CN110580934A - 一种基于外周血游离dna高通量测序预测妊娠期相关疾病的方法 - Google Patents

一种基于外周血游离dna高通量测序预测妊娠期相关疾病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于孕妇外周血游离DNA高通量测序预测妊娠期相关疾病的方法。本发明研究发现，孕妇外周血游离DNA在基因转录起始位点区域的分布情况能够反应孕妇与胎儿的生理状态，基于基因转录起始位点区域的血清游离DNA丰度在妊娠期相关疾病患者与健康孕妇中存在显著差异，能够有效预测妊娠期相关疾病的发病。本发明基于此构建了基于外周血游离DNA检测的妊娠期相关疾病筛查预测模型，可在妊娠期相关疾病临床症状出现之前预测妊娠期相关疾病的发病，是一种无创、经济方便、准确的早期预测妊娠期相关疾病的方法，在开发妊娠期相关疾病的预测筛查产品方面具有很好的应用前景。

Description

一种基于外周血游离DNA高通量测序预测妊娠期相关疾病的 方法
技术领域
本发明属于疾病检测产品技术领域。更具体地，涉及一种基于外周血游离DNA高通量测序预测妊娠期相关疾病的方法。
背景技术
妊娠期相关疾病可影响妊娠的一系列生理过程，对孕妇和胎儿的健康造成伤害，严重者甚至危及孕妇与胎儿的生命安全。部分妊娠期相关疾病在人群中具有较高的发病频率，包括先兆子痫(发病率3～8％)、妊娠期糖尿病(5～10％)、胎儿生长受限(5～10％)、巨大儿(7～12％)等。
目前，根据这些妊娠期相关疾病的明确诊断指标可在胎儿发育趋近成熟或已经生产时确诊，先兆子痫确诊时间在妊娠24周左右、妊娠期糖尿病确诊时间在妊娠24-28周之间、胎儿生长受限确诊时间在新生儿出生后、巨大儿确诊时间在新生儿出生后。疾病导致的部分症状已经无法及时预防与干预，因此若能对这些妊娠期相关疾病进行早期预测，对于优生优育和妊娠女性生活质量的提高具有重要的意义和价值。
研究发现，疾病患者往往伴随着基因表达水平的异常，而基因表达的异常往往早于临床症状的出现。无创伤检测方法主要包括孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查和外周血游离RNA检测。其中，孕妇外周血中游离胎儿DNA在预防出生缺陷的产前诊断中取得了一定的成绩，然而仍面临着众多难题，如：孕妇外周血中游离胎儿DNA通常只占母总DNA的5-20％，导致阳性率低；目前研究的孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查只适于一小部分出生缺陷类型，更多由于多基因等复杂因素引起的出生缺陷，以及更多的孕妇妊娠期相关疾病，尚未不适用。而外周血游离RNA检测虽然可以直接检测部分基因的表达水平，但面临样本易降解、提取成本高、定量不稳定等缺点，临床应用较为局限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏妊娠期相关疾病早期预测技术的问题，提供一种基于外周血游离DNA高通量测序从而预测妊娠期相关疾病的技术，可在妊娠期相关疾病临床症状出现之前进行有效准确地预测，方法有效准确、成本低、无创伤，实现早期检测筛查。
本发明的目的是提供一种基于外周血游离DNA高通量测序的妊娠期相关疾病预测模型。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现，外周血游离DNA序列在基因组的分布并不均匀，而这种不均匀的分布与细胞内核小体的定位吻合(图1)，说明外周血游离DNA可以有效反应细胞内核小体的分布情况。进一步地，研究发现不同基因转录起始位点区域的外周血游离DNA数量存在差异，并且转录起始位点区域的DNA序列数量与基因的表达水平呈显著的负相关关系(图2、图3)。在此基础上，本发明发现，基因转录起始位点区域的外周血游离DNA序列数量可以有效反映孕妇和胎儿的生理状态，包括胎儿发育阶段(图4、图5)、胎儿性别(图6)、胎儿染色体核型异常(图7)等。基于以上的发现，本发明使用机器学习算法，通过不同差异基因的优选组合，发明了相对无创且经济方便的妊娠期相关疾病的早期预测方法，可用于先兆子痫、妊娠期糖尿病、胎儿生长受限、巨大儿等妊娠期相关疾病的早期检测筛查。
一种基于外周血游离DNA高通量测序的妊娠期相关疾病预测模型，首先对孕妇外周血游离DNA进行高通量测序，将测序结果与染色体组序列图谱进行比对后，计算在同一样本内来自待测基因转录起始位点区域DNA序列数量，根据DNA序列总数进行校正后，结合不同基因表达情况计算并输出待检孕妇妊娠期相关疾病患病预测结果。
其中，所述待测基因是高通量测序结果与染色体组序列图谱进行比对后得出的差异基因组合。
