SE455600B - Forfarande for detektering av vextvirus och dess tillempning for detektering av rodsotvirus och potatisvirus - Google Patents

Description

455 600 5 10 15 20 25 30 35 NUVARANDE METODIK Screening för virusresistens i ett förädlings- program innebär vanligtvis en mätning av virusproduk- tionen efter en testinfektion. Detta betyder att tusen- tals plantor skall testas för virusförekomst pà rela- tivt kort tid. Den vanligaste metoden tills för nâgra år sedan har helt enkelt varit att visuellt bedöma plantorna för karakteristiska symptom från en virus- infektion. Nackdelarna med denna form av urval är att ett ringa virusinnehàll inte ger synliga symptom samtidigt som det krävs ett tränat öga för att göra en någorlunda tillförlitlig bedömning.

Eftersom angrepp av t ex rödsotvirus i vallgräs inte ger några som helst synliga symptom är det svårt att uppskatta förekomsten och skadan av detta virus.

Resistensförädling mot rödsotvirus i vallgräsen måste därför baseras på en laboratoriemetod. En sådan metod, som fått allt större användning inom växtvirusdiag- nostiken, är den s k ELISA-tekniken. Denna serologiska metod baserar sig på antigeniciteten i virusprotein- höljet så att viruspartiklarna detekteras genom att 'antikroppar reagerar med virusprotein. ELISA-tekniken är den gängse metoden för detektion av växtvirus och används rutinmässigt pà Svalöf AB inom potatisprogrammet för såväl kontrollen av utsäde som resistensförädling.

Metoden har många fördelar, då den är enkel att utföra, är snabb och relativt känslig, kan användas i stor skala samt kräver ingen dyrbar utrustning. Dessvärre har ELISA-testet även sina begränsningar, då metoden är osäker vid låg frekvens av virus. Svårigheten med detta test för t ex rödsotvirus är att få en ren virus- .preparation för produktion av antikroppar, eftersom viruset förekommer endast i låg frekvens.

NY METODIK Majoriteten av växtvirus, ca 75%, innehåller nukleinsyran RNA, som genetiskt material, omsluten av ett proteinhölje. Det är antigeniciteten i detta lv 10 15 20 25 30 35 455 600 3 protein, som utnyttjas i ELISA-testet, men det rep- resenterar enbart lO% av virusgenomets information.

Genom att istället analysera virusnukleinsyran direkt kan betydligt tillförlitligare resultat erhållas vid detektion av virus. Detta nya sätt att diagnosticera virus baserar sig pá att komplementära nukleínsyra- strängar hybridiserar med varandra, en grundfunktion inom rekombinant-DNA-tekniken. En sådan metod, nuklein- syrahybridisering medelst “dot-blot", har just de egenskaper, som gör den önskvärd i resistensförädlingen mot virus. Den är mycket känslig och snabb, har stor kapacitet samt är framför allt tillförlitlig. På den engelska växtförädlingsinstitutionen PBI, Cambridge, har en sådan molekylär screeningmetod helt och hållet ersatt ELISA-tekniken för detektion av potatisvirus X (Baulcombe et al 1984).

Med potatis som modellgröda har på Svalöf AB utvecklats en icke-radioaktiv molekylär hybridiserings- teknik för detektion av potatisvirus Y (PVY), som med vissa modifikationer kan användas för detektion av diverse andra växtvirus t ex rödsotvirus.

- Bruket av nukleinsyrahybridisering för detektion av PVY förutsätter_tillgàng till DNA komplementärt till virus-RNA-genomet. Metodiken med nukleinsyra- hybridisering omfattar därför följande moment: - isolering av virus - isolering av virus-RNA - cDNA-syntes samt molekylär kloning - spot-test Isolering av virus PVY renframställs från infekterade tobaksblad enligt Oxelfelt (pers. commun.). Cellväggarna i bladen bryts ner genom homogenisering i en buffert, som medför att viruspartiklarna inte aggregerar. Såväl reducerande som chelaterande ämnen tillsättes för att förhindra/- reducera polyfenolinverkan resp enzymaktivitet. Orga- neller, ribosomer etc fránskiljes genom centrifugering, 10 15 20 25 30 35 455 600 4 varefter virus koncentreras genom fällning med poly- etylenglykol följt av rening genom ultracentrifugering.

