JPS6076667A - ポリヌクレオチド配列の生体内標識化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の要約〕 生体内標識されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド
の生体内標識方法、検出方法および標識されたポリヌク
レオチドを特徴とするキットにつき開示する。：本発明
の生体内生物学標識ポリヌクレオチドは種々の分析物を
検出する際、或いは他の実験上、工業上またはＶ！ｉ桑
上の用途において有用である。

〔発明の属する技術分野〕

本発明は、ポリヌクレオチド配列の生体内標識に関する
ものである。さらに詳細には、本発明は分析物に対する
ヒブリド化ＶＣ際し検出を可能にするＤ　Ｉｉ　Ａ配列
の生物学的標識化に関するものである。

以下の説明から判るように１本発明の方法により産生さ
れかつ生物学標識されたポリヌクレオチド配列は多くの
実験上、工業上または医薬上の用途において分析物の使
用が望ましい場合にＮ要である。

〔従来技術とその問題点〕

以下の記載において、次の用語を使用する：分析物：　
存在を検出しかつ所望ならば定ｔ１すべき物質もしくは
複数の物質のそれぞれ９独または混合物。この分析物は
小分子旦または篩分子量のＤ　Ｎ　ＡもしくはＲＮ　Ａ
分子、これらの分子を含む分子複合体−またはたとえば
ウィルス、細胞もしくはふ（０胞群のような（劾設ケ含
廟する生物系とすることができる。一般的な分析物には
核［（ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくはその断片、単一鎖
もしくは二重鎖のもの、ウィルス、細菌、培養細胞など
がある。グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含め全
体としてもしくはその断片としての細菌、真菌類、藻類
およびその他の微生物も分析物であり、さらに動物（た
とえば、哺乳動物）および柚物の細胞および組織も包含
される。

プローブ：　特定分析物のポリヌクレオチド配列に対し
補完的でありかっこの分析物ポリヌクレオチド配列へヒ
プリド化する標識されたポリヌクレオチド配列。

標　識：　そのままで、または信号部分もしくは架橋部
分と信号部分との組合せが共有結合した後に、または゛
信号部分もしくは架橋部分と信号部分との組合せが非共
有結゛合した後に、検出しうるまたは成る場合には定量
化しうる信号を発生するポリヌクレオチド配列に結合さ
れた部分。この釉の標識を有する化合物はたとえばグル
コシル化ヌクレオチド、グリコジル化ヌクレオチド、ｊ
−ヒドロキシメチルウラシル。

ＢγｄＵＲおよびｊ−メチルシトシンを包含する。

架橋部分：　ボリヌクレオチ１゛配列の標識へ共有結合
または非共有結合する際、標識と信号部分との間で結合
手またに架橋として作用する部分。

信号部分：　ポリヌクレオチド配列のｂ５ｍｋへまたは
との標識に結合された架橋部分へ共有結合または非共有
結合する際に、標識を検出するための信号を発生する部
分。

信　号；　信号を持たない配列から検出されうる似識ま
たけ信号部分の特徴。

生物試＊−＋２よび非生物試料にお・ける微ｉの物質の
分析お、ｌ：び検出は、臨昧実験および分析実験におい
て日常の手段と斤つンて。これらの検出技術は次の−２
つの主たる分類に分けることができる；（１）リガント
−受答体の相互作用に基づくもの（たとえば免疫分析に
基づく技術）訃よび（２）核酸ヒブリド化に基づくもの
（ポリヌクレオチド配列に基づく技術）。

免疫分析に基づく技術は、抗体とそれに補完的な抗原と
の非共有結合からなる一連の工程を％徴とする。たとえ
ば、ティー・チャード、「放射免疫分析および関連技術
の初歩」（／り７ｇ）全参照することができる。

ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術は、標識された
ポリヌクレオチド配列址たはグローブをアデニン（Ａ）
とチミジン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）　、！：シテ
ジン（Ｃ）とワトンンークリック塩基対にしたがってヒ
ブリド化条件下で分析物の補完配列へ非共有結合させ、
かつそのヒプリド化を検出することからなる一連の工程
を特徴とする。（エム。グルンシュタインおよヒティー
ｅニス・ホグネス、「コロニーヒブリト化：特異遺伝子
を含有するクローン化ＤＮＡの単離方法」、グロシーデ
ィング・ナショナルΦアカデミ−・ザイエンス・Ｕ　Ｓ
　Ａ　ｓ　第７　’　４　＊　４３２Δ／−１ｇ頁（／
９７ｊ）〕。

一般般的法において、分析物の補完配列に対するＷ４繊
配列もしくはプローブの非共有結合は、ポリヌクレオチ
ド配列に基づく検出技術の主たる識別過程である。この
結合過程は、グローブと分析物との補完ヌクレオチド配
列の正確な分子整列および相互作用により行なわれる。

これは非共有結合の自由エネルギ、たとえば水素結合自
由エネルギ、積Ｊｆｌｉ自由エネルギなどの放出により
エネルギ的に促進される。

主たる識別過程の他に、さらに標識ヌクレオチド配列と
分析物の補完配列との間で結合が生ずる時点を検出する
ことが必要である。この検出は信号過程で行なわれる。

信号過程は定せ的もしくは定性的な検出を可能にし、た
とえば主たる識別過程の発生をヒトまたは装置の検出系
で検知することを可能にする。

ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術の主たる識別過
程および信号過程は、直接的にまたは間接的に、或いは
比例的にまたは逆比例的に結合することができる。たと
えば充分蓋の放射能標識したプローブによる核酸ヒブリ
ド化のような系において、放射能の菫は一般に存在する
分析物の門に比例する。逆比例の技術は、たとえば検出
される信号の址が試料中に存在する分析物の伍が多くな
るにつれて低下するような競合免疫分析を包含する。

１ｇ号過程を主たる識別過程に対し／：ｌより大きい比
で関連させるよう検出を向上させるために増幅技術を開
用することもできる。たとえば２分析の信号成分を各識
別成分に対しｌｏ；／の比で存在させて、ｉｏ倍の感度
増加を与えることもできる。

王たる識別過程の発生を検出するには多くの種類の信号
過程を使用することができる。選択する信号過程は、主
たる識別過程で使用されるポリヌクレオチド配列の標識
または信号部分を特徴とする特定信号に依存する。Ｗ４
繊はこれへ信号部分または架橋部分と信号部分との組合
せを結合させる処理なしにそれ自身で検出されうるが１
この標識に対しそれ自身で検出されうるまたはさらに改
変した後に検出されうるようになる信号部分または架橋
部分と信号部分との組合せを共有結合または非共有結合
させるのがよ−り般的である。

勿論、上記の架橋部分と信号部分との組合せは標識へ結
合させる前に作成Ｉ、うろこと、或いは標識へ順次に結
合させうろことを了解すべきである。たとえば、架橋部
分を先ず標識へ結合させ、次いで信号部分をその架橋部
分へ結合させることができる。さらに、幾つかの架橋部
分および／または信号部分を一緒に、架橋部分と信号部
分との組合せにおいて使用することもできる。

標識に対する信号部分または架橋部分と信号部分との組
合せの共有結合の例は、たとえば放射性部分、螢光性部
分または検出手段となりうる信号をそれ自体で与える他
の部分のような信号部分による標識の化学的改変、或い
は信号を与えるための架橋部分と信号部分との少なくと
も１つの組合せによる標識の化学的改変である。

標識に対する信号部分または架橋部分と信号部分との組
合せの非共有結合の例は、適当な手段によりそれ自身で
検出されうる信号部分の標識に対する非共有結合、或い
はこれら手段の１つにより検出されうる信号を発生する
架橋部分と信号部分との組合せの標識に対する非共有結
合でらる。たとえば、ポリヌクレオチド配列の標識を抗
体、螢光性部分゛または適当な手段により検出しうる他
の部分へ非共有結合させることができる。或いは、標識
を架橋部分（たとえばレクチン）へ結合させ、次いでレ
クチン、すなわち架橋部分を介して適当な手段により検
出しうる他の部分へ結合させることもできる。

分析物検出系においてプローブとして有用なポリヌクレ
オチド配列の標識へ共有結合させまたは非共有結合させ
るのに使用しうる極めて多くの種類の信号部分および架
橋部分が存在する。

