CN104830998B - 一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法 - Google Patents

一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，该鉴定方法步骤如下：1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺；2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘；3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的RQ值；4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价。本发明能够在水稻萌芽期在分子水平上准确地鉴定水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级，鉴定周期短且准确度高，具有较大的育种应用价值。

Description

一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法
技术领域
本发明属于生物和现在农业高新技术领域，涉及一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，具体地说，涉及一种鉴定周期短、准确度高的水稻黑条矮缩病品种抗性的分子鉴定方法。
背景技术
水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）引起的水稻黑条矮缩病是一种由灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）传播的虫媒病毒病害，广泛分布于中国、朝鲜、韩国和日本等东亚地区。水稻黑条矮缩病症状主要表现为植株矮缩，叶色浓绿，分蘖增加，叶片短缩、僵硬，叶片背面、叶鞘以及茎秆表面有蜡白色脉肿出现，发病后期变为沿叶脉纵向黑褐色的瘤状突起，穗小或不抽穗以及结实不良等症状，不同的品种、不同的部位及生育期发病的症状也会有所不同。该病害1941年在日本有一次暴发，之后于20世纪60年代在中国、日本、韩国、朝鲜均成为流行病害，此后30年间一度销声匿迹，20世纪90年代后期水稻黑条矮缩病在江浙沪以及安徽福建北部在内的长江中下游稻区暴发流行，造成了巨大的经济损失。
水稻黑条矮缩病主要以灰飞虱为传毒媒介进行持久性传播，介体飞虱一旦染毒，终身带毒，并能连续传毒，但不经卵传毒。病毒主要在大麦、小麦病株上越冬，有部分也在灰飞虱体内越冬。田间病毒通过麦、早稻、晚稻的途径完成侵染循环。第一代灰飞虱在病麦上接毒后传到早稻、单季稻、晚稻和青玉米上传毒。稻田中繁殖的2、3代灰飞虱，在水稻病株上吸毒后，迁入晚稻和秋玉米上传毒，晚稻上繁殖的灰飞虱成虫和越冬代若虫又进行传毒，传给大麦、小麦。灰飞虱在病毒寄主上吸汁获毒，最短获毒时间30分钟，1-2天即可充分获毒，病毒在灰飞虱体内循回期为8-35天，接毒时间仅1分钟，获毒最低温度在8℃以下，4～5℃介体不能传毒。
近年来，随着耕作制度和栽培方式的变化、农田生态多样、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、湖南等省大规模发生，迅速成为华东稻区最主要的水稻病害之一，造成了粮食减产、农民减收，给水稻生产造成严重损失，同时也严重挫伤了农民的种粮积极性，也对全国的粮食安全构成了极大的威胁。
与大部分植物病毒病流行一样，水稻黑条矮缩病的流行同样需要其流行生态系统中病毒-介体-寄主-环境4大基本因子的完美结合。现今对该病害的突发成灾原因还未有详细的研究，对灰飞虱种群数量以及带毒率波动、暖冬、品种、栽培模式等条件如何对病害流行起作用和为什么起作用还有待进一步研究。利用水稻品种本身抗病性是防治水稻黑条矮缩病的有效手段，由于现在缺乏高抗品种，挖掘、筛选较好抗病性的种质资源对该病害的控制有着重要的意义。
目前水稻黑条矮缩病的品种抗性鉴定主要有田间自然鉴定法和室内人工接种鉴定法。田间自然发病鉴定将待鉴定水稻以小区种植于大田，传毒介体灰飞虱自然传毒，待水稻显现病症后调查各鉴定水稻小区的穴发病率来鉴别水稻的抗性水平。田间自然鉴定法无法排除排趋性的干扰，可能带来假抗病表现。室内人工接种鉴定是在人工控制条件下定量接种带毒灰飞虱一定时间，培养待测水稻至发病显症后，根据病害发生的严重度来评价待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平，该方法可以克服自然鉴定法中排趋性的干扰，实现了科学准确的水稻抗病的评价，然而该方法用于品种抗性鉴定需要大量的传毒介体灰飞虱，人工筛选无毒灰飞虱人工饲养规模量小，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制了该方法的推广应用。同时，无论是田间自然鉴定法和室内人工接种鉴定法，均需要培养至水稻分蘖盛期显症后通过调查发病率来评价品种抗性水平，鉴定周期很长，为保证准确度需要大量的实验处理，费时又费力。
当前检验鉴定植物病毒的技术飞速发展，除了传统的生物学方法、血清学方法、电子显微镜法、芯片检测法，新兴起的分子生物学方法给植物病毒的鉴定提供了新思路。目前主要应用的定性检测分子生物学方法包括病毒核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术和多聚酶链式反应（PCR）技术，定量检测主要是指实时荧光定量PCR技术。此种方法灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作过程也比较简便、可用于大量样品检测。荧光定量PCR在植物病毒检测与鉴定方面，能够定量检测病毒拷贝数。应用荧光定量PCR检测未知样本时，相比其他定量方法和普通PCR方法特异性更强、准确性高、灵敏度高、线性关系广、操作简单安全，样品的污染较底，且不需要后期处理。
我们研究证明对水稻植株接种RBSDV，不管是抗病还是感病水稻植株体内，均检测到RBSDV病毒，另外水稻植株苗期感染RBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病性，需要等到分蘖盛期才能确定其抗病性。令人振奋的是，我们新近研究发现水稻低氧萌发所产生的胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直接相关。胚芽鞘是水稻胚芽外的锥形套状物，是一个鞘状结构，胚芽鞘本来是植物叶片的保护组织，有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。通常水稻植株感染RBSDV病毒都是在水稻秧苗期通过灰飞虱传毒的，而种子萌发产生胚芽鞘的传毒研究被忽略，我们研究发现胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直接相关，我们的研究发现给水稻黑条矮缩病抗病性的鉴定提供了新思路。
本发明通过胚芽鞘培养前期激素的低氧诱导和胚芽鞘培养后期激素的抑制培养来拓展胚芽鞘的生长时间，而在此时间内通过荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后胚芽鞘内的RBSDV含量进行检测，通过制作RBSDV增殖趋势图实现了接毒后胚芽鞘内RBSDV病毒增殖速度快速而准确地测量，进而通过比较待鉴定水稻和鉴定标尺胚芽鞘内病毒粒子增殖速度差异快速鉴定水稻品种对黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级。这一鉴定方法除了可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域。