具体地，所述差异基因组合的筛选方法为：针对不同疾病，根据所有差异基因校正后的基因转录起始位点区域DNA片段数量，使用逐步逻辑回归(Stepwise LogisticRegression)计算拟合模型，并通过留一交叉验证(Leave-One-Out-Cross-Validation，LOOCV)评估获取可用于预测的最优基因组合。
更具体地，所述差异基因组合的筛选方法步骤如下：
(1)使用所有单个基因分别利用逻辑回归构建预测模型，使用留一交叉验证评估每个模型的预测效能后，选择表现最好的单基因模型为初始的原模型；
(2)在原模型的基础上，使用所有未入选模型的单个基因分别加入到模型中，利用逻辑回归构建预测模型，使用留一交叉验证评估每个模型的预测效能，选择预测效能最好的模型为新模型；
(3)若新模型预测效能优于原模型，则以新模型为原模型，重复步骤(2)，若新模型预测效能不优于原模型，则原模型中使用的基因为最优基因组合。
另外，具体地，本发明所述基于外周血游离DNA高通量测序的妊娠期相关疾病预测模型包括三个模块：
(1)待测样本外周血游离DNA进行高通量测序与分析模块：
对待测样本外周血游离DNA进行高通量测序(测序可以是单端测序或双端测序)，将测序结果与染色体组序列图谱进行比对，计算得到同一样本内来自待测基因转录起始位点区域DNA片段数量；
(2)公式1：
式中，总比对序列数指高通量测序数据中比对到人类染色体组序列的总序列数；
公式1用于对步骤(1)所得待测基因转录起始位点区域DNA片段数量进行校正；
优选地，公式1中，基因的转录起始位点区域大小为基因上游1000bp至下游1000bp的区域；
(3)公式2：
式中，Y为疾病预测评分，xi为基因i校正后的基因转录起始位点区域DNA片段数量，βi为基因i的系数β；c为常量；
公式2用于计算并输出待检孕妇妊娠期相关疾病患病预测结果；
进一步地，结果的预测标准如下：
将公式2的计算结果带入公式3：logit(Y)＝ln(Y/(1-Y))，计算出Y值；将Y值与妊娠期相关疾病风险阈值P进行比较，当样本数值Y大于阈值P时，则样本判断为妊娠期相关疾病高危；当样本数值Y小于阈值P时，则样本判断为妊娠期相关疾病低危；其中，针对不同的妊娠期疾病类型存在不同的阈值P，所述风险阈值P为使用最优待测基因组合，使用所有样本，通过逻辑回归计算拟合获得的最佳阈值。
另外，优选地，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，所述待测基因为CC2D2B、NAT10、SIPA1、ZNF565、ZNF552、WDR35、MICALL1、CTNNB1、CLOCK、BCKDHB、TGIF2LY中的任意几种；
优选地，当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，所述待测基因为SMC3、MASTL、CREM、C1QTNF12、MLXIP、MAP3K9、IGSF6、APC2、GPM6A、TMEM128、NIPBL、TMEM184A中的任意几种；
优选地，当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，所述待测基因为NFKB2、EHBP1L1、AMOTL1、VSIG10、USP10、ZSWIM4、ZNF565、BZW1、ATP6V1E2、CDX1中的任意几种；
优选地，当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，所述待测基因为HPS5、PTDSS2、OR4P4、PNRC2、CD63、VPS35、VAV1、DNPEP、TCF7、DPP6、LANCL2、GPAT4、FAM214B中的任意几种。
优选地，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，公式2中，所述c常量为0.957，所述基因及其对应系数β分别为：CC2D2B的系数β为0.565、NAT10的系数β为-1.060、SIPA1的系数β为-1.070、ZNF565的系数β为-0.620、ZNF552的系数β为-0.805、WDR35的系数β为-0.367、MICALL1的系数β为0.559、CTNNB1的系数β为-0.653、CLOCK的系数β为-0.529、BCKDHB的系数β为-0.674、TGIF2LY的系数β为-0.693；
优选地，当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，公式2中，所述c常量为2.180，所述基因及其对应系数β分别为：SMC3的系数β为0.605、MASTL的系数β为-1.204、CREM的系数β为1.366、C1QTNF12的系数β为-1.295、MLXIP的系数β为-0.471、MAP3K9的系数β为-0.811、IGSF6的系数β为-1.284、APC2的系数β为-1.347、GPM6A的系数β为-0.504、TMEM128的系数β为1.048、NIPBL的系数β为-0.057、TMEM184A的系数β为-1.652；
