CN103834641B - 一种草菇菌株0229分子特异性检测标记及其检测方法 - Google Patents
一种草菇菌株0229分子特异性检测标记及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种草菇菌株0229分子特异性检测标记及其检测方法，其特征在于：所述特异性检测标记为特异性引物，其中引物序列为：F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。检测方法，包括：将草菇菌株接种PDA平板培养基，32℃培养5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，‑70℃冰箱保存，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA，得到DNA；将上述DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，进行电泳检测。本发明检测时间短，准确性高的优点，利用所获得的分子标记鉴别草菇菌株0229，有利于草菇育种工作的开展，加快草菇新品种的研发工作。
Description
技术领域
本发明属于草菇菌种检测标记及其检测领域，特别涉及一种草菇菌株0229分子特异性检测标记及其检测方法。
背景技术
草菇（Volvariella volvacea）栽培起源于中国，迄今已有300多年的栽培历史，在我国南方地区广泛栽培。草菇味道鲜美，不仅具有丰富的营养价值，而且还具有重要的医疗保健作用，深受广大消费者喜爱。草菇作为一种高温栽培食用菌，同其它食用菌相比，其显著的特点是生长速度极快，从播种到收获一般只需要2周的时间，其年产量在我国食用菌产业中一直位居前十位。
我国草菇栽培面积广，产量曾经在食用菌中排到第五位，但品种单一，检测主要栽培草菇菌株交配型基因的类型，发现现有的菌株多源于上世纪七十年代野生草菇分离菌株V23菌株，通过对其进行系统选育获得，遗传背景比较狭窄，但农艺性状有很大差别。面对这种情况，迫切需要加快草菇菌株鉴定技术的研究，开发更为有效的菌株鉴定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇菌株0229分子特异性检测标记及其检测方法，该发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有检测时间短，准确性高的优点。可以利用所获得的分子标记鉴别草菇菌株0229，有利于草菇育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作。
本发明的一种草菇菌株0229分子特异性检测标记，其特征在于：所述特异性检测标记为特异性引物，其中引物序列为：
F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；
R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
本发明的一种草菇菌株0229分子特异性检测方法，包括：
（1）将草菇菌株接种PDA平板培养基，32℃培养5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，-70℃保存，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA，得到DNA；
（2）将上述DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，进行电泳检测，其中特异性检测标记引物为F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
所述步骤（1）中改进的CTAB法提取基因组DNA的具体方法步骤为：将冷冻干燥的菌丝研磨成粉末，加入65℃预热2×CTAB抽提液，分装到2mL离心管中，65℃保温45min，间或轻摇混匀；4℃，12000rpm离心20min，取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻混匀，15min后4℃,12000rpm离心20min。取上清液移入新离心管中，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动，5min后4℃,8000rpm离心10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇（含10mmol/L NaAc）洗涤3次，每次4℃,8000rpm离心10min。最后用预冷的95%乙醇洗涤一次，轻轻上下颠倒，4℃，12000rpm离心20min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干，加入200μL双蒸水溶解DNA沉淀。DNA溶液加入1μL10mg/mL RNase，37℃水浴1h,去除RNA。最终的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
所述步骤（2）中PCR扩增体系为：总体积为25μL，其中10×PCR buffer II(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP各2.5mM、2uL，5U/μL ExTaq DNA酶（TaKaRa公司）0.25μL，10μmol/L特异性引物对各0.5μL，50ng/μL模板DNA0.5μL，ddH2O 18.75μL。
所述步骤（2）中PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃补平10min。
所述步骤（2）中电泳检测方法为：取PCR扩增产物20μL，与12μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5分钟，结束后置于冰水混合物中冷却3分钟，点样3μL与6%变性聚丙烯酰胺上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000V，电流200mA，功率200W，电泳45分钟，银染，显色，然后在凝胶成像仪上拍照。
所述草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之间扩增出2条特异条带。
原理：
根据草菇基因组信息设计SSR引物，对现有主要栽培草菇菌株DNA进行扩增。筛选获得针对草菇菌株0229特异条带的引物，建立以特定SSR引物为分子标记的快速鉴别草菇菌株0229分子生物学方法。采用特定引物对草菇菌株进行PCR扩增，草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之间扩增出2条特异条带，其它草菇菌株不能同时扩增出2条条带。
有益效果
本发明的检测方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有检测时间短，准确性高的优点；可以利用所获得的分子标记鉴别草菇菌株0229，有利于草菇育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作。
