JPH08224084A - ポリヌクレオチドの生体内標識化方法 - Google Patents
ポリヌクレオチドの生体内標識化方法Info
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- JPH08224084A JPH08224084A JP7332416A JP33241695A JPH08224084A JP H08224084 A JPH08224084 A JP H08224084A JP 7332416 A JP7332416 A JP 7332416A JP 33241695 A JP33241695 A JP 33241695A JP H08224084 A JPH08224084 A JP H08224084A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 種々の分析物の検出、実験上、工業上、また
は医学・医療上応用することができる標識ポリヌクレオ
チドを、量産における高コスト等の従来方法における制
約なしに、生物学的手法を用いて生体内標識することに
より提供する。 【解決手段】 標識しようとするポリヌクレオチドを特
徴とする宿主を、その宿主が成長するのに必要とする、
標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチ
ド、またはその同族体もしくは先駆体の存在下で培養し
て標識をポリヌクレオチド中に組み込む。
は医学・医療上応用することができる標識ポリヌクレオ
チドを、量産における高コスト等の従来方法における制
約なしに、生物学的手法を用いて生体内標識することに
より提供する。 【解決手段】 標識しようとするポリヌクレオチドを特
徴とする宿主を、その宿主が成長するのに必要とする、
標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチ
ド、またはその同族体もしくは先駆体の存在下で培養し
て標識をポリヌクレオチド中に組み込む。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリヌクレオチド
の生体内（in vivo ）標識に関する。より詳細には、本
発明は、ＤＮＡの生物学的標識に関し、分析物に対して
ヒブリド化したそれらＤＮＡの検出を可能とする。本発
明の方法により作製された生物学的に標識されたポリヌ
クレオチドは、種々の分析物の検出が必要とされる多く
の研究、工業、医薬上の応用において有用である。
の生体内（in vivo ）標識に関する。より詳細には、本
発明は、ＤＮＡの生物学的標識に関し、分析物に対して
ヒブリド化したそれらＤＮＡの検出を可能とする。本発
明の方法により作製された生物学的に標識されたポリヌ
クレオチドは、種々の分析物の検出が必要とされる多く
の研究、工業、医薬上の応用において有用である。
【０００２】
【従来の技術】以下の記載において、次の用語を使用す
る。
る。
【０００３】分析物： 存在を検出しかつ所望ならば定
量すべき物質もしくは複数の物質のそれぞれ単独物また
は混合物。この分析物は、低分子量または高分子量のＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ分子、これらの分子を含む複合体分
子、または例えばウィルス、細胞もしくは細胞群のよう
な核酸を含有する生物系とすることができる。一般的な
分析物には、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくはその
断片、単一鎖もしくは二重鎖のもの、ウィルス、細菌、
培養細胞などがある。グラム陽性細菌およびグラム陰性
細菌を含め全体としてもしくはその断片としての細菌、
真菌、藻類およびその他の微生物も分析物であり、さら
に動物（たとえば哺乳動物）および植物の細胞および組
織も包含される。
量すべき物質もしくは複数の物質のそれぞれ単独物また
は混合物。この分析物は、低分子量または高分子量のＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ分子、これらの分子を含む複合体分
子、または例えばウィルス、細胞もしくは細胞群のよう
な核酸を含有する生物系とすることができる。一般的な
分析物には、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくはその
断片、単一鎖もしくは二重鎖のもの、ウィルス、細菌、
培養細胞などがある。グラム陽性細菌およびグラム陰性
細菌を含め全体としてもしくはその断片としての細菌、
真菌、藻類およびその他の微生物も分析物であり、さら
に動物（たとえば哺乳動物）および植物の細胞および組
織も包含される。
【０００４】プローブ： 特定分析物のポリヌクレオチ
ドに対し相補的であり、かつこの分析物ポリヌクレオチ
ド配列へヒブリド化する、標識されたポリヌクレオチ
ド。
ドに対し相補的であり、かつこの分析物ポリヌクレオチ
ド配列へヒブリド化する、標識されたポリヌクレオチ
ド。
【０００５】標識： そのままで、または信号部分もし
くは架橋部分と信号部分との組合せが共有結合した後
に、または信号部分もしくは架橋部分と信号部分との組
合せが非共有結合した後に、検出しうるまたはある場合
には定量化しうる信号を発生する、ポリヌクレオチドに
結合された部分。この種の標識を有する化合物は、例え
ばグルコシル化ヌクレオチド、グリコシル化ヌクレオチ
ド、５−ヒドロキシメチルウラシル、ＢｒｄＵＲおよび
５−メチルシトシンを包含する。
くは架橋部分と信号部分との組合せが共有結合した後
に、または信号部分もしくは架橋部分と信号部分との組
合せが非共有結合した後に、検出しうるまたはある場合
には定量化しうる信号を発生する、ポリヌクレオチドに
結合された部分。この種の標識を有する化合物は、例え
ばグルコシル化ヌクレオチド、グリコシル化ヌクレオチ
ド、５−ヒドロキシメチルウラシル、ＢｒｄＵＲおよび
５−メチルシトシンを包含する。
【０００６】架橋部分： ポリヌクレオチド配列の標識
へ共有結合または非共有結合する際、標識と信号部分と
の間で結合手または架橋として作用する部分。
へ共有結合または非共有結合する際、標識と信号部分と
の間で結合手または架橋として作用する部分。
【０００７】信号部分： ポリヌクレオチドの標識へま
たはこの標識に結合された架橋部分へ共有結合または非
共有結合する際に、標識を検出するための信号を発生す
る部分。
たはこの標識に結合された架橋部分へ共有結合または非
共有結合する際に、標識を検出するための信号を発生す
る部分。
【０００８】信号： 標識または信号部分の特性であっ
て、標識を持たないヌクレオチド群から標識または信号
部分を検出可能とするもの。
て、標識を持たないヌクレオチド群から標識または信号
部分を検出可能とするもの。
【０００９】生物試料および非生物試料における微量の
物質の分析および検出は、臨床実験および分析実験にお
いて日常の手段となった。これらの検出技術は次の２つ
の主たる群に分類することができる。すなわち： (1)リガンド−レセプターの相互作用に基づくもの（例
えば免疫分析に基づく技術）および、(2)核酸ヒブリド
化に基づくもの（ポリヌクレオチドに基づく技術）であ
る。
物質の分析および検出は、臨床実験および分析実験にお
いて日常の手段となった。これらの検出技術は次の２つ
の主たる群に分類することができる。すなわち： (1)リガンド−レセプターの相互作用に基づくもの（例
えば免疫分析に基づく技術）および、(2)核酸ヒブリド
化に基づくもの（ポリヌクレオチドに基づく技術）であ
る。
【００１０】免疫分析に基づく技術は、抗体とそれに相
補的な抗原との非共有結合からなる一連の工程を特徴と
する。例えば、T. Chard, "An Introduction To Radioi
mmunoassay And Related Techniques" (1978) を参照す
ることができる。
補的な抗原との非共有結合からなる一連の工程を特徴と
する。例えば、T. Chard, "An Introduction To Radioi
mmunoassay And Related Techniques" (1978) を参照す
ることができる。
【００１１】ポリヌクレオチドに基づく検出技術は、標
識されたポリヌクレオチド配列またはプローブをアデニ
ン（Ａ）とチミジン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）とシ
チジン（Ｃ）のワトソン−クリックの塩基対合に従っ
て、ヒブリド化条件下で分析物の相補配列へ非共有結合
させ、かつそのヒブリド化を検出することからなる一連
の工程を特徴とする。〔M. GrunsteinおよびD. S. Hogn
ess, "Colony Hybridization: A Method For The Isola
tion Of Cloned DNAs That Contain A SpecificGene",
Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 72, pp. 3961-65 (197
5)〕。
識されたポリヌクレオチド配列またはプローブをアデニ
ン（Ａ）とチミジン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）とシ
チジン（Ｃ）のワトソン−クリックの塩基対合に従っ
て、ヒブリド化条件下で分析物の相補配列へ非共有結合
させ、かつそのヒブリド化を検出することからなる一連
の工程を特徴とする。〔M. GrunsteinおよびD. S. Hogn
ess, "Colony Hybridization: A Method For The Isola
tion Of Cloned DNAs That Contain A SpecificGene",
Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 72, pp. 3961-65 (197
5)〕。
【００１２】一般的意味において、分析物の相補配列に
対する標識配列もしくはプローブの非共有結合は、ポリ
ヌクレオチドに基づく検出技術の主たる識別過程であ
る。この結合過程は、プローブと分析物との相補ヌクレ
オチドの正確な分子配列および相互作用によって起こ
る。これは、非共有結合の自由エネルギー、例えば水素
結合自由エネルギー、積層自由エネルギーなどの放出に
よりエネルギー性に促進される。
対する標識配列もしくはプローブの非共有結合は、ポリ
ヌクレオチドに基づく検出技術の主たる識別過程であ
る。この結合過程は、プローブと分析物との相補ヌクレ
オチドの正確な分子配列および相互作用によって起こ
る。これは、非共有結合の自由エネルギー、例えば水素
結合自由エネルギー、積層自由エネルギーなどの放出に
よりエネルギー性に促進される。
【００１３】主たる識別過程の他に、さらに標識ヌクレ
オチドと分析物の相補配列部分との間で結合が生ずる時
点を検出することが必要である。この検出は信号過程で
行われる。信号過程は定量的もしくは定性的な検出を可
能にし、例えば主たる識別過程の発生をヒトまたは装置
の検出系で検知することを可能にする。
オチドと分析物の相補配列部分との間で結合が生ずる時
点を検出することが必要である。この検出は信号過程で
行われる。信号過程は定量的もしくは定性的な検出を可
能にし、例えば主たる識別過程の発生をヒトまたは装置
の検出系で検知することを可能にする。
【００１４】ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術の
主たる識別過程および信号過程は、直接的にまたは間接
的に、或いは比例的にまたは逆比例的に組み合わせるこ
とができる。例えば充分量の放射性標識したプローブに
よる核酸ヒブリド化のような系において、放射能の量は
一般に存在する分析物の量に比例する。逆比例の技術
は、例えば検出される信号の量が試料中に存在する分析
物の量が多くなるにつれて低下するような競合免疫分析
を包含する。
主たる識別過程および信号過程は、直接的にまたは間接
的に、或いは比例的にまたは逆比例的に組み合わせるこ
とができる。例えば充分量の放射性標識したプローブに
よる核酸ヒブリド化のような系において、放射能の量は
一般に存在する分析物の量に比例する。逆比例の技術
は、例えば検出される信号の量が試料中に存在する分析
物の量が多くなるにつれて低下するような競合免疫分析
を包含する。
【００１５】信号過程を主たる識別過程に対し、１：１
より大きい比で関連させるよう検出を向上させるために
増幅技術を使用することもできる。例えば分析の信号成
分を各識別成分に対し１０：１の比で存在させて、１０
倍の感度増加を与えることもできる。
より大きい比で関連させるよう検出を向上させるために
増幅技術を使用することもできる。例えば分析の信号成
分を各識別成分に対し１０：１の比で存在させて、１０
倍の感度増加を与えることもできる。
【００１６】主たる識別過程の発生を検出するには多く
の種類の信号過程を使用することができる。選択する信
号過程は、主たる識別過程で使用されるポリヌクレオチ
ドの標識または信号部分を特徴とする特定信号に依存す
る。標識はこれへ信号部分または架橋部分と信号部分と
の組合せを結合させる処理なしにそれ自身で検出されう
るが、この標識に対しそれ自身で検出されうるまたはさ
らに改変した後に検出され得るようになる信号部分また
は架橋部分と信号部分との組合せを共有結合または非共
有結合させるのがより一般的である。
の種類の信号過程を使用することができる。選択する信
号過程は、主たる識別過程で使用されるポリヌクレオチ
ドの標識または信号部分を特徴とする特定信号に依存す
る。標識はこれへ信号部分または架橋部分と信号部分と
の組合せを結合させる処理なしにそれ自身で検出されう
るが、この標識に対しそれ自身で検出されうるまたはさ
らに改変した後に検出され得るようになる信号部分また
は架橋部分と信号部分との組合せを共有結合または非共
有結合させるのがより一般的である。
【００１７】もちろん、上記の架橋部分と信号部分との
組合せは標識へ結合させる前に作製し得ること、或いは
標識へ順次に結合させうることを了解すべきである。例
