CN116926164A - 用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用 - Google Patents
用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116926164A CN116926164A CN202310769120.7A CN202310769120A CN116926164A CN 116926164 A CN116926164 A CN 116926164A CN 202310769120 A CN202310769120 A CN 202310769120A CN 116926164 A CN116926164 A CN 116926164A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- loop
- molecular beacon
- stem
- isothermal amplification
- mediated isothermal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 39
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 25
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 3
- 241001327682 Oncorhynchus mykiss irideus Species 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- -1 salt ion Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241001646580 Albatrossia pectoralis Species 0.000 description 1
- 241001597062 Channa argus Species 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001086186 Engraulis encrasicolus Species 0.000 description 1
- 241000276438 Gadus morhua Species 0.000 description 1
- 241000735215 Lepidocybium flavobrunneum Species 0.000 description 1
- 241000276495 Melanogrammus aeglefinus Species 0.000 description 1
- 241000276397 Merluccius merluccius Species 0.000 description 1
- 241001502127 Mullus barbatus Species 0.000 description 1
- 241000969797 Odontobutis potamophila Species 0.000 description 1
- 241000277326 Oncorhynchus gorbuscha Species 0.000 description 1
- 241000277269 Oncorhynchus masou Species 0.000 description 1
- 241000277277 Oncorhynchus nerka Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000157468 Reinhardtius hippoglossoides Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000277289 Salmo salar Species 0.000 description 1
- 241001620072 Scomberomorus niphonius Species 0.000 description 1
- 241001486863 Sprattus sprattus Species 0.000 description 1
- 241000719209 Trachinotus ovatus Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于可视化环介导等温扩增的分子信标，包括未经标记的寡核苷酸茎环结构LBP‑n‑0、茎环结构与靶标互补产生的双链LBP‑n‑b1/‑b2c。还包括其制备方法及其在检测虹鳟鱼中的应用。本发明利用寡核苷酸在熔解曲线中的荧光强度差值关系，成功筛选出能够实现可视化环介导等温扩增检测的分子信标，极大减少分子信标设计的背景信号，降低成本。针对新设分子信标建立的可视化检测方法可以在25min内实现对靶标的特异性检测，对建立基于分子信标的可视化检测具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用。