优选地，当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，公式2中，所述c常量为-0.655，所述基因及其对应系数β分别为：NFKB2的系数β为-1.146、EHBP1L1的系数β为1.350、AMOTL1的系数β为-1.371、VSIG10的系数β为-0.784、USP10的系数β为-1.047、ZSWIM4的系数β为-1.226、ZNF565的系数β为1.242、BZW1的系数β为-0.983、ATP6V1E2的系数β为0.761、CDX1的系数β为1.842；
优选地，当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，公式2中，所述c常量为-1.000，所述基因及其对应系数β分别为：HPS5的系数β为-0.797、PTDSS2的系数β为-1.142、OR4P4的系数β为0.846、PNRC2的系数β为0.636、CD63的系数β为1.208、VPS35的系数β为0.310、VAV1的系数β为-1.903、DNPEP的系数β为-1.313、TCF7的系数β为-1.370、DPP6的系数β为0.673、LANCL2的系数β为0.574、GPAT4的系数β为-1.288、FAM214B的系数β为1.238。
优选地，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，所述风险阈值P为0.259；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，所述风险阈值P为0.277；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，所述风险阈值P为0.258；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，所述风险阈值P为0.190。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于外周血游离DNA高通量测序的妊娠期相关疾病预测模型和方法，该技术可在临床症状出现之前预测先兆子痫、妊娠期糖尿病、胎儿生长受限、巨大儿等妊娠期相关疾病的发病，是一种无创、经济、方便、可在临床症状出现之前进行早期有效准确预测且早于现有方法的妊娠期相关疾病预测的方法，可以为妊娠期相关疾病的早期预测筛查提供有效的方法。
同时，该技术基于外周血游离DNA检测，外周血游离DNA由细胞破裂时进入外周血，经酶切后片段化后形成DNA片段，其半衰期很短，半小时就会被清除。由于基因转录表达时，转录起始位点附近的染色体DNA与核小体分离，染色体呈开放状态，细胞破裂时，这些开放区域的DNA由于不受核小体保护，更加容易降解。因而高表达水平基因的转录起始位点染色体开放程度更高，游离DNA片段的丰度显著低于其它区域。因此，转录起始位点区域的外周血游离DNA丰度可以提示染色体开放程度，从而预测基因表达水平，反映母体与胎儿的生理状态。且结合高通量测序技术，成本可控、稳定性好。
该方法基于高通量测序，可以同时检测多个不同基因的染色体开放水平，检测准确性更高，可以同时预测不同疾病的发病风险。
附图说明
图1是外周血游离DNA序列和细胞内核小体的分布示例，图片上半部分是外周血游离DNA序列的分布水平，下半部分是通过核小体定位测序获取的细胞内核小体分布水平，两者具有很好的一致性。
图2是外周血细胞中表达最高的1000个基因与表达最低的1000个基因的转录起始位点区域的核小体测序及外周血游离DNA序列的分布情况，无论核小体测序还是外周血游离DNA测序的数据，高表达基因的转录起始位点区域的DNA序列数量显著低于低表达基因。
图3是外周血游离DNA分布、细胞内核小体分布、细胞内基因表达量的相关性分析，可以看到外周血游离DNA分布与细胞内核小体分布显著正相关，与基因表达水平显著负相关。
图4是基于外周血游离DNA序列在所有基因转录起始位点分布绘制的主成分分析图，每个点代表一名孕妇，不同形状代表胎儿性别，不同颜色代表胎儿的孕周。可以看到利用转录起始位点区域的DNA序列数量可以显著区分胎儿的性别和胎儿的发育阶段。并且对于男胎和女胎，该方法都能准确区分胎儿的发育阶段。
图5是胎儿不同发育阶段时，孕妇外周血游离DNA在基因转录起始位点区域覆盖度比较，部分基因转录起始位点区域的染色体开放程度存在显著差异，能有效区分胎儿所处的发育阶段。