えば、架橋部分を先ず標識へ結合させ、次いで信号部分
をその架橋部分へ結合させることができる。さらに、幾
つかの架橋部分および／または信号部分を一緒に架橋部
分と信号部分との組合せにおいて使用することもでき
る。
組合せは標識へ結合させる前に作製し得ること、或いは
標識へ順次に結合させうることを了解すべきである。例
えば、架橋部分を先ず標識へ結合させ、次いで信号部分
をその架橋部分へ結合させることができる。さらに、幾
つかの架橋部分および／または信号部分を一緒に架橋部
分と信号部分との組合せにおいて使用することもでき
る。
【００１８】標識に対する信号部分または架橋部分と信
号部分との組合せの共有結合の例は、例えば放射性部
分、蛍光性部分または検出手段となりうる信号をそれ自
体で与える他の部分のような信号部分による標識の化学
的改変、或いは信号を与えるための架橋部分と信号部分
との少なくとも１つの組合せによる標識の化学的改変で
ある。
号部分との組合せの共有結合の例は、例えば放射性部
分、蛍光性部分または検出手段となりうる信号をそれ自
体で与える他の部分のような信号部分による標識の化学
的改変、或いは信号を与えるための架橋部分と信号部分
との少なくとも１つの組合せによる標識の化学的改変で
ある。
【００１９】標識に対する信号部分または架橋部分と信
号部分との組合せの非共有結合の例は、適当な手段によ
りそれ自身で検出されうる信号部分の標識に対する非共
有結合、或いはこれら手段の１つにより検出されうる信
号を発生する非共有結合である。例えばポリヌクレオチ
ドの標識を抗体、蛍光性部分または適当な手段によって
検出しうる他の部分へ非共有結合させることができる。
或いは、標識を架橋部分（例えばレクチン）へ結合さ
せ、次いでレクチン、すなわち架橋部分を介して適当な
手段により検出しうる他の部分へ結合させることもでき
る。
号部分との組合せの非共有結合の例は、適当な手段によ
りそれ自身で検出されうる信号部分の標識に対する非共
有結合、或いはこれら手段の１つにより検出されうる信
号を発生する非共有結合である。例えばポリヌクレオチ
ドの標識を抗体、蛍光性部分または適当な手段によって
検出しうる他の部分へ非共有結合させることができる。
或いは、標識を架橋部分（例えばレクチン）へ結合さ
せ、次いでレクチン、すなわち架橋部分を介して適当な
手段により検出しうる他の部分へ結合させることもでき
る。
【００２０】分析物検出系においてプローブとして有用
なポリヌクレオチドの標識へ共有結合させ、または非共
有結合させるのに使用しうる極めて多くの種類の信号部
分および架橋部分が存在する。これらは多くの種類の放
射性および非放射性信号部分を包含し、さらに多くの種
類の非放射性架橋部分を包含する。必要とされること
は、信号部分が適当な手段により検出されうる信号を与
えること、並びに存在すれば架橋部分が標識に対し共有
結合または非共有結合する能力および信号部分と結合す
る能力を特徴とすることである。
なポリヌクレオチドの標識へ共有結合させ、または非共
有結合させるのに使用しうる極めて多くの種類の信号部
分および架橋部分が存在する。これらは多くの種類の放
射性および非放射性信号部分を包含し、さらに多くの種
類の非放射性架橋部分を包含する。必要とされること
は、信号部分が適当な手段により検出されうる信号を与
えること、並びに存在すれば架橋部分が標識に対し共有
結合または非共有結合する能力および信号部分と結合す
る能力を特徴とすることである。
【００２１】放射性の信号部分並びに各種の架橋部分と
放射性信号部分との組合せは、例えばＰ32，Ｉ131 ，Ｃ
14，Ｈ3 ，Ｃｏ60，Ｎｉ59，Ｎｉ63などの様な１種もし
くはそれ以上の放射性同位元素を特徴とする。好ましく
は、使用する同位元素はβ線またはγ線を放出し、かつ
長い半減期を有する。次いで、特に一般的には放射能信
号の検出は、例えばフィルムへ露出するような放射能検
出器によって行われる。
放射性信号部分との組合せは、例えばＰ32，Ｉ131 ，Ｃ
14，Ｈ3 ，Ｃｏ60，Ｎｉ59，Ｎｉ63などの様な１種もし
くはそれ以上の放射性同位元素を特徴とする。好ましく
は、使用する同位元素はβ線またはγ線を放出し、かつ
長い半減期を有する。次いで、特に一般的には放射能信
号の検出は、例えばフィルムへ露出するような放射能検
出器によって行われる。
【００２２】非放射性信号部分、ならびに架橋部分と非
放射性信号部分との組合せは、研究および臨床分野にお
いてますますその使用が増大しつつある。これらの信号
および架橋部分は放射能を含まないので、これらを使用
する技術および標識プローブは安全、クリーンかつ一般
的に貯蔵の際より安定であり、その結果安価に使用でき
る。さらに、非放射性信号部分の検出感度は、放射性標
識技術と同程度に高いかまたはそれ以上である。
放射性信号部分との組合せは、研究および臨床分野にお
いてますますその使用が増大しつつある。これらの信号
および架橋部分は放射能を含まないので、これらを使用
する技術および標識プローブは安全、クリーンかつ一般
的に貯蔵の際より安定であり、その結果安価に使用でき
る。さらに、非放射性信号部分の検出感度は、放射性標
識技術と同程度に高いかまたはそれ以上である。
【００２３】非放射性標識と共に使用しうる好適な非放
射性信号部分または架橋−信号部分の組合せの内には、
ビオチン／アビジン結合系に基づくものがある〔P. R.
Langerら, "Enzymatic Synthesis Of Biotin-Labeled P
olynucleotides : Novel Nucleic Acid Affinity Probe
s", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, pp. 6633-37(19
81)；J. Stavrianopoulosら, "Glycosylated DNA Probe
s for Hybridization/ Detectio Of Homologous Sequen
ces", 組換えＤＮＡ研究に対する第３階会議（1983
年）において発表；R. H. SingerおよびD. C. Ward、"A
ctin Gene Expression Visualized In Chicken Muscle
Tissue Culture By Using In Situ Hybridization With
A Biotinated Nucleotide Analog", Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 79, pp. 7331-35 (1982)〕。非放射性信
号系および架橋−信号系、ビオチン／アビジンなどにつ
いては、D. C. Wardら, "Modified Nucleotides And Me
thodsOf Preparing And Using Same"、欧州特許出願第
６３８７９号明細書を参照することができる。
射性信号部分または架橋−信号部分の組合せの内には、
ビオチン／アビジン結合系に基づくものがある〔P. R.
Langerら, "Enzymatic Synthesis Of Biotin-Labeled P
olynucleotides : Novel Nucleic Acid Affinity Probe
s", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, pp. 6633-37(19
81)；J. Stavrianopoulosら, "Glycosylated DNA Probe
s for Hybridization/ Detectio Of Homologous Sequen
ces", 組換えＤＮＡ研究に対する第３階会議（1983
年）において発表；R. H. SingerおよびD. C. Ward、"A
ctin Gene Expression Visualized In Chicken Muscle
Tissue Culture By Using In Situ Hybridization With
A Biotinated Nucleotide Analog", Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 79, pp. 7331-35 (1982)〕。非放射性信
号系および架橋−信号系、ビオチン／アビジンなどにつ
いては、D. C. Wardら, "Modified Nucleotides And Me
thodsOf Preparing And Using Same"、欧州特許出願第
６３８７９号明細書を参照することができる。
【００２４】非放射性標識ポリヌクレオチドは、検出系
においてそれほど広く使用されていない。なぜなら、検
出系においてプローブとして有用なポリヌクレオチドに
対する標識（ヒブリド化を阻害しないもの）の結合が高
価となるからである。
においてそれほど広く使用されていない。なぜなら、検
出系においてプローブとして有用なポリヌクレオチドに
対する標識（ヒブリド化を阻害しないもの）の結合が高
価となるからである。
【００２５】第１に、標識を加えるようポリヌクレオチ
ド重合対を改変するのに有用である化学反応条件は、し
ばしば苛酷すぎて特定ヌクレオチドについては選択する
ことができない。さらに重要なことに、ポリヌクレオチ
ドヌクレオチド配列の化学的標識は、しばしばヒブリド
化を阻害する。なぜなら、この標識はヒブリド化に必要
な水素結合を阻害するからである。例えば、ケトキサー
ルまたはグリオキサールのようなジカルボニル試薬はグ
アニン残基と反応する〔Shapiro ら, Biochemi stry, 5,
pp. 2799-2807 (1966) ; M. Litt , Biochemistry, 8,
pp. 3249-53 (1969) ; Politzら, Biochemistry, 20,
pp. 372-78 (1981) 〕。しかしながら、ケトキサールお
よびグリオキサールで標識したヌクレオチドは、分析物
における相補配列に対しヒブリド化しない。なぜなら、
この標識はヒブリド化に必要な水素結合を阻害するから
である。
ド重合対を改変するのに有用である化学反応条件は、し
ばしば苛酷すぎて特定ヌクレオチドについては選択する
ことができない。さらに重要なことに、ポリヌクレオチ
ドヌクレオチド配列の化学的標識は、しばしばヒブリド
化を阻害する。なぜなら、この標識はヒブリド化に必要
な水素結合を阻害するからである。例えば、ケトキサー
ルまたはグリオキサールのようなジカルボニル試薬はグ
アニン残基と反応する〔Shapiro ら, Biochemi stry, 5,
pp. 2799-2807 (1966) ; M. Litt , Biochemistry, 8,
pp. 3249-53 (1969) ; Politzら, Biochemistry, 20,
pp. 372-78 (1981) 〕。しかしながら、ケトキサールお
よびグリオキサールで標識したヌクレオチドは、分析物
における相補配列に対しヒブリド化しない。なぜなら、
この標識はヒブリド化に必要な水素結合を阻害するから
である。
【００２６】従って、プローブとして使用するポリヌク
レオチドを標識するためには、標識された単量体ヌクレ
オチドを合成し、次いでこれをポリヌクレオチド中に組
み込まねばならない。標識がヒブリド化を阻害しないよ
うな方法で個々のヌクレオチドを標識するには種々の方
法が使用できる。これら標識された単量体ヌクレオチド
をポリヌクレオチドプローブへ結合させるにも、種々の
化学的および酵素的方法が使用できる。例えば、２’−
デオキシウリジン５’−トリホスフェート５−アリルア
ミンビオチンのような標識されたヌクレオチドを、ＤＮ
Ａプローブにおいてニック翻訳によって置換することが
でき〔P. R. Langerら, "Enzymatic Synthesis Of Biot
in-Labeled Polynucleotides : Novel Nucleic Acid Af
finity Probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, p
p. 6633-37 (1981)〕、または末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼを用いるＤＮＡプローブへの末
端付加により置換することができる。
レオチドを標識するためには、標識された単量体ヌクレ
オチドを合成し、次いでこれをポリヌクレオチド中に組
み込まねばならない。標識がヒブリド化を阻害しないよ
うな方法で個々のヌクレオチドを標識するには種々の方
法が使用できる。これら標識された単量体ヌクレオチド
をポリヌクレオチドプローブへ結合させるにも、種々の
化学的および酵素的方法が使用できる。例えば、２’−
デオキシウリジン５’−トリホスフェート５−アリルア
ミンビオチンのような標識されたヌクレオチドを、ＤＮ
Ａプローブにおいてニック翻訳によって置換することが
でき〔P. R. Langerら, "Enzymatic Synthesis Of Biot
in-Labeled Polynucleotides : Novel Nucleic Acid Af
finity Probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, p
p. 6633-37 (1981)〕、または末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼを用いるＤＮＡプローブへの末
端付加により置換することができる。
【００２７】しかしながら、これらの方法には製造上の
制約がある。例えば、標識された単量体ヌクレオチドを
ポリヌクレオチドプローブ中へ組み込む前に、これらヌ
クレオチドを合成する必要がある。この合成は、しばし
ば高価な化学的方法を包含する。ポリヌクレオチド中へ
の標識された単量体ヌクレオチドの結合も高価につく。
例えば酵素的結合に使用する酵素は高価である。これに
関連する制約は、この方法を工業的規模まで拡大するの
に困難を伴いかつ費用が嵩むことである。その結果、こ
れらの方法は、現在希望するよりも高価につく非放射性
標識したポリヌクレオチドを生産する。