发明内容
本发明的目的是针对现有的水稻黑条矮缩病品种抗性鉴定方法存在有鉴定周期长、准确度低等缺点，提供了一种鉴定周期短、准确度高的水稻黑条矮缩病品种抗性的分子鉴定方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺：大田采集灰飞虱高龄若虫并纯化筛选，传代保存，鉴定前采用RBSDV毒源饲毒1.5-2.5龄期灰飞虱若虫，获得带毒灰飞虱；根据人工接毒鉴定中不同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺；
2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧浸种培养3天，诱导出胚芽鞘；将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的相对表达量，即RQ值：按照周期时间点取材上一步骤的胚芽鞘的特定部位，取材2-3重复，提取并纯化病毒RNA，荧光定量PCR扩增RBSDV病毒S9片段，.扩增完毕，进入结果分析界面，以OsUBQ5为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S9与内参基因的RQ值；
4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价：用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，然后以RQ值均值为纵坐标，周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx，然后根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级。
所述步骤1）中的带毒灰飞虱的获取步骤为：
1.1）RBSDV毒源获取：从水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
1.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；
1.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄期灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱。
所述步骤1）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为9%-11%；中抗鉴定标尺排名为23%-27%；感病鉴定标尺排名为47%-53%。
所述步骤2）中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1.5-2.5μmol/L；所述的低氧浸种方法为种子置于液面下5-10cm处培养；所述的适宜浓度的ABA溶液浓度为40-60μmol/L。
所述步骤2）中的定量接种带毒灰飞虱为5-8虫/个胚芽鞘的比例。
所述步骤3）和步骤4）中的周期取样时间点为RBSDV传毒后4-10天内每隔1.5-2.0天均匀分布的3-4个时间点；所述步骤3）中的胚芽鞘的特定部位为胚芽鞘长度的正中间部位。
所述步骤3）中的RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；所述的RNA纯化方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase Icocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。
所述步骤3）中的荧光定量PCR所采用的引物为RBSDV病毒S9片段引物：RBSDV-F：5’-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3’和RBSDV-R：5’- GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3’；荧光定量反应体系：每20μL中含10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10µM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环，95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。
所述步骤4）中的根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级的划分方法为：
4.1）待测品种抗性水平划分：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；
4.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种；待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种；待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种；待测品种k值大于感病标尺为超感品种。
所述步骤1.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为22-28天。
附图说明
附图为对实施例所选择的鉴定标尺胚芽鞘传毒后周期取材点取材检测RBSDV浓度变化所获得RBSDV增殖指数趋势图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明。
一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺：大田采集灰飞虱高龄若虫并纯化筛选并传代保存，鉴定前采用RBSDV毒源饲毒1.5-2.5龄期灰飞虱若虫，获得带毒灰飞虱；根据人工接毒鉴定中不同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺，具体的操作步骤如下：
1.1）RBSDV毒源获取：从水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
1.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；
1.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄期灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过22-28天的循回期即为带毒灰飞虱；
1.4）鉴定标尺的选择：根据人工接毒鉴定中不同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺，其中，高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为9%-11%；中抗鉴定标尺排名为23%-27%；感病鉴定标尺排名为47%-53%；