これらは多くの種類の放射性および非放射性信号部分を
包含し、さらに多くの種類の非放射性信号部分を包含す
る。必要とされることは、信号部分が適当な手段により
検出されうる信号を与えること、並びに存在すれば架橋
部分が標識に対し共有結合または非共有結合する能力お
よび信号部分と結合する能力を特徴とすることでるる。

放射性の信号部分並びに各種の架橋部分と放射性信号部
分との組合せは、たとえばＰ、Ｉ。

Ｃ、Ｈ、Ｃｏ　、Ｎ＋　、Ｎｉ　などＯＸうな／梅もし
くはそれ以上の放射性同位元素を特徴とする。好ましく
は、使用する同位元素はβ線寸たけγ線を放出し、かつ
長い半減期を有する。

次いで、特に一般的には放射能信号の検出は、たとえば
フィルムへ露出するような放射能＋６丁出器によって行
なわれる。

非放射性信号部分、並びに架橋部分と非放射往信ぢ部分
との、ｔｎ合せは、研究および臨床分野においてますま
すその使用が増大しつつある。

これらの信号および架橋部分は放射能を含まないので、
これらを使用する技術および標識プローブは安全、＠麗
かつ一般的に貯蔵の除より安定でおり、その結果安価に
使用できる。さらに、非放射性信号部分の検出感度は、
放射能標識技術と同程度に高いがまたはそれ以上である
。

非放射性標識と共に使用しうる好適な非放射性信号部分
または架橋−信号部分の組合せのうちには、ビオチン／
アビジン結合系に基づくものがある〔ビー・アール・２
ンガー等、「ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵素的合
成：新規な核酸親和性プローブＪ１プロシープインク・
ナショナル・アカデミ−命サイエンス・ＵＳＡ。

第７ｒ巻、第６６３３−３７頁（／Ｙｅｔ）；　ジェー
・スタプリアノボウロス等、［同族配列のヒダリド化／
検出に対するグリコモル化ＤＮＡプローブｊ１ａ換ＤＮ
Ａ研究に対する第３＠会議（／９１’３年）で提出；ア
ール・エッチ・シンガーおよびディー・シー・ウォード
、「ビオチン化ヌクレオチド同族体によりその場でヒブ
リド化させることによりニワトリ筋肉組織培養物で肉眼
化させたアクチン遺伝予見ｍＪ　＊　グロシーディング
・ナショナル・アカデミ−響すイエンスφＵＳＡ、第７
２巻、第７３３／−４，を頁。

（１５’♂コ）〕。非非放射性標識および架橋−信号系
、ビオチン／アビジンなどについては、ディーもシーー
ウオード等、「改良ヌクレオチド並びにその製造および
使用方法Ｊ１　ヨーロッパ特許出願第Ａ３１７り号明細
誓を参照することができる。

非放射能標識ポリヌクレオチドは、検出系においてそれ
程広く使用されていない。何故なら、検出系においてプ
ローブ七して有用なポリヌクレオチド配列に対する標識
（ヒブリド化を阻害しない）の結合が高価となるからで
ある。

第１に、標識を加えるようポリヌクレオチド重合体を改
変するのに有用である化学反応条件は、しばしば苛酷す
ぎて特定ヌクレオチドについては選択することができな
い。さらに重要なことに、ポリヌクレオチド配列の化学
的標識は、しばしばヒプリド化を阻害する。何故なら、
この標識はヒプリド化に必要な水素結合を阻害するから
である。たとえば、ケトキサールまたはグリオキサール
のようなジカルボニル試薬はグアニン残基と反応する［
シャピロ等、バイオケミストリー、第ｊ巻、第２７９２
−２♂ｏ７頁（／り６６）：エム・す、ットαくイオタ
ミストリー。第を巻、第３．２４１２−ｊ３頁（／ハ２
）；ボリッッ等、バイオケミストリー、Ｉｇ２ｏ巻。

第３７Ｊ−７ｉ頁（／Ｐｆｌ）］。しがしながら、ケト
キサールおよびグリオキサールで標識したヌクレオチド
は、分析物における補完配列に対しヒブリド化しない。

何故なら、との棟臓はヒプリド化に必要な水素結合を阻
害するからである。

したがって、プローブとして使用するポリヌクレオチド
配列を標識するためには、標識された単量体ヌクレオチ
ドを合成し、次いでこれをポリヌクレオチド配列中に組
込まねばならない。

標識がヒプリド化を阻害しないような方法で個々のヌク
レオチドを標識するには種々の方法が使用できる。これ
ら標識された単量体ヌクレオチドをポリヌクレオチドプ
ローブへ結合させるにも、種々の化学的および酵素的方
法が使用できる。たとえば、λ′−デオキシウリジン２
　／　−トリホスフェートターアリルアミンビオチンの
ような標識されたヌクレオチドを、ＤＮＡプローブにお
いてニック翻訳によって置換することができ〔ビー・ア
ール・ランガー等、［ビオチン標識したポリヌクレオチ
ドの酵素的合成；新規な核酸親和性プローブ」、プロシ
ーディング噂ナショナル・アカデミ−・サイエンス・Ｕ
ＳＡ。

第７ざ巻、第ｔ７３３−３７頁（／りｒ／）〕または末
端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いる
ＤＮＡプローブへの末端付加により置換することができ
る。

しかしながら、これらの方法には製造上の制約がある。

たとえば、標識された単量体ヌクレオチドをポリヌクレ
オチド配列中プ中へ組込む前に、これらヌクレオチドを
合成する必要がある。この合成は、しばしば高価な化学
的方法を含む。ポリヌクレオチド中への標識された単量
体ヌクレオチドの結合も高価につく。たとえば、酵素的
結合に使用する酵素は高価である。これに関連する制約
は、この方法を工業的規模まで拡大するのに困難を伴い
かつ費用が嵩むことである。その結果、これらの方法は
、現在希望するよりも高価につく非放射能標識したポリ
ヌクレオチドを生産する。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、分析物の検出においてグローブとして
有用である生体内または生物学的に標識したポリヌクレ
オチド配列を提供することにより、上記の製造上の制約
を解決することである。これらの配列は、問題とする分
析物を検出するための方法およびキットに使用すること
ができる。

〔発明の要点〕

本発明の標識したＤＮＡ配列の製造方法は、一般にその
ｌ具体例において、所望ポリヌクレオチド配列の生体内
標識化を含む。或いは、本発明の方法を使用して、予め
標識された塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオナトを
所望のポリヌクレオチド配列中へ生体内で組込むことも
できる。本発明のこれら両具体例は、従来のポリヌクレ
オチド［ｔｉ方法に対する改良である。

さらに、これら両者は非放射能標識したグローブを釉々
の検出系に使用するのに一層低価格で容易に供給するこ
とを可能にする。

より詳細には、本発明のポリヌクレオチド配列の生体内
標識方法における第／の具体例は、械敵することが望ま
しいポリヌクレオチド配列と少なくとも７種の他のポリ
ヌクレオチド配列とを特徴とする宿主を培養する工程か
らなシ、前記他のポリヌクレオチド配列は培養宿主の複
製に際し所望のポリヌクレオチド配列を標識する産生物
を発現する。好ま１−くけ、　この方法はさらに標識さ
れたポリヌクレオチド配列がら々る少なくとも１種のポ
リヌクレオチド配列を培養宿主から単離する工程をも含
む。より好１しくけ、培養宿主から単離されたＤＮＡ配
列は、標識されたポリヌクレオチド配列自身の１部また
は全部である。

本発明の／っの好適具体例においては、標識するごとが
望ましい異質ＤＮＡ配列をＴ≠バクチリオファ〜ジゲノ
ム（これは一般にヒドロキシルメチル化されかつグルコ
シル化されたＤＮＡを含有する）中へ挿入する。宿主Ｔ
ｏｙアージは、ヒドロキシメチル化されかつグルコシル
化されたＤＮＡを産生ずる条件下で増殖される。

挿入されたグローブＤＮＡ配列を含有するＴ４ｔファー
ジを収穫し、そしてプローブＤＮＡ配列を好ましくは周
知のその場におけるもしくは試験管内のヒプリド化法に
おいてヒブリド化プローブとして使用するために切断す
る（たとえば、サウザンプロット、ノーザンプロット、
ドツトプロット、コロニーヒブリド化またはブラックリ
フト法）。或いは、挿入された生体内標識したプローブ
ＤＮＡ配列を含有するＴ４Ｌ７アージゲノムをプローブ
として使用することもできる。