制約がある。例えば、標識された単量体ヌクレオチドを
ポリヌクレオチドプローブ中へ組み込む前に、これらヌ
クレオチドを合成する必要がある。この合成は、しばし
ば高価な化学的方法を包含する。ポリヌクレオチド中へ
の標識された単量体ヌクレオチドの結合も高価につく。
例えば酵素的結合に使用する酵素は高価である。これに
関連する制約は、この方法を工業的規模まで拡大するの
に困難を伴いかつ費用が嵩むことである。その結果、こ
れらの方法は、現在希望するよりも高価につく非放射性
標識したポリヌクレオチドを生産する。
【００２８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、分析
物の検出においてプローブとして有用である生体内また
は生物学的に標識したポリヌクレオチドを提供すること
により、上記の製造上の制約を解消することである。こ
れらの配列は、問題とする分析物を検出するための方法
およびキットに使用することができる。
物の検出においてプローブとして有用である生体内また
は生物学的に標識したポリヌクレオチドを提供すること
により、上記の製造上の制約を解消することである。こ
れらの配列は、問題とする分析物を検出するための方法
およびキットに使用することができる。
【００２９】
【課題を解決するための手段】本発明の標識したＤＮＡ
の製造方法は、一般にその１具体例において、所望ポリ
ヌクレオチドの生体内標識化を包含する。或いは、本発
明の方法を使用して、予め標識された塩基、ヌクレオシ
ドもしくはヌクレオチドを所望のポリヌクレオチド中へ
生体内で組み込むこともできる。本発明のこれら両具体
例は、従来のポリヌクレオチド標識方法に対する改良で
ある。さらに、これら両者は、非放射性標識したプロー
ブを種々の検出系に使用するのに一層低価格で容易に供
給することを可能にする。
の製造方法は、一般にその１具体例において、所望ポリ
ヌクレオチドの生体内標識化を包含する。或いは、本発
明の方法を使用して、予め標識された塩基、ヌクレオシ
ドもしくはヌクレオチドを所望のポリヌクレオチド中へ
生体内で組み込むこともできる。本発明のこれら両具体
例は、従来のポリヌクレオチド標識方法に対する改良で
ある。さらに、これら両者は、非放射性標識したプロー
ブを種々の検出系に使用するのに一層低価格で容易に供
給することを可能にする。
【００３０】より詳細には、本発明のポリヌクレオチド
の生体内標識方法における第１の具体例は、標識しよう
とするポリヌクレオチドと少なくとも１種の他のポリヌ
クレオチドとを特徴とする宿主を培養する工程から成
り、前記他のポリヌクレオチドは、培養される宿主の複
製に際し、所望のポリヌクレオチドを標識する産生物を
発現する。好ましくは、この方法は、さらに標識された
ポリヌクレオチドから成る少なくとも１種のポリヌクレ
オチドを培養された宿主から単離する工程をも包含す
る。より好ましくは、培養された宿主から単離されたポ
リヌクレオチドは、標識されたポリヌクレオチド自身の
１部または全部である。
の生体内標識方法における第１の具体例は、標識しよう
とするポリヌクレオチドと少なくとも１種の他のポリヌ
クレオチドとを特徴とする宿主を培養する工程から成
り、前記他のポリヌクレオチドは、培養される宿主の複
製に際し、所望のポリヌクレオチドを標識する産生物を
発現する。好ましくは、この方法は、さらに標識された
ポリヌクレオチドから成る少なくとも１種のポリヌクレ
オチドを培養された宿主から単離する工程をも包含す
る。より好ましくは、培養された宿主から単離されたポ
リヌクレオチドは、標識されたポリヌクレオチド自身の
１部または全部である。
【００３１】本発明の１つの好適具体例においては、標
識しようとする異質ＤＮＡをＴ４バクテリオファージゲ
ノム（これは一般にヒドロキシメチル化されかつグルコ
シル化されたＤＮＡを含有する）中へ挿入する。宿主Ｔ
４ファージは、ヒドロキシメチル化されかつグルコシル
化されたＤＮＡを産生する条件下で増殖される。挿入さ
れたプローブＤＮＡを含有するＴ４ファージを回収し、
そしてプローブＤＮＡを好ましくは周知のin situ もし
くはin vitroヒブリド化法においてヒブリド化プローブ
として使用するために切断する（例えばサウザンブロッ
ト、ノーザンブロット、ドットブロット、コロニーヒブ
リド化またはプラークリフト法）。或いは、挿入された
生体内標識したプローブＤＮＡを含有するＴ４ファージ
ゲノムをプローブとして使用することもできる。
識しようとする異質ＤＮＡをＴ４バクテリオファージゲ
ノム（これは一般にヒドロキシメチル化されかつグルコ
シル化されたＤＮＡを含有する）中へ挿入する。宿主Ｔ
４ファージは、ヒドロキシメチル化されかつグルコシル
化されたＤＮＡを産生する条件下で増殖される。挿入さ
れたプローブＤＮＡを含有するＴ４ファージを回収し、
そしてプローブＤＮＡを好ましくは周知のin situ もし
くはin vitroヒブリド化法においてヒブリド化プローブ
として使用するために切断する（例えばサウザンブロッ
ト、ノーザンブロット、ドットブロット、コロニーヒブ
リド化またはプラークリフト法）。或いは、挿入された
生体内標識したプローブＤＮＡを含有するＴ４ファージ
ゲノムをプローブとして使用することもできる。
【００３２】次いで分析物へヒブリド化したプローブの
存在を、例えば架橋部分と信号部分との組合せを用いて
検出する。例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をグ
ルコシル化プローブＤＮＡ配列に結合させ、そして元来
グリコシル化されている酵素に対する架橋として作用さ
せる。酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）は適
当な基質（例えばＨ２Ｏ２やジアミノベンジジン）に接
触すると比色分析しうる生成物を生成し、これを検出す
ることができる。さらに、他の検出系または抗体、或い
は周知の方法を用いる他の検出系も、ヒブリド化ＤＮＡ
を検出するために使用することができる。
存在を、例えば架橋部分と信号部分との組合せを用いて
検出する。例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をグ
ルコシル化プローブＤＮＡ配列に結合させ、そして元来
グリコシル化されている酵素に対する架橋として作用さ
せる。酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）は適
当な基質（例えばＨ２Ｏ２やジアミノベンジジン）に接
触すると比色分析しうる生成物を生成し、これを検出す
ることができる。さらに、他の検出系または抗体、或い
は周知の方法を用いる他の検出系も、ヒブリド化ＤＮＡ
を検出するために使用することができる。
【００３３】本発明による方法の他の具体例において
は、所望の標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌ
クレオチドまたはその同族体もしくは先駆体を生体内で
ポリヌクレオチド中へ組み込む。この具体例において、
本発明のポリヌクレオチドの生体内標識方法は、標識し
ようとするポリヌクレオチドを特徴とする宿主をその宿
主が成長するのに必要とする標識を有する塩基、ヌクレ
オシドもしくはヌクレオチドまたはその同族体もしくは
先駆体の存在下で培養して、この標識をポリヌクレオチ
ド中へ組み込む工程を包含する。ここでも標識されたポ
リヌクレオチドから成る少なくとも１種のポリヌクレオ
チドを培養された宿主から単離することが好ましい。更
に好ましくは、培養された宿主から単離されたポリヌク
レオチドは、標識されたポリヌクレオチド自身の部また
は全部である。
は、所望の標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌ
クレオチドまたはその同族体もしくは先駆体を生体内で
ポリヌクレオチド中へ組み込む。この具体例において、
本発明のポリヌクレオチドの生体内標識方法は、標識し
ようとするポリヌクレオチドを特徴とする宿主をその宿
主が成長するのに必要とする標識を有する塩基、ヌクレ
オシドもしくはヌクレオチドまたはその同族体もしくは
先駆体の存在下で培養して、この標識をポリヌクレオチ
ド中へ組み込む工程を包含する。ここでも標識されたポ
リヌクレオチドから成る少なくとも１種のポリヌクレオ
チドを培養された宿主から単離することが好ましい。更
に好ましくは、培養された宿主から単離されたポリヌク
レオチドは、標識されたポリヌクレオチド自身の部また
は全部である。
【００３４】標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくは
ヌクレオチドまたはその同族体もしくは先駆体をポリヌ
クレオチド中へ生体内で組み込むための本発明による１
つの好適具体例において、標識しようとするポリヌクレ
オチドを特徴とするイー・コリのチミンもしくはチミジ
ン要求性の突然変異種をチミンもしくはチミジンの代わ
りにＢｒｄＵＲを補充した培地で増殖させて、所望のポ
リヌクレオチドをＢｒｄＵＲによって生物学的に標識す
る。
ヌクレオチドまたはその同族体もしくは先駆体をポリヌ
クレオチド中へ生体内で組み込むための本発明による１
つの好適具体例において、標識しようとするポリヌクレ
オチドを特徴とするイー・コリのチミンもしくはチミジ
ン要求性の突然変異種をチミンもしくはチミジンの代わ
りにＢｒｄＵＲを補充した培地で増殖させて、所望のポ
リヌクレオチドをＢｒｄＵＲによって生物学的に標識す
る。
【００３５】この標識プローブのその後の使用は実質的
に上記した通りである。プローブ検出／分析物ヒブリド
化の過程は、ＢｒｄＵＲ標識したプローブＤＮＡのビオ
チン化と幾つかの公知方法のいずれかによるビオチン成
分の検出を介して行うことができる。或いは、抗体また
は他の検出方式を使用して、ＢｒｄＵＲ置換したＤＮＡ
を直接に検出することもできる〔H. G. Gratzner, "Mon
oclonal Antibody To5-Bromo- and 5-Iodo-deoxyuridin
e : A new Reagent For Detection Of DNA Replicatio
n", Science , 218, pp. 474-75 (1982)〕。
に上記した通りである。プローブ検出／分析物ヒブリド
化の過程は、ＢｒｄＵＲ標識したプローブＤＮＡのビオ
チン化と幾つかの公知方法のいずれかによるビオチン成
分の検出を介して行うことができる。或いは、抗体また
は他の検出方式を使用して、ＢｒｄＵＲ置換したＤＮＡ
を直接に検出することもできる〔H. G. Gratzner, "Mon
oclonal Antibody To5-Bromo- and 5-Iodo-deoxyuridin
e : A new Reagent For Detection Of DNA Replicatio
n", Science , 218, pp. 474-75 (1982)〕。
【００３６】
【発明の実施の形態】本発明をより一層良く理解するた
めに、以下詳細に説明する。
めに、以下詳細に説明する。
【００３７】生体内標識されるポリヌクレオチドの原料 多数のポリヌクレオチドを本発明の方法に使用して標識
しかつ分析物の検出に使用することができる。例えば、
これには各種のウィルス、ウィロイド、真菌、寄生虫ま
たは細菌の感染、遺伝子障害を特徴づけるポリヌクレオ
チド、または検出しようとする分析物における他のポリ
ヌクレオチドが包含される。これらは合成物、半合成
物、または天然由来物とすることができる。
しかつ分析物の検出に使用することができる。例えば、
これには各種のウィルス、ウィロイド、真菌、寄生虫ま
たは細菌の感染、遺伝子障害を特徴づけるポリヌクレオ
チド、または検出しようとする分析物における他のポリ
ヌクレオチドが包含される。これらは合成物、半合成
物、または天然由来物とすることができる。
【００３８】多数の入手しうる原料のいずれかを使用し
て、生体内標識されたポリヌクレオチドを産生させるこ
とができる。例えば、Ｔ−偶数ファージ（すなわちＴ
２、Ｔ４、およびＴ６）が包含され、これらは天然にお
いてモノリン酸シチジンの代わりにグルコシル化された
モノリン酸ヒドロキシメチルデオキシシチジンを有する
〔I. R. Lehmanら, J. Biol. Chem., 235, pp. 3254-59
(1960) 〕；さらに５−ヒドロキシメチルウラシルによ
りチミジン残基を置換する枯草菌ファージＳＰＯ１〔R.
G. Kallenら, J. Mol. Biol., 5, pp. 248-50 (1962)
〕；５−メチルシトシンによりＣ残基を置換するキサ
ントモナス・オリゼ（Xanthomonus oryzea）ファージＸ
Ｐ１２〔T. T. Kuo ら, J. Mol. Biol., 34, pp. 373-7
5 (1968)〕；並びにＴ残基の６２％がホスホグルクロン
化されかつグルコシル化された５-(４',５'-ジヒドロキ
シペンチル）ウラシルにより置換された枯草菌ファージ
ＳＰ１５〔H. Hayashiら, J. Amec. Chem. Soc. , 95,
pp. 8749-57 (1973)〕が包含される。そして本発明の変
法において、５−ブロム−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ
Ｒ）または他の標識された塩基、ヌクレオシドもしくは
ヌクレオチドによるプローブＤＮＡの標識化は、これら
塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを成長に必要
とする突然変異種をこれらの存在下で増殖させて行う。
て、生体内標識されたポリヌクレオチドを産生させるこ
とができる。例えば、Ｔ−偶数ファージ（すなわちＴ
２、Ｔ４、およびＴ６）が包含され、これらは天然にお
いてモノリン酸シチジンの代わりにグルコシル化された
モノリン酸ヒドロキシメチルデオキシシチジンを有する
〔I. R. Lehmanら, J. Biol. Chem., 235, pp. 3254-59
(1960) 〕；さらに５−ヒドロキシメチルウラシルによ
りチミジン残基を置換する枯草菌ファージＳＰＯ１〔R.
