JP2021506332A - サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法 - Google Patents
サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
1、材料:
1.1 試験用サツマイモの種芋:本発明で使用される種芋は、前年の異なる植栽地で収穫され、穴蔵に保存された種芋である。品種は商薯19(S19)であり、異なる区画から収穫された175個の種芋を無作為に選択し、番号を付けた後、メスでサツマイモの塊根の中央部の皮とそれにつながるイモの肉の部分を掘り出し、液体窒素で粉砕し、核酸(DNA、RNA)抽出用として、−70℃の超低温冷蔵庫に保存しておく。
NCBI GenBankにおけるSPFMV、SPVC、SPVG、SPLV、SPV2、CMV、SPCSV、及びSweepovirusesゲノム配列により、DNAMANソフトウェアを用いて配列を比較し、上述のウイルスの検出用の特異的なプライマー(表1)を設計し、プライマーは、Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.により合成されるものである。
Plant Total RNA Purification Kit(Genemark、Taiwan)で全RNAを抽出し、EZ−10 Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit(Sangon Biotech Co., Ltd.、中国上海)で全DNAを抽出する。テンプレートとして、RNAサンプル800ngを取り、RevertAid Reverse Transcriptase Kit(Thermo Scientific、USA)を用いて逆転写し、cDNAの第一鎖を合成し、上記の具体的な作業はいずれも対応するキットの説明書を参照して行う。合成されたcDNAと抽出された全DNAをそれぞれテンプレートとし、Ex Taq DNAポリメラーゼ(Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd、中国大連)を用いてPCR増幅する。反応系において、2×Premix Ex Taq10.0μL、5pmol/Lのフォワードプライマーとリバースプライマー各2.0μL、100〜400ng/μLの全DNA(又はcDNA)テンプレート1.5μL、RNaseフリー水で20.0μLとなるまでに補充する。増幅プログラムにおいて、95℃で5min初期変性させる;95℃で30s変性させ、53〜57℃で30sアニーリングさせ、72℃で50s伸長させるサイクルが35回行われる;72℃で7min伸長させる。増幅産物は1%のアガロースゲル電気泳動で検出され、AlphaImager Mini(ProteinSimple、USA)ゲルイメージャーで観察され、検出結果を記録する。
PCR増幅産物を、Cycle−Pure Kit(Omega Bio−tek、USA)により精製・回収した後、Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.に委託して直接にシークエンシングする。シークエンシングして得られた配列を、DNAMANとBLASTオンラインソフトウェアにより、ソートして分析する。結果から、本発明で得られる各ウイルスの核酸断片の配列と、対応するウイルスの配列との同一性がいずれも98%以上であることが示され、設計した検出用プライマーはいずれも特異的なプライマーであると言える。
0級:植物が正常であり、葉がいずれの症状もない;
1級:植物の一部の葉がやや縮んでしまい、或いは軽度のモザイク病にかかっている;
3級:植物の全部又は大部分の葉が縮んで、黄変やモザイク病にかかっており、新葉の葉脈透化症状が顕著で、植物が軽度に矮小化する;
5級:植物全体の葉が小さくなり、軽度の奇形があり、葉が縮んで、葉脈透化が起こり、或いは黄変症状が伴って、植物が顕著に矮小化する;
7級:植物全体の葉が小さくなり、葉に顕著な奇形があり、やや革質なものになり、縮んで、葉脈透化が起こり、或いは黄変症状が伴って、植物が深刻に矮小化する;
9級:植物全体の葉が小さくなり、葉に深刻な奇形があり、革質なものになり、縮んで葉脈透化が深刻であり、カールした葉があり、植物が深刻に矮小化する。
(1)種芋が持っているウイルスは、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症を引き起こす可能性が高い。本発明では、175個の種芋についてウイルス検出を行った。それらの中で、153個の種芋はウイルスを持っているが、22個の種芋はウイルスが検出されなかった。種芋のウイルス保有率は87.4%(153/175)であり、153個のウイルス保有種芋を育苗した後に、122個の種芋の薯苗が発症したが、31個の種芋の薯苗は発症しなかった。従って、ウイルス保有種芋の薯苗のウイルス性疾患の発症確率が79.7%(122/153)であった。