图6是不同胎儿性别的孕妇外周血游离DNA在基因转录起始位点区域覆盖度比较，通过部分基因转录起始位点区域的染色体开放程度，能够有效区分胎儿性别。
图7是胎儿染色体核型异常的孕妇外周血游离DNA在基因转录起始位点区域覆盖度与健康胎儿母体的差异。
图8是本发明针对四类妊娠期相关疾病，在训练组和验证组判断妊娠期相关疾病患者的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本文中名词解释：双端测序是指分别测试位于序列两端的序列。单端测序是指测试位于序列一端的序列。
实施例1
1、实验方法
(1)收集同一样本的外周血游离DNA、外周血白细胞DNA和RNA。使用微球核酸酶(Micrococcal Nuclease，MNase)处理外周血白细胞DNA，获得与核小体结合的DNA序列。对外周血游离DNA、外周血白细胞RNA、外周血白细胞核小体结合DNA进行高通量测序，将测序结果与染色体组序列图谱进行比对,计算得到同一样本内来自全部基因转录起始位点区域DNA片段数量、核小体结合DNA片段数量、以及待测基因RNA片段数量。
本步骤具体是确定DNA或RNA片段来自染色体上的具体位置：在进行了DNA双端测序后(可替换地，也可以是单端测序)，可以将这两端的序列与人类基因组标准序列37.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/data/？build＝37)，该数据库也称hg19，确定了这两端的序列分别在染色体上的位置，该两端序列之间的距离就是该DNA或RNA片段的长度，同时该两端序列所在的染色体位置即确定了该DNA或RNA片段来自几号染色体；
(2)对待测基因转录起始位点区域外周血游离DNA片段数量和外周血白细胞核小体结合DNA片段数量进行校正。
公式1：
式中，总比对序列数指高通量测序数据中比对到人类染色体组序列的总序列数；
公式1用于对步骤(1)所得待测基因转录起始位点区域DNA片段数量进行校正；
(3)对待测基因的表达量进行计算
公式4：
式中，总比对序列数指高通量测序数据中比对到人类染色体组序列的总序列数；
公式4用于对步骤(1)所得待测基因区域RNA片段数量进行校正；
(4)统计待测样本中所有基因的表达量以及校正后的转录起始位点区域外周血游离DNA片段数量和外周血白细胞核小体结合DNA片段数量。对同一样本，使用Pearson相关系数(Pearson Correlation Coefficient)衡量外周血游离DNA、核小体定位、基因表达图谱的相关性。整合不同样本数据，利用秩和检验筛选外周血游离DNA序列数量在不同样本分组之间存在差异的基因转录起始位点区域；利用主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)分析不同样本之间的相似性关系。
2、实验结果
外周血游离DNA序列在基因组的分布并不均匀，而这种不均匀的分布与细胞内核小体的定位吻合(图1)，说明外周血游离DNA可以有效反应细胞内核小体的分布情况。进一步地，研究发现不同基因转录起始位点区域的外周血游离DNA数量存在差异，并且转录起始位点区域的DNA序列数量与基因的表达水平呈显著的负相关关系(图2、图3)。在此基础上，本发明发现，基因转录起始位点区域的外周血游离DNA序列数量可以有效反映孕妇和胎儿的生理状态，包括胎儿发育阶段(图4、图5)、胎儿性别(图6)、胎儿染色体核型异常(图7)等。
实施例2
基因上述研究成果，本发明使用机器学习算法，通过不同差异基因的优选组合，提供了相对无创且经济方便的妊娠期相关疾病的早期预测方法，可用于先兆子痫、妊娠期糖尿病、胎儿生长受限、巨大儿等妊娠期相关疾病的早期检测筛查。
具体地，一种基于外周血游离DNA高通量测序的妊娠期相关疾病预测模型，包括三个模块：
(1)待测样本外周血游离DNA进行高通量测序与分析模块：
对待测样本外周血游离DNA进行高通量测序，将测序结果与染色体组序列图谱进行比对，计算得到同一样本内来自待测基因转录起始位点区域DNA片段数量；
(2)公式1：
式中，总比对序列数指高通量测序数据中比对到人类染色体组序列的总序列数；
公式1用于对步骤(1)所得待测基因转录起始位点区域DNA片段数量进行校正；
(3)公式2：
式中，Y为疾病预测评分，xi为基因i校正后的基因转录起始位点区域DNA片段数量，βi为基因i的系数β；c为常量；
公式2用于计算并输出待检孕妇妊娠期相关疾病患病预测结果。
结果的预测标准如下：