Renheten hos PVY kontrolleras genom mätning av absorp- tionsspektrum, medan infektiviteten kontrolleras på tobak med åtföljande ELISA-test.

Isolering av RNA RNA isoleras från renframställt PVY med gängse fenolextraktion för nukleinsyror enligt modifiering av Clemens (1985). Renheten hos RNA-preparationen kontrolleras dels genom mätning av absorptionen, dels genom agaroselektrofores.

Molekylär kloning Framställning av komplementärt DNA (CDNA) till PVY-RNA utföres med RNase H-metoden enligt modifiering av Gubler and Hoffman (1983). Fördelen med denna metodik är att längre sammanhängande DNA-sekvenser erhålles samtidigt som hela proceduren äger rum i ett enda provrör; Koncentration och mängd syntetiserat cDNA beräknas genom inmärkning med radioaktivt fosfor (32P). cDNA fogas in i en plasmid, som är lineariserad genom behandling med ett restriktionsenzym. Plasmiden överförs och förökas i E. coli-celler, varefter kolonier med plasmid + CDNA identifieras på selektivt medium. Bakte- rier och därmed också plasmider från dessa kolonier förökas i stor skala, varefter plasmid-DNA isoleras genom ultracentrifugering. Storleken på plasmiden samt det infogade cDNA:t bestäms genom agaroselektro- fores. På detta sätt har vi på Svalöf AB framställt flera PVY-kloner med DNA komplementärt till virus-RNA, vilka kan användas för detektion av PVY medelst nuklein- syrahybridisering.

Sgot-test Den egentliga detektionen av virusförekomst utförs med ett s k spot-test, varvid virus-RNA från bladsaft binds till ett nitrocellulosamembran, känns igen och hybridiserar med tillsatt komplementärt DNA, som gjorts detekterbart genom inmärkning med antingen radioaktiva In 10 15 20 25 30 35 455 600 5 isotoper eller biotin. Undersökningarna pá Svalöf AB har koncentrerats på att utarbeta en optimal spot- test,-vilken baseras på den icke-radioaktiva detektionen med biotin. Det vanligaste sättet att märka in sitt prov är med 32P, men detta tillvägagångssätt har vissa nackdelar. Eftersom halveringstiden för 32P endast är 14 dagar, mäste man ständigt göra nya inmärkningar.

För laboratoriepersonalens säkerhet är det dessutom bättre om icke-radioaktivt material kan användas i synnerhet som hybridiseringsmetoden är ämnad för scree- ning-bruk. Den metodik Vi utarbetat grundas därför på inmärkning medelst nick-translation med biotinderi- vat av deoxiribonukleotider istället för 32P.

En liten mängd potatissaft appliceras på nitro- cellulosafilter efter det att bladsaften behandlats med ett proteinnedbrytande enzym. Detta är ett nöd- vändigt moment, då i potatisblad endogent förekommande biotin är bundet till protein (Nikolau et al 1985), som i likhet med nukleinsyror också binder till nitro- cellulosa. Om inte proteinet bryts ner före applicering kommer det endogena biotinet att detekteras, som om det fanns virus.

Nitrocellulosafiltret ”bakas” vid hög temperatur i vakuum för bindning av nukleinsyrorna, bl a virus-RNA, varefter man gör en prehybridisering för att minimera bakgrundsstörningar.

Beträffande prehybridiseringen är detta ett nöd- vändigt steg i förfarandet för att minimera bakgrunds- störningar i filtret p g a ospecifik bindning av makro- molekyler. Detta undviks genom att filtret behandlas med en lösning, vars ingredienser har funktionen att reducera eller förhindra en ospecifik bakgrund.