背景技术
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种核酸等温扩增技术。该技术对目的基因设计出4～6条引物，在等温条件下(60℃-65℃)可以快速、准确地扩增靶标，具有极高的特异性。
为了实现高效的LAMP分析，可以选择实时或终点测定的方法来检测扩增反应。然而，由于LAMP检测操作简单、反应快速且不需要复杂仪器，因此进行终点可视化检测已经成为当前的研究热点。事实上，基于LAMP扩增副产物的可视化检测方法应用广泛，包括pH指示剂法、金属离子指示剂法、浊度法等。此外，还可以利用LAMP扩增产物双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)进行可视化检测，如，高浓度荧光染料SYBR Green I可以与dsDNA结合，产生明显颜色变化。然而，上述的可视化检测方法无法区分由引物二聚体产生的非特异性扩增，导致假阳性的结果。
为了实现特异性检测，具有茎环结构的分子信标(Molecular Beacon，MB)越来越多地被使用。MB的环区通常由15bp～30bp组成，能够特异性识别靶标。MB的茎区由5bp～8bp互补配对的碱基组成发夹结构。5’与3’末端分别标记荧光基团与淬灭基团。当靶标存在时，发夹结构打开，荧光基团与淬灭基团彼此分离，发出强烈荧光；无靶标存在时，发夹结构保持稳定，荧光基团的荧光被淬灭。为了更好的实现特异性检测，MB已被应用于LAMP检测系统中，其实时检测的有效性已被证实。
在MB-LAMP检测方法构建中，由于不合适的茎环结构组合，极大降低了MB在LAMP中的应用。理想的MB-LAMP不仅能检测出特定的产物，而且能实现可视化判定结果。本发明以虹鳟鱼为例，对MB设计中最佳茎环结构提出标准化要求，并成功应用于MB-LAMP可视化检测中，有效降低MB设计错误的几率，有利于MB在LAMP中的进一步应用。
发明内容
本发明的目的在于提供用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于可视化环介导等温扩增的分子信标，包括
未经标记的寡核苷酸茎环结构LBP-n-0、茎环结构与靶标互补产生的双链LBP-n-b1/-b2c，用于分析熔解曲线中的荧光强度差值关系。
熔解曲线中的荧光强度差值关系，包括以下条件：
(1)达到反应温度前，未经标记的寡核苷酸茎环结构在熔解曲线中的荧光强度，低于茎环结构与靶标互补产生的双链的荧光强度；
(2)在反应温度下，当未经标记的寡核苷酸茎环结构的荧光强度显著低于茎环结构与靶标互补产生的双链的荧光强度时，产生的背景信号较低。
一种用于可视化环介导等温扩增的分子信标的制备方法，包括以下步骤：
S1：未经标记的寡核苷酸茎环结构模拟与双链Tm值的模拟；
S2：将茎环结构、LAMP缓冲溶液、核酸染料混合得到混合体系1，将茎环结构与靶标互补的双链、LAMP缓冲溶液、SYTO 9混合得到混合体系2；
S3：将配制的混合体系1、混合体系2置于实时荧光检测仪，并将反应温度设置为35℃～97℃，每摄氏度收集10次荧光信号，得茎环结构、茎环结构与靶标互补的双链熔解曲线；
S4：选择茎环结构与靶标互补的双链熔解曲线产生的荧光信号高于茎环结构的寡核苷酸，进行荧光与淬灭基团修饰，得到分子信标。
一种鉴别虹鳟鱼的引物的应用，虹鳟鱼的引物如下表所示
表1虹鳟鱼引物
一种基于荧光强度设计MB的方法建立。
为了解决MB在可视化环介导等温扩增中的设计问题，本发明公开了一种基于荧光强度设计MB的方法。未经标记的寡核苷酸茎环结构命名为LBP-n-0；MB理论与靶标结合形成的双链命名为LBP-n-a/-ac；MB实际与靶标结合形成的双链命名为LBP-n-b1/-b2c。以虹鳟LBP-4-1为例，寡核苷酸与LBP-4-1(MB)序列如下表所示。
表2引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| LBP-4-1-0 | AAAGGCGACTCTAACACGATTTTTCGCCTTT |
| LBP-4-1-a | ACTCTAACACGATTTTTCGCCTTT |
| LBP-4-1-b1 | AAGGCGACTCTAACACGATTTTTCGCCTTT |
| LBP-4-1-b2 | AACGCCACTCTAACACGATTTTTCGCCTTT |
| LBP4-1 | FAM-AAAGGCGACTCTAACACGATTTTTCGCCTTT-Dabcyl |
*-ac与-b2c分别为-a、-b2的反向互补序列，此处未展示。
用于可视化LAMP检测的MB应满足以下条件：
(1)达到反应温度前，LBP-n-b1/-b2c的熔解曲线高于LBP-n-0的熔解曲线。
(2)在反应温度下，LBP-n-b1/-b2c的荧光强度与LBP-n-0的荧光强度存在显著差异。
一种鉴定虹鳟鱼的MB-LAMP可视化方法，包括以下步骤：
(1)寡核苷酸荧光强度分析，设计MB；
(2)提取待测样品DNA；
(3)将模板DNA与环介导等温扩增反应试剂、引物组、MB混合得到反应前的混合体系，所述引物、MB分别为虹鳟鱼引物、MB；
