CN104789704A - 一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻srbsdv品种抗性的方法 - Google Patents

一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻srbsdv品种抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，该方法步骤如下：1）选择鉴定标尺；2）低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘；3）胚芽鞘接种带毒白背飞虱后暗培养；4）荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）；5）绘制SRBSDV增殖指数趋势线；6）根据SRBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对南方水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级。本发明通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度对水稻SRBSDV种质抗性进行快速评价，能够在水稻萌芽期从分子水平上确定水稻品种对SRBSDV的抗性水平和抗性等级，鉴定周期短且可靠性高，具有较大的育种应用价值。

Description

一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法
技术领域
本发明涉及农业科学技术领域，具体地说是一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法。
背景技术
水稻是被子植物门单子叶植物纲莎草目禾本科稻属植物。水稻是最主要的三大粮食作物之一，播种面积占粮食播种面积的1/5，年产量约4.8亿吨，占世界粮食总产量的1/4，全世界二分之一以上的人口以水稻为主食，同时也是我国最主要的栽培作物之一。水稻原产亚洲热带，是世界主要粮食作物之一。我国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。栽培历史已有6000-7000年。为重要粮食作物；除食用颖果外，可制淀粉、酿酒、制醋，米糠可制糖、榨油、提取糠醛，供工业及医药用；稻秆为良好饲料及造纸原料和编织材料，谷芽和稻根可供药用，在粮食产业安全、加工制造生产中具有重要地位。
南方水稻黑条矮缩病是在2001年首次在我国广东省阳西县由周国辉等发现、鉴定和命名。病害名称中的“黑条矮缩” 表示病害的典型症状，即病株矮缩和茎秆表面有黑色条状排列的小瘤突。“南方” 代表该病害首次发现于华南地区，且主要发生于南方稻区。其田间症状类似于水稻黑条矮缩病，而后者主要发生于气温较低的小麦-水稻种植区。感染该病的水稻植株矮缩，不抽穗或抽穗困难，籽粒少且不饱满，对产量造成严重损失。南方水稻黑条矮缩病毒是由南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的，SRBSDV是呼肠孤病毒科斐济病毒属的一个种，与水稻黑条矮缩病毒同属不同种。由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病主要由白背飞虱以持久性方式传播，自然寄主包括玉米、水稻和小麦等禾本科作物，而由南方水稻黑条矮缩病毒引起的南方水稻黑条矮缩病主要由白背飞虱带毒传播，是近年来造成越南北部和我国南方省区水稻矮缩病的主要病原。
近年来，南方水稻黑条矮缩病在国内的海南、两广、湖南、江西、江浙以及国外的越南等地暴发成灾，据不完全统计，2009年受害面积超过30万hm，约6500hm水稻失收。2011年，农业部成立了南方水稻黑条矮缩病联防联控协作组和专家指导组。加强了对病害的防控力度，发病面积控制在24.67万hm左右。2012年病害有所回升，发病面积约40万hm。该病在我国广东、广西、海南、湖南、湖北、江西、云南和贵州等省( 自治区) 中稻及晚稻受害最为严重，常见颗粒无收的重病田块。南方水稻黑条矮缩病的大暴发给我国南方水稻的生产带来严重的危害，挫折了农民生产积极性，给国家粮食安全带来极大的挑战。
作为一种病毒病，目前市场上缺少可有效防治该病的药剂，南方水稻黑条矮缩病的防控主要采用“治虫防病”的措施，通常是早期采用杀虫剂杀灭稻飞虱以阻断传毒环节。但是，白背飞虱迁入批次多，虫源地不明，迁入时问难以把握，而且该虫的传毒特性还不十分清楚。基础研究的缺失使得对SRBSDV测报困难、防控盲目性大、可用措施不多、长期防控效果不佳。
筛选抗病资源应用于抗病育种生产是最为直接有效的方法，筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础。但迄今SRBSDV抗性QTL检测和遗传效应分析还处于起步阶段，在生产上也没有发现对SRBSDV免疫的品种，所以对SRBSDV抗性种质进行大规模筛选和展开SRBSDV抗性遗传特性研究显得尤为迫切。
目前水稻育种上筛选抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系均采用田间自然发病鉴定，即将各鉴定品种或品系以小区形式种植于大田，每个小区几十株左右，大田常规栽培管理，传毒介体白背飞虱自然传毒，待水稻显现病症后调查各鉴定品种（家系）小区的穴发病率，以此为标准鉴别水稻品种（家系）抗感能力的差异。自然鉴定法是长久以来应用的方法，但因其受到自然条件的制约，不同年份、不同地点的鉴定结果差异较大，且自然鉴定法无法有效控制诸如白背飞虱带毒率、接虫量、接种时间等的一致性，因而使得鉴定结果不准确。
为排除田间自然环境的多变性和传毒介体的不可控性对抗病鉴定的影响，对水稻进行人工定量接种带毒介体成为一种必然。人工接种鉴定法是在借鉴自然鉴定法基础上建立起来的接种鉴定方法，即在室内条件下以定量带毒白背飞虱在水稻特定生育期接种待测水稻一定时间，培养待测水稻显症后，根据病害发生的严重度评价待测水稻对SRBSDV的抗性水平。室内人工饲养白背飞虱和人工接种SRBSDV的方法能够保证鉴定使用的白背飞虱带毒率和接虫数量的稳定性，能够保证鉴定结果重复性好、可信度高。目前室内鉴定均采用苗期接虫，待植株分蘖盛期显症后通过调查品种的发病率来确定该种质的抗病能力。然而，由于水稻对SRBSDV获毒至显症的时间间距非常长，水稻获毒之后需要经历近两个月的潜伏期，这给水稻种质资源的抗性调查和理论研究带来很大的不变。因此，迫切需要发展一种针对水稻种质资源和试验材料能够快速、准确地进行SRBSDV抗性评价的新技术。
我们研究证明对水稻植株接种SRBSDV，不管是抗病还是感病水稻植株体内，均检测到SRBSDV病毒，另外水稻植株苗期感染SRBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病性，需要等到分蘖盛期才能确定其抗病性。令人振奋的是，我们新近研究发现水稻低氧萌发所产生的胚芽鞘接种SRBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的SRBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直接相关。胚芽鞘是水稻胚芽外的锥形套状物，是一个鞘状结构，胚芽鞘本来是植物叶片的保护组织，有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。通常水稻植株感染SRBSDV病毒都是在水稻秧苗期通过灰飞虱传毒的，而种子萌发产生胚芽鞘的传毒研究被忽略，我们研究发现胚芽鞘接种SRBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的SRBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直接相关，我们的研究发现给SRBSDV的抗性鉴定提供了新思路。
本发明通过胚芽鞘培养前期激素的低氧诱导和胚芽鞘培养后期激素的抑制培养来拓展胚芽鞘的生长时间，而在此时间内通过荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后胚芽鞘内的SRBSDV含量进行检测，通过制作SRBSDV增殖趋势图实现了接毒后胚芽鞘内SRBSDV病毒增殖速度快速而准确地测量，进而快速鉴定水稻品种SRBSDV的抗性水平和抗性等级。
利用本方法评价水稻品种对SRBSDV的抗性水平，可以克服传统生物学检测方法工作量大、耗时长、准确性低而且受季节性限制的难题，大大缩短了鉴定周期，并且大大提高了鉴定准确度。这一鉴定方法除了可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域。
发明内容
本发明的目的是针对现有SRBSDV品种抗性室内鉴定周期长、准确度低等缺点，提供一种鉴定周期短、准确度高的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对南方水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺；
2）低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接种带毒白背飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒白背飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h，将传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