2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下浓度为1.5-2.5μmol/L的IAA溶液液面下5-10cm处浸种培养3天，诱导出胚芽鞘；然后将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，按照5-8虫/个胚芽鞘的比例定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了浓度为40-60μmol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的RQ值：RBSDV传毒后4-10天内每隔1.5-2.0天选择均匀分布的3-4个时间点取材上一步骤的胚芽鞘长度的正中间部位，提取和纯化病毒RNA，（RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA WashBuffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNAPrewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNAWash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。）采用RBSDV病毒S9片段引物：RBSDV-F：5’-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3’和RBSDV-R：5’-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3’进行荧光定量PCR（荧光定量反应体系：每20μL中含10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10µM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环，95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。）扩增RBSDV病毒S9片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以OsUBQ5 为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）；
4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价：用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，然后以RQ值均值为纵坐标，饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx，然后根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级，具体评价方法如下：
4.1）待测品种抗性水平划分：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；
4.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种；待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种；待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种；待测品种k值大于感病标尺为超感品种。
实施例
2015年，利用该发明的鉴定方法对征集得到的部分水稻品种资源进行了黑条矮缩病抗性鉴定，具体步骤如下：
1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺：大田采集灰飞虱高龄若虫并纯化筛选并传代保存，鉴定前采用RBSDV毒源饲毒2龄期灰飞虱若虫，获得带毒灰飞虱；根据人工接毒鉴定中不同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，具体的操作步骤如下：
1.1）RBSDV毒源获取：从水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
1.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用武育粳3号幼苗饲养并传代；
1.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的2龄期灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过25天的循回期获得带毒灰飞虱；
1.4）鉴定标尺的选择：根据室内接毒鉴定中抗病表现设置水稻黑条矮缩病鉴定标尺，分别设置镇稻88、淮糯12、秀水04三个水稻品种做为高抗、中抗、感病鉴定标尺，其中，镇稻88在2012-2014年室内接毒鉴定中抗病表现在152个淮北稻区水稻品种资源群体中排名12，淮糯12排名30，秀水04排名76；
2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘：每个品种取18粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下浓度为2.0μmol/L的IAA溶液液面下8cm处浸种培养3天，诱导出胚芽鞘；然后将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，按照6虫/个胚芽鞘的比例定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了浓度为50μmol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的RQ值：RBSDV传毒后第4、6、8、10天取材上一步骤的胚芽鞘长度的正中间部位约50g，提取和纯化病毒RNA（RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中）；
然后采用RBSDV病毒S9片段引物：RBSDV-F：5’-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3’和RBSDV-R：5’- GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3’进行荧光定量PCR（荧光定量反应体系：每20μL中含10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10µM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环，95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s）扩增RBSDV病毒S9片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以OsUBQ5 为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）；
4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价：用3重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，鉴定标尺的RQ均值统计如表一；然后以RQ值均值为纵坐标，饲毒后取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx，如附图；然后根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级，具体评价方法如下：