(4)将混合试剂置于恒温混匀仪并将反应温度设置为63℃，反应25min后得到反应后的混合体系；
(5)在反应结束后，根据混合体系的在蓝光下的荧光颜色判断是否存在虹鳟鱼；
进一步地，所述环介导等温扩增反应体系见表3。
表3 LAMP扩增体系
其中，所述Bst DNA Polymerase Large Fragment的酶活力单位(U)，酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。定义：其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化为1μM底物，或者底物中1μM有关基团所需的酶量，称为一个酶活力国际单位(IU，又称U)。
反应程序：63℃，反应25min。反应设置两个阴性平行对照。以灭菌去离子水代替DNA加入反应体系中。
本发明的技术效果和优点：(1)本发明基于荧光强度分析MB的茎环结构，利用寡聚核苷酸对MB进行设计，降低成本；
(2)本发明建立的MB-LAMP可视化检测技术，仅需要简单的加热恒温装置即可实现靶标的快速特异性扩增，所需反应时长可缩短至25min；
(3)本发明对结果的判定简单，反应后的溶液置于蓝光下，不出现荧光的为阴性，出现绿色荧光才是阳性，实现精准定性；
(4)本发明提供的MB-LAMP可视化检测方法，具有较低检测限，最低检测限为2.5pg/μL。
附图说明
图1是MB设计优化图，其中，左是LBP-n-0的结构模拟，右是LBP-n-0与靶标结合的模拟图，其中形成的双链分别为LBP-n-a/-ac、LBP-n-b1/b2c；
图2是MB-LAMP结合原理图，茎区个别碱基存在错配时，有概率与靶标结合，形成更稳定的双链结构；
图3是LBP-n-0、LBP-n-a/-ac和LBP-n-b1/b2c的熔解曲线。在达到反应温度(63℃)前寡核苷酸LBP-n-b1/-b2c产生的熔解曲线高于LBP-n-0，且在反应温度下存在显著荧光差值时，经过荧光基团与淬灭基团修饰得到LBP-n(MB)，将LBP-n进行LAMP扩增可视化检测，阳性样品(P)的反应管可以产生强烈绿色荧光，阴性样品(N)的反应管不产生绿色荧光；
图4是MB-LAMP可视化方法特异性验证，其中(A)为可视化结果，(B)为PEI交叉验证，(P)为阳性对照，(N)为阴性对照；
图5是MB-LAMP可视化方法灵敏度验证，其中“1”的DNA浓度为25ng/μL，(P)为阳性对照，(N)为阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：MB的设计
(1)结构模拟
以LAMP引物组中环引物LB序列为基础设计LBP-4-1，使用在线软件NUPACK(https://nupack.org/partition/new)进行结构模拟，预测室温下引物二级结构并判断其稳定性(如图1)。软件中盐离子浓度设置50mmol/L Na+、2.5mmol/L Mg2+，近似模拟体系环境。
(3)荧光强度分析
虹鳟茎环结构序列命名为LBP-4-1-0；MB理论与靶标结合形成的双链命名为LBP-4-1-a/-ac；MB实际与靶标结合形成的双链命名为LBP-4-1-b1/-b2c。以上引物委托通用生物(安徽)股份有限公司完成。引物序列如表2。
采用全自动医用PCR分析系统(Gentier 96)将温度从35℃升高至97℃，在1.0μLSYTO 9、2.5μL 10×ThermoPol缓冲液(2.5mmol/L Mg2+)中检测0.4μmol/L的引物的荧光信号，每摄氏度采集10次荧光信号。反应后根据Tm值的大小，模拟MB与靶标结合状态(如图2)。
LBP-4-1的寡核苷酸符合：1)在反应温度(63℃)前，LBP-4-1-b1/-b2c的熔解曲线高于LBP-4-1-0的熔解曲线。2)在反应温度下，LBP-4-1-b1/-b2c的荧光强度与LBP-4-1-0的荧光强度存在差值(如图3)。
委托通用生物(安徽)股份有限公司合成双标记(荧光、淬灭基团)的LBP-4-1。
实施例2：方法建立
(1)样品采集
本实验共采集25种非目标物种，O.masou、O.nerka、O.tshawyscha、O.gorbuscha、S.salar、Gadus morhua、G.macrocephalus、G.chalcogrammus、Melanogrammusaeglefinus、Pollachius virens、Merluccius merluccius、Albatrossia pectoralis、Katsuwonuspelamis、Scomberomorus niphonius、Mullus barbatus、Odontobutispotamophila,Channa argus、Reinhardtius hippoglossoides、Pleuronectesplatessa、Sprattus sprattus、Encrasicholinapunctifer、Lepidocybium flavobrunneum、Engraulis encrasicolus、Trachinotus ovatus、Cyprinus carpio。
(2)DNA提取