次いで分析物へヒブリド化したプローブの存在を、たと
えば架橋部分と信号部分との組合せを用いて検出する。

たとえば、コンカナバリンＡ　（「ＣｏｎＡＪ　）をグ
ルコシル化プローブＤＮＡ配列に結合させ、そして天然
グリコジル化酵素に対する架橋として作用させる。酵素
（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）は適当な基
質（たとえば、　Ｈ２Ｏ２）とジアミノベンジジンとに
接触すると比色分析しうる生成物を生成し、これを検出
することができる。さらに、他の検出系または抗体、或
いは周知の方法を用いる他の検出系も、ヒブリド化ＤＮ
Ａ配列を検出するために使用することができる。

本発明による方法の他の具体例においては、所望の標識
を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドまた
はその同族体もしくは先駆体を生体内でポリヌクレオチ
ド配列中へ組込む。

この具体例において、本発明のポリヌクレオチド配列の
生体内標識方法は、標識することが望−ましいポリヌク
レオチド配列を特徴とする宿主をその宿主が成長するの
に必要とする標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくは
ヌクレオチドまたはその同族体もしくは先駆体の存在下
で培養して、この標識をポリヌクレオチド配列中へ組込
む工程を含む。ここでも標識されたポリヌクレオチド配
列からなる少なくとも７種のポリヌクレオチド配列を培
養宿主から単離するのが好ましい。さらに好ましくは、
培養宿主から単離された配列は、標識されたポリヌクレ
オチド配列自身の一部または全部である。

標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド
またはその同族体もしくは先駆体をポリヌクレオチド配
列中へ生体内で組込むための本発明による１つの好適具
体例において、標識することが望ましいポリヌクレオチ
ド配列を特徴とするイー・コリのチミンもしくはチミジ
ン要求性の突然変異種をチミジンもしくはチミンの代り
にＢγｄＵＲを補充した培地で増殖させて、所望のポリ
ヌクレオチド配列をＢγｄＵＲによって生物学的に標識
する。

この標識プローブのその後の使用は実質的に上記した通
りである。プローブ検出／分析物ヒプリド化の過程は、
ＢγｄＵＲ標識したプローブＤＮＡ配列のビオチン化と
幾つかの公知方法のいずれかによるビオチン成分の検出
を介して行なうことができる。或いは、抗体または他の
検出方式を使用して、ＢγｄＵＲ置換したＤＮＡを直接
に検出することもできる〔エッチ嗜シイ−・グラツナ−
１［！−ブロムーおよびｊ−イオドーデオキシウリジン
に対するモノクローナル抗体：ＤＮＡ：ｌ製を検出する
ための新規な試薬」、サイエンス、第２７ｇ巻、第グア
４１−７１頁（ｌりざ２）〕。

〔発明の実施例〕

本発明を一層よく理解するよう、以下詳細に説明する。

生体内標識されるポリヌクレオチドの原料多数のポリヌ
クレオチド配列を本発明の方法に使用して標識しかつ分
析物の検出に使用することができる。たとえば、これに
は各種のウィルス性、擬似ウィルス性、真菌性、寄生性
もしくは細菌性の感染、遺伝障害または検出することが
望ましい分析物における他の配列を特徴とするポリヌク
レオチド配列が包含される。これらは合成、生合成また
は天然の起源とすることができる。

多数の入手しうる原料のいずれかを使用して、生体内標
識されたポリヌクレオチドを産生させることができる。

たとえば、Ｔ−偶数ファージ（すなわちＴＪ、Ｔグおよ
びＴＪ）が包含され、これらは天然においてモノ燐酸シ
チジンの代すにグルコシル化されたモノ燐酸ヒドロキシ
メチルデオキシシチジンを有する〔アイｅアール・レー
マン等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２３！巻、第３２３’、＜ｔ−ｊｆり頁（／りＡｏ）
）；さらにｊ−ヒドロキシメチルウラシルによりチミジ
ン残基を置換する枯草菌ファージＳＰＯ／（アール・シ
イ−・カレン等、ジャーナル・モレキュラー争バイオロ
ジー＊　第３巻、第、２グｒ−ｚθ頁（ｌり２コ）〕；
〕！−メチルシトシによりＣ残基を置換するキサントモ
ナｘ−オリゼ（Ｘａｎｔｂｏｍｏｎｕｓ　ｏｒｙｚｅａ
　）ファージＸＰｔ２（ティー・ティー・クオ等、ジャ
ーナル・モレキュラー・バイオロジー、　８３４’巻、
第３７３−７６頁（ｌりｔ♂）〕；　並びにＴＵ＆の６
．２％がホスホグルクロン化されかつグルコシル化ｇｔ
ｌ−ｊ　−（Ｆ’、　ｊ’−ジヒドロキシペンチル）ウ
ラシルにより鰺換された枯草菌ファージ５Ｐｙｓ（エッ
チ・ハヤシ等、ジャーナル中アメリカン・ケミカル・ソ
サエティ＋第Ｐｊ巻、第Ｊ’７４’ターｊ７頁（ｌＰ７
３））が包含される。本発明の変法（・でおいて、ｊ−
プロムーブ副キシウリジン（Ｂγｄ　Ｕ　Ｒ）または他
の標識された塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド
によるプローブＤＮＡ配列の標識化は、これらの塩基、
ヌク１／オシドもしくはヌクレオチドを成長に必要とす
る突然変異種をこれらの存在下で増殖させて行なう。

標識することが望ましいポリヌクレオチド配列と標識の
原料とは、多くの方法で宿主中において組合せることが
できる。′ｆｃとえげ、標識すべきポリヌクレオチド配
列は、元来、特定宿主の原ゲノムの１部とすることがで
き、或いはたとえば組換ＤＮＡ技術の方法を用いてその
ゲノム中へ挿入することもできる。或いは、標識すべき
ポリヌクレオチド配列は、復製させかつ標識するよう宿
主を形質転換させるのに使用するクローン化ベヒクル、
ファージＤＮＡまた（弓、その他のＤＮＡ配列の７部と
することもできる。

さらに標識の原７月を、種々の方法で宿主中に存在させ
ることもできる。たとえば、標識の原料がポリヌクレオ
チド配列を特徴とする宿主において複製させる際にこの
所望のポリヌクレオチド配列を標識する産生物を発現す
るＤＮＡ配列である場合、このＤＮＡ配列を宿主中に存
在させることができる。何故外ら、こねは宿主の天然ゲ
ノムの１部であったか、或いはそのゲノム中に挿入され
たものであるからである。或いは、標識の原料であるＤ
ＮＡ配列は、複製のために宿主を形質転換させるのに使
用するクローン化ベヒクル、ファージＤＮＡまたはその
他のＤＮＡ配列の１部とすることもできる。本発明の１
つの好適共体例においで、標識すべきポリヌクレオチド
配列は、標識の原料であるＤＮＡ配列と同じクローン化
ベヒクルまたはファージＤＮＡに存在する。或いは、２
種のＤＮＡ配列が宿主中に別々に存在してもよい。特に
好ましくｕ、ｍａすべきポリヌクレオチド配列を、標識
の原料であるＤＮＡ配列中にクローン化させる。いずれ
にせよ、宿主を培養する際、所望ＤＮＡ配列を複製中に
または複製後に標識の原料であるＤＮＡ配列により発現
された産生物の結果として標識する。

標識の原料が塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド
またはその同族体もしくは先駆体である場合、これは宿
主における複製の際に所望ポリヌクレオチド配列中に組
込まれる。何故なら、この宿主は、所望の標識を有する
増殖用の標識保持部分、塩基、ヌクレオシドもしくはヌ
クレオチドまたはその同族体もしくは先駆体を培養培地
へ加えることを必要とする変種でらるからである。次い
で１本発明の方法により培養する際、所望のポリヌクレ
オチド配列が宿主における複製に際し標識の組込みによ
って生体内標識される。