G. Kallenら, J. Mol. Biol., 5, pp. 248-50 (1962)
〕；５−メチルシトシンによりＣ残基を置換するキサ
ントモナス・オリゼ（Xanthomonus oryzea）ファージＸ
Ｐ１２〔T. T. Kuo ら, J. Mol. Biol., 34, pp. 373-7
5 (1968)〕；並びにＴ残基の６２％がホスホグルクロン
化されかつグルコシル化された５-(４',５'-ジヒドロキ
シペンチル）ウラシルにより置換された枯草菌ファージ
ＳＰ１５〔H. Hayashiら, J. Amec. Chem. Soc. , 95,
pp. 8749-57 (1973)〕が包含される。そして本発明の変
法において、５−ブロム−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ
Ｒ）または他の標識された塩基、ヌクレオシドもしくは
ヌクレオチドによるプローブＤＮＡの標識化は、これら
塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを成長に必要
とする突然変異種をこれらの存在下で増殖させて行う。
【００３９】標識しようとするポリヌクレオチドと標識
の原料とは、多くの方法で宿主中において組み合わせる
ことができる。例えば、標識しようとするポリヌクレオ
チドは、元来、特定宿主のゲノムの１部とすることがで
き、或いは例えば組換えＤＮＡ技術の方法を用いてその
ゲノム中へ挿入することもできる。或いは、標識すべき
ポリヌクレオチドは、複製させかつ標識するよう宿主を
形質転換させるのに使用するクローン化ベヒクル、ファ
ージＤＮＡまたはその他のＤＮＡの１部とすることもで
きる。
の原料とは、多くの方法で宿主中において組み合わせる
ことができる。例えば、標識しようとするポリヌクレオ
チドは、元来、特定宿主のゲノムの１部とすることがで
き、或いは例えば組換えＤＮＡ技術の方法を用いてその
ゲノム中へ挿入することもできる。或いは、標識すべき
ポリヌクレオチドは、複製させかつ標識するよう宿主を
形質転換させるのに使用するクローン化ベヒクル、ファ
ージＤＮＡまたはその他のＤＮＡの１部とすることもで
きる。
【００４０】さらに標識に原料を、種々の方法で宿主中
に存在させることもできる。例えば、標識の原料が、標
識しようとするポリヌクレオチドを特徴とする宿主中で
そのポリヌクレオチドが複製する際にそのポリペプチド
を標識する産生物を発現するＤＮＡである場合、このＤ
ＮＡを宿主中に存在させることができる。なぜならば、
これは宿主の天然ゲノムの１部であったか、或いはその
ゲノム中に挿入されたものであるからである。或いは、
標識の原料であるＤＮＡ配列は、複製のために宿主を形
質転換させるのに使用するクローン化ベヒクル、ファー
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡの１部とすることもでき
る。本発明の１つの好適具体例において、標識すべきポ
リヌクレオチドは、標識の原料であるＤＮＡと同じクロ
ーン化ベヒクルまたはファージＤＮＡに存在する。或い
は、２種のＤＮＡが宿主中に別々に存在していても良
い。特に好ましくは、標識すべきポリヌクレオチドを、
標識に原料であるＤＮＡ中にクローン化させる。いずれ
にせよ、宿主を培養する際、所望のＤＮＡは、複製中ま
たは複製後に、標識の原料であるＤＮＡにより発現され
た産生物の結果として標識される。
に存在させることもできる。例えば、標識の原料が、標
識しようとするポリヌクレオチドを特徴とする宿主中で
そのポリヌクレオチドが複製する際にそのポリペプチド
を標識する産生物を発現するＤＮＡである場合、このＤ
ＮＡを宿主中に存在させることができる。なぜならば、
これは宿主の天然ゲノムの１部であったか、或いはその
ゲノム中に挿入されたものであるからである。或いは、
標識の原料であるＤＮＡ配列は、複製のために宿主を形
質転換させるのに使用するクローン化ベヒクル、ファー
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡの１部とすることもでき
る。本発明の１つの好適具体例において、標識すべきポ
リヌクレオチドは、標識の原料であるＤＮＡと同じクロ
ーン化ベヒクルまたはファージＤＮＡに存在する。或い
は、２種のＤＮＡが宿主中に別々に存在していても良
い。特に好ましくは、標識すべきポリヌクレオチドを、
標識に原料であるＤＮＡ中にクローン化させる。いずれ
にせよ、宿主を培養する際、所望のＤＮＡは、複製中ま
たは複製後に、標識の原料であるＤＮＡにより発現され
た産生物の結果として標識される。
【００４１】標識の原料が、塩基、ヌクレオシドもしく
はヌクレオチドまたはその同族体もしくは先駆体である
場合、これは宿主における複製の際に所望のポリヌクレ
オチド中に組み込まれる。なぜならば、この宿主は、成
長のために、所望の標識を有する標識保持物質、すなわ
ち塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドまたはその
同族体もしくは先駆体を培養培地へ加えることを必要と
する変種であるからである。次いで、本発明の方法によ
り培養する際、所望のポリヌクレオチド配列が、宿主に
おける複製に際し標識の組み込みによって生体内標識さ
れる。
はヌクレオチドまたはその同族体もしくは先駆体である
場合、これは宿主における複製の際に所望のポリヌクレ
オチド中に組み込まれる。なぜならば、この宿主は、成
長のために、所望の標識を有する標識保持物質、すなわ
ち塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドまたはその
同族体もしくは先駆体を培養培地へ加えることを必要と
する変種であるからである。次いで、本発明の方法によ
り培養する際、所望のポリヌクレオチド配列が、宿主に
おける複製に際し標識の組み込みによって生体内標識さ
れる。
【００４２】本発明の方法に有用な宿主は、極めて多く
の公知生物から選択することができる。これらは、例え
ばイー・コリ、バチルス、シュードモナス、ストレプト
ミセス並びに各種の真菌類、藻類のような各種の微生物
並びに植物およびヒトの培養細胞を包含する。必要なこ
とは、標識しようとするポリヌクレオチドを宿主中で複
製させ、かつ宿主の増殖のために選択された培養条件下
で標識の原料により標識することだけである。
の公知生物から選択することができる。これらは、例え
ばイー・コリ、バチルス、シュードモナス、ストレプト
ミセス並びに各種の真菌類、藻類のような各種の微生物
並びに植物およびヒトの培養細胞を包含する。必要なこ
とは、標識しようとするポリヌクレオチドを宿主中で複
製させ、かつ宿主の増殖のために選択された培養条件下
で標識の原料により標識することだけである。
【００４３】分析物の原料および検出 本発明の生物学的に産出されたプローブＤＮＡは、多く
の実用的用途を有する。１つの用途は分析物の検出であ
る。検出すべき分析物は任意の生物学的または非生物学
的試料、例えば臨床試料（例えば血液、尿、糞便、唾
液、膿、精子、血清、その他の組織）、発酵用ブロス、
培養培地などに存在することができる。
の実用的用途を有する。１つの用途は分析物の検出であ
る。検出すべき分析物は任意の生物学的または非生物学
的試料、例えば臨床試料（例えば血液、尿、糞便、唾
液、膿、精子、血清、その他の組織）、発酵用ブロス、
培養培地などに存在することができる。
【００４４】必要に応じ、分析物は、その核酸を濃縮す
るために公知方法により予備抽出し或いは精製すること
ができる。この種の核酸濃縮法は、例えばフェノール抽
出、クロロホルム−イソアミルアルコールもしくはクロ
ロホルム−オクタノールによる処理、カラムクロマトグ
ラフィー（例えば、セファデックス、ヒドロキシルアパ
タイト）およびＣｓＣｌ平行遠心分離を包含する。分析
物は、存在する夾雑物と一緒に混合物中で或いは精製し
た状態で試験することができ、或いは分析物は分析前に
固定化することもできる。
るために公知方法により予備抽出し或いは精製すること
ができる。この種の核酸濃縮法は、例えばフェノール抽
出、クロロホルム−イソアミルアルコールもしくはクロ
ロホルム−オクタノールによる処理、カラムクロマトグ
ラフィー（例えば、セファデックス、ヒドロキシルアパ
タイト）およびＣｓＣｌ平行遠心分離を包含する。分析
物は、存在する夾雑物と一緒に混合物中で或いは精製し
た状態で試験することができ、或いは分析物は分析前に
固定化することもできる。
【００４５】本発明の検出方法およびキットについても
多数の用途がある。試料中において検出しかつ分析しよ
うとする任意の分析物を本発明の方法及びキットにかけ
ることができる。例えば、この方法およびキットを使用
して、ウィルス性および細菌性のＤＮＡを検出し、かつ
同定することができ、例えばヘルペスウィルスの検出が
可能である。
多数の用途がある。試料中において検出しかつ分析しよ
うとする任意の分析物を本発明の方法及びキットにかけ
ることができる。例えば、この方法およびキットを使用
して、ウィルス性および細菌性のＤＮＡを検出し、かつ
同定することができ、例えばヘルペスウィルスの検出が
可能である。
【００４６】さらに本発明の方法およびキットを使用し
てヒトの遺伝子障害を診断することができ、その際遺伝
子障害に関連するＤＮＡに対し相補的なプローブを作製
し、かつ主たる識別過程の存在または不存在を検出す
る。これらの遺伝子障害には、例えば地中海貧血症があ
る。この地中海貧血症の診断は、プローブポリヌクレオ
チドをゲノムＤＮＡへヒブリド化させて行うことができ
る。
てヒトの遺伝子障害を診断することができ、その際遺伝
子障害に関連するＤＮＡに対し相補的なプローブを作製
し、かつ主たる識別過程の存在または不存在を検出す
る。これらの遺伝子障害には、例えば地中海貧血症があ
る。この地中海貧血症の診断は、プローブポリヌクレオ
チドをゲノムＤＮＡへヒブリド化させて行うことができ
る。
【００４７】本発明の方法およびキットの他の用途は染
色体の核型分類であり、これは染色体のそれぞれに特異
的に位置する一連の特定ＤＮＡに対応する一連の標識ポ
リヌクレオチドを使用し、次いで主たる識別過程を検出
することから成っている。
色体の核型分類であり、これは染色体のそれぞれに特異
的に位置する一連の特定ＤＮＡに対応する一連の標識ポ
リヌクレオチドを使用し、次いで主たる識別過程を検出
することから成っている。
【００４８】ヒブリド化分析の方法 試験を行うため、分析物を含有すると思われる組成物
を、標識されたプローブポリヌクレオチドと一緒に、分
析物のポリヌクレオチドとプローブ上の識別用ポリヌク
レオチドとの間のヒブリド化を惹起するのに充分な時間
および条件の下で培養する。これらの条件は、分析物お
よびプローブの性質および量に応じて変化する〔D. E.
Kennell, "Principles And Practices Of Nucleic Acid
Hybridization", Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Bio
l., 11, pp. 259-301 (1971)〕。
を、標識されたプローブポリヌクレオチドと一緒に、分
析物のポリヌクレオチドとプローブ上の識別用ポリヌク
レオチドとの間のヒブリド化を惹起するのに充分な時間
および条件の下で培養する。これらの条件は、分析物お
よびプローブの性質および量に応じて変化する〔D. E.
