CN112094943A - 一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法及检测引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效检测蛹虫草不同菌株交配型的方法及检测引物组，本发明基于等温扩增技术，设计检测蛹虫草不同菌株交配型MAT1‑1和MAT1‑2的特异性引物(Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B和Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B)；四条引物Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B用于蛹虫草MAT1‑1交配型的检测，另外四条引物Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B用于MAT1‑2交配型的检测。本发明检测结果特性性强，简单快速，只需将试剂混合后置于恒温水浴锅中反应，通过混合液的颜色即可快速区分交配型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法及检测引物组。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)是虫草属真菌的模式种，又称为北冬虫夏草等，属药食两用真菌，隶属于子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，虫草科(Cordycipitaceae)，虫草属(Cordyceps)。近几十年来，蛹虫草资源的研究和开发取得了很大进展，目前已实现大规模人工栽培。
蛹虫草为二极性异宗结合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型，其有性生殖需要两种交配型菌株的参与。作为生产使用的菌种，需明确不同来源菌种的交配型，避免部分遗传背景等特征不清楚，例如不单一或混杂的菌种同时有两个交配型，导致蛹虫草栽培形成畸形子实体，品质下降甚至减产等严重问题。目前为止，为明确不同来源菌种交配型，需进行PCR反应以明确菌株的交配类型，这种对不同菌种交配型鉴定的方法存在效率低，需要鉴定所需时间长，步骤繁琐，需要PCR预变形、温度循环、胶电泳和紫外显影等步骤。因此，研究快速检测蛹虫草菌株交配型的方法，对于菌种鉴定、改良和子实体的培育具有重要理论和实践价值。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法。本发明检测结果特性性强，简单快速，只需将试剂混合后置于恒温水浴锅中反应，通过混合液的颜色即可快速区分交配型。
一种快速区分蛹虫草交配型的检测引物组，包括蛹虫草交配型MAT1-1引物组和蛹虫草交配型MAT1-2引物组；蛹虫草交配型MAT1-1引物组包括序列SEQ ID NO:1、序列SEQ IDNO:2、序列SEQ ID NO:3和序列SEQ ID NO:4；所述蛹虫草交配型MAT1-2引物组包括序列SEQID NO:5、序列SEQ ID NO:6、序列SEQ ID NO:7和序列SEQ ID NO:8。
一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法，包括如下步骤：
步骤一、将待检测物和环介导等温扩增缓冲液分别与蛹虫草交配型MAT1-1引物组和蛹虫草交配型MAT1-2引物组混合，得到混合反应液；蛹虫草交配型MAT1-1引物组包括序列SEQ ID NO:1、序列SEQ ID NO:2、序列SEQ ID NO:3和序列SEQ ID NO:4；所述蛹虫草交配型MAT1-2引物组包括序列SEQ ID NO:5、序列SEQ ID NO:6、序列SEQ ID NO:7和序列SEQ IDNO:8；
步骤二、将混合反应液加热进行环介导等温扩增；
步骤三、若加入蛹虫草交配型MAT1-1引物组的混合反应液变色则待检测物为蛹虫草交配型MAT1-1；若加入蛹虫草交配型MAT1-2引物组的混合反应液变色则待检测物为蛹虫草交配型MAT1-2。
进一步的改进，所述混合反应液中包括10×Bst Buffer 2体积份，100mMMg2SO41.6体积份，10mM dNTPs 2.8体积份，蛹虫草交配型MAT1-1引物组或蛹虫草交配型MAT1-2引物组5.5体积份；蛹虫草交配型MAT1-1引物组中，序列SEQ ID NO:1、序列SEQ IDNO:2、序列SEQ ID NO:3和序列SEQ ID NO:4的摩尔比为1:10:10:1；蛹虫草交配型MAT1-2引物组中，序列SEQ ID NO:5、序列SEQ ID NO:6、序列SEQ ID NO:7和序列SEQ ID NO:8的摩尔比为1:10:10:1；8U/μl Bst DNA polymerase 0.8-1.5体积份，3mM羟基萘酚蓝溶液1.6体积份，10-200ng/μL待检测物1体积份，然后加ddH2O补足至20体积份。
进一步的改进，所述混合反应液变色指混合反应液由蓝紫色变成天蓝色。
进一步的改进，所述步骤二中，环介导等温扩增的加热温度为62-63℃，时间为0.75-1.5h。
进一步的改进，所述待检测物为所需检测蛹虫草的DNA。
本发明的优点：
本发明检测结果特性性强，简单快速，只需将试剂混合后置于恒温水浴锅中反应，通过混合液的颜色即可快速区分交配型。
附图说明
图1为特异性引物组Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B(SEQ ID NO:1-4)和Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B(SEQ ID NO:5-8)检测蛹虫草菌株交配型的羟基萘酚蓝染色检测结果，图中3和6为阴性对照(DNA模板用ddH2O代替)，1-2为引物组Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B扩增单孢代表菌株cm1(MAT1-1)和cm2(MAT1-2)的模板DNA；4-5为引物组Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B扩增单孢代表菌株cm1(MAT1-1)和cm2(MAT1-2)的模板DNA。