本発明の方法に有用な宿主は、極めて多くの公知生物か
ら選択することができる。これらは、たとえばイー・コ
リ、バチルス、シュードモナス、ストレプトミセス並び
に各種の真菌類、藻類のような各種の微生物並びに植物
およびヒトの培養細胞を包含する。必要々ことは、標識
することが望ましいポリヌクレオチド配列を宿主中で複
製させ、かつ宿主の増殖のために選択された培養条件下
で標識の原料により標識することだけである。

本発明の生物学的に産生されたプローブＤＮＡ配列は、
多くの実用的用途を有する。１つの用途は分析物の検出
である。検出すべき分析物は任意の生物学的または非生
物学的試料、たとえば臨床試料（たとえば血液、尿、糞
、唾液、膿、精子、血清、その他の組織）、発酵用ブロ
ス、培養培地などに存在することができる。

必要に応じ、分析物は、その核酸を濃縮するために公知
方法により予備抽出し或いは精製することができる。こ
の種の核酸濃縮法は、たと、ｔはフェノール抽出、クロ
ロホルム−イソアゼルアルコールもしくはクロロホルム
−オクタツールによる処理、カラムクロマトグツフィー
（たとえば、セファデックス、ヒドロキクルアパタイト
）およびＣｓＣ１平衡遠心分離を包含する。分析物は、
存在する汚染物質と一緒に混合物中で或いは精製した状
態で試験することができ、或いは分析物は分析前に固定
化することもできる。

本発明の検出方法およびキットについても多数の用途が
ある。試料中において検出しかつ分析することが望まし
い任意の分析物を本発明の方法およびキットにかけるこ
とができる。たとえば、この方法およびキッｉ使用して
、ウィルス性および細菌性のＤＮＡ配列を検出しかつ同
定することができ、たとえばヘルペスウィルスの検出が
可能でおる。

さらに本発明の方法およびキットを使用してヒトの遺伝
障害を診断することができ、その際遺伝障害に関連する
ＤＮＡ配列に対し補完的なプローブを作成し、かつ主た
る標識過程の存在または不存在を検出する。これらの遺
伝障害には、たとえば海洋貧血がある。この海洋貧血の
診＠ｌｄ、グローブポリヌクレオチド配列をゲノムＤＮ
Ａ−＼ヒプリド化させて行なうことができる。

本発明の方法およびキットの他の用途は染色体の核型分
類であり、これは染色体のそれぞれに特異的に位置する
一連の所定ＤＮＡ配列に対応する一連の標識ポリヌクレ
オチド配列を使用し、次いで主たる識別過８を検出する
ことからなっている。

ヒプリド化分析の方法 試験を行なうため、分析物を含有すると思われる組成物
を、標識されたプローブポリヌクレオチド配列と一緒に
、分析物のポリヌクレオチド配列とプローブ上の識別用
ポリヌクレオチド配列との間のヒプリド化を行なわせる
のに充分な時間および条件の下で培養する。これらの条
件は分析物およびグローブの性質および量に応じて変化
する〔ディー拳イー拳ケネル、「核酸ヒブリド化の原理
および実施−１、プログレス・ヌクレイツク拳アシドー
リサーチ・モレキュラー・バイオロジー、第１Ｉ巻、第
２ｊター３０／頁（ｌり７／）〕。

多くの種類の信号過程を用いて、主たる識別過程の発生
、すなわち分析物における補完配列に対する標識ＤＮＡ
配列のヒプリド化を検出することができる。選択する特
定の信号過程は、ポリヌクレオチド配列の標識または改
変ｍ識を特徴とする特定の信号に依存する。

たとえば、ポリヌクレオチド配列により担持される標識
は、これに信号部分−または架橋部分と信号部分との少
なくとも７つの組合せを結合させる処理なしに検出する
ことができる。しかしながら、より一般的にはそれ自身
で検出しうる或いはさらに改変した後に検出しうるよう
になる（上記）信号部分或いは架橋部分と信号部分との
少々くともｌっの組合せを共有結合させ、または非共有
結合させる。

ポリヌクレオチド配列の標識に共有結合させうる信号部
分および架橋部分の例は放射性化合物、螢光性化合物、
フルオレシン、ローダミン、ダンシル、磁性化合物、キ
レート剤並びにこれら標識に対し共有結合させうるその
他の信号部分および架橋部分を包含する。

ポリヌクレオチド配列の６１に対し非共有結合させうる
信号部分および架橋部分の例はポリペプチド、蛋白質、
レクチン、フンカナバリンＡ１酵素、アルカリホスファ
ターゼ、酸ホスファターゼ、抗原、抗体、結合されたス
トレプトアビジン基を有するポリペプチド、β−ガンク
トシダ〜ゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペル
オキ７ダーゼ、キレート剤並びにこれら標識に対し非共
有結合させうるその他の信号部分および架橋部分を包含
する。

たとえば、酵素を信号部分としてポリヌクレオチドプロ
ーブ配列の標識へ非共有結合させることができる。次い
で、基質を加えて発色させる（螢光、放射能もしくはキ
レート検出の方式も使用することができる）。或いは、
標識に結合された部分がビオチン成分であれば、たとえ
ばアビジン、ストレプトアビジンまたはアンチ−ビオチ
ン抗体のようなビオチン結合分子を次いでこれに加える
こともできる。次いで、ビオチン結合分子が酵素、螢光
性化合物、電子濃密化合物または不溶性固体相へ結合さ
せて、適当な手段により検出を行なうことができる。

本発明を一層よく理解するよう、以下に実施例を示す。

これら実施例は説明の目的であって、本発明はこれらの
みに限定されない 実施例Ｉ 組換ＤＮＡ技術を用いて、プローブＤＮＡ配列を、グル
コシル残基で標識するためＴｌバクテリオファージ中へ
挿入することができる。

ＴｐＤＮＡは天然グルコシル化されている。

一般的に使用される制限エンドヌクレアーゼの殆んどは
グルコシル化ＤＮＡ１加水分解しないので、エンドヌク
レオ分解およびプローブＤＮＡの挿入の前にＴｌＤＮＡ
中らグルツース残基を除去する必要がある。ヒドロキシ
メチルシチジングルコシダーゼ、すなわちファージ銹発
酵素はグルコース部分をグルコシル化ＤＮＡから除去し
て、これをその逆反応でＵＤＰへ移動させル〔ジエーー
ジョツセ等、ジャーナル・バイオロジカル勢ケミストリ
ー、第２３７巻、第１りｇ、ｉ’−７乙頁（／り６２）
　；ニス−アール・チンメルマン等、ジャーナル・バイ
オロジカル−ケミストリー、第、２３７巻、第ｊｔ／、
２−／ざ頁（／りＡ２）〕。

或いはＴａファージを、シトシンがヒドロキシメチル誘
導体を置換するような条件下で増殖させることもできる
〔ケー・カールソン等、ジャーナル・バイロロジー、第
３を巻、第１−／７Ｊｊ（／Ｐ７り）ｉピー・オーファ
レル等、モレキュラー・ゼネラル−ジェネティックス、
第７７り巻、第グ２／−３ｊ頁（ｉｙ♂θ）；　エル・
クンダー等、グロシーデイング・ナショナル・アカデミ
−・サイエンス・Ｕ　Ｓ　Ａ％第７３巻、第３０２ざ−
３１０，２頁（／り７６）〕。

Ｔ　！　Ｄ　Ｎ　Ａが上記のように脱グルコシル化され
た後、プローブＤＮＡ配列を脱グルコシル化されたＴ４
ｔゲノム中へ挿入する。脱グルコシル化Ｔｌｌ１ｙ’／
ム中へのグローブＤＮＡ配列の挿入は各種の公知方法で
行表うこともできるが、これはｍ識の後にＴ≠ＤＮＡか
ら除去しうるような方法で挿入するのが好適である。

Ｔ≠ファージにおいてはＣ残基のみがグルコシル化され
ているので、ＤＮＡ配列ＴＴＴＡＡＡｆ、識別しかつ開
裂する制限エンドヌクレアーゼ泪」■が原Ｔ弘ＤＮＡを
開裂しうる数少ないエンドヌクレアーゼの７種でおる。