4）荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）：按照周期时间点采集待测水稻和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3重复，-70℃保存，提取RNA并纯化，取1μL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物SRBSDV-F：5’-GAGACCCACCTCCACTGATT-3’和SRBSDV-R：5’-ACGTTTACCACTGCGCCTTC-3’按照荧光定量PCR扩增程序扩增SRBSDV病毒S9片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）；
5）绘制SRBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得SRBSDV增殖指数趋势线y=Aekx；
6）根据SRBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对南方水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级：根据每个品种SRBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对SRBSDV抗性低，待测品种k值小于等于高抗标尺的为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种k值大于感病标尺的为超感品种。
所述步骤1）和6）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为7%-9%；中抗鉴定标尺排名为18%-22%；感病鉴定标尺排名为47%-53%。
所述步骤2）中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1.5-2.5μmol/L；所述的低氧诱导方法为种子置于液面下5-10cm处培养。
所述步骤3）中的带毒白背飞虱的获取步骤为：
3.1）SRBSDV毒源获取：从南方水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为南方水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
3.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化白背飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；
3.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出南方水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄期白背飞虱若虫转入保鲜盒内的SRBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将白背飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过循回期即为带毒白背飞虱。
所述步骤3）中的适宜浓度的ABA溶液浓度控制为40-60μmol/L；所述的定量接种带毒白背飞虱控制为4-6虫/个胚芽鞘。
所述步骤4）中的周期取样时间点为SRBSDV传毒后4-10天内每隔1.5-2.0天均匀分布的3-4个时间点；特定位置的胚芽鞘为胚芽鞘长度的正中间部位。
所述步骤4）中的提取RNA的方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中。
所述步骤4）中的纯化RNA的方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。
所述步骤4）中的荧光定量反应体系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10μM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。
所述步骤3.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为23-28天。
附图说明
图1为对实施例所选择的鉴定标尺胚芽鞘传毒后周期取材点取材检测SRBSDV浓度变化所获得SRBSDV增殖指数趋势图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种南方水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对南方水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺，其中，高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为7%-9%，中抗鉴定标尺排名为18%-22%，感病鉴定标尺排名为47%-53%；
2）低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下1.5-2.5μmol/L的IAA溶液液面下5-10cm处低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接种带毒白背飞虱后暗培养：
3.1）SRBSDV毒源获取：从南方水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为南方水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
3.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化白背飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；
3.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出南方水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄期白背飞虱若虫转入保鲜盒内的SRBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将白背飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过23-28天的循回期后即为带毒白背飞虱；
3.4）胚芽鞘接种带毒白背飞虱：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，按照4-6虫/个胚芽鞘的比例定量接种带毒白背飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；
3.5）胚芽鞘接毒后暗培养：将胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了40-60μmol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
4）荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）：白背飞虱传毒结束后4-10天内在每隔1.5-2.0天均匀分布的3-4个时间点采集待测水稻和鉴定标尺胚芽鞘长度的正中间部位40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3重复，-70℃保存，提取RNA并纯化，（RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。）取1μL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物SRBSDV-F：5’-GAGACCCACCTCCACTGATT-3’和SRBSDV-R：5’-ACGTTTACCACTGCGCCTTC-3’按照荧光定量PCR扩增程序扩增SRBSDV病毒S9片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；
5）绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx；
6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对南方水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级：
6.1）待测品种抗性水平评价：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；
6.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种，待测品种k值大于感病标尺为超感品种。
实施例
2015年，利用该发明的鉴定方法对征集得到的部分水稻品种资源进行了SRBSDV抗性鉴定。分别设置顺优109、IR24、丰两优4号三个水稻品种做为高抗、中抗、感病鉴定标尺，其中，顺优109在2013-2014年室内接毒鉴定中抗病表现在138个水稻品种资源群体中排名第11，IR24排名28，丰两优4号排名69。胚芽鞘采集时间点设置为接毒完成后第4天、第6天、第8天、第10天四个时间点，每个品种每个时间点取材3重复。
实时荧光定量PCR获得每个品种周期取样时间点的RQ值，如表一所示：
  
