNA浓度。

从Conc=0.025开始，每次增加胎儿游离DNA浓度可能值Conc=Conc+0.001，然后用上步同样的方法计算出AllDistance，在这475个AllDistance选出最小的，其所对应的Conc就是实际的胎儿游离DNA浓度。每次递增的大小可变。

具体实施例

本发明将DNA高通量测序法引入到孕妇游离DNA中胎儿游离DNA比例测定技术中，具体应用过程的流程结合具体实例作进一步描述。

1、材料

供试样本为未知胎儿游离DNA浓度的孕妇外周血4例，其中2例男胎，2例女胎，为体现本实施例的准确性，两例男胎都用现有的定量技术定量胎儿游离DNA浓度进行对比。

高通量测序法试剂主要由3个试剂盒组成，文库构建试剂盒（扩增文库构建试剂盒和连接文库构建试剂盒）；测序模板制备试剂盒以及测序试剂盒。

2、方法

将四个样本按照上述实验步骤经过建库和上机处理，得到样本数据，然后进行数据分析。

1）数据处理

对上步拿到的数据进行预处理，即过滤掉长度少于100bp，或者序列中测序质量在Q20的比例小于50%的序列，二者中任一条件满足就去掉。四个样本过滤情况如下：

	原始reads数目	过滤后reads数目	有效reads比例
				样本1	3732137	3423150	91.7%
样本2	3523141	3261449	92.6%
				样本3	3869887	3494950	90.3%
样本4	6453416	6019736	93.2%

2）将过滤后的序列用bowtie2比对到参考序列人类基因组HG19。

根据上步比对的结果，筛选出错配数目小于等于4，且比对到人类基因组一个位置的reads，四个样本过滤的情况如下：

	质量过滤后reads数目	比对过滤后的reads数目	有效reads比例
				样本1	3423150	2385351	69.7%
样本2	3261449	2295840	70.4%
				样本3	3494950	2150867	61.5%
样本4	6019736	4113254	68.3%

3）利用软件samtools的命令mpileup，统计出四个样本每个SNP的碱基类型，碱基比例及覆盖深度。

根据上步的统计结果，确定每个SNP的Major和Minor，即出现次数最多碱基是Major，出现次数第二多的是Minor，并根据S17计算测序错误，四个样本的测序错误分别如下：

样本1	0.19%
		样本2	0.24%
样本3	0.14%
		样本4	0.18%

4）将得到的上述数据，运用S18到S20的步骤计算出四个样本的胎儿游离DNA浓度如下：

样本编号	胎儿游离DNA浓度	男胎Y计算的胎儿游离DNA浓度
			样本1	9.3%	10%
样本2	10.3%	10.5%
			样本3	8.7%	/
样本4	13.2%	/

综上所述，本发明运用高通量测序的方法，结合生物信息学，统计学等技术，计算出游离DNA中胎儿游离DNA的比例。本发明不仅可以用来计算胎儿游离DNA的比例，同样适合混合血浆样本中混合比例的计算。相对于传统方法中采用一些胎儿与母亲甲基化不同的基因，或者男性特有基因等来计算胎儿游离DNA浓度，本发明采用SNP来计算胎儿游离DNA浓度，准确率高，且本发明有系统的矫正PCR引入误差的统计学算法，如动态优化算法，遍历法等，而传统的方法只是简单的通过甲基化基因的比例来判断胎儿游离DNA浓度（甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法），或者是用PCR定量曲线得到胎儿游离DNA浓度，没有矫正实验或者PCR引入误差的能力，同样提高了准确率。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，包括步骤：

C、提取样品DNA；

E、纯化扩增到的PCR产物；

K、文库检测：对小片段文库检测浓度和片段大小；

L、高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序；

O、序列筛选：根据比对的结果，筛选出unique read的序列；

2.根据权利要求1所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，所述步骤O中，筛选出错配碱基在4个以下，且只比对到一处的序列，作为unique read。

3.根据权利要求1所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，所述步骤Q中，ErrorUp= (ErrorMean+ErrorSD*2), Errormean（Errori）i=1…N，N为SNP位点个数。

4.根据权利要求1所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，所述步骤U中，四种SNP组合类型为：类型1：母亲和胎儿都是纯合SNP；类型2：母亲纯合SNP，胎儿杂合SNP；类型3：母亲杂合SNP，胎儿纯合SNP；类型4：母亲和胎儿都是杂合SNP。

5.根据权利要求1所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，所述步骤A中，在1-13、18及21这15条染色体上共选出1035个SNP位点。

6.根据权利要求1所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，Conc的范围为0.025-0.5。

7.根据权利要求1所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，所述步骤R具体包括：

Type=1,A=Err/3,B=-(1-Err);