图2为特异性引物组Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B和Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B对不同来源的蛹虫草菌种交配型进行检测图，图A中的1-14为引物组Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B对不同来源的蛹虫草菌株编号为1-14的交配型MAT1-1检测图，cm1为阳性对照(DNA模板为cm1菌株的DNA)，cm2为阴对照(DNA模板为cm2菌株的DNA)；图B中的1-14为引物组Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B对不同来源的蛹虫草菌株编号为1-14的交配型MAT1-2检测图，cm2为阳性对照(DNA模板为cm2菌株的DNA)，cm1为阴性对照(DNA模板为cm1菌株的DNA)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明。
以下实施例中所用于蛹虫草菌株cm1和cm2为子座分离获得的菌株，保藏于怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室。
实施例1：
引物组Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B检测蛹虫草交配型MAT1-1菌株。
(1)快速释放样品中的DNA；
称已知交配型为MAT1-1蛹虫草菌株(交配型MAT1-1代表菌株cm1)的新鲜样品≧100mg或干燥样品≧50mg，置于研钵中，加入3倍重量的无菌石英砂，混合研磨后，转入离心管中，加400-600μl无菌双蒸水，100℃水浴10min，10000rpm/min离心5min，取上清，备用。上清液保存于-20℃，48h内使用。
(2)利用由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成的4条特异性引物组(Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B)进行环介导等温扩增，引物序列见表1。
表1蛹虫草交配型MAT1-1快速检测引物序列
(3)交配型MAT1-1等温扩增体系和反应温度如下：10×Bst Buffer 2μl，100mMMg2SO41.6μl，10mM dNTPs 2.8μl，10μM引物Cm1F 0.25μl，10μM引物Cm1B 0.25μl，10μM引物Cm1FIP 2.5μl，10μM引物Cm1BIP 2.5μl，8U/μl Bst DNA polymerase 1.0μl，3mM羟基萘酚蓝溶液1.6μl，步骤(1)的备用液1μl，ddH2O补足至20μl。混合后63℃水浴1h，再80℃水浴10min终止反应。样品交配型MAT1-1的反应体系由蓝紫色变成天蓝色，如图1A所示；
实施例2：
引物组Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B检测蛹虫草交配型MAT1-2菌株。
(1)快速释放样品中的DNA；
称已知交配型为MAT1-2蛹虫草菌株(交配型MAT1-2代表菌株cm2)的新鲜样品≧100mg或干燥样品≧50mg，置于研钵中，加入3倍重量的无菌石英砂，混合研磨后，转入离心管中，加400-600μl无菌双蒸水，100℃水浴10min，10000rpm/min离心5min，取上清，备用。上清液保存于-20℃，48h内使用。
(2)利用由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成的4条特异性引物(Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B)进行环介导等温扩增，引物序列见表2。
表2蛹虫草交配型MAT1-2快速检测引物序列
(3)交配型MAT1-2等温扩增体系和反应温度如下：
__10×Bst Buffer 2μl，100mM Mg2SO41.6μl，10mM dNTPs 2μl，10μM引物Cm2F0.25μl，10μM引物Cm2B 0.25μl，10μM引物Cm2FIP 2.5μl，10μM引物Cm2BIP 2.5μl，8U/μlBst DNA polymerase 1.0μl，3mM羟基萘酚蓝溶液1.6μl，步骤(1)的备用液1μl，ddH2O补足至20μl。混合后63℃水浴1h，再80℃水浴10min终止反应。样品交配型MAT1-2的反应体系由蓝紫色变成天蓝色，如图1B。
实施例3：
与实施例1中的步骤(1)不同，其余相同。具体为：
(1)采用CTAB/NaCl法提取所需检测样本的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行定量分析。保存于-20℃，1年内有效。
实施例4：
与实施例2中的步骤(1)不同，其余相同。具体为：
(2)采用CTAB/NaCl法提取所需检测样本的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行定量分析。保存于-20℃，1年内有效。
实施例5：
对不同来源的蛹虫草菌种交配型进行检测。