将公式2的计算结果带入公式3：logit(Y)＝ln(Y/(1-Y))，计算出Y值；将Y值与妊娠期相关疾病风险阈值P进行比较，当样本数值Y大于阈值P时，则样本判断为妊娠期相关疾病高危；当样本数值Y小于阈值P时，则样本判断为妊娠期相关疾病低危；其中，针对不同的妊娠期疾病类型存在不同的阈值P。
其中，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，所述待测基因为CC2D2B、NAT10、SIPA1、ZNF565、ZNF552、WDR35、MICALL1、CTNNB1、CLOCK、BCKDHB、TGIF2LY中的任意几种；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，所述待测基因为SMC3、MASTL、CREM、C1QTNF12、MLXIP、MAP3K9、IGSF6、APC2、GPM6A、TMEM128、NIPBL、TMEM184A中的任意几种；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，所述待测基因为NFKB2、EHBP1L1、AMOTL1、VSIG10、USP10、ZSWIM4、ZNF565、BZW1、ATP6V1E2、CDX1中的任意几种；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，所述待测基因为HPS5、PTDSS2、OR4P4、PNRC2、CD63、VPS35、VAV1、DNPEP、TCF7、DPP6、LANCL2、GPAT4、FAM214B中的任意几种。
需要说明的是，在不矛盾的情况下，所述的待测基因组合仅代表某一试剂、仪器平台下的优选组合，本发明不限制发明人在其他仪器、试剂条件下优选使用其他差异基因组合进行预测。
当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，公式2中，所述c常量为0.957，所述基因及其对应系数β分别为：CC2D2B的系数β为0.565、NAT10的系数β为-1.060、SIPA1的系数β为-1.070、ZNF565的系数β为-0.620、ZNF552的系数β为-0.805、WDR35的系数β为-0.367、MICALL1的系数β为0.559、CTNNB1的系数β为-0.653、CLOCK的系数β为-0.529、BCKDHB的系数β为-0.674、TGIF2LY的系数β为-0.693；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，公式2中，所述c常量为2.180，所述基因及其对应系数β分别为：SMC3的系数β为0.605、MASTL的系数β为-1.204、CREM的系数β为1.366、C1QTNF12的系数β为-1.295、MLXIP的系数β为-0.471、MAP3K9的系数β为-0.811、IGSF6的系数β为-1.284、APC2的系数β为-1.347、GPM6A的系数β为-0.504、TMEM128的系数β为1.048、NIPBL的系数β为-0.057、TMEM184A的系数β为-1.652；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，公式2中，所述c常量为-0.655，所述基因及其对应系数β分别为：NFKB2的系数β为-1.146、EHBP1L1的系数β为1.350、AMOTL1的系数β为-1.371、VSIG10的系数β为-0.784、USP10的系数β为-1.047、ZSWIM4的系数β为-1.226、ZNF565的系数β为1.242、BZW1的系数β为-0.983、ATP6V1E2的系数β为0.761、CDX1的系数β为1.842；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，公式2中，所述c常量为-1.000，所述基因及其对应系数β分别为：HPS5的系数β为-0.797、PTDSS2的系数β为-1.142、OR4P4的系数β为0.846、PNRC2的系数β为0.636、CD63的系数β为1.208、VPS35的系数β为0.310、VAV1的系数β为-1.903、DNPEP的系数β为-1.313、TCF7的系数β为-1.370、DPP6的系数β为0.673、LANCL2的系数β为0.574、GPAT4的系数β为-1.288、FAM214B的系数β为1.238。
当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，所述风险阈值P为0.259；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，所述风险阈值P为0.277；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，所述风险阈值P为0.258；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，所述风险阈值P为0.190。