したがって、本発明の１つの好適具体例において、プロ
ーブＤＮＡ配列は、部分脱グルコシル化されたＴｌＤＮ
Ａ中へ挿入する前に両末端にＡｂａｃｉ制限部位を有す
るように改変される（第１図）。このような作成におい
て、プローブＤＮＡ配列は次いでＡｈａｉｌｌでの制限
によりＴ弘ＤＮＡから標識の後に単離することができる
。

ＤＮＡグローブの作成、Ｔ≠ＤＮＡ中へのその挿入およ
び標識後におけるその除去に関する一般的方法を下記に
説明しかつ第１図に示す：（１）先ず最初にＤＮＡ配列
ｐ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　ｐ（公知技術により合成
）をプローブＤＮＡの３′末端に結合させ、これをＲＮ
Ａリガーゼを用いてＴｌゲノム内に挿入する。コンカテ
マーの生成を防止するにはＤＮＡ配列ｐＴＴＴＡＡＡ、
ｐの３′末端とｊ′末端との両者に燐酸を必要とする。

次いで、プライマＤＮＡ配列ＴＴＴＡＡｐ（常法により
合成）を、上記で作成されたＤＮＡ配列へ非共有結合さ
せる（第１図）。このＤＮＡ配列（ＴＴＴＡＡｐ）はプ
ライマとして作用し、したがってＤＮＡポリメラーゼと
デオキシヌクレオチド三燐酸ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧ
ＴＰおよびデオキシヒドロキシメチルＣＴＰ（ｄＨＭＣ
ＴＰ）の存在下で複製する際、λつのＤＮＡ配列が生成
される（第１図）。これらの配列は、プロープＤＮＡ配
列の対向末端にＡｂａｌｌｌ制限エンドヌクレアーゼ部
位を有する（第１図〕。これらはさらに、ＤＮＡ＠の１
つに標識＜　？＞を有する。

第λのＡｈａ［１部位をグローブＤＮＡ配列の他力の末
端へ付加させるため、同様な一連の工程を行なう。ここ
でもＤＮＡ配列ｐＴ１’ＴＡＡＡｐを、予め作成された
ＤＮＡ配列の３′末端へ結合させる（第７図）。次いで
、ＤＮＡ配列Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　ｐをプライマと
して使用して生成配列へ非共有結合させ（第１図）、そ
して処理された配列をＤＮＡポリメラーゼおよび４を種
のデオキシヌクレオチド三燐酸の存在下で前記ノヨうに
複製させる（第７図）。

この一連の工程の結呆、、ｉ！Ｉｆ端部において人り■
制限エンドヌクレアーゼ部位により整列され、かつ両Ｄ
　Ｎ　Ａ鎖に標識を有するプローブＤＮＡ配列からなる
ＤＮＡ配列が生成される（第１図）。

これら工程の副産物として、２釉の単一鎖ＤＮＡ配列も
生成される。これらの単一鎖ＤＮＡ配列は、！つの左回
」制限部位を有する所望のプローブＤＮＡ配列から容易
に分離することができる。

次いで、燐酸基をグローブＤＮＡ配列の末端からアルカ
リホスファターゼにより除去し７た後、プローブＤＮＡ
配列をＴ４ｆゲノム中−１挿入する。

（２）上記のように作成された部分脱グルコシル化され
たファージＴグＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼにより
開裂させた後、プローブＤＮＡｆＴ４ｔゲノムの非必須
部分中へ挿入し、すなわちファージ複Ｈ、ヒドロキシメ
チルシトシン生成およびＤＮＡグルコシル化に必要とさ
ねない遺伝子中へ挿入する。ＢａｍＩ（Ｉは、このよう
な部位においてＴ＋ＤＮＡを開裂する。制限の後、必要
に応じ単一鎖末端をＤＮＡポリメラーゼエによってＡＴ
Ｐ　、ＴＴＰ　、ＧＴＰおよびデオキシヒドロキシメチ
ルＣＴＰの存在下で埋め込む。

１３）　Ａｈａｌｌ識別部位を有するプローブＴ）ＮＡ
配列を５Ｔグゲノムの予め制限された非必須領域へ鈍端
結合させる〔ブイ・スガラメラ、「）ぐクテリオファー
ジＰλ、２　ＤＮＡおよび線状猿つィルス弘θＤＮＡの
酵素的オリゴマー化」、プロシーディングｅナショナル
拳アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第６２巻、第３３
ざター２３頁（／り７．２））。

（４）　グローブをＴ４Ｚゲノム中へ挿入した後、好ま
しくは全組換ＤＮＡ分子をαおよびβグルコシルトラン
スフェラーゼによってＵＤＰ−グルコースの存在下で〔
ジエー・ジョツセ等、上記〕試験管内にてグルコシル化
することにより、組換ＤＮＡ分子をファージによるエン
ドヌクレオ分解攻撃から保護する。

（５）組換Ｔ弘プローブＤＮＡ分子の試験管内カプセル
化は、エル礁ダブリュウ令ブラックの方法にしたがって
行なうことができる〔「バクテリオファージＴ４ｔＤＮ
Ａの試験管内充填Ｊ。

パイロロジー、第１／３号、第３３ｔ−ググ頁（／りざ
／）〕。

（６）プローブＤＮＡ配列を含有するこれらクローンに
関する形質転換宿主Ｔ≠ファージの選別は、補完的ビオ
チン化ＤＮＡプローブによって、またはその他任意の慣
用の選別法によってヒプリド化により行なわれる。

（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉ　、多くの公知方法のいずれか
によリグローブＤＮＡを含有するＴ４Ｌクローンから単
離する〔たとえば、ジー・エル・カントニおよびディー
−アール・ダビエスｌ）、フロセジュアーφイン・ヌク
レイツク、アシッド・リサーチ、ニューヨーク：ハーバ
−優アント畳ロー（、ＩＪＡ））。

（８）生体内標識されたプローブＤＮＡ配列を組換Ｔグ
ゲノムから切除した後に、これを上記のように作成され
た整列した配列にて入りｍ制限エンドヌクレアーゼで開
裂することにより検出系で使用することができる。或い
は、プローブＤＮＡ配列を含有する全組換Ｔ＋ゲノムを
グローブとして使用することもできる。

見 ＣｏｎＡ、すなわち架橋部分は、グルコシル化ＤＮＡと
グリコジル化蛋白質（信号部分）との両者に結合する。

ｐＨｔが室温より低い温度にて、ＣｏｎＡｌｊダイマで
あってλつのグリコジル結合部位を有する。生理学的−
１かつ室温もしくはそれより若干ぬい温度（３７℃）に
て、原Ｃｏｎ　Ａはテトシマであってμつの結合部位を
ゼする。

アルカリ性ｐＨ（ｆ、ｊもしくはそれ以上）かつより島
い温間ＶＣで、Ｃｏｎ　Ａは不活性なサブ単位に解離す
る。Ｃｎｎ　Ａがグリコジル残基に結合するには、マン
ガンもしくはマグネシウムとカルシウムとが８費とされ
る。Ｃｏｎ　Ａの保存浴液をＴＣ７１りＮ緩衝液（ｊｍ
Ｍ）リスＨＣ／　、　ｐＨ７，０、／　ｍＭ　ＣａＣ，
／２、／　ｍＭ　ＭｎＣｊ？２、ｔ　Ｍ’ＮｔＩＣｌ　
）における／　−６１ダ／ｍｔの濃度にてガラス管中に
保つ。何故なら、ＣｏｎＡはｓ　ｍｙ　／　ｍｌより大
きい濃度１ｃてプラスチック表面に付着しかつ凝固する
からである。ＣｏｎＡは７℃にて約３ケ月間貯蔵するこ
とができる。