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は、ウイルス性疾患の重症度を顕著に増大させる。例えば、本発明で検出された61個のSPCSVの感染とPotyvirusウイルスの感染との組み合わせにおいて、発症率は100%であり、かつ症状の重症度はいずれも中度(3級〜5級)又は重度(7級〜9級)であった。
材料:穴蔵に保存される2バッチの異なる地域(洛陽、許昌)由来の種芋から、ぞれぞれ、ウイルス検出用のサンプルとして一部のサツマイモの塊根を無作為に選択し、品種は商薯19(S19)である。第1バッチの種芋の総質量は約400kgであり、計15個のサツマイモの塊根(約7.5 kg)を選択し、サンプル量は総質量の約1.9%を占めている;第2バッチの種芋の総質量は約400 kgであり、計92個のサツマイモの塊根(約46 kg)を選択し、サンプル量は総質量の約11.5 %を占めている。ウイルスの種類の検出方法は実施例1の場合と同じである。
本発明の種芋の育苗期における症状の重症度の調査結果を表3に示す。
(1)第1バッチの種芋としては、計15個のサツマイモの塊根を無作為に選択し、ウイルス検出により、7個のサツマイモの塊根がウイルスを持っており、ウイルス保有率が46.7%(7/15)であった;SPCSVとPotyvirusとの混合ウイルスのウイルス保有率が6.7%(1/15)であった;実施例1の実験結果により、当該バッチの種芋のウイルス性疾患の発症率が37.2%(46.7%×0.797)であると予測される;中度(3級〜5級)又は重度(7級〜9級)の発症率が6.7%であると予測される。
Claims (9)
- サツマイモを育苗する前に、サツマイモの種芋サンプルを無作為に選択し、種芋サンプルの全DNAと全RNAを抽出し、PCRとRT−PCR法により、種芋が持っているウイルスの状況をそれぞれ検出し、種芋が持っているウイルスの種類と種芋のウイルス保有率により、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度を予測することを特徴とする、サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
- ウイルスは、SPFMV、SPVC、SPVG、SPLV、SPV2、CMV、SPCSV、及びSweepovirusesを含むことを特徴とする、請求項1に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
- サツマイモを育苗する前に、無作為に選択されるサツマイモの種芋の検出サンプルの重量比は8〜15%であることを特徴とする、請求項1に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
- PCRの反応系において、2×Premix Ex Taq 10.0μL、5 pmol/Lのフォワードプライマーとリバースプライマー各2.0μL、100〜400ng/μLのDNAテンプレート1.5μL、RNaseフリー水で20.0μLとなるまでに補充することを特徴とする、請求項1に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
- PCRの反応プログラムにおいて、95℃で5min初期変性させる;95℃で30s変性させ、53〜57℃で30sアニーリングさせ、72℃で50s伸長させるサイクルが35回行われる;72℃で7min伸長させることを特徴とする、請求項1に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
- サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率を予測する計算式は、
予測するウイルス性疾患の発症率(%)=検出された種芋サンプルのウイルス保有率 × ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率
であることを請求項1に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。 - ウイルス保有種芋のウイルス性疾患の発症確率が0.797であることを特徴とする、請求項7に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
- サツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の重症度はサツマイモの育苗期における中重症発症状況であり、
予測するウイルス性疾患の中重症発症率(%)=検出された種芋サンプルのSPCSVとPotyvirusとの混合ウイルスのウイルス保有率
であることを特徴とする、請求項1に記載のサツマイモの育苗期におけるウイルス性疾患の発症率と重症度の予測方法。
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