实施例3检测示例
1、妊娠期糖尿病检测示例
按照实施例2的方法进行操作。步骤2中统计样本总比对序列数，本示例中样本1和样本2分别为69479和57037。计算在同一样本内所述待测基因转录起始位点区域内DNA片段的数量，使用公式1对DNA片段丰度进行校正。表3为两个样本待测基因转录起始位点区域的DNA片段丰度计算的示例：
表3
使用公式2计算妊娠期糖尿病的发病风险，计算示例如下：
样本1(已确诊妊娠期糖尿病的发病前样本)：
logit(Y)＝0.957+0.565×CC2D2B–1.060×NAT10–1.070×SIPA1–0.620×ZNF565–0.805×ZNF552–0.367×WDR35+0.559×MICALL1–0.653×CTNNB1–0.529×CLOCK–0.674×BCKDHB–0.693×TGIF2LY＝2.835
Y＝0.944
样本数值大于妊娠期糖尿病阈值P(0.259)，判断为妊娠期糖尿病高危样本。结果准确。
样本2(健康样本)：
logit(Y)＝0.957+0.565×CC2D2B–1.060×NAT10–1.070×SIPA1–0.620×ZNF565–0.805×ZNF552–0.367×WDR35+0.559×MICALL1–0.653×CTNNB1–0.529×CLOCK–0.674×BCKDHB–0.693×TGIF2LY＝-4.040
Y＝0.017
样本数值小于阈值P(0.259)，判断为妊娠期糖尿病低危样本。结果准确。
2、妊娠期巨大儿检测示例
按照实施例2的方法进行操作。步骤2中统计样本总比对序列数，本示例中样本1和样本2分别为61724和53241。计算在同一样本内所述待测基因转录起始位点区域内DNA片段的数量，使用公式1对DNA片段丰度进行校正。表3为两个样本待测基因转录起始位点区域的DNA片段丰度计算的示例：
表3
使用公式2计算妊娠期糖尿病的发病风险，计算示例如下：
样本1(已确诊巨大儿的发病前样本)：
logit(Y)＝2.180+0.605×SMC3–1.204×MASTL+1.366×CREM–1.295×C1QTNF12–0.471×MLXIP–0.811×MAP3K9–1.284×IGSF6–1.347×APC2–0.504×GPM6A+1.048×TMEM128–0.057×NIPBL–1.652×TMEM184A＝2.755
Y＝0.940
样本数值大于巨大儿阈值P(0.277)，判断为巨大儿高危样本。结果准确。
样本2(健康样本)：
logit(Y)＝2.180+0.605×SMC3–1.204×MASTL+1.366×CREM–1.295×C1QTNF12–0.471×MLXIP–0.811×MAP3K9–1.284×IGSF6–1.347×APC2–0.504×GPM6A+1.048×TMEM128–0.057×NIPBL–1.652×TMEM184A＝-4.854
Y＝0.007
样本数值小于阈值P(0.277)，判断为巨大儿低危样本。结果准确。
3、妊娠期先兆子痫检测示例
按照实施例2的方法进行操作。步骤2中统计样本总比对序列数，本示例中样本1和样本2分别为63486和51100。计算在同一样本内所述待测基因转录起始位点区域内DNA片段的数量，使用公式1对DNA片段丰度进行校正。表3为两个样本待测基因转录起始位点区域的DNA片段丰度计算的示例：
表3
使用公式2计算妊娠期糖尿病的发病风险，计算示例如下：
样本1(已确诊先兆子痫孕妇的发病前样本)：
logit(Y)＝–0.655–1.146×NFKB2+1.350×EHBP1L1–1.371×AMOTL1–0.784×VSIG10–1.047×USP10–1.226×ZSWIM4+1.242×ZNF565–0.983×BZW1+0.761×ATP6V1E2+1.842×CDX1＝0.439
Y＝0.608
样本数值大于先兆子痫阈值P(0.258)，判断为先兆子痫高危样本。结果准确。
样本2(健康样本)：
logit(Y)＝–0.655–1.146×NFKB2+1.350×EHBP1L1–1.371×AMOTL1–0.784×VSIG10–1.047×USP10–1.226×ZSWIM4+1.242×ZNF565–0.983×BZW1+0.761×ATP6V1E2+1.842×CDX1＝-4.911
Y＝0.007
样本数值小于阈值P(0.258)，判断为先兆子痫低危样本。结果准确。
4、妊娠期胎儿生长受限检测示例
