CN102220425A - 一组用于禾谷丝核菌多样性分析的微卫星引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组用于小麦纹枯病菌禾谷丝核菌多样性分析的微卫星引物，并进一步提供了利用该组引物进行菌株多样性及群体遗传结构分析的方法，属植物保护领域。本发明所提供的用于禾谷丝核菌多样性及群体遗传结构分析的微卫星引物，是根据禾谷丝核菌的转录组数据库开发设计的。该组引物扩增产物清晰、稳定、多态性好，可用于禾谷丝核菌菌株的多样性及群体遗传结构的分析，该方法具有快速、经济、稳定、操作简便等特点。

Description

一组用于禾谷丝核菌多样性分析的微卫星引物

技术领域

本发明涉及一组对小麦纹枯病菌禾谷丝核菌进行多样性分析的微卫星引物，可应用于禾谷丝核菌群体遗传多样性的分析，属植物保护领域。 

背景技术

由丝核菌侵染小麦引起的小麦纹枯病(sharp eyespot ofwheat)，是一种世界性小麦病害，几乎遍布世界各温带小麦种植区。该病在我国冬麦区普遍发生，并已成为黄淮平原及长江流域麦区的主要病害之一。国内许多学者对小麦纹枯病病原进行了较深入的研究，表明在我国小麦纹枯病的病原主要是禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Van der Hoeven)，属双核丝核菌的AG-D融合群，其有性型为担子菌门的禾谷角担菌(Ceratobasidium cereale Murray and Burpee)。丝核菌是以菌丝融合群来进行分类的，其中引起小麦纹枯病的禾谷丝核菌是一种土传植物病原真菌，在自然界中也可能存在菌丝融合现象，为其遗传物质的交换提供了条件。禾谷丝核菌具有丰富的遗传多样性，不同群体间可能存在遗传结构的差异。 

微卫星(Microsatelite)或称简单重复序列(Simple sequence repea，SSR)，是由1-6个核苷酸重复串联构成的DNA序列。SSR在真核生物基因组中分布广泛、数量丰富，并具有较高的突变频率，因此作为一种基于PCR的共显性遗传标记，具有相对较高的多态性并且经济易行，适于大规模样品的群体遗传多样性分析。目前，SSR已经成为分子生态学研究应用最广泛的分子标记，在遗传多样性分析、遗传图谱构建、物种分类和系统发育，以及植物病害流行学、病原菌的进化和迁移规律方面有着重要的应用价值。到目前为止国际上还没有一套用以分析禾谷丝核菌群体遗传结构的微卫星引物，本发明提供了一组用于禾谷丝核菌群体遗传多样性分析的微卫星引物，具有多态性高、结果稳定等优点，有很好的应用价值。 

发明内容

本发明目的在于提供用于小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传多样性分析的微卫星引物，并进一步给出了应用该引物的PCR检测方法。 

1、引物设计： 

根据小麦纹枯病菌禾谷丝核菌菌株R0301的转录组数据库相关序列设计多态性丰富的微卫星引物，引物序列如下： 

表1禾谷丝核菌微卫星引物及对应的指标参数 

2、真菌总DNA提取： 

真菌菌丝的总DNA提取采用“植物基因组DNA快速提取试剂盒”购自广东东盛生物科技有限公司(网址：http://www.dongshengbio.com，电话：020-87791356，产品货号：N1192)，具体操作参照产品说明书。 

3、聚合酶链式反应(PCR)： 

以提取的禾谷丝核菌总DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系包括： 

反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30sec、58℃退火45sec、72℃延伸30sec，35次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。 

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测： 

根据TaKaRa实验手册配制8％聚丙烯酰胺凝胶，加入封装好的垂直电泳槽内，插入齿梳，凝固1-2小时，待胶凝固后加入2μPCR产物和6×buffer的混合上样液，在0.5×TBE缓冲液和120V恒压下电泳约2.5小时。 

采用硝酸银染色观察电泳结果：将电泳得到凝胶用固定液(乙醇30ml，乙酸1.5ml，加水至300ml)浸泡12min；纯水漂洗1-2次，每次5min；加入染色液(硝酸银0.6g，加水至300ml)，摇12min；纯水快速地漂洗10-15s；定影液(10％硫代硫酸钠60μl，加水至300ml)浸泡30s；纯水再次漂洗；加入4℃预冷的显色液(NaOH 4.5g，甲醛3ml，加水至300ml)，显色10min；大量水冲洗；观察显色条带，记录结果。 

具体实施方式

实例一：利用本发明的微卫星引物进行禾谷丝核菌的群体遗传结构分析，起步骤如下： 

1、引物合成： 

应用DNA合成仪合成微卫星引物6对，各2OD，一般由有DNA合成能力的生物工程公司来完成。序列如下，对应的指标参数见表1： 

2、禾谷丝核菌群体基因组DNA的提取： 

收集禾谷丝核菌群体菌株，在新鲜培养基上培养，每个菌株收集菌丝体约100mg。参考DNA提取试剂盒说明书，加入液氮充分研磨，将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 65℃预热缓冲液GPL的离心管中，颠倒混匀后，65℃水浴20min；加入700ul氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；小心地将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的缓冲液GPD，充分混匀；将混匀的液体转入纯化柱，室温静置1min，12000rpm离心30s，弃滤液；向纯化中加入500ul去蛋白液PS，12000rpm离心30s，弃滤液；向纯化柱中加入500ul漂洗液PE，12000rpm离心30s，弃滤液；12000rpm空离纯化柱2min；将纯化柱放入新的1.5ml 离心管中，向柱中央加入100ul纯化液TE，室温静置2min后12000rpm离心2min收集DNA，-20℃保存。 

3、PCR扩增： 

以提取的禾谷丝核菌总DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系包括： 

反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30sec、58℃退火45sec、72℃延伸30sec，35次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。 

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测： 

根据TaKaRa实验手册配制8％聚丙烯酰胺凝胶，加入封装好的垂直电泳槽内，插入齿梳，凝固1-2小时，待胶凝固后加入2μPCR产物和6×buffer的混合上样液，在0.5×TBE缓冲液和120V恒压下电泳约2.5小时。 

采用硝酸银染色观察电泳结果：将电泳得到凝胶用固定液(乙醇30ml，乙酸1.5ml，加水至300ml)浸泡12min；纯水漂洗1-2次，每次5min；加入染色液(硝酸银0.6g，加水至300ml)，摇12min；纯水快速地漂洗10-15s；定影液(10％硫代硫酸钠60μl，加水至300ml)浸泡30s；纯水再次漂洗；加入4℃预冷的显色液(NaOH 4.5g，甲醛3ml，加水至300ml)，显色10min；大量水冲洗；观察显色条带，记录结果。 

5、结果分析： 

经电泳获得的图谱每群体在所有位点的条带式样组成一个01矩阵。用POPGEN3.2软件进行等位基因数(observed alleles number，Na)、有效等位基因数(effective alleles number，Ne)、等位基因频率(allele frequency)、观测杂合度(observed heterozygosity，HO)、期望杂合度(expected heterozygosity，HE)、群体内的近交系数(within population inbreeding coefficient，FIS)、总近交系数(total inbreeding coefficient，FIT)、群体分化系数。 

Claims (3)

1.一组用于小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构分析的微卫星引物，其核苷酸序列为：

2.根据权力要求1所述的一组用于小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构分析的微卫星引物，其特征在于所述微卫星引物的指标参数如下表所示：

3.权力要求1所述引物在禾谷丝核菌群体遗传结构分析中的应用。