附图说明
图1为草菇菌株特异条带扩增图，其中M:Marker（50bp DNA ladder）；1:草菇菌株0229；2:草菇菌株泰国1号；3:草菇菌株泗联草菇；4.草菇菌株巨大草菇；5:草菇菌株V23；6:草菇菌株屏优。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
DNA提取：
将草菇菌株接种PDA平板培养基，32℃培养5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，-70℃冰箱保存，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA（方法简述如下：将冷冻干燥的菌丝研磨成粉末，加入65℃预热2×CTAB抽提液，分装到2mL离心管中，65℃保温45min，间或轻摇混匀；4℃，12000rpm离心20min，取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻混匀，15min后4℃,12000rpm离心20min。取上清液移入新离心管中，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动，5min后4℃,8000rpm离心10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇（含10mmol/LNaAc）洗涤3次，每次4℃,8000rpm离心10min。最后用预冷的95%乙醇洗涤一次，轻轻上下颠倒，4℃，12000rpm离心20min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干，加入200μL双蒸水溶解DNA沉淀。DNA溶液加入1μL 10mg/mL RNase，37℃水浴1h,去除RNA。最终的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
PCR反应体系及条件：
将上述DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增体系为：总体性为25μL，其中10×PCR buffer II(Mg2+ Plus)2.5μL，dNTP各2.5mM、2uL，5U/μL ExTaq DNA酶0.25μL，10μmol/L特异性引物对各0.5μL，模板DNA浓度50ng/μL、0.5μL，ddH2O 18.75μL。特异性引物序列为：F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA
PCR反应条件为：：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃补平10min。
电泳检测：
取PCR扩增产物20μL，与12μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5分钟，结束后置于冰水混合物中冷却3分钟，点样3μL与6%变性聚丙烯酰胺上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000V，电流200mA，功率200W，电泳45分钟，银染，显色，然后在凝胶成像仪上拍照。
如图1所示：采用特异性引物对包括草菇菌株0229在内的6株草菇菌株进行PCR扩增，只有草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之间扩增出2条特异条带，其它草菇菌株不能同时扩增出这2条条带。
Claims (5)
1.一种草菇菌株0229分子特异性检测标记，其特征在于：所述特异性检测标记为特异性引物，其中引物序列为：
F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；
R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA。
2.一种草菇菌株0229分子特异性检测方法，包括：
(1)将草菇菌株接种PDA平板培养基，32℃培养5d，将表面菌丝装入无菌管中，-70℃保存，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA，得到DNA；
(2)将上述DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，进行电泳检测，其中特异性检测标记引物为F：CTTTCAGGAAGAGCCCAGC；R：TGAAGGGCTTGAAGGAGAAA；草菇菌株0229能在分子量200bp-300bp之间扩增出2条特异条带，其它草菇菌株不能在相同位置同时扩增出这2条条带。
3.根据权利要求2所述的一种草菇菌株0229分子特异性检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增体系为：总体积为25μL，其中10×PCR buffer II(Mg2+Plus)2.5μL，2.5mMdNTP各2uL，5U/μL ExTaq DNA酶0.25μL，10μmol/L特异性引物对各0.5μL，50ng/μL模板DNA0.5μL，ddH2O 18.75μL。
4.根据权利要求2所述的一种草菇菌株0229分子特异性检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃补平10min。
5.根据权利要求2所述的一种草菇菌株0229分子特异性检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中电泳检测方法为：取PCR扩增产物20μL，与12μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5分钟，结束后置于冰水混合物中冷却3分钟，点样3μL与6％变性聚丙烯酰胺上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000V，电流200mA，功率200W，电泳45分钟，银染，显色，然后在凝胶成像仪上拍照。
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Application publication date: 20140604 Assignee: Jiangsu Jiangnan Biology Technology Co., Ltd. Assignor: Shanghai Academy of Agricultural Sciences Contract record no.: 2018320000045 Denomination of invention: Volvariella volvacea strain 0229 molecule specific detection markers and detection method using the same Granted publication date: 20171031 License type: Exclusive License Record date: 20180309 |