按照实施例2的方法进行操作。步骤2中统计样本总比对序列数，本示例中样本1和样本2分别为75583和77406。计算在同一样本内所述待测基因转录起始位点区域内DNA片段的数量，使用公式1对DNA片段丰度进行校正。表3为两个样本待测基因转录起始位点区域的DNA片段丰度计算的示例：
表3
使用公式2计算妊娠期糖尿病的发病风险，计算示例如下：
样本1(已确诊胎儿生长受限的发病前样本)：
logit(Y)＝–1.000–0.797×HPS5–1.142×PTDSS2+0.846×OR4P4+0.636×PNRC2+1.208×CD63+0.310×VPS35–1.903×VAV1–1.313×DNPEP–1.370×TCF7+0.673×DPP6+0.574×LANCL2–1.288×GPAT4+1.238×FAM214B＝4.834
Y＝0.992
样本数值大于胎儿生长受限阈值P(0.190)，判断为胎儿生长受限高危样本。结果准确。
样本2(健康样本)：
logit(Y)＝–1.000–0.797×HPS5–1.142×PTDSS2+0.846×OR4P4+0.636×PNRC2+1.208×CD63+0.310×VPS35–1.903×VAV1–1.313×DNPEP–1.370×TCF7+0.673×DPP6+0.574×LANCL2–1.288×GPAT4+1.238×FAM214B＝-6.374
Y＝0.017
样本数值小于阈值P(0.190)，判断为胎儿生长受限低危样本。结果准确。
实施例4样本检测
1、实验样本：
(1)妊娠期糖尿病样本
训练组包含126例妊娠期糖尿病样本，378例健康对照；
验证组包含54例妊娠期糖尿病样本，162例健康对照。
(2)巨大儿样本
训练组包含119例巨大儿样本，378例健康对照；
验证组包含72例巨大儿样本，162例健康对照。
(3)先兆子痫样本
训练组包含60例先兆子痫样本，378例健康对照；
验证组包含44例先兆子痫样本，162例健康对照。
(4)胎儿生长受限样本
训练组包含132例胎儿生长受限样本，378例健康对照；
验证组包含103例胎儿生长受限样本，162例健康对照。
按照实施例2的方法操作。统计计算方法的准确性、敏感性和特异性。
2、结果显示，本发明的方法模型针对不同类型的妊娠期相关疾病，在训练组和验证组中均能有效在早期发病前判断妊娠期糖尿病患者(表2及图8)。
表2本发明方法对不同类型的妊娠期相关疾病的预测准确度评估
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于外周血游离DNA高通量测序的妊娠期相关疾病预测模型，其特征在于，对孕妇外周血游离DNA进行高通量测序，将测序结果与染色体组序列图谱进行比对后，计算在同一样本内来自待测基因转录起始位点区域DNA序列数量，根据DNA序列总数进行校正后，结合不同基因表达情况计算并输出待检孕妇妊娠期相关疾病患病预测结果；所述待测基因是高通量测序结果与染色体组序列图谱进行比对后得出的差异基因组合。
2.根据权利要求1所述预测模型，其特征在于，所述差异基因组合的筛选方法为：针对不同疾病，根据所有差异基因校正后的基因转录起始位点区域DNA片段数量，使用逐步逻辑回归(Stepwise Logistic Regression)计算拟合模型，并通过留一交叉验证(Leave-One-Out-Cross-Validation，LOOCV)评估获取可用于预测的最优基因组合。
3.根据权利要求1所述预测模型，其特征在于，包括三个模块：
(1)待测样本外周血游离DNA进行高通量测序与分析模块：
对待测样本外周血游离DNA进行高通量测序，将测序结果与染色体组序列图谱进行比对，计算得到同一样本内来自待测基因转录起始位点区域DNA片段数量；
(2)公式1：
式中，总比对序列数指高通量测序数据中比对到人类染色体组序列的总序列数；
公式1用于对步骤(1)所得待测基因转录起始位点区域DNA片段数量进行校正；
(3)公式2：
式中，Y为疾病预测评分，xi为基因i校正后的基因转录起始位点区域DNA片段数量，βi为基因i的系数β；c为常量；
公式2用于计算并输出待检孕妇妊娠期相关疾病患病预测结果。
4.根据权利要求3所述预测模型，其特征在于，预测标准如下：
将公式2的计算结果带入公式3：logit(Y)＝ln(Y/(1-Y))，计算出Y值；将Y值与妊娠期相关疾病风险阈值P进行比较，当样本数值Y大于阈值P时，则样本判断为妊娠期相关疾病高危；当样本数值Y小于阈值P时，则样本判断为妊娠期相关疾病低危；其中，所述风险阈值P为使用待测基因组合，使用所有样本，通过逻辑回归计算拟合获得的最佳阈值。