4.1）待测品种抗性水平划分：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；
4.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种；待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种；待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种；待测品种k值大于感病标尺为超感品种。
在本实验中，高抗标尺镇稻88的k值计算为0.6097；中抗标尺淮糯12的k值计算为1.4207；感病标尺秀水04的k值计算为2.0088，如附图所示。待测品种的k值与鉴定标尺比较获得相应的抗性等级，我们对以下10个水稻品种采用本发明的鉴定方法鉴定种质黑条矮缩病抗性，结果如表二。
通过将表二的鉴定结果与田间多年多点黑条矮缩病发病结果的比较，我们发现该鉴定结果与大田发病结果非常吻合，而且本发明在种子萌发后对胚芽鞘检测就能对种质黑条矮缩病抗性进行准确的评价，从而大大缩短了鉴定时间。
通过实施例可以发现，本发明的鉴定新方法与现有鉴定方法相比，能够在水稻萌发后胚芽鞘时期就能确定其抗性水平，大大缩短了鉴定周期；与利用发病病症确定抗感性的方法相比，通过调查接种后胚芽鞘内病毒增殖速度从分子水平上确定水稻种质对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级，可靠性更高，因而本发明具有较大的育种应用价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (1)

1.一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺：大田采集灰飞虱高龄若虫并纯化筛选，传代保存，鉴定前采用RBSDV毒源饲毒1.5-2.5龄期灰飞虱若虫，获得带毒灰飞虱；根据人工接毒鉴定中不同水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺；
2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧浸种培养3天，诱导出胚芽鞘；将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的相对表达量，即RQ值：按照周期时间点取材上一步骤的胚芽鞘的特定部位，取材2-3重复，提取并纯化病毒RNA，荧光定量PCR扩增RBSDV病毒S9片段，.扩增完毕，进入结果分析界面，以OsUBQ5为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S9与内参基因的RQ值；
4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价：用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，然后以RQ值均值为纵坐标，周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx，然后根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级；
所述步骤1）中的带毒灰飞虱的获取步骤为：
1.1）RBSDV毒源获取：从水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70℃保存；
1.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；
1.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出水稻黑条矮缩病病株，常温放置3-5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄期灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱；
所述步骤1）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为9%-11%；中抗鉴定标尺排名为23%-27%；感病鉴定标尺排名为47%-53%；
所述步骤2）中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1.5-2.5μmol/L；所述的低氧浸种方法为种子置于液面下5-10cm处培养；所述的适宜浓度的ABA溶液浓度为40-60μmol/L；
所述步骤2）中的定量接种带毒灰飞虱为5-8虫/个胚芽鞘的比例；
所述步骤3）和步骤4）中的周期取样时间点为RBSDV传毒后4-10天内每隔1.5-2.0天均匀分布的3-4个时间点；所述步骤3）中的胚芽鞘的特定部位为胚芽鞘长度的正中间部位；
所述步骤3）中的RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；所述的RNA纯化方法为：a）直接添加一体积95%-100%酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤，吸附柱置于收集管中，然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase Icocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中；
所述步骤3）中的荧光定量PCR所采用的引物为RBSDV病毒S9片段引物：RBSDV-F：5’-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3’和RBSDV-R：5’- GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3’；荧光定量反应体系：每20μL中含10μL的2×qPCR master mix、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10µM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环，95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s；
所述步骤4）中的根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级的划分方法为：
4.1）待测品种抗性水平划分：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；
4.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种；待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种；待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种；待测品种k值大于感病标尺为超感品种；
所述步骤1.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为22-28天。
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