Kennell, "Principles And Practices Of Nucleic Acid
Hybridization", Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Bio
l., 11, pp. 259-301 (1971)〕。
【００４９】多くの種類の信号過程を用いて、主たる識
別過程の発生、すなわち分析物における相補配列に対す
る標識ＤＮＡのヒブリド化を検出することができる。選
択する特定の信号過程は、ポリヌクレオチドの標識また
は改変標識を特徴とする特定の信号に依存する。
別過程の発生、すなわち分析物における相補配列に対す
る標識ＤＮＡのヒブリド化を検出することができる。選
択する特定の信号過程は、ポリヌクレオチドの標識また
は改変標識を特徴とする特定の信号に依存する。
【００５０】例えば、ポリヌクレオチドにより担持され
る標識は、これに信号部分または架橋部分と信号部分と
の少なくとも１つの組合せを結合させる処理なしに検出
することができる。しかしながら、より一般的にはそれ
自身で検出しうる或いはさらに改変した後に検出し得る
ようになる（上記）信号部分或いは架橋部分と信号部分
との少なくとも１つの組合せを共有結合させ、または非
共有結合させる。
る標識は、これに信号部分または架橋部分と信号部分と
の少なくとも１つの組合せを結合させる処理なしに検出
することができる。しかしながら、より一般的にはそれ
自身で検出しうる或いはさらに改変した後に検出し得る
ようになる（上記）信号部分或いは架橋部分と信号部分
との少なくとも１つの組合せを共有結合させ、または非
共有結合させる。
【００５１】ポリヌクレオチドの標識に共有結合させう
る信号部分および架橋部分の例は、放射性化合物、蛍光
性化合物、フルオレシン、ローダミン、ダンシル、磁性
化合物、キレート剤並びにこれら標識に対し共有結合さ
せうるその他の信号部分および架橋部分を包含する。
る信号部分および架橋部分の例は、放射性化合物、蛍光
性化合物、フルオレシン、ローダミン、ダンシル、磁性
化合物、キレート剤並びにこれら標識に対し共有結合さ
せうるその他の信号部分および架橋部分を包含する。
【００５２】ポリヌクレオチドの標識に対し、非共有結
合させうる信号部分および架橋部分の例はポリペプチ
ド、蛋白質、レクチン、ＣｏＡ、酵素、アルカリホスフ
ァターゼ、酸ホスファターゼ、抗原、抗体、結合された
ストレプトアビジン基を有するポリペプチド、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、キレート剤並びにこれら標識に対し非
共有結合させうるその他の信号部分および架橋部分を包
含する。
合させうる信号部分および架橋部分の例はポリペプチ
ド、蛋白質、レクチン、ＣｏＡ、酵素、アルカリホスフ
ァターゼ、酸ホスファターゼ、抗原、抗体、結合された
ストレプトアビジン基を有するポリペプチド、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、キレート剤並びにこれら標識に対し非
共有結合させうるその他の信号部分および架橋部分を包
含する。
【００５３】例えば、酵素を信号部分としてポリヌクレ
オチドプローブの標識へ非共有結合させることができ
る。次いで、基質を加えて発色させる（蛍光、放射能も
しくはキレート検出の方式も使用することができる）。
或いは、標識に結合された部分がビオチン成分であれ
ば、例えばアビジン、ストレプトアビジンまたはアンチ
−ビオチン抗体のようなビオチン結合分子を次いでこれ
に加えることもできる。次いで、ビオチン結合分子が酵
素、蛍光性化合物、電子密度の濃い化合物または不溶性
固体相へ結合させて、適当な手段により検出を行うこと
ができる。
オチドプローブの標識へ非共有結合させることができ
る。次いで、基質を加えて発色させる（蛍光、放射能も
しくはキレート検出の方式も使用することができる）。
或いは、標識に結合された部分がビオチン成分であれ
ば、例えばアビジン、ストレプトアビジンまたはアンチ
−ビオチン抗体のようなビオチン結合分子を次いでこれ
に加えることもできる。次いで、ビオチン結合分子が酵
素、蛍光性化合物、電子密度の濃い化合物または不溶性
固体相へ結合させて、適当な手段により検出を行うこと
ができる。
【００５４】
【実施例】本発明を一層良く理解するよう、以下に実施
例を示す。これら実施例は、本発明の説明を目的とする
ものであって、本発明を限定するものではない。
例を示す。これら実施例は、本発明の説明を目的とする
ものであって、本発明を限定するものではない。
【００５５】実施例１ Ａ）バクテリオファージＴ４におけるグルコシル化プロ
ーブＤＮＡの産生 組換えＤＮＡ技術を用いて、プローブＤＮＡを、グルコ
シル残基で標識するためにＴ４バクテリオファージ中に
挿入することができる。
ーブＤＮＡの産生 組換えＤＮＡ技術を用いて、プローブＤＮＡを、グルコ
シル残基で標識するためにＴ４バクテリオファージ中に
挿入することができる。
【００５６】Ｔ４ＤＮＡは、天然グルコシル化されてい
る。一般的に使用される制限エンドヌクレアーゼの殆ど
は、グルコシル化ＤＮＡを加水分解しないので、エンド
ヌクレアーゼによる開裂およびプローブＤＮＡの挿入に
先立ってＴ４ＤＮＡからグルコース残基を除去する必要
がある。ファージによって誘導される酵素、ヒドロキシ
メチルシチジングルコシダーゼは、グルコース部分をグ
ルコシル化ＤＮＡから除去して、これをその逆反応でＵ
ＤＰへ移動させる〔J. Josseら、J. Biol. Che m., 237,
pp. 1968-76 (1962) ; S. R. Zimmerman ら、J. Biol.
Chem., 237, pp. 512-18 (1962)〕。或いは、Ｔ４ファ
ージを、シトシンがヒドロキシメチル誘導体を置換する
ような条件下で増殖させることもできる〔K. Carlson
ら、J. Vir ol., 36, pp. 1-17 (1979) ; P. O'Farrell
ら、Mol. Gen. Genet., 179, pp. 421-35 (1980) ; L.
Snyder ら、Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 73, pp. 309
8-3102 (1976) 〕。
る。一般的に使用される制限エンドヌクレアーゼの殆ど
は、グルコシル化ＤＮＡを加水分解しないので、エンド
ヌクレアーゼによる開裂およびプローブＤＮＡの挿入に
先立ってＴ４ＤＮＡからグルコース残基を除去する必要
がある。ファージによって誘導される酵素、ヒドロキシ
メチルシチジングルコシダーゼは、グルコース部分をグ
ルコシル化ＤＮＡから除去して、これをその逆反応でＵ
ＤＰへ移動させる〔J. Josseら、J. Biol. Che m., 237,
pp. 1968-76 (1962) ; S. R. Zimmerman ら、J. Biol.
Chem., 237, pp. 512-18 (1962)〕。或いは、Ｔ４ファ
ージを、シトシンがヒドロキシメチル誘導体を置換する
ような条件下で増殖させることもできる〔K. Carlson
ら、J. Vir ol., 36, pp. 1-17 (1979) ; P. O'Farrell
ら、Mol. Gen. Genet., 179, pp. 421-35 (1980) ; L.
Snyder ら、Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 73, pp. 309
8-3102 (1976) 〕。
【００５７】Ｔ４ＤＮＡが上記のように脱グルコシル化
された後、プローブＤＮＡ配列を脱グルコシル化された
Ｔ４ゲノム中へ挿入する。脱グルコシル化Ｔ４ゲノム中
へのプローブＤＮＡの挿入は、各種の公知方法で行うこ
ともできるが、これは標識の後にＴ４ＤＮＡから除去し
得るような方法で挿入するのが好適である。
された後、プローブＤＮＡ配列を脱グルコシル化された
Ｔ４ゲノム中へ挿入する。脱グルコシル化Ｔ４ゲノム中
へのプローブＤＮＡの挿入は、各種の公知方法で行うこ
ともできるが、これは標識の後にＴ４ＤＮＡから除去し
得るような方法で挿入するのが好適である。
【００５８】Ｔ４ファージにおいては、Ｃ残基のみがグ
ルコシル化されているので、ＤＮＡ配列ＴＴＴＡＡＡを
識別し、かつ開裂する制限エンドヌクレアーゼAha III
が原Ｔ４ＤＮＡを開裂しうる数少ないエンドヌクレアー
ゼの１種である。従って、本発明の１つの好適具体例に
おいて、プローブＤＮＡは、部分脱グルコシル化された
Ｔ４ＤＮＡ中へ挿入する前に両末端にAha III 制限部位
を有するように改変される（図１）。このような構成に
おいて、プローブＤＮＡは次いでAha III での制限によ
りＴ４ＤＮＡから、標識の後に単離することができる。
ルコシル化されているので、ＤＮＡ配列ＴＴＴＡＡＡを
識別し、かつ開裂する制限エンドヌクレアーゼAha III
が原Ｔ４ＤＮＡを開裂しうる数少ないエンドヌクレアー
ゼの１種である。従って、本発明の１つの好適具体例に
おいて、プローブＤＮＡは、部分脱グルコシル化された
Ｔ４ＤＮＡ中へ挿入する前に両末端にAha III 制限部位
を有するように改変される（図１）。このような構成に
おいて、プローブＤＮＡは次いでAha III での制限によ
りＴ４ＤＮＡから、標識の後に単離することができる。
【００５９】ＤＮＡプローブの作製、Ｔ４ＤＮＡ中への
その挿入および標識後におけるその除去に関する一般的
方法を下記に説明し、且つ図１に示す： (1) まず最初にＤＮＡ配列ｐＴＴＴＡＡＡｐ（公知技術
により合成）をプローブＤＮＡの３’末端に結合させ、
これをＲＮＡリガーゼを用いてＴ４ゲノム内に挿入す
る。コンカテマーの生成を防止するには、ＤＮＡ配列ｐ
ＴＴＴＡＡＡｐの３’末端と５’末端との両者にリン酸
を必要とする。
その挿入および標識後におけるその除去に関する一般的
方法を下記に説明し、且つ図１に示す： (1) まず最初にＤＮＡ配列ｐＴＴＴＡＡＡｐ（公知技術
により合成）をプローブＤＮＡの３’末端に結合させ、
これをＲＮＡリガーゼを用いてＴ４ゲノム内に挿入す
る。コンカテマーの生成を防止するには、ＤＮＡ配列ｐ
ＴＴＴＡＡＡｐの３’末端と５’末端との両者にリン酸
を必要とする。
【００６０】次いで、プライマＤＮＡであるＴＴＴＡＡ
Ａｐ（常法により合成）を上記で作製されたＤＮＡへ非
共有結合させる（図１）。このＤＮＡ（ＴＴＴＡＡＡ
ｐ）は、プライマとして作用し、従ってＤＮＡポリメラ
ーゼとデオキシヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ，ｄＧＴＰおよびデオキシヒドロキシメチルＣＴＰ
（ｄＨＭＣＴＰ）の存在下で複製する際、２つのＤＮＡ
が生成される（図１）。これらのＤＮＡは、プローブＤ
ＮＡ配列の対抗末端にAha III 制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を有する（図１）。これらはさらに、ＤＮＡ鎖
の一方に標識を有する。
Ａｐ（常法により合成）を上記で作製されたＤＮＡへ非
共有結合させる（図１）。このＤＮＡ（ＴＴＴＡＡＡ
ｐ）は、プライマとして作用し、従ってＤＮＡポリメラ
ーゼとデオキシヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ，ｄＧＴＰおよびデオキシヒドロキシメチルＣＴＰ
（ｄＨＭＣＴＰ）の存在下で複製する際、２つのＤＮＡ
が生成される（図１）。これらのＤＮＡは、プローブＤ
ＮＡ配列の対抗末端にAha III 制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を有する（図１）。これらはさらに、ＤＮＡ鎖
の一方に標識を有する。
【００６１】第２のAha III 認識部位をプローブＤＮＡ
配列の他の末端へ付加させるため、同様な一連の工程を
実施する。ここでもＤＮＡ配列ｐＴＴＴＡＡＡｐを予め
作製されたＤＮＡ配列の３´末端へ結合させる。次いで
ＤＮＡＴＴＴＡＡＡｐをプライマとして使用して生成し
たＤＮＡへ非共有結合させ（図１）、そして処理された
配列をＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキシヌクレ
オチド三リン酸の存在下で前記の様に複製させる（図
１）。
配列の他の末端へ付加させるため、同様な一連の工程を
実施する。ここでもＤＮＡ配列ｐＴＴＴＡＡＡｐを予め
作製されたＤＮＡ配列の３´末端へ結合させる。次いで
ＤＮＡＴＴＴＡＡＡｐをプライマとして使用して生成し
たＤＮＡへ非共有結合させ（図１）、そして処理された
配列をＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキシヌクレ
オチド三リン酸の存在下で前記の様に複製させる（図
１）。
【００６２】この一連の工程の結果、各端部がAha III
制限エンドヌクレアーゼ認識部位でフランキングされ、
かつ両ＤＮＡ鎖に標識を有するプローブＤＮＡから成る
ＤＮＡが生成される（図１）。これら工程の副産物とし
て、２種の単一鎖ＤＮＡも生成される。これらの単一鎖
ＤＮＡは、２つのAha III 制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を有する目的のプローブＤＮＡから容易に分離する
ことができる。
制限エンドヌクレアーゼ認識部位でフランキングされ、
かつ両ＤＮＡ鎖に標識を有するプローブＤＮＡから成る
ＤＮＡが生成される（図１）。これら工程の副産物とし
て、２種の単一鎖ＤＮＡも生成される。これらの単一鎖
ＤＮＡは、２つのAha III 制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を有する目的のプローブＤＮＡから容易に分離する
ことができる。
【００６３】次いで、プローブＤＮＡをＴ４ゲノム中へ
挿入する前に、リン酸基をプローブＤＮＡの末端からア
ルカリホスファターゼにより除去する。
挿入する前に、リン酸基をプローブＤＮＡの末端からア
ルカリホスファターゼにより除去する。
【００６４】(2) 上述と同様に作製された部分脱グルコ
シル化されたファージＴ４ＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼにより開裂させた後、プローブＤＮＡをＴ４ゲノム
の非必須部分中、すなわちファージ複製、ヒドロキシメ
チルシトシン生成およびＤＮＡグルコシル化に必要とさ
れない遺伝子中へ挿入する。Bam HIは、このような部位
においてＴ４ＤＮＡを開裂する。開裂の後、必要に応じ
単一鎖末端をＤＮＡポリメラーゼＩによってＡＴＰ，Ｔ
ＴＰ，ＧＴＰおよびｄＨＭＣＴＰの存在下で埋め込む。
シル化されたファージＴ４ＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼにより開裂させた後、プローブＤＮＡをＴ４ゲノム
の非必須部分中、すなわちファージ複製、ヒドロキシメ
チルシトシン生成およびＤＮＡグルコシル化に必要とさ
れない遺伝子中へ挿入する。Bam HIは、このような部位
においてＴ４ＤＮＡを開裂する。開裂の後、必要に応じ
単一鎖末端をＤＮＡポリメラーゼＩによってＡＴＰ，Ｔ
ＴＰ，ＧＴＰおよびｄＨＭＣＴＰの存在下で埋め込む。
【００６５】(3) Aha III 認識部位を有するプローブＤ
ＮＡ配列をＴ４ゲノムの予め開裂された非必須領域へ鈍
端結合させる〔V. Sgramella, "Enzymatic Oligomeriza
tion Of Bacteriophage P22 DNA And Of Linear Simian
Virus 40 DNA", Proc. Natl. Acd. Sci. USA , 69, pp.