グルコシル化されｆＣＴ４ｔＤＮＡを打点したニトロセ
ルロース紙を、λチ酸性化牛血清アルブミ７（ＢＳＡ）
、／　ｘ　Ｔ　ＣＭＮオよび０．／　％ｖ／ｖ　トＩＪ
　トンＸ−１０θを含有する緩衝液において湿潤室中で
グλ℃にて／１児遮閉した。これらニトロセルロー７２
紙を次いでそれぞれ／％ＢＳＡと／ＸＴＣＭＮとを含有
する緩衝液により５分間３回洗浄した。次いで、これら
ニトロセルロールｆ紙をｏ、ｉ係ＢＳＡおよび／ＸＴＣ
ＭＮにおけるｔｏｏ−，２００μ（ｉ　Ｃｏｎ　Ａ　／
Ｎ；よりなるＣｏｎ　Ａ溶液中で培養した。この溶液を
ニトロセルロー７２紙／　（：ｈＬ２当り０．０　／　
Ｉ　ｍｅまたはワットマン（登録商標）　３　ＭＭ　７
１　ｔ　Ｋ’当／）０．．２ｍｌの１で４．布し、そし
て３７℃にて７時間培養した。培養後、こわら沢紙をそ
れぞれ０．／％ＢＳＡおよび／ｘＴｃＭＮ［荷液におい
て５分間３〜ケ月洗浄した。これらｆ紙を、２ｍ１０単
位の酵素を含有するθ、／チＢＳＡおよび／ＸＴＣＭＮ
の溶液中で培養した。これら溶液を二）−ロセルロース
／　ｃｍ２当Ｆ）　’−”♂ｒｎｌ、或いはワットマン
（登録商標）３ＭＭＩＰ紙／薗２当りｏ、２ｍ１（Ｄ量
で塗布した。培養を３７℃にて１時間行なった、次いで
、これらの１紙をそれぞれＮＢＴＴ緩衝液（０，６Ｍ　
ＮａＣ／　、θ、／　％　Ｂ　ＳＡ、　０．０６％ツイ
ーン２０，１０ｍＭトリスＨｅ／　、　ｐＨ７，２）に
て５分間３回およびそれぞれＮＣＢＴ緩衝液（０，３Ｍ
　ＮａＣＪ、０００３Ｍクエン酸ナトリウム、ｏ、ｉ％
ＢＳＡおよびｏ、ｏ　ｓ％ツイーン２０）にてｊ分間λ
回洗浄した。

グリコジル化された酵素−ＣｏｎＡ−誘導化。

ＤＮＡ配列は次のように検出した： ｆＡｌ　西洋ワサビペルオキシダーゼ Ｃｏｎ　Ａ−グルコシル化ＤＮＡとグリコジル化酵素と
を含有するｆ紙を、６ｍ９のジアミノベンジジンと０．
０℃％のＩ（２０２と全！　ｍ　Ｍ　）すｘ　ＨＣ，ｅ
（ｐ＋−１７，６）　／θｍｌ中に含有する新たに調製
した溶液中に浸漬し、そして光から保護した。褐色がイ
ンジケータとして生じた。

＋ＢＪ　酸ホスファターゼ Ｃｏｎ　Ａグルコモル化ＤＮＡとグリコジル化酵素とを
含有するり：Ｊ紙金、０．２　Ｍ　ＮｕＯＡｃ／ｍ２当
り０．／Ｉｎ９のす７　Ｉ−−ルＡｓ　−ＭＸ燐酸を含
有する基質溶液（ｐＨｔ、と）に浸漬し、暗所で３７℃
にて培養し、た。インジケータとしてバラ色が生じた。

（Ｃ１クルコースオキシダーゼ ｊＯｍＭ）す、７．　／　）ＩＣｅ（ｐＨ７，ｓ　）　
ｉ　ｍｌ中のＡ、７　Ｉｎ９のβ−Ｄグルコ〜スおよび
。、６７ｍＱのニドＯＷテトラツリウムｆ１３７℃番で
て７時間培養した。１０　ｏ　ｔＪｉノ１０１００ｘＰ
　（７−Ｌナシ：ｙ　、？’　トサル７　ニー　１・、
０．０　／　、４７／ｎ９７ｍ１蒸留水中）を加え、そ
して溶液を混合した。

Ｃｏｎ　Ａ−グルコシル化ＤＮＡおよびグリコジル化酵
素を含有する沢紙を、次いでこの混合物中で暗所にて３
７℃で１時間、或いは室温でｌ娩培養し＞’ｃ、　（ン
ジヶータとして強い青色が生じた。

反応の感に： ｆＡ）　西洋ワサビペル副キシダーゼ ／！０−２６θピコグラムのＤＮＡが検出された。貯蔵
後に色は褪色１−た。

ｆＢｌ　酸ホスファターゼ ヒプリド化し１ＤＮＡプロツトのみを分析し、７−／ｊ
ピコグラムのＤＮＡが検出された。

ｔｃ＋　グルコースオキシダーゼ グルコシル化ＤＮＡフロットのみを検査し、１５０−２
１０ピコグラムのＤＮＡが検出された。

ＣｏｎＡ検出のこの方法は、最適でないことが判明した
。Ｃｏｎ　Ａに続く酵素の順次の添加は、分析検出系に
おいて過度のバックグランドを生ずることが判明した。

さらに、この方法は比較的時間がかかり、検出感度が所
望より低いものであった。したがって、ＣｏｎＡとグル
コシル化ＤＮＡと酵素とを接触させる第コの方法を使用
した。

Ｃｏｎ　Ａとグリコジル化酵素とをＴＣＭＮ緩衝液中で
ｌ：ｌのモル比にて混合し、そして３７℃で２時間、或
いは、２ｊ℃でグ〜を時間、或いはグ℃でｌ晩乃至ｙ−
ｒ時間培養した。（培養期間の後、混合物は透明となる
。もし透明でなければ、ＣｏｎＡが過剰に存在し、より
多音の酵素を加えねば々らない）。

Ｔ４ｔグルコシル化ＤＮＡを含有するニトロセルロース
フィルタの遅閉を上記のように行なった。次いで、これ
ら２紙をそれぞれＴＣＭＮ緩衝液および／％ＢＳＡで５
分間洗浄した。次いで、上記のように作成したＣｏｎ　
Ａ−酵素錯体をθ、Ｏｔ１ｍｌ／［株］２の容蓋にてＰ
紙に接触させ、或いは約２−１０単位の酵素を含有する
門で接触させた。培養は３７℃で７時間行なった。培養
後、これら１紙を先ずそれぞれＮＢＴＴで５分間３回、
次いでそれぞれＮＣＢＴで！分間−回洗浄した。

西洋ワザビベルオキシダーゼ反応を上記と同様に行なっ
た。この過程で３八、２５ピコグラムのＤＮＡを検出す
ることができ、かつ上記の検出技術によるよりもずっと
ノ（ツクグランドが少なかった。さらに同様な検出子Ｉ
＠をＣｏｎＡ　−ｆｌｉｔホスファターゼ錯体、Ｃｏｎ
Ａ−／／レコー　スオキシダーゼ錯体並びにその他の同
様なＣｏｎＡ−酵素錯体を用いて行なうことができる。

さらに、レクチン／抗体およびその他の検出系も使用す
ることができる〔ワード等、上記〕。

界−９−再−ｅ１！−ｎ− グルコシル化ＴグＤＮＡ（１）Ｌ？−もオーく泄−グル
コシル化プローブＤＮＡと分析物との間におけるヒプリ
ド化反応の検出を助けるため、グルコシル化プローブＩ
）　Ｎ　Ａをさらにビオチン成分で訪尋化させ、これに
対しては標準検出系が知られている。

（１７，７Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４ｔ、Ｊ）に
おける／ｍｙ／ｍｅのＴ　４４　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ｍｌ
をｏ、ｔ　ｍｌの新たに作成した／　Ｍ　ＮａＩＯ４溶
液と混合した。この混合物を暗所にて室温で３時間培養
した。

酸化反応が完結した後、溶液を暗所中でり℃にてｏ、ｏ
ｓｈｓ６酸ナトリウム（ｐＨψ、ｏ　）、０．１Ｍ　Ｎ
ｔｓＣｌ會λ回取替えてかつ０．３　Ｍ硼酸ナトリウム
（−タ、０−タ、Ｊ）、０゜／　Ｍ　ＮａＣＪを２回取
替えて透析した。次いで、このＴイ１液ｔ…り、３のジ
アミン貯Ｑ溶液からのｌ、乙−ジアミノヘキサン中でｏ
、ｔ、ｔ　Ｍにした。この混合物を暗所でｙ。