随机选取通过单孢分离技术选取的12个蛹虫草单孢菌株和通过子实体组织分离法选取的2个菌株进行检测。以确定检测体系的实用性。利用2组特异性引物(Cm1F/Cm1FIP/Cm1BIP/Cm1B和Cm2F/Cm2FIP/Cm2BIP/Cm2B)对这14个菌株进行交配型检测。交配型MAT1-1等温扩增体系和反应温度同实施例1，交配型MAT1-2等温扩增体系和反应温度同实施例2。交配型MAT1-1等温扩增体系由蓝紫色变成天蓝色的样品为交配型MAT1-1，如图2A所示；交配型MAT1-2等温扩增体系由蓝紫色变成蓝色的样品为交配型MAT1-2，如图2B所示。检测结果如图2所示，设计的特异性引物可以快速区分不同来源菌株的交配型。其中，12个单孢来源的群体中，交配型为MAT1-1有7株，交配型为MAT1-2有5株，二者比列为7：5；而通过子实体组织分离法选取的2个菌株同时还有MAT1-1和MAT1-2两种交配型。
上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。
序列表
<110> 怀化学院
<120> 一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法及检测引物组
<130> 20201027-1
<160> 8
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Claims (6)
1.一种快速区分蛹虫草交配型的检测引物组，其特征在于，包括蛹虫草交配型MAT1-1引物组和蛹虫草交配型MAT1-2引物组；蛹虫草交配型MAT1-1引物组包括序列SEQ ID NO:1、序列SEQ ID NO:2、序列SEQ ID NO:3和序列SEQ ID NO:4；所述蛹虫草交配型MAT1-2引物组包括序列SEQ ID NO:5、序列SEQ ID NO:6、序列SEQ ID NO:7和序列SEQ ID NO:8。
2.一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将待检测物和环介导等温扩增缓冲液分别与蛹虫草交配型MAT1-1引物组和蛹虫草交配型MAT1-2引物组混合，得到混合反应液；蛹虫草交配型MAT1-1引物组包括序列SEQID NO:1、序列SEQ ID NO:2、序列SEQ ID NO:3和序列SEQ ID NO:4；所述蛹虫草交配型MAT1-2引物组包括序列SEQ ID NO:5、序列SEQ ID NO:6、序列SEQ ID NO:7和序列SEQ IDNO:8；
步骤二、将混合反应液加热进行环介导等温扩增；
步骤三、若加入蛹虫草交配型MAT1-1引物组的混合反应液变色则待检测物为蛹虫草交配型MAT1-1；若加入蛹虫草交配型MAT1-2引物组的混合反应液变色则待检测物为蛹虫草交配型MAT1-2。
3.如权利要求2所述的快速区分蛹虫草交配型的检测方法，其特征在于，所述混合反应液中包括10×Bst Buffer 2体积份，100mM Mg2SO4 1.6体积份，10mM dNTPs 2.8体积份，蛹虫草交配型MAT1-1引物组或蛹虫草交配型MAT1-2引物组5.5体积份；蛹虫草交配型MAT1-1引物组中，序列SEQ ID NO:1、序列SEQ ID NO:2、序列SEQ ID NO:3和序列SEQ ID NO:4的摩尔比为1:10:10:1；蛹虫草交配型MAT1-2引物组中，序列SEQ ID NO:5、序列SEQ ID NO:6、序列SEQ ID NO:7和序列SEQ ID NO:8的摩尔比为1:10:10:1；8U/μl Bst DNA polymerase0.8-1.5体积份，3mM羟基萘酚蓝溶液1.6体积份，10-200ng/μL待检测物1体积份，然后加ddH2O补足至20体积份。
4.如权利要求3所述的快速区分蛹虫草交配型的检测方法，其特征在于，所述混合反应液变色指混合反应液由蓝紫色变成天蓝色。
5.如权利要求2所述的快速区分蛹虫草交配型的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，环介导等温扩增的加热温度为62-63℃，时间为0.75-1.5h。
6.如权利要求2所述的快速区分蛹虫草交配型的检测方法，其特征在于，所述待检测物为所需检测蛹虫草的DNA。
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| CN202011176885.2A Pending CN112094943A (zh) | 2020-10-28 | 2020-10-28 | 一种快速区分蛹虫草交配型的检测方法及检测引物组 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112094943A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101649350A (zh) * | 2009-06-01 | 2010-02-17 | 中国农业大学 | 一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法 |
-
2020
- 2020-10-28 CN CN202011176885.2A patent/CN112094943A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101649350A (zh) * | 2009-06-01 | 2010-02-17 | 中国农业大学 | 一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YUZHEN LU 等: "Functional convergence and divergence of mating-type genes fulfilling in Cordyceps militaris", 《FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY》 * |
| 刘敏祥 等: "蛹虫草菌株的交配型鉴定及其部分栽培特征研究", 《安徽科技学院学报》 * |
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