3389-93 (1972)〕。
ＮＡ配列をＴ４ゲノムの予め開裂された非必須領域へ鈍
端結合させる〔V. Sgramella, "Enzymatic Oligomeriza
tion Of Bacteriophage P22 DNA And Of Linear Simian
Virus 40 DNA", Proc. Natl. Acd. Sci. USA , 69, pp.
3389-93 (1972)〕。
【００６６】(4) プローブをＴ４ゲノム中へ挿入した
後、好ましくは全組換えＤＮＡ分子をαおよびβグルコ
シルトランスフェラーゼによってＵＤＰ−グルコースの
存在下で〔J. Josseら、上述〕in vitroでグルコシル化
することにより、組換えＤＮＡ分子をファージのエンド
ヌクレアーゼ攻撃から保護する。
後、好ましくは全組換えＤＮＡ分子をαおよびβグルコ
シルトランスフェラーゼによってＵＤＰ−グルコースの
存在下で〔J. Josseら、上述〕in vitroでグルコシル化
することにより、組換えＤＮＡ分子をファージのエンド
ヌクレアーゼ攻撃から保護する。
【００６７】(5) 組換えＴ４プローブＤＮＡ分子のin v
itroにおける被包は、L. W. Black, "In Vitro Packagi
ng Of Bacteriophage T4 DNA", Virology , 113, pp. 3
36-44(1981)の方法に従って行うことができる。
itroにおける被包は、L. W. Black, "In Vitro Packagi
ng Of Bacteriophage T4 DNA", Virology , 113, pp. 3
36-44(1981)の方法に従って行うことができる。
【００６８】(6) プローブＤＮＡを含有するこれらクロ
ーンに関する形質転換宿主Ｔ４ファージのスクリーニン
グは、相補的ビオチン化ＤＮＡプローブを用いたヒブリ
ド化によって、またはその他任意の慣用的なスクリーニ
ング方法によって実施される。
ーンに関する形質転換宿主Ｔ４ファージのスクリーニン
グは、相補的ビオチン化ＤＮＡプローブを用いたヒブリ
ド化によって、またはその他任意の慣用的なスクリーニ
ング方法によって実施される。
【００６９】(7) ＤＮＡを多くの公知の方法のいずれか
により、プローブＤＮＡを含有するＴ４クローンから単
離する〔例えば、G. L. Cantoni およびD. R. Davies
編、Proc edures in Nucleic Acid Reserch, New York：
Harper and Row (1966) を参照〕。
により、プローブＤＮＡを含有するＴ４クローンから単
離する〔例えば、G. L. Cantoni およびD. R. Davies
編、Proc edures in Nucleic Acid Reserch, New York：
Harper and Row (1966) を参照〕。
【００７０】(8) 生体内標識されたプローブＤＮＡは、
組換えＴ４ゲノムから取り出すことができ、これを上述
のように作製されたフランキング配列でAha III 制限エ
ンドヌクレアーゼで開裂することにより、検出系で使用
することができる。或いは、プローブＤＮＡを含有する
全組換えＴ４ゲノムをプローブとして使用することもで
きる。
組換えＴ４ゲノムから取り出すことができ、これを上述
のように作製されたフランキング配列でAha III 制限エ
ンドヌクレアーゼで開裂することにより、検出系で使用
することができる。或いは、プローブＤＮＡを含有する
全組換えＴ４ゲノムをプローブとして使用することもで
きる。
【００７１】Ｂ）グルコシル化ＤＮＡの検出：コンカナ
バリンＡ−グリコシル化酵素複合体の使用 ＣｏｎＡ、すなわち架橋部分は、グルコシル化ＤＮＡと
グリコシル化蛋白質（信号部分）との両者に結合する。
ｐＨ５および室温よりも低い温度にて、ＣｏｎＡは２量
体であって、２つのグリコシル結合部位を有する。生理
的ｐＨおよび室温もしくはそれより若干高い温度（３７
℃）にて、原ＣｏｎＡは４量体であって、４つの結合部
位を有する。アルカリ性（ｐＨ８．５以上）かつより高
温において、ＣｏｎＡは不活性なサブユニットに解離す
る。ＣｏｎＡがグリコシル残基に結合するには、マンガ
ンもしくはマグネシウムとカルシウムとが必要とされ
る。ＣｏｎＡの保存溶液をＴＣＭＮ緩衝液（５ｍＭトリ
スＨＣｌ，ｐＨ７．０，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ
ＭｎＣｌ２，１Ｍ ＮａＣｌ）における１〜５ｍｇ／ｍ
ｌの濃度にてガラス管の中に保つ。なぜなら、ＣｏｎＡ
は、５ｍｇ／ｍｌより大きい濃度にてプラスチック表面
に付着しかつ凝固するからである。ＣｏｎＡは、４℃に
て約３ヶ月間貯蔵することができる。
バリンＡ−グリコシル化酵素複合体の使用 ＣｏｎＡ、すなわち架橋部分は、グルコシル化ＤＮＡと
グリコシル化蛋白質（信号部分）との両者に結合する。
ｐＨ５および室温よりも低い温度にて、ＣｏｎＡは２量
体であって、２つのグリコシル結合部位を有する。生理
的ｐＨおよび室温もしくはそれより若干高い温度（３７
℃）にて、原ＣｏｎＡは４量体であって、４つの結合部
位を有する。アルカリ性（ｐＨ８．５以上）かつより高
温において、ＣｏｎＡは不活性なサブユニットに解離す
る。ＣｏｎＡがグリコシル残基に結合するには、マンガ
ンもしくはマグネシウムとカルシウムとが必要とされ
る。ＣｏｎＡの保存溶液をＴＣＭＮ緩衝液（５ｍＭトリ
スＨＣｌ，ｐＨ７．０，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ
ＭｎＣｌ２，１Ｍ ＮａＣｌ）における１〜５ｍｇ／ｍ
ｌの濃度にてガラス管の中に保つ。なぜなら、ＣｏｎＡ
は、５ｍｇ／ｍｌより大きい濃度にてプラスチック表面
に付着しかつ凝固するからである。ＣｏｎＡは、４℃に
て約３ヶ月間貯蔵することができる。
【００７２】(1) ＣｏｎＡおよびグリコシル化酵素によ
るグルコシル化ＤＮＡの順次の処理 グルコシル化されたＴ４ＤＮＡをドットしたニトロセル
ロース紙を、２％酸性化ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、１×ＴＣＭＮおよび０．１％ｖ／ｖトリトンＸ−
１００を含有する緩衝液において湿潤チャンバー中で４
２℃にて一晩ブロッキングした。これらニトロセルロー
ス濾紙を、次いでそれぞれ１％ＢＳＡと１×ＴＣＭＮと
を含有する緩衝液により５分間３回洗浄した。次いで、
これらニトロセルロース濾紙を０．１％ＢＳＡおよび１
×ＴＣＭＮにおける１００−２００μｇＣｏｎＡ／ｍｌ
よりなるＣｏｎＡ溶液中で培養した。この溶液をニトロ
セルロース濾紙１ｃｍ２当たり０．０１８ｍｌまたはワ
ットマン（登録商標）３ＭＭ紙１ｃｍ２当たり０．２ｍ
ｌの量で塗布し、そして３７℃にて１時間培養した。培
養後、これら濾紙をそれぞれ０．１％ＢＳＡおよび１×
ＴＣＭＮ緩衝液において５分間３〜４回洗浄した。これ
ら濾紙を２〜１０単位の酵素を含有する０．１％ＢＳＡ
および１×ＴＣＭＮの溶液中で培養した。これら溶液を
ニトロセルロース１ｃｍ２当たり０．０１８ｍｌ、或い
はワットマン３ＭＭ濾紙１ｃｍ２当たり０．２ｍｌの量
で塗布した。培養を３７℃にて１時間行った。次いで、
これらの濾紙をそれぞれＮＢＴＴ緩衝液（０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０、１
０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．２）にて５分間３回およ
びそれぞれＮＣＢＴ緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．
０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、０．０５
％ツイーン２０）にて５分間２回洗浄した。
るグルコシル化ＤＮＡの順次の処理 グルコシル化されたＴ４ＤＮＡをドットしたニトロセル
ロース紙を、２％酸性化ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、１×ＴＣＭＮおよび０．１％ｖ／ｖトリトンＸ−
１００を含有する緩衝液において湿潤チャンバー中で４
２℃にて一晩ブロッキングした。これらニトロセルロー
ス濾紙を、次いでそれぞれ１％ＢＳＡと１×ＴＣＭＮと
を含有する緩衝液により５分間３回洗浄した。次いで、
これらニトロセルロース濾紙を０．１％ＢＳＡおよび１
×ＴＣＭＮにおける１００−２００μｇＣｏｎＡ／ｍｌ
よりなるＣｏｎＡ溶液中で培養した。この溶液をニトロ
セルロース濾紙１ｃｍ２当たり０．０１８ｍｌまたはワ
ットマン（登録商標）３ＭＭ紙１ｃｍ２当たり０．２ｍ
ｌの量で塗布し、そして３７℃にて１時間培養した。培
養後、これら濾紙をそれぞれ０．１％ＢＳＡおよび１×
ＴＣＭＮ緩衝液において５分間３〜４回洗浄した。これ
ら濾紙を２〜１０単位の酵素を含有する０．１％ＢＳＡ
および１×ＴＣＭＮの溶液中で培養した。これら溶液を
ニトロセルロース１ｃｍ２当たり０．０１８ｍｌ、或い
はワットマン３ＭＭ濾紙１ｃｍ２当たり０．２ｍｌの量
で塗布した。培養を３７℃にて１時間行った。次いで、
これらの濾紙をそれぞれＮＢＴＴ緩衝液（０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０、１
０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．２）にて５分間３回およ
びそれぞれＮＣＢＴ緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．
０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、０．０５
％ツイーン２０）にて５分間２回洗浄した。
【００７３】グリコシル化された酵素−ＣｏｎＡ−誘導
化ＤＮＡは、次のように検出した： (A) 西洋ワサビペルオキシダーゼ ＣｏｎＡ−グルコシル化ＤＮＡとグリコシル化酵素とを
含有する濾紙を、５ｍｇのジアミノベンジジンと０．０
１％のＨ２Ｏ２とを５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１０ｍｌ中に含有する新たに調製した溶液中に浸漬し、
そして遮光した。褐色がインジケータとして生じた。
化ＤＮＡは、次のように検出した： (A) 西洋ワサビペルオキシダーゼ ＣｏｎＡ−グルコシル化ＤＮＡとグリコシル化酵素とを
含有する濾紙を、５ｍｇのジアミノベンジジンと０．０
１％のＨ２Ｏ２とを５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１０ｍｌ中に含有する新たに調製した溶液中に浸漬し、
そして遮光した。褐色がインジケータとして生じた。
【００７４】(B) 酸ホスファターゼ ＣｏｎＡグルコシル化ＤＮＡとグリコシル化酵素とを含
有する濾紙を、０．２Ｍ ＮａＯＡｃ１ｍｌ当たり０．
１ｍｇのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸を含有する基質溶
液（ｐＨ５．８）に浸漬し、暗所にて３７℃にて培養し
た。インジケータとしてバラ色が生じた。
有する濾紙を、０．２Ｍ ＮａＯＡｃ１ｍｌ当たり０．
１ｍｇのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸を含有する基質溶
液（ｐＨ５．８）に浸漬し、暗所にて３７℃にて培養し
た。インジケータとしてバラ色が生じた。
【００７５】(C) グルコースオキシダーゼ ５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍｌ中の６．
７ｍｇのβ−Ｄグルコースおよび０．６７ｍｇのニトロ
青テトラゾリウムを、３７℃にて１時間培養した。１０
０μｌの１００×ＰＭＳ（フエナジンメトサルフェー
ト、０．０１６７ｍｇ／ｍｌ蒸留水中）を加え、そして
溶液を混合した。ＣｏｎＡ−グルコシル化ＤＮＡおよび
グリコシル化酵素を含有する濾紙を、次いでこの混合物
中で暗所にて３７℃で１時間、或いは室温で一晩培養し
た。インジケータとして強い青色が生じた。
７ｍｇのβ−Ｄグルコースおよび０．６７ｍｇのニトロ
青テトラゾリウムを、３７℃にて１時間培養した。１０
０μｌの１００×ＰＭＳ（フエナジンメトサルフェー
ト、０．０１６７ｍｇ／ｍｌ蒸留水中）を加え、そして
溶液を混合した。ＣｏｎＡ−グルコシル化ＤＮＡおよび
グリコシル化酵素を含有する濾紙を、次いでこの混合物
中で暗所にて３７℃で１時間、或いは室温で一晩培養し
た。インジケータとして強い青色が生じた。
【００７６】反応の感度： (A) 西洋ワサビペルオキシダーゼ １５０〜２５０ピコグラムのＤＮＡが検出された。貯蔵
後には褪色した。
後には褪色した。
【００７７】(B) 酸ホスファターゼ ヒブリド化したＤＮＡブロットのみを分析し、７〜１５
ピコグラムのＤＮＡが検出された。
ピコグラムのＤＮＡが検出された。
【００７８】(C) グルコースオキシダーゼ グルコシル化ＤＮＡのブロットのみを検査し、１５０〜
２５０ピコグラムのＤＮＡが検出された。
２５０ピコグラムのＤＮＡが検出された。
【００７９】ＣｏｎＡ検出のこの方法は、最適でないこ
とが判明した。ＣｏｎＡに続く酵素の順次の添加は、分
析検出系において過度のバックグラウンドを生ずること
が判明した。さらに、この方法は比較的時間がかかり、
検出感度が所望よりも低いものであった。従って、Ｃｏ
ｎＡとグルコシル化ＤＮＡと酵素とを接触させる第２の
方法を使用した。
とが判明した。ＣｏｎＡに続く酵素の順次の添加は、分
析検出系において過度のバックグラウンドを生ずること
が判明した。さらに、この方法は比較的時間がかかり、
検出感度が所望よりも低いものであった。従って、Ｃｏ
ｎＡとグルコシル化ＤＮＡと酵素とを接触させる第２の
方法を使用した。