Härefter vidtar den egentliga nukleinsyrahybri- diseringen (Gatti et al 1984), dä filtret inkuberas med biotinmärkt DNA homologt till PVY-RNA. Ifall ett prov är infekterat med PVY kommer virus-RNA bundet i nitrocellulosafiltret att hybridiseras med en homolog 10 15 20 25 30 35 455 600 6 cDNA-sträng och detekteras genom en enzymatisk reaktion med biotin, vilket resulterar i en färgad produkt klart synlig för ögat. Blåfärgade fläckar på filtret anger sålunda att en hybridisering ägt rum mellan virus-RNA och komplementärt framställt DNA och indikerar därmed en virusinfektion. Där det inte syns någonting har ingen hybridisering skett, och detta betyder ett virusfritt prov.

Med denna icke-radioaktiva hybridiseringsteknik detekteras så små mängder som 2 pg virus-RNA, vilket är den undre detekteringsgränsen med 32P. Genom att ändra inmärkningssättet med biotin är det dock möjligt att sänka detektionsgränsen ytterligare (Forster et al 1985). För att kunna detektera 2 pg virus-RNA med 32P krävs en exponeringstid av flera dagar jämfört med biotininmärkning där svaret erhålles efter endast 1-4 timmar.

Metoden är således mycket känslig och klart över- lägsen ELISA-tekniken för detektion av små koncentra- tioner av virus. Fördelen med detta test i jämförelse med ELISA-metoden är också att man behöver göra virus- isoleringen endast en gång. Med det molekylära testet förökas bakterierna med CDNA vid behov, men med ELISA- -testet måste man göra kontinuerliga virusreningar för framställning av antikroppar. Kapaciteten för hybridiseringstekniken är mycket hög och jämförbar med ELISA-testet, d V s screening av tusentals plantor tar endast ett par dagar. Ytterligare fördelar med det molekyära hybridiseringstestet är den potential detta utgör för en användning på andra grödor än po- tatis. Detta innebär t ex att vi kan undersöka tolerans mot rödsotvirus i vallgräs, vilket tidigare varit omöjligt i avsaknad av laboratoriemetod.

SLUTSATSER Eftersom virusangrepp av skilda slag orsakar stora skördeförluster på grödorna i landet, är det 7 ekonomiskt betydelsefullt att tillförlitliga laboratorie- metoder för detektion av virus utvecklas. Jag anser 0,, 10 15 20 25 455 600 7 att den teknik, som utarbetats på Svalöf AB för stor- skalig detektion av virus medelst icke-radioaktiv nukleinsyrahybridisering har just de egenskaper, som är önskvärda för en sådan laboratoriemetod. Denna hybridiseringsmetodik är sålunda ett av de första exemplen där rekombinant-DNA-teknik med fördel kan användas inom praktisk växtförädling.

Litteraturförteckning: Baulcombe, D., Flavell, R.B., Boulton, R.E. and Jellis, G.J. 1984. Plant Pathol. 33: 361-370.

Clemens, M.J. 1985. In Viroloqy, A practical approach.

(Ed. B.W.J. Mahy). IRL Press: 211-230.

Forster, A.C. Mcïnnes, J.L., Skingle, D.C, and Symons, R.H. 1985. Nucl. Acids Res. l3(3): 745-761. 1984. Bio- Gatti, R.A., Concannon, P. and Salser, W- techniques 3: 148-155.

Gubler, U. and Hoffman, B.J. 1983. Gene 25: 263-269.

Lindsten, K. 1974. Nordisk Jordbruksforskning. 55(3):. 354-356.

Nikolau, B.J., Wurtele, E.S. and Stumpf, P.K. 1985.

Anal. Biochem. 149: 448-453.

Claims (2)

455 600 10 - PATENTKRAV

1. Förfarande för detektering av växtvirus, A k ä n n e t e c k n a t av att bladsaft behandlas med ett proteinnedbrytande enzym för avlägsnande av endogent bundet biotin, virus-RNA från bladsaften binds till ett filtermembran, en prehybridisering genomföres, virus-RNA hybridiseras genom att membranet inkuberas med biotinmärkt DNA som är homologt till RNA i det virus som skall detekteras, varvid ett bio- tinspecifikt enzym tillsättes, varvid närvaron av det specifika virus-RNA blir visuellt pàvisbar genom uppkomst av en färg.

2. Användning av förfarandet enligt krav l, för detektering av potatisvirus Y, Xu S, A eller M av rödsotvirus. H1