5.根据权利要求1-3任一所述预测模型，其特征在于，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，所述待测基因为CC2D2B、NAT10、SIPA1、ZNF565、ZNF552、WDR35、MICALL1、CTNNB1、CLOCK、BCKDHB、TGIF2LY中的任意几种；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，所述待测基因为SMC3、MASTL、CREM、C1QTNF12、MLXIP、MAP3K9、IGSF6、APC2、GPM6A、TMEM128、NIPBL、TMEM184A中的任意几种；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，所述待测基因为NFKB2、EHBP1L1、AMOTL1、VSIG10、USP10、ZSWIM4、ZNF565、BZW1、ATP6V1E2、CDX1中的任意几种；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，所述待测基因为HPS5、PTDSS2、OR4P4、PNRC2、CD63、VPS35、VAV1、DNPEP、TCF7、DPP6、LANCL2、GPAT4、FAM214B中的任意几种。
6.根据权利要求5所述预测模型，其特征在于，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，公式2中，所述c常量为0.957，所述基因及其对应系数β分别为：CC2D2B的系数β为0.565、NAT10的系数β为-1.060、SIPA1的系数β为-1.070、ZNF565的系数β为-0.620、ZNF552的系数β为-0.805、WDR35的系数β为-0.367、MICALL1的系数β为0.559、CTNNB1的系数β为-0.653、CLOCK的系数β为-0.529、BCKDHB的系数β为-0.674、TGIF2LY的系数β为-0.693；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，公式2中，所述c常量为2.180，所述基因及其对应系数β分别为：SMC3的系数β为0.605、MASTL的系数β为-1.204、CREM的系数β为1.366、C1QTNF12的系数β为-1.295、MLXIP的系数β为-0.471、MAP3K9的系数β为-0.811、IGSF6的系数β为-1.284、APC2的系数β为-1.347、GPM6A的系数β为-0.504、TMEM128的系数β为1.048、NIPBL的系数β为-0.057、TMEM184A的系数β为-1.652；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，公式2中，所述c常量为-0.655，所述基因及其对应系数β分别为：NFKB2的系数β为-1.146、EHBP1L1的系数β为1.350、AMOTL1的系数β为-1.371、VSIG10的系数β为-0.784、USP10的系数β为-1.047、ZSWIM4的系数β为-1.226、ZNF565的系数β为1.242、BZW1的系数β为-0.983、ATP6V1E2的系数β为0.761、CDX1的系数β为1.842；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，公式2中，所述c常量为-1.000，所述基因及其对应系数β分别为：HPS5的系数β为-0.797、PTDSS2的系数β为-1.142、OR4P4的系数β为0.846、PNRC2的系数β为0.636、CD63的系数β为1.208、VPS35的系数β为0.310、VAV1的系数β为-1.903、DNPEP的系数β为-1.313、TCF7的系数β为-1.370、DPP6的系数β为0.673、LANCL2的系数β为0.574、GPAT4的系数β为-1.288、FAM214B的系数β为1.238。
7.根据权利要求4所述筛查预测模型，其特征在于，当所述妊娠期相关疾病为妊娠期糖尿病时，所述风险阈值P为0.259；
当所述妊娠期相关疾病为巨大儿时，所述风险阈值P为0.277；
当所述妊娠期相关疾病为先兆子痫时，所述风险阈值P为0.258；
当所述妊娠期相关疾病为胎儿生长受限时，所述风险阈值P为0.190。
8.根据权利要求3所述筛查预测模型，其特征在于，公式1中，基因的转录起始位点区域大小为基因上游1000bp至下游1000bp的区域。
9.根据权利要求1或3所述筛查预测模型，其特征在于，测序是单端测序或双端测序。
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