分間培奈した。得られたシッフ塩基ｆ：Ｎａ　ＢＩｉ４
で還元した。水中で、２八１の濃度１で新たに溶解させ
たＮ！ＬＢＨ４をこの混合物へ３０分間間隔で弘回加え
、ＮａＢＨ４の振腋を徐々にθ、ｏａｒＭ〜０．／ｈｌ
まで増加させた。全培養時間ｅま３時間でめった。≠Ｍ
酢眩ナトリウム（ｐ１４　ＩＡ、０　）を加えることに
より　ｐｉ（をｊ、ｏ　−ｓ、ｓ　ｖｃ副調整て、Ｎａ
ＢＨａを冷却した。このＤＮＡ宿桐浴液を０．／Ｍ＠酸
ナトリウム（ＰＨＡ、７　）において／、２時間透析し
、次いでグＯ％ｖ　／ｖ　］）　ＭＦおよび２０ｍｈ４
ビオチンＮＨＳニスデルにした。この浴液を１２時間培
養した。過剰のビオチンおよびビオチンＮ　Ｈ８エステ
ルを、溶出緩衝剤として／ｘ８ＳＣを用いるＧｊＯセフ
ァデックスカラムを通しての１過により除去した。ＤＮ
Ａを含有するフラクションをカラムから集め、混合し、
かつ０−／　Ｍ　ＮａＣＺ　％０−０　（７／　Ｍ　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ＰＨ７、Ｏ）を含有する溶液に対し透
析し、そして後に使用するまで一コＯ℃にて貯蔵した。

配列の作成 この実施例においては、標識することが望ましいポリヌ
クレオチド配列を含有する宿主をその標識を有するヌク
レオチド、塩基もしくはヌクレオシドの同族体の存在下
で培養することにより、標識をポリヌクレオチド配列中
に生体内で組込んだ。何故なら、この宿主は標識担持同
族体を必要とする変種であるからである。上記のように
、標識することが望ましいポリヌクレオチド配列は宿主
のゲノムの１部とすることができ、或いはゲノムへ加え
ることができる。さらに、これは宿主を形質転換させる
のに使用するＤＮＡ配列または他のクローン化ベヒクル
もしくはファージの７部とすることもできる。

標識することが望ましいＤＮＡ配列を特徴とするイー・
コリのチミン要求性突然変異種（ｔｈｙ　Ａ　）を、チ
ミジンの代りに！−ブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ
Ｒ）を補充した培地において、ミラー、エキスペリメン
ト・イン・モレキュラ・ジエネテイツクス、コールド・
スプリング昏ハーバ−・ラバトリー（／り７＋２）の技
術にしたがって増殖させた。細胞を収穫し、そして標識
されたプローブＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ配列を単離
した。このＤＮＡ配列を。

ヒプリド化の研究に直接使用することができる。

或いは、標識されたグローブ配列の全部または７部を先
ずＤＮＡ配列の残部からエンドヌクレオ分解によって除
去し、そして分析物の検出用に単独で使用することがで
きる。

分析物に対する標識プローブのヒプリド化はＢｒｄＵＲ
に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体と
の反応により検出することができる〔グラツナ−１「５
−ブロム−およびｊ−イオドーデオキクウリジンに対す
るモノクナール抗体？　ＤＮＡ複製を検出するたやの新
規な試薬」、ザイエンス、第２１♂巻、第！７４’−７
５頁（ｌりざ、２））。或いは、このグローブをさらに
、たとえばチオビオチンのような成分を加えることによ
り化学的にＭＪ化することもできる。次いで、このチオ
ビオチン化したＤＮＡプローブを検出することができ、
この場合プローブは、たとえばブチツク（登録商標）ｉ
−ｈｒｐのようなビオチン検出系、或いは他のこの種の
ビオチン検出系を用いて分析物にヒプリド化させる。

実施例■ 実施例■において作成されかつ分析物にヒブリド化され
たＢγｄＵＲ標識プローブＤ　Ｎ　Ａを検出するため、
とのＢγｄＵＲ標識したプローブＤＮＡをさらにビオチ
ンで誘導体化することができる。

ブロムデオキシウリジン残基金含有するＤＮＡのトリエ
チルアンモニウム塩、２００μｇを、、２ｔｎｌの無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させた。この
溶液へ無水ＤＭＦ中の３０ｍＭチオビオチン０．！Ｉｌ
ｌを加え、そして混合物をアルゴンガスの下で６０℃に
て２時間培養した。

ａＯ℃にて減圧下で蒸発させて溶剤を除去した。

残漬を０．６ｍｅの／Ｘ５ＳＣに溶解させた。未溶解物
質を遠心分離により除去した。溶出緩衝剤として／　Ｘ
　Ｓ　８．Ｃを用いるＧ！０セファデックスカラムでの
ｆ過によって過剰のビオチンを上澄液から除去した。Ｄ
ＮＡ含有フラクションをカラムから回収し、混合しかつ
後に使用するまで一７０℃にて貯蔵した。