采用细胞/血液/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP340)提取总DNA。采用BioPhotometer D30核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)测定DNA浓度和纯度，并将DNA置于-20℃保存备用。经测定，所以样品DNA的A260/280值在1.8-2.0范围内，表明提取的DNA蛋白质残留较少，适用于后续的分子检测。
(3)MB-LAMP可视化检测体系建立
根据参考文献所述的引物组，引物委托通用生物(安徽)股份有限公司合成，引物序列如表1。MB-LAMP反应体系如下表4所示：
表4
反应程序：63℃，25min。实验设置2个阴性平行对照(以灭菌去离子水代替DNA加入LAMP反应体系)。反应结束后，加入2μL的聚乙烯亚胺(PEI)工作液(2.32mol/L，分子量600)来聚沉扩增产物。在1000xg下离心30s后，置于470nm光源下进行可视化检测。结果如图3反应管所示，只有阳性对照(P)在蓝光下出现强烈的绿色荧光；
阴性对照在蓝光下不出现绿色荧光。
(4)特异性验证
以虹鳟鱼(O.mykiss)和其他25个非目标物种的DNA为模板，进行MB-LAMP可视化检测，验证LBP-4-1的特异性。结果如图4所示，只有阳性对照(P)在蓝光下出现强烈的绿色荧光。说明本发明设计的LBP-4-1对虹鳟鱼(O.mykiss)具有特异性。
(5)灵敏度验证
将虹鳟鱼(O.mykiss)的基因组DNA进行倍比稀释，浓度设定为25ng/μL、2.5ng/μL、0.25ng/μL、25pg/μL和2.5pg/μL。作为反应模板进行扩增，验证方法的灵敏度。可视化结果如图5所示，初步验证虹鳟鱼的MB-LAMP可视化最低可检测到2.5pg/μL的DNA。
本发明通过利用未经标记的寡核苷酸茎环结构(LBP-n-0)、茎环结构及其与靶标结合的双联(LBP-n-b1/-b2c)的熔解曲线进行对比，筛选符合条件的寡核苷酸LBP-n-0。对LBP-n-0进行双标记(荧光、淬灭基团)修饰，得到成功应用于LAMP可视化检测的LBP-n。利用设计的LBP-n，构建的虹鳟鱼成分MB-LAMP可视化检测方法，通过颜色反应进行精准判断。反应后不出现绿色荧光为阴性样品，仅当出现绿色荧光时才是检出虹鳟鱼(O.mykiss)，实现精确定性。
本发明提出设计MB的条件，有利于MB在LAMP中的进一步发展，建立的MB-LAMP可视化虹鳟鱼成分检测技术耗时短、灵敏度高，具有广阔应用前景。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种用于可视化环介导等温扩增的分子信标，其特征在于：包括
未经标记的寡核苷酸茎环结构LBP-n-0、茎环结构与靶标互补产生的双链LBP-n-b1/-b2c。
2.一种根据权利要求1所述的用于可视化环介导等温扩增的分子信标的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：未经标记的寡核苷酸茎环结构模拟与双链Tm值的模拟；
S2：将茎环结构、LAMP缓冲溶液、核酸染料混合得到混合体系1，将茎环结构与靶标互补的双链、LAMP缓冲溶液、SYTO9混合得到混合体系2；
S3：将配制的混合体系1、混合体系2置于实时荧光检测仪，并将反应温度设置为35℃～97℃，每摄氏度收集10次荧光信号，得茎环结构、茎环结构与靶标互补的双链熔解曲线；
S4：选择茎环结构与靶标互补的双链熔解曲线产生的荧光信号高于茎环结构的寡核苷酸，进行荧光与淬灭基团修饰，得到分子信标。
3.一种根据权利要求1-2任一所述的用于可视化环介导等温扩增的分子信标在检测虹鳟鱼的应用，其特征在于：包括
将分子信标与环介导等温扩增反应试剂、引物组混合得到混合试剂；
将配制的混合试剂置于恒温加热装置中，并将反应温度设置为63℃，时间为25min，得到在蓝光下出现荧光的混合体系；
反应结束后，根据体系在蓝光下出现的荧光颜色判断是否检出虹鳟鱼。
4.根据权利要求3所述的一种用于可视化环介导等温扩增的分子信标的应用，其特征在于：所述引物组为虹鳟鱼引物。
5.根据权利要求4所述的种用于可视化环介导等温扩增的分子信标的应用，其特征在于：所述环介导等温扩增反应试剂包括引物组5.2μL、分子信标0.8μL、BstDNAPolymeraseLargeFragment8.0U、dNTP0.9μL、10×ThermoPolBuffer2.5μL、模板DNA1.0μL和用去离子水补足20μL。
6.根据权利要求5所述的种用于可视化环介导等温扩增的分子信标的应用，其特征在于：反应设置两个阴性平行对照，所述阴性平行对照采用灭菌去离子水代替DNA加入反应体系中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310769120.7A CN116926164A (zh) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | 用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310769120.7A CN116926164A (zh) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | 用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116926164A true CN116926164A (zh) | 2023-10-24 |