【００８０】(2) 複合ＣｏｎＡ／グリコシル化酵素によ
るグルコシル化ＤＮＡの処理 ＣｏｎＡとグリコシル化酵素とをＴＣＭＮ緩衝液中で
１：１のモル比にて混合し、そして３７℃で２時間、或
いは２５℃で４〜６時間、或いは４℃で一晩乃至４８時
間培養した。（培養期間の後、混合物は透明となる。も
し透明でなければ、ＣｏｎＡが過剰に存在し、より多量
の酵素を加えねばならない。）Ｔ４グルコシル化ＤＮＡ
を含有するニトロセルロースフィルタのブロッキングを
上述のように行った。次いで、これら濾紙をそれぞれＴ
ＣＭＮ緩衝液および１％ＢＳＡで５分間洗浄した。次い
で、上記のように作製したＣｏｎＡ−酵素複合体を０．
０１８ｍｌ／ｃｍ２の容量にて濾紙に接触させ、或いは
約２〜１０単位の酵素を含有する量で接触させた。培養
は３７℃で１時間行った。培養後、これら濾紙を先ずそ
れぞれＮＢＴＴで５分間３回、次いでそれぞれＮＣＢＴ
で５分間２回洗浄した。
るグルコシル化ＤＮＡの処理 ＣｏｎＡとグリコシル化酵素とをＴＣＭＮ緩衝液中で
１：１のモル比にて混合し、そして３７℃で２時間、或
いは２５℃で４〜６時間、或いは４℃で一晩乃至４８時
間培養した。（培養期間の後、混合物は透明となる。も
し透明でなければ、ＣｏｎＡが過剰に存在し、より多量
の酵素を加えねばならない。）Ｔ４グルコシル化ＤＮＡ
を含有するニトロセルロースフィルタのブロッキングを
上述のように行った。次いで、これら濾紙をそれぞれＴ
ＣＭＮ緩衝液および１％ＢＳＡで５分間洗浄した。次い
で、上記のように作製したＣｏｎＡ−酵素複合体を０．
０１８ｍｌ／ｃｍ２の容量にて濾紙に接触させ、或いは
約２〜１０単位の酵素を含有する量で接触させた。培養
は３７℃で１時間行った。培養後、これら濾紙を先ずそ
れぞれＮＢＴＴで５分間３回、次いでそれぞれＮＣＢＴ
で５分間２回洗浄した。
【００８１】西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を上述と
同様に行った。この過程で３１．２５ピコグラムのＤＮ
Ａを検出することができ、かつ上述の検出技術によるよ
りも遥かにバックグラウンドが少なかった。さらに同様
な検出手順をＣｏｎＡ−酸ホスファターゼ複合体、Ｃｏ
ｎＡ−グルコースオキシダーゼ複合体ならびにその他の
同様なＣｏｎＡ−酵素複合体を用いて行うことができ
る。
同様に行った。この過程で３１．２５ピコグラムのＤＮ
Ａを検出することができ、かつ上述の検出技術によるよ
りも遥かにバックグラウンドが少なかった。さらに同様
な検出手順をＣｏｎＡ−酸ホスファターゼ複合体、Ｃｏ
ｎＡ−グルコースオキシダーゼ複合体ならびにその他の
同様なＣｏｎＡ−酵素複合体を用いて行うことができ
る。
【００８２】さらに、レクチン／抗体およびその他の検
出系も使用することができる〔Wardら、上述参照〕。
出系も使用することができる〔Wardら、上述参照〕。
【００８３】実施例２ グルコシル化Ｔ４ＤＮＡのビオチン化 グルコシル化プローブＤＮＡと分析物との間におけるヒ
ブリド化反応の検出を助けるため、グルコシル化プロー
ブＤＮＡをさらにビオチン成分で誘導体とした。これに
対しては標準検出系が既知である。
ブリド化反応の検出を助けるため、グルコシル化プロー
ブＤＮＡをさらにビオチン成分で誘導体とした。これに
対しては標準検出系が既知である。
【００８４】０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．
３）における１ｍｇ／ｍｌのＴ４ＤＮＡ１ｍｌを０．１
ｍｌの新たに作製した１Ｍ ＮａＩＯ４溶液と混合し
た。この混合物を暗所にて室温で３時間培養した。
３）における１ｍｇ／ｍｌのＴ４ＤＮＡ１ｍｌを０．１
ｍｌの新たに作製した１Ｍ ＮａＩＯ４溶液と混合し
た。この混合物を暗所にて室温で３時間培養した。
【００８５】酸化反応が完結した後、溶液を暗所中で４
℃にて０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．
１Ｍ ＮａＣｌを２回取り替えてかつ０．３Ｍホウ酸ナ
トリウム（ｐＨ９．０〜９．３）、０．１Ｍ ＮａＣｌ
を２回取り替えて透析した。次いで、この溶液をｐＨ
９．３のジアミン貯蔵溶液からの１，６−ジアミノヘキ
サン中で０．４Ｍにした。この混合物を暗所で９０分間
培養した。得られたシッフ塩基をＮａＢＨ４で還元し
た。水中で２Ｍの濃度まで新たに溶解させたＮａＢＨ４
をこの混合物へ３０分間感覚で４回加え、ＮａＢＨ４の
濃度を徐々に０．０２５Ｍ〜０．１Ｍまで増加させた。
全培養時間は３時間であった。４Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４．０）を加えることによりｐＨを５．０〜５．５に
調製して、ＮａＢＨ４を冷却した。このＤＮＡ含有溶液
を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）において１
２時間透析し、次いで４０％ｖ／ｖＤＭＦおよび２０ｍ
ＭビオチンＮＨＳエステルにした。この溶液を１２時間
培養した。過剰のビオチンおよびビオチンＮＨＳエステ
ルを、溶出緩衝剤として１×ＳＳＣを用いるＧ５０セフ
ァデックスカラムを通しての濾過により除去した。ＤＮ
Ａを含有するフラクションをカラムから集め、混合し、
かつ０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．０）を含有する溶液に対して透析し、そして後に
使用するまで−２０℃にて貯蔵した。
℃にて０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．
１Ｍ ＮａＣｌを２回取り替えてかつ０．３Ｍホウ酸ナ
トリウム（ｐＨ９．０〜９．３）、０．１Ｍ ＮａＣｌ
を２回取り替えて透析した。次いで、この溶液をｐＨ
９．３のジアミン貯蔵溶液からの１，６−ジアミノヘキ
サン中で０．４Ｍにした。この混合物を暗所で９０分間
培養した。得られたシッフ塩基をＮａＢＨ４で還元し
た。水中で２Ｍの濃度まで新たに溶解させたＮａＢＨ４
をこの混合物へ３０分間感覚で４回加え、ＮａＢＨ４の
濃度を徐々に０．０２５Ｍ〜０．１Ｍまで増加させた。
全培養時間は３時間であった。４Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４．０）を加えることによりｐＨを５．０〜５．５に
調製して、ＮａＢＨ４を冷却した。このＤＮＡ含有溶液
を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）において１
２時間透析し、次いで４０％ｖ／ｖＤＭＦおよび２０ｍ
ＭビオチンＮＨＳエステルにした。この溶液を１２時間
培養した。過剰のビオチンおよびビオチンＮＨＳエステ
ルを、溶出緩衝剤として１×ＳＳＣを用いるＧ５０セフ
ァデックスカラムを通しての濾過により除去した。ＤＮ
Ａを含有するフラクションをカラムから集め、混合し、
かつ０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．０）を含有する溶液に対して透析し、そして後に
使用するまで−２０℃にて貯蔵した。
【００８６】実施例３ 形質転換されたチミン要求性イー・コリ突然変異種にお
けるＢｒｄＵＲ標識されたＤＮＡの作製 この実施例においては、標識しようとするポリヌクレオ
チドを含有する宿主を、その標識を有するヌクレオチ
ド、塩基もしくはヌクレオシドの同族体の存在下で培養
することにより、標識をポリヌクレオチド中に生体内で
組み込んだ。なぜなら、この宿主は標識担持同族体を必
要とする変種であるからである。上述のように、標識し
ようとするポリヌクレオチドは宿主のゲノムの１部とす
ることができ、或いはゲノムへ加えることができる。さ
らに、これは宿主を形質転換させるのに使用するＤＮＡ
配列または他のクローン化ベヒクルもしくはファージの
１部とすることもできる。
けるＢｒｄＵＲ標識されたＤＮＡの作製 この実施例においては、標識しようとするポリヌクレオ
チドを含有する宿主を、その標識を有するヌクレオチ
ド、塩基もしくはヌクレオシドの同族体の存在下で培養
することにより、標識をポリヌクレオチド中に生体内で
組み込んだ。なぜなら、この宿主は標識担持同族体を必
要とする変種であるからである。上述のように、標識し
ようとするポリヌクレオチドは宿主のゲノムの１部とす
ることができ、或いはゲノムへ加えることができる。さ
らに、これは宿主を形質転換させるのに使用するＤＮＡ
配列または他のクローン化ベヒクルもしくはファージの
１部とすることもできる。
【００８７】標識しようとするＤＮＡを特徴とするイー
・コリのチミン要求性突然変異種（ｔｈｙＡ）をチミジ
ンの代わりに５−ブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ
Ｒ）を補充した培地において、Millerの、Experiments
In Molecular Genetics 〔Cold Spring Harbor Laborat
ory, (1972) 〕の技術に従って増殖させた。細胞を回収
し、そして標識されたプローブＤＮＡを含有するＤＮＡ
を単離した。このＤＮＡをヒブリド化の研究に直接使用
することができる。或いは、標識されたプローブの全部
または１部を先ずＤＮＡの残部からエンドヌクレアーゼ
切断によって除去し、そして分析物の検出用に単独で使
用することができる。
・コリのチミン要求性突然変異種（ｔｈｙＡ）をチミジ
ンの代わりに５−ブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ
Ｒ）を補充した培地において、Millerの、Experiments
In Molecular Genetics 〔Cold Spring Harbor Laborat
ory, (1972) 〕の技術に従って増殖させた。細胞を回収
し、そして標識されたプローブＤＮＡを含有するＤＮＡ
を単離した。このＤＮＡをヒブリド化の研究に直接使用
することができる。或いは、標識されたプローブの全部
または１部を先ずＤＮＡの残部からエンドヌクレアーゼ
切断によって除去し、そして分析物の検出用に単独で使
用することができる。
【００８８】分析物に対する標識プローブのヒブリド化
は、ＢｒｄＵＲに対するモノクローナルもしくはポリク
ローナル抗体との反応により検出することができる〔Gr
atzner, "Monoclonal Antibody To 5-Bromo- And 5-Iod
odeoxyuridine: A New Reagent For Detection Of DNA
Replication", Science , 218, pp. 474-75 （１９８
２）〕。或いは、このプローブをさらに、例えばチオビ
オチンのような成分を加えることにより化学的に誘導体
とすることができる。次いで、このチオビオチン化した
ＤＮＡプローブを検出することができ、この場合プロー
ブは、例えばデテック（登録商標）１−ｈｒｐの様なビ
オチン検出系、或いは他のこの種のビオチン検出系を用
いて分析物にヒブリド化させる。
は、ＢｒｄＵＲに対するモノクローナルもしくはポリク
ローナル抗体との反応により検出することができる〔Gr
atzner, "Monoclonal Antibody To 5-Bromo- And 5-Iod
odeoxyuridine: A New Reagent For Detection Of DNA
Replication", Science , 218, pp. 474-75 （１９８
２）〕。或いは、このプローブをさらに、例えばチオビ
オチンのような成分を加えることにより化学的に誘導体
とすることができる。次いで、このチオビオチン化した
ＤＮＡプローブを検出することができ、この場合プロー
ブは、例えばデテック（登録商標）１−ｈｒｐの様なビ
オチン検出系、或いは他のこの種のビオチン検出系を用
いて分析物にヒブリド化させる。
【００８９】実施例４ ５−ブロムデオキシウリジンを含有するＤＮＡのビオチ
ン化 実施例３において作製され、かつ分析物にヒブリド化さ
れたＢｒｄＵＲ標識プローブＤＮＡを検出するため、こ
のＢｒｄＵＲ標識したプローブＤＮＡをさらにビオチン
で誘導体とすることができる。
ン化 実施例３において作製され、かつ分析物にヒブリド化さ
れたＢｒｄＵＲ標識プローブＤＮＡを検出するため、こ
のＢｒｄＵＲ標識したプローブＤＮＡをさらにビオチン
で誘導体とすることができる。
【００９０】ブロムデオキシウリジン残基を有するＤＮ
Ａのロリエチルアンモニウム塩２００μｇを、２ｍｌの
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させた。
この溶液へ無水ＤＭＦ中の５０ｍＭチオビオチン０．５
ｍｌを加え、そして混合物をアルゴンガスの下で６０℃
にて２時間培養した。４０℃にて減圧下で蒸発させて溶
剤を除去した。残渣を０．５ｍｌの１×ＳＳＣに溶解さ
せた。未溶解物質を遠心分離により除去した。溶出緩衝
剤として１×ＳＳＣを用いるＧ５０セファデックスカラ
ムでの濾過によって過剰のビオチンを上澄液から除去し
た。ＤＮＡ含有フラクションをカラムから回収し、混合
しかつ後に使用するまで−７０℃にて貯蔵した。
Ａのロリエチルアンモニウム塩２００μｇを、２ｍｌの
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させた。
この溶液へ無水ＤＭＦ中の５０ｍＭチオビオチン０．５
ｍｌを加え、そして混合物をアルゴンガスの下で６０℃
にて２時間培養した。４０℃にて減圧下で蒸発させて溶
剤を除去した。残渣を０．５ｍｌの１×ＳＳＣに溶解さ
せた。未溶解物質を遠心分離により除去した。溶出緩衝
剤として１×ＳＳＣを用いるＧ５０セファデックスカラ
ムでの濾過によって過剰のビオチンを上澄液から除去し
た。ＤＮＡ含有フラクションをカラムから回収し、混合
しかつ後に使用するまで−７０℃にて貯蔵した。