以上、本発明を多数の具体例につき説明したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用する
他の具体例を提供しうろことが了解されよう。したがっ
て、本発明は上記の具体例のみに限定されず、本発明の
範囲内において多くの改変をなしうることが了解されよ
〔発明の効果〕 本発明によれば、従来の製造上の制約なしに、興味ある
分析物を検出するための方法およびキットに使用しうる
プローブとして有用な生体内もしくは生物学的に標識し
たポリヌクレオチド配列が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生体内標識方法に使用するためのグロ
ーブＤＮＡ配列の両末端へＡｂａｌ制限エンドヌクレア
ーゼ部位を結合させる方法のｌ具体例の工程略図でおる
。 「・１而の１＋”Ｉ”　３（内容に変更なし）ＦＩＧ、
１ 第１頁の続き ０発　明　者　ノーマン　イー　ケル カー アメリカ合衆国、ニューヨーク州１００１６．ニューヨ
ーク、イースト　３幡ストリート　真３番−丁一　糸、
−二　ン山　−ｉ−，１：　ｊｌ七〈１１式）１．事（
’ｌの表示 １ｌｉｆ４１円Ｄ’ｌ　１．ｌｉｉ’ｌｌｉず１第１３
７３８１号２、、Ｒ明σ）ｉ′１（ブ１１ 小す−スク１）１月・配列の牛４４１内標識化３、補止
をづ−る、３ ’Ｊｌ’ｌ　、ＩＩσ）閂１；ｉ　４’ｌｉｉ’ｌ出斯
１人（旬明せ１市 （ｄｌ　＋ｓ＋先１ｔＩｌｉ１ｒ明：七（原７ｋｄ’；
Ｊ、ヒ訳文）６、補正の内容 手　続　ン市　−ｔ、Ｅ　讐１（方式）％式％ ２、発明の名称 ポリメクレＡブト配列の生体内標識化 ３、補正をする占 事（ｉどの関係　特許出願人 名　称　］−ンゾー　バイΔケム　イン］−ボレイテツ
ト代表省　イラザール　ラバンニ 〈国　籍）　（アメリカ合衆１η） ４、代Ｊ１１！人 ６、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　標絃することが望ましいポリヌクレオチド配列
   ｆａ）と、少なくとも他のｌ独のポリヌクレオチド配列
   ｔｂｌとを％徴とする宿主を培養する工程からなり、前
   記他のヌクレオチド配列（ｂｌは前記宿主を培養する際
   にこの培養宿主において複製される時所望のポリヌクレ
   オチド配列（ａ）を標識する産生物を発現することを特
   徴とするポリヌクレオチド配列の生体内標識方法。 （２）　ポリヌクレオチド配列ｒａｔを前記宿主の原ゲ
   ノムの１部であるＤＮＡ配列、前記宿主の原ゲノム中Ｖ
   Ｃ挿入されるＤＮＡ配列、および前記宿主を形質転換さ
   せるのに使用するＤＮＡ配列の少なくとも７部を構成す
   るＤＮＡ配列よりなる群から選択する特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 （３）前記宿主を形質転換するのに使用するＤＮＡ配列
   を、標識することが望ましいポリヌクレオチド配列をｖ
   ｆ徴とするクローン化ベヒクルおよび７アージよりなる
   群から選択し、前記クローン化ベヒクルおよびファージ
   は宿主中で複製しうる特許請求の範囲第２項記載の方法
   。 （４）　ポリヌクレオチド配列（ｂｌを前記宿主の原ゲ
   ノムの１部であるＤＮＡ配列、前記宿主の原ゲノム中に
   挿入されるＤＮＡ配列、および前記宿主を形質転換させ
   るのに使用するＤＮＡ配列の少々くとも１部を構成する
   ＤＮＡ配列よりなる群から選択する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 （５）　前記宿主を形質転換はせるのに使用するＤＮＡ
   配列金、宿主の培養に際しこの培養宿主において複製す
   る時所望のポリヌクレオチド配列を標識する産生物を発
   現するようなポリヌクレオチド配列を特徴とするクロー
   ン化ベヒクルおよびファージよりなる群から選択シ、前
   記クローン化ベヒクルおよびファージは宿主中で複製し
   うる特許請求の範囲第Ｖ項記載の方法。 （６）　ポリヌクレオチド配列（ｂｌを７アージに含有
   されるポリヌクレオチド配列を標識するファージから得
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （７）　前記ファージをＴ−偶数イー・コリノくクテリ
   オファージよりなる群から選択する特許請求の範囲第６
   項記載の方法。 （８）　前Ｆｌｉｆｉファージをバクテリオファージで
   λ、バクテリオファージＴＦおよびバクテリオファージ
   Ｔ６よりなる群から選択する特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 （９）　ポリヌクレオチド配列ｆｂｌをキサントモナス
   ・オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ、　
   ）　／（クテリオファージＸＰ／Ｊから得る特許請求の
   範囲第７項記載の方法。 Ｑｌ　ポリヌクレオチド配列（ｂｌをバチルスΦファー
   ジ５ＰＯｔから得る％Ｆｊ’Ｆ　請求の範囲第１項αυ
   　標識ヲ、グリコジル化ヌクレオチド１グルコシル化ヌ
   クレオチド、デオキシヒドロキシメチルウリジンおよび
   ！−メチルシトシンよりなる群から選択される化合物に
   よって行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 （Ｉの　標識することが望ましい少なくとも／釉のポリ
   ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列を前記培養宿主か
   ら単離する工程をさらに含む特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 崗　単離したＤＮＡ配列が、標識することが望ましいポ
   リヌクレオチド配列のｌｓまたは全部である特許請求の
   範囲第１．２項記載の方法。 ａａ　ｉｓすることが望ましいポリヌクレオチド配列を
   含有する宿主を、この宿主またはその変種が増殖のため
   に必要とする塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド
   またはその同族体もしくは先駆体の存在下で培養し、前
   記塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドまたはその
   同族体もしくは先駆体が所望の標識を有することを特徴
   とするポリヌクレオチド配列の生体内標識方法。 ０１　標識することが望ましいポリヌクレオチド配列を
   宿主の原ゲノムの７部でおるＤＮＡ配列、宿主の原ゲノ
   ム中へ挿入されるＤＮＡ配列、および前記宿主を形質転
   換させるのに使用　するＤＮＡ配列の少なくとも１部を
   構成するＤＮＡ配列よりなる群から選択する特許請求の
   範囲Ｍａ１項紀截の方法。 ＱＱ　前記宿主全形質転換させるのに使用するＤＮＡ配
   列を、標識することが望ましいポリヌクレオチド配列を
   ％徴とするクローン化ベヒクルおよびファージよりなる
   群から選択し前記ベヒクルおよびファージは前記宿主中
   で複製しうる特許請求の範囲第ｔＳ項記載の方法。 （ｌη　前記宿主金チミンもしくはチミジンの無い突然
   変異種から選択し、かつ標識を有する同族体がＢｒｄＵ
   Ｒである％許請求の範囲第７４拍偶己僻σ）項九１− ａＦｊ　信号部分、架橋部分または架橋部分と信号部分
   との少なくとも１つの組合せをポリヌクレオチド配列の
   前記標識へ結合させる工程をさらに含む特許請求の範囲
   第１項１には第１４’項記載の方法。 ａｌ　信号部分、架橋部分゛または架橋部分と信号部分
   との組合せを前記標識へ共有結合させる特許請求の範囲
   第１ざ項記載の方法。 四　信号部分訃よび架橋部分を放射性化合物、ビオチン
   、螢光性化（ｔ　ＱｋＪ　（フルオレシン、ローダミン
   、ダンシル、磁性化合物、キレート剤並びに標識ポリヌ
   クレオチド配列へ共有結、合させうる他の信号おＪ：び
   架橋部分よりなる群から選択する特許請求の範ｇ第１り
   項記載の方法。 ２１）信号部分、架橋部分または架橋部分と信号部分と
   の組合せを前記標識へ非共有結合させる特許請求の範Ｉ
   Ｉ５第ｔ２？項記載の方法。 ！　（２２）信号部分および架橋部分をポリペプチド、
   蛋白質、レクチン、コンカナバリンＡ１酵素１アルカリ
   ホスファターゼ、酸ホスファターゼ、抗原、抗体、β−
   ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサ
   ビペルオキシダーゼ、キレート剤並びに標識ポリヌクレ
   オチド配列に非共有結合しうる他の信号および架橋部分
   よりなる群から選択する特許請求の範囲第、２７項記載
   の方法。 （２、特許請求の範囲第１項乃至Ｍ７７項のいずれかに
   記載の方法により標識されたポリヌクレオチド配列。 （２４）ＤＮＡおよびＲＮＡよりなる群から選択するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載のポリヌク
   レオチド配列。 （２５）ポリヌクレオチド配列における前記標識をさら
   に信号部分、架橋部分または架橋部分と信号部分との少
   なくとも７つの組合せに結合させ、前記信号部分、架橋
   部分または組合せは前記標識ポリヌクレオチド配列のヒ
   プリド化を阻害しないことを特徴とする特許請求の範囲
   第２３項記載のポリヌクレオチド配列。 （２６）信号部分、架橋部分または架橋部分と信号部分
   との組合せが、前記標識に共有結合されてなる特許請求
   の範囲第、２５項記載のポリヌクレオチド配列。 （２７）信号および架橋部分が放射性化合物、螢光性化
   合物、ビオチン、フルオレシン、ローダミン、ダンシル
   、磁性化合物、キレート剤並びに前記標識に共有結合さ
   せうる他の信号および架橋部分よりなる群から選択され
   る特許請求の範囲第、２６項記載のポリヌクレオチド配
   列。 （２８）信号部分、架橋部分または信号部分と架橋部分
   との組合せが１前記標識へ非共有結合されてなる特許請
   求の範囲第一！項記載のポリヌクレオチド配列。 （２９）信号部分および架橋部分がポリペプチド、蛋白
   質、レクチン、コンカナバリンＡ１酵素、アルカリホス
   ファターゼ、酸ホスファターゼ、抗原、抗体、β−ガラ
   クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペ
   ルオキシダーゼ、キレート剤並びに前記標識へ非共有結
   合さすうる他の信号および架橋部分よりなる群から選択
   される特許請求の範囲第、２を項記載のポリヌクレオチ
   ド配列。 （３０）特許請求の範囲第２３項記載のポリヌクレオチ
   ド配列を特徴とする分析物の検出キット。 （３１）％許請求の範囲第２ｊ項記載のポリヌクレオチ
   ド配列を特徴とする分析物の検出キット。 （３２）分析物をこの分析物における所望のポリヌクレ
   オチド配列に対し補完的な特許請求の範囲第、２３項記
   載の標識ポリヌクレオチド配列　。 ヘヒプリド化させ、かつこのヒプリド化ヲ検出すること
   を特徴とする分析物におけるポリヌクレオチド配列の検
   出方法。 （３３）分析物における補完配列に対しポリヌクレオチ
   ド配列をヒプリド化させた後に前記ポリヌクレオチド配
   列の標識へ、信号部分または架橋部分と信号部分との少
   なくとも７つの組合せを結合させる工程をさらに含む特
   許請求の範囲第３２項記載の方法。 （３４）信号部分または架橋部分と信号部分との組合せ
   を前記標識へ共有結合または非共有結合させる特許請求
   の範囲第３３項Ｗ己戟の方法。 （ろ５）分析物をこの分析物における所望のポリヌクレ
   オチド配列に対し補完的な特許請求の範囲第、２ｊ項記
   載の標識ポリヌクレオチド配列へヒブリド化させ、かつ
   そのヒプリド化を検出することを特徴とする分析物にお
   けるポリヌクレオチド配列の検出方法。