然后绘制SRBSDV增殖指数趋势线：以RQ值均值为纵坐标，饲毒后取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得SRBSDV增殖指数趋势线，如附图所示。
根据SRBSDV增殖指数趋势图中各品种趋势线公式的k值评价待测水稻品种的南方水稻黑条矮缩病抗性水平和抗性等级。在本实验中，高抗标尺顺优109的k值计算为0.5459；中抗标尺IR24的k值计算为0.8998；感病标尺丰两优4号k值计算为1.555，如附图所示。待测品种分别与鉴定标尺k值相比较获得相应的抗性等级，我们对以下12个水稻品种采用本发明的鉴定方法鉴定种质SRBSDV抗性，结果如下：
 
通过将表二的鉴定结果与田间多年多点南方水稻黑条矮缩病发病结果的比较，我们发现该鉴定结果与大田发病结果非常吻合，而且本发明通过胚芽鞘饲毒后检测胚芽鞘内SRBSDV增殖速度在水稻种子萌发时期就能对种质SRBSDV抗性进行准确的检测，从而大大缩短了鉴定时间。
通过实施例可以发现，本发明的鉴定新方法与以往鉴定方法相比，能够在水稻萌发期检测种质SRBSDV抗性水平，从而大大缩短了鉴定周期；与利用发病病症进行抗性鉴定相比，通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度从分子水平上确定水稻种质对SRBSDV抗性水平和抗性等级，可靠性更高，因而本发明具有较大的育种应用价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对南方水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺；
2）低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接种带毒白背飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒白背飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h，将传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
4）荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）：按照周期时间点采集待测水稻和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3重复，-70℃保存，提取RNA并纯化，取1μL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物SRBSDV-F：5’-GAGACCCACCTCCACTGATT-3’和SRBSDV-R：5’-ACGTTTACCACTGCGCCTTC-3’按照荧光定量PCR扩增程序扩增SRBSDV病毒S9片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）；
5）绘制SRBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得SRBSDV增殖指数趋势线y=Aekx；
6）根据SRBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对南方水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级：根据每个品种SRBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对SRBSDV抗性低，待测品种k值小于等于高抗标尺的为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种k值大于感病标尺的为超感品种。
2.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤1）和6）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为7%-9%；中抗鉴定标尺排名为18%-22%；感病鉴定标尺排名为47%-53%。
3.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤2）中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1.5-2.5μmol/L；所述的低氧诱导方法为种子置于液面下5-10cm处培养。
4.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤3）中的带毒白背飞虱的获取步骤为：
3.1）SRBSDV毒源获取：从南方水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为南方水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
3.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化白背飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；
3.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出南方水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄期白背飞虱若虫转入保鲜盒内的SRBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将白背飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过循回期即为带毒白背飞虱。
5.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤3）中的适宜浓度的ABA溶液浓度控制为40-60μmol/L；所述的定量接种带毒白背飞虱控制为4-6虫/个胚芽鞘。
6.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤4）中的周期取样时间点为SRBSDV传毒后4-10天内每隔1.5-2.0天均匀分布的3-4个时间点；特定位置的胚芽鞘为胚芽鞘长度的正中间部位。
7.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤4）中的提取RNA的方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中。
8.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤4）中的纯化RNA的方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。
9.根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤4）中的荧光定量反应体系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10μM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。
10.根据权利要求4所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征在于：所述步骤3.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为23-28天。
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