【００９１】以上、本発明を多数の具体例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を提供しうることが了解されよ
う。従って、本発明は、上述の具体例のみに限定され
ず、本発明の範囲内において多くの改変を為し得ること
が了解されよう。
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を提供しうることが了解されよ
う。従って、本発明は、上述の具体例のみに限定され
ず、本発明の範囲内において多くの改変を為し得ること
が了解されよう。
【００９２】
【発明の効果】本発明によれば、従来の製造上の制約な
しに、目的とする分析物を検出するための方法およびキ
ットに使用しうるプローブとして有用な生体内もしくは
生物学的に標識したポリヌクレオチド配列が得られる。
しに、目的とする分析物を検出するための方法およびキ
ットに使用しうるプローブとして有用な生体内もしくは
生物学的に標識したポリヌクレオチド配列が得られる。
【図１】本発明の生体内標識方法に使用するためのプロ
ーブＤＮＡ配列の両末端へAhaIII 制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を結合させる方法の１具体例の工程略図で
ある。
ーブＤＮＡ配列の両末端へAhaIII 制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を結合させる方法の１具体例の工程略図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒューイ ラング ヤング アメリカ合衆国、ニュー ジャージー州 07670、テナフライ、エングル ストリー ト 76番 (72)発明者 ノーマン イー ケルカー アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 10016、ニュー ヨーク、イースト 30番 ストリート 343番
Claims (9)
- 【請求項１】 標識しようとするポリヌクレオチドを含
有する宿主を、この宿主またはその変種が増殖のために
必要とする塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ま
たはそれらの同族体もしくは先駆体の存在下で培養する
工程から成るポリヌクレオチドを生体内で標識する方法
であって、前記塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチ
ド、またはそれらの同族体もしくは先駆体が所望の標識
を備えている、ポリヌクレオチドを生体内で標識する方
法。 - 【請求項２】 前記標識しようとするポリヌクレオチド
が、前記宿主の原ゲノムの一部であるＤＮＡ、前記宿主
の原ゲノムに挿入されるＤＮＡ、および前記宿主を形質
転換させるために使用するＤＮＡ配列の少なくとも一部
を構成するＤＮＡより成る群から選択される、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】 前記宿主を形質転換させるために使用す
るＤＮＡが、標識しようとするポリヌクレオチドを有す
ること並びに前記宿主中で複製し得ることを特徴とする
クローン化ベヒクルおよびファージより成る群から選択
される、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】 前記宿主が、チミンもしくはチミジン欠
損変異株から選択され、標識を備える同族体が５−ブロ
モデオキシウリジン（ＢｒｄＵＲ）である、特許請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項５】 信号部分、架橋部分、または架橋部分と
信号部分との少なくとも１つの組合せ物をポリヌクレオ
チドの前記標識に結合させる工程をさらに含む、特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記信号部分、架橋部分、または架橋部
分と信号部分との組合せ物が、前記標識に共有結合され
る、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記信号部分および架橋部分が、放射性
化合物、ビオチン、蛍光性化合物、フルオレセン、ロー
ダミン、ダンシル、磁性化合物、キレート剤、並びに標
識ポリヌクレオチドへ共有結合され得る他の信号部分お
よび架橋部分より成る群から選択される、特許請求の範
囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】 前記信号部分、架橋部分、または架橋部
分と信号部分との組合せ物が、前記標識に非共有結合さ
れる、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記信号部分および架橋部分が、ポリペ
プチド、蛋白質、レクチン、コンカナバリンＡ、酵素、
アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、抗原、抗
体、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、キレート剤、並びに標識
ポリヌクレオチドへ非共有結合され得る他の信号部分お
よび架橋部分より成る群から選択される、特許請求の範
囲第８項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51097583A | 1983-07-05 | 1983-07-05 | |
| US510975 | 1983-07-05 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59137381A Division JP2540482B2 (ja) | 1983-07-05 | 1984-07-04 | ポリヌクレオチド配列の生体内標識化 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08224084A true JPH08224084A (ja) | 1996-09-03 |
| JP2607058B2 JP2607058B2 (ja) | 1997-05-07 |
Family
ID=24032961
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59137381A Expired - Lifetime JP2540482B2 (ja) | 1983-07-05 | 1984-07-04 | ポリヌクレオチド配列の生体内標識化 |
| JP7332416A Expired - Fee Related JP2607058B2 (ja) | 1983-07-05 | 1995-12-20 | ポリヌクレオチドの生体内標識化方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59137381A Expired - Lifetime JP2540482B2 (ja) | 1983-07-05 | 1984-07-04 | ポリヌクレオチド配列の生体内標識化 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0133473B1 (ja) |
| JP (2) | JP2540482B2 (ja) |
| AT (1) | ATE103327T1 (ja) |
| AU (1) | AU581620B2 (ja) |
| CA (1) | CA1338856C (ja) |
| DE (1) | DE3486290T2 (ja) |
| DK (1) | DK328084A (ja) |
| ES (2) | ES8606229A1 (ja) |
| IL (1) | IL72302A0 (ja) |
| NO (1) | NO842720L (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| ATE45385T1 (de) * | 1984-05-15 | 1989-08-15 | Smithkline Beckman Corp | Polynucleotid-hybridisierungsprobe. |
| CA1277931C (en) * | 1984-06-05 | 1990-12-18 | Shimon Ulitzur | Detection and/or identification of microorganisms in a test sample usingbioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker |
| NO870613L (no) * | 1986-03-05 | 1987-09-07 | Molecular Diagnostics Inc | Deteksjon av mikroorganismer i en prve inneholdende nukleinsyre. |
| FR2596773B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1988-06-24 | Pasteur Institut | Sonde monocatenaire marquee, non radioactive, procede pour sa fabrication et procede de detection d'une sequence nucleotidique determinee a l'aide de cette sonde |
| SE455600B (sv) * | 1986-11-27 | 1988-07-25 | Svalof Ab | Forfarande for detektering av vextvirus och dess tillempning for detektering av rodsotvirus och potatisvirus |
| AU601021B2 (en) * | 1987-03-11 | 1990-08-30 | Molecular Diagnostics, Inc. | Assay for necleic acid sequences in a sample |
| GB2209754A (en) * | 1987-09-17 | 1989-05-24 | Thomas Lee Mattson | Polyaldehydic polynucleotides in use as probes,their preparation and use |
| US6326136B1 (en) | 1988-04-01 | 2001-12-04 | Digene Corporation | Macromolecular conjugate made using unsaturated aldehydes |
| WO1993011261A1 (en) * | 1991-11-25 | 1993-06-10 | Keygene N.V. | A novel pcr method with a single primer for nucleic acid analysis |
| US5912126A (en) * | 1995-08-30 | 1999-06-15 | Darzynkiewicz; Zbigniew | Methods for labeling DNA ends with halogenated nucleotides and detecting same with antibodies |
| DE19850594A1 (de) * | 1998-11-03 | 2000-05-04 | Biochip Technologies Gmbh | Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren |
| DE102006038686A1 (de) * | 2006-08-17 | 2008-02-21 | Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh | Verfahren zur nicht radioaktiven Markierung von Ribonukleinsäure |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| CA1309672C (en) * | 1983-01-27 | 1992-11-03 | Jannis G. Stavrianopoulos | Methods and structures employing non-radioactive chemically-labeled polynucleotide probes |
| CA1228811A (en) * | 1983-05-05 | 1987-11-03 | Robert G. Pergolizzi | Assay method utilizing polynucleotide sequences |
-
1984
- 1984-06-28 CA CA000457804A patent/CA1338856C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 AU AU30205/84A patent/AU581620B2/en not_active Ceased
- 1984-07-04 NO NO842720A patent/NO842720L/no unknown
- 1984-07-04 ES ES534014A patent/ES8606229A1/es not_active Expired
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