Family
ID=88381869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310769120.7A Pending CN116926164A (zh) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | 用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116926164A (zh) |
-
2023
- 2023-06-28 CN CN202310769120.7A patent/CN116926164A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6571895B1 (ja) | 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法 | |
| CN101952461B (zh) | 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒 | |
| CN110699426B (zh) | 基因目标区域富集方法及试剂盒 | |
| CN105934523A (zh) | 核酸的多重检测 | |
| CN105803074B (zh) | 一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针 | |
| CN104726549B (zh) | 一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法 | |
| CN105358709A (zh) | 用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法 | |
| US20150087556A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING cDNA LIBRARIES FROM SMALL RNAs | |
| CN111270011B (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒 | |
| CN114250276B (zh) | 基于指数扩增反应和Argonaute核酸酶的microRNA检测体系及方法 | |
| CN108300804B (zh) | 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法 | |
| CN114134208B (zh) | 荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法 | |
| CN107406891A (zh) | Pcr方法 | |
| CN116926164A (zh) | 用于可视化环介导等温扩增的分子信标、制备方法及应用 | |
| US20210371941A1 (en) | Systems and methods for detection of low-copy number nucleic acids | |
| CN110603328B (zh) | 定量pcr扩增引物对及其应用 | |
| CN111534634A (zh) | 一种ⅱ型犬腺病毒的可视化等温扩增检测试剂及其应用 | |
| CN110577986A (zh) | Dna甲基化检测探针 | |
| CN110577985A (zh) | Dna甲基化的检测方法 | |
| CN112195221B (zh) | 一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量pcr仪及其检测方法 | |
| CN115058493B (zh) | 一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用 | |
| CN118028433A (zh) | 核酸序列特异性的靶标切割等温指数扩增方法 | |
| CN117802207A (zh) | 一种基于自淬灭探针lamp的可视化检测体系及其方法 | |
| CN114250275A (zh) | 一种荧光定量pcr反应系统、pcr反应试剂盒及核酸定量检测方法 | |
| WO2024015999A1 (en) | Methods, systems and compositions for detection of multiple analytes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |