CN103667199B - 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 - Google Patents
体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103667199B CN103667199B CN201210350365.8A CN201210350365A CN103667199B CN 103667199 B CN103667199 B CN 103667199B CN 201210350365 A CN201210350365 A CN 201210350365A CN 103667199 B CN103667199 B CN 103667199B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- albumen
- rotavirus
- vlp
- buffer
- particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 title claims abstract description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 52
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 30
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 30
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 108700003743 Rotavirus VP2 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 abstract description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 5
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 52
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 23
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 10
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 10
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 9
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 7
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 7
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 7
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 6
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 3
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 208000019637 Infantile Diarrhea Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108700031314 Rotavirus VP6 Proteins 0.000 description 2
- 229940124859 Rotavirus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 229910014813 CaC2 Inorganic materials 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042365 Virus-Like Particle Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium chloride Substances Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001142 anti-diarrhea Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012792 core layer Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229930195727 α-lactose Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12323—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12333—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2720/12352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及轮状病毒双层类病毒颗粒的制备方法，包括从裂解上清中纯化轮状病毒VP6蛋白，由VP2蛋白和VP6蛋白构成的双层类病毒颗粒的体外组装，所述蛋白和类病毒颗粒可用于预防或减轻轮状病毒感染导致的临床症状。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学和分子病毒学领域，具体的，本发明涉及轮状病毒的结构蛋白VP6蛋白，其制备方法，以及包含其的类病毒颗粒体外组装的方法，所述蛋白及其类病毒颗粒可用于预防或减轻轮状病毒感染所导致的腹泻。
背景技术
轮状病毒(rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，1973年Bishop在胃肠炎病人十二指肠发现(Bishop,Davidson et al.1973)。研究表明，95%以上的儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒，据WHO统计，每年因轮状病毒感染而导致的死亡高达60万，而腹泻病例则高达2亿，仅在美国，每年因轮状病毒感染而造成的经济损失就高达1亿美元(Hsu,Staat et al.2005;Tate,Burton et al.2011)，造成严重的经济负担和社会负担。
轮状病毒为无包膜RNA病毒，基因组由11条双链RNA组成，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4，VP6和VP7)和6种非结构蛋白（NSP1-NSP6）(Estes and Cohen 1989)。轮状病毒为二十面体对称，其衣壳由三个同心层构成，即由VP1、VP2和VP3构成的核心层，由VP6构成的内衣壳，以及由VP4和VP7构成的外衣壳。其中VP6为组特异性抗原，根据其抗原性不同可将轮状病毒分为A-G 7个组，其中A组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，该蛋白具有较强的免疫原性，尽管不是中和抗原，却能够产生较好的免疫保护效果(Sabara,Frenchicket al.1994)。VP4和VP7为主要中和抗原，根据二者抗原性的不同可将A组轮状病毒分为不同的P血清型和G血清型，根据二者基因的不同可分为不同的基因型。G型和P型相互独立又相互影响，常见的组合包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]，近年来，G9P[8]和G9P[6]的流行显著增加(Li,Liu et al.2009)。
目前尚无针对轮状病毒的特效药，安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。经过多年的研究，历经单价减毒疫苗，多价基因重配疫苗和基因工程疫苗三个阶段，目前已有四种轮状病毒疫苗相继上市，包括惠氏的四价人-猿基因重配疫苗，兰州所的单价减毒疫苗、默克的五价人-牛基因重配疫苗和葛兰素史克的单价减毒疫苗。但这些疫苗均为减毒活疫苗，存在较大的安全隐患，其中惠氏的疫苗由于肠套叠问题上市半年后即被撤回(Murphy,Gargiullo et al.2001)；默克和葛兰素史克的疫苗尽管经过大量的临床实验证实其安全性和有效性(Bernstein,Sack et al.1999;Vesikari,Matson et al.2006;Linhares,Velázquez et al.2008;Vesikari,Itzler et al.2009;Snelling,Andrews etal.2011)，但在亚洲和非洲等轮状病毒死亡率较高的国家和地区的保护效率远低于欧美等发达国家(Armah,Sow et al.2010;Zaman,Anh et al.2010;Madhi,Cunliffe etal.2011)，且越来越多的证据表明，二者接种后均产生排毒并可导致病毒的水平传播(Anderson 2008;Rivera,Pena et al.2011;Yen,Jakob et al.2011)，也有研究表明，免疫缺陷儿童接种疫苗后可产生严重胃肠炎(Steele,Cunliffe et al.2009;Patel,Hertel etal.2010)；兰州所的疫苗上市十多年，至今尚未发现严重问题，但仅能预防严重腹泻，不能预防轮状病毒的感染(Fu,Wang et al.2007)。因此，尽管轮状病毒减毒疫苗的研究取得了可喜的结果，但也还存在一定的问题，其安全性和有效性还有待进一步提高，发展更加安全、有效的疫苗势在必行。非复制型疫苗是目前轮状病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特点而备受关注。
基因工程疫苗主要指通过基因工程方法表达轮状病毒的抗原，免疫动物或人，从而达到免疫保护的作用。这类疫苗包括核酸疫苗、合成肽疫苗、重组表达抗原疫苗和类病毒颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗。目前类病毒颗粒疫苗的有效性和安全性已在HBV、HEV和HPV疫苗上得到了充分的证实，已经成为世界公认的新一代最具研究价值的候选疫苗。RV-VLPs疫苗的研究始于上世纪八十年代，且大量的动物实验结果表明，RV-VLP疫苗具有较好的保护性，并可介导广泛的异型保护。
RV-VLP指由结构蛋白构成的在形态结构上与天然病毒颗粒相似，且保留了病毒颗粒的天然构象却不含病毒核酸的类病毒颗粒。该颗粒分为两类，即：一类是由VP2、VP4、VP6、VP7构成的三层颗粒，或由VP6和VP4、VP7构成的双层颗粒，可刺激机体产生中和抗体(Crawford,Estes et al.1999;Jiang,Estes et al.1999)；另一类是由VP2和VP6构成的双层颗粒，以及由VP6构成的单层颗粒，由于不含中和抗原，因此不能刺激机体产生中和抗体，但由于可以刺激机体产生较强的细胞免疫，因此也具有较好的保护效果(Coste,Sirard etal.2000;Yuan,Geyer et al.2000;Nguyen,Iosef et al.2003)，由于VP6变异性相对较小，因此该颗粒可以产生广泛的异型保护。相对第一类颗粒，第二类颗粒由于具有同样的保护效果，但成分较少，大大降低了其工艺难度和成本，因此更受青睐。
VP2/6-VLP疫苗研制的关键是能够大量高效的制备均一的VLP样品。目前常用的是昆虫-杆状病毒表达系统，在该系统中共表达轮状病毒结构蛋白VP2、VP6可以自发形成VLP(Bertolotti-Ciarlet,Ciarlet et al.2003)，但真核表达系统成本高，周期长，操作复杂，表达量低，并且组装过程中常常非特异性包裹杂蛋白和核酸，难以实现高效、可控的组装(Palomares and Ramírez 2009)；尽管目前也有对轮状病毒类病毒颗粒的体外组装进行了异性的研究，但其得率较低，限制了RVVLP疫苗的进一步发展。
而原核表达系统具有成本低，操作简便等优势，但原核表达系统由于缺少特定的翻译后修饰，导致很多蛋白在原核系统表达中形成包涵体。目前，已有研究通过原核系统表达轮状病毒的结构蛋白，包括VP6、VP4、VP7，但或以包涵体的形式表达，不能有效复性(Zhao,Chen et al.2011)，或融合表达(Choi,Basu et al.2000)，尽管融合表达有助于目的蛋白的纯化，但融合蛋白的切除往往需要价格昂贵的酶，不适合大规模生产。
因此，本领域仍然需要具有低成本，能够实现体外高效、可控的组装，可大规模生产的轮状病毒结构蛋白和类病毒颗粒的制备技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法，该双层颗粒由轮状病毒VP2蛋白和VP6蛋白组成。
本发明人经研究出人意料的发现，轮状病毒结构蛋白VP6在大肠杆菌内能够以可溶形式表达，纯化后的VP6以三聚体形式存在，可自组装形成单层类病毒颗粒6-VLP，也可与病毒样颗粒或非病毒样颗粒状态的VP2共组装形成双层类病毒颗粒2/6-VLP，且VP6蛋白及其类病毒颗粒可用于预防或减轻轮状病毒感染引起的临床症状。
因此，本发明涉及A组轮状病毒VP6蛋白，该蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化；含该蛋白的类病毒颗粒2/6-VLP的体外组装；VP6蛋白及其类病毒颗粒在预防或减轻轮状病毒感染引起的腹泻中的用途。具体如下：
1.本发明涉及一种从大肠杆菌中纯化轮状病毒VP6蛋白的方法，包括该蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达和含有该蛋白的裂解上清的纯化。
在一个优选实施方案中，获得VP6蛋白的方法包括：
a）在大肠杆菌表达系统中表达VP6蛋白；
b)将表达了VP6蛋白的大肠杆菌裂解，分离得到上清液；
c）向b）上清液中加入0.05%～0.5%的聚乙烯亚胺（PEI）或其类似物，也可加入10～80mM的金属离子如MnCl2、MgCl2、CaCl2、CuCl2、AlCl3等，沉淀核酸和部分杂蛋白，分离得到上清液；
d）向c）上清液中加入硫酸铵，经充分沉淀，收集沉淀；
e）将d）中沉淀在高盐缓冲液中重新溶解，分离得到溶液，其中含纯度至少85%的VP6蛋白；
f）将e）中纯度至少85%的VP6蛋白经色谱层析进一步纯化，可得到纯度大于98%的VP6蛋白，经鉴定，纯化后的VP6蛋白在溶液中以非颗粒形式存在。
2.本发明再一方面涉及轮状病毒双层类病毒颗粒2/6-VLP的体外组装工艺。
在一个优选实施方案中，2/6-VLP的体外组装工艺如下：将纯化后的VP6蛋白与非颗粒状态的VP2蛋白混合，并将缓冲液更换至组装缓冲液，主要包括以下方面：
a)组装缓冲液的pH介于3.0～7.0，优选pH4.0～6.4，最优选pH6.4：
b)组装缓冲液中含0-2M盐，优选NaCl，更优选150mM～1M NaCl，最优选300mMNaCl；
c)VP2蛋白和VP6蛋白的质量比介于1：1～1：10，优选1：2～1：3，最优选1：2.6；
3.本发明再一方面涉及VP6、6-VLP和2/6-VLP在预防或减轻轮状病毒感染引起的腹泻中的用途。免疫途径包括但不限于皮下免疫和肌肉注射，佐剂包括但不限于铝佐剂和弗氏佐剂。
本发明中相关术语的说明及解释
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：ER2566,BL21(DE3),TG1,DH5α及JM109。
根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“色谱层析“包括但不限于：离子交换色谱（例如阳离子交换色谱）、疏水相互作用色谱、吸附层析法（例如羟基磷灰石色谱）、凝胶过滤（凝胶排阻）层析以及亲和层析色谱。
根据本发明，在本发明获得VP2和VP6蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。
根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压匀浆、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；
根据本发明，在本发明获得VP6蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一种或几种，优选NaCl。
根据本发明，在本发明获得VP6蛋白的方法中，所用聚乙烯亚胺及其类似物是指表面带正电荷的聚合物，包括但不限于直链聚乙烯亚胺、支链聚乙烯亚胺及其衍生物，其分子量介于1300～750000，优选分子量750000的聚乙烯亚胺。
根据本发明，在本发明获得VP6蛋白的方法中，所用二价和三价金属离子包括但不限于Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+和Al3+等，优选Ca2+和Mn2+，最优选Ca2+。
根据本发明，获得类病毒颗粒2/6-VLP的方法中，缓冲液是指能在一定范围内维持弱酸性pH（pH3.0～7.0）稳定的溶液，包括但不限于，磷酸盐缓冲液，MES缓冲液，柠檬酸盐缓冲液等等。
发明的有益效果
目前轮状病毒VLP制备均采用真核表达系统，应用最多的是昆虫-杆状病毒表达系统。
在真核表达系统中表达的VP2、VP6蛋白构象更接近天然蛋白，能够在体内自发形成VLP，但是真核表达系统表达周期长，操作复杂，表达量低，组装过程中常常非特异性包裹杂蛋白和核酸，特别是多蛋白共表达过程中会形成不同类型的病毒样颗粒，后期纯化困难，难以实现高效、可控的组装，再加上高昂的成本，给大规模工业化生产带来了极大困难。
而原核表达系统特别是大肠杆菌表达系统具有成本低，周期短，表达量大的优势，是重组蛋白最常用、最成熟的表达系统。但在大肠杆菌表达系统中表达的轮状病毒衣壳蛋白往往不能形成正确构象，以包涵体形式表达，而包涵体复性难度大、效率低，难以用于大规模生产。融合表达可实现VP6的可溶性表达，但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，无法应用于大规模生产。
本发明在大肠杆菌表达系统中表达了A组轮状病毒内衣壳蛋白VP6，经过PEI或金属离子沉淀预处理可去除大部分的核酸和部分杂蛋白，而VP6蛋白仍以可溶形式保留于上清中，进一步通过盐析和色谱层析纯化，可获得纯度高于95%的VP6蛋白；经分析，该蛋白在溶液中以三聚体的形式存在，保持了VP6蛋白的正确构象。该工艺操作简便，成本低廉，得率较高，可应用于大规模工业化生产。通过以上步骤获得纯化后的VP6蛋白可以自组装为单层颗粒6-VLP，也可与颗粒或非颗粒状态的VP2共组装形成双层颗粒2/6-VLP，其工艺简单、可控且组装效率高于95%，显著高于真核表达自组装的效率；经小鼠实验证实，原核表达的VP6蛋白及其类病毒颗粒具有较高的免疫原性和较好的保护性，具有成为轮状病毒候选疫苗的潜力。
由此可见，本发明具有以下优点：本发明的制备方法既不需要真核表达的高昂成本，复杂工艺，也不需要昂贵的酶，操作简便，成本低廉；纯化工艺中没有经过剧烈的变性、复性，保留了VP6蛋白的正确构象，该蛋白可自组装形成6-VLP或与VP2共组装形成2/6-VLP，具有较好的免疫原性，且在小鼠实验中表现出较好的免疫保护性；本发明的VP6蛋白和类病毒颗粒的制备方法可用于大规模的工业化生产；本发明的VP6蛋白及其类病毒颗粒可用于预防轮状病毒感染引起的腹泻。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例1中不同纯化阶段的VP6蛋白经10%SDS-PAGE分离的结果。图1A显示了PEI沉淀的结果，1：裂解上清，2～9：不同PEI浓度条件下40%硫酸铵沉淀的结果，2：无PEI，3：0.05%PEI；4：0.08%PEI；5：0.1%PEI；6：0.15%PEI；7：0.2%PEI，8：0.3%PEI；9：0.5%PEI；图1B显示了金属离子沉淀+40%硫酸铵沉淀的结果，1：20mM MnCl2，2：10mM CaCl2，3：20mMCaC2，4：50mM CaCl2，5：100mM CaCl2；其中以20mM CaCl2条件下的纯度最高；图1C显示了20mM CaCl2沉淀→25%硫酸铵沉淀→Phenyl-HP纯化的结果，1：菌体裂解上清；2：CaCl2沉淀后上清；3：硫酸铵沉淀后溶解上清；4：Phenyl-HP 2M NaCl洗脱组分。结果显示，通过二价离子沉淀、硫酸铵沉淀粗纯后，VP6的纯度由10%左右提高到85%左右，进一步通过疏水层析纯化后其纯度达到98%以上。
图2显示了实施例2中不同纯化阶段VP2蛋白经10%SDS-PAGE分离的结果。1：菌体裂解上清；2：PEI沉淀上清；3：硫酸铵沉淀后溶解上清；4：SP FF 500mM NaCl洗脱组分。结果显示，通过PEI沉淀、硫酸铵沉淀粗纯后，VP2纯度从5%左右，提高到了约80%左右，进一步通过阳离子交换色谱纯化后其纯度达到95%左右。
图3显示了纯化后的VP2蛋白和VP6蛋白经SDS-PAGE、分子筛层析和分析超离鉴定的结果。其中图A显示了SDS-PAGE鉴定的结果，1为分子量Marker；2-5为纯化后的VP2蛋白，6-9为纯化后的VP6蛋白，其中2&5为上样缓冲液含巯基乙醇，100℃水浴10min的结果，3&6为上样缓冲液含巯基乙醇，未经热处理的结果，4&8为上样缓冲液中不含巯基乙醇，100℃水浴10min的结果；5&9为上样缓冲液中不含巯基乙醇，无热处理的结果。可见，VP2蛋白和VP6蛋白的纯度均达到95%以上，VP2蛋白以单体形式存在，可能SDS破坏了VP2单体间的相互作用，而VP6以聚体形式存在。图B显示了纯化后的VP2蛋白和VP6蛋白经Sepherdex200分子筛层析鉴定的结果，VP2蛋白和VP6蛋白的保留时间分别为27.34min和33.91min。图3C显示了VP2蛋白经分析超离鉴定的结果，其分子量为204.4±5.6KD，接近二聚体的分子量。图3D显示了VP6蛋白经分析超离鉴定的结果，其分子量为114.9±1.6KD，接近三聚体的分子量。
图4显示了实施例4中RV类病毒颗粒2-VLP的透射电镜结果，视野中可见大量直径50-60nm的类病毒颗粒，与理论值相符。
图5显示了实施例5中所得类病毒颗粒6-VLP鉴定的结果。A为透射电镜观察结果，可见大量直径70nm左右的颗粒，结构较为松散；B为动态光散射的结果，6-VLP的水花分子动力学半径为40.36nm，颗粒组装百分比为100%；C为G5000PWXL分子筛层析的结果，6-VLP的保留时间为10.551min，颗粒组装效率高于95%。
图6显示了实施例5中通过两步法组装的类病毒颗粒2/6-VLP鉴定的结果。A为分析型超速离心的结果；B为pH6.0条件下透射电镜观察的结果，可见直径60nm左右的类病毒颗粒。
图7显示了实施例5中不同缓冲体系下2/6-VLP鉴定的结果。A：50MM MES6.0，可见大量直径70nm左右的单层颗粒；B：50MM MES6.0+150mM NaCl，可见直径70nm左右的单层颗粒和60nm左右的双层颗粒；C：50MM MES6.0+300mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒，大小均一；D：50MM MES6.0+500mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒，大小均一；E：PB5.8+300mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒；F：PB6.0+300mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒；G：PB6.4+300mM NaCl可见直径60nm左右的双层颗粒，大小均一；H：6-VLP对照，可见直径70nm左右的单层颗粒。
图8显示了实施例5中VP2和VP6不同比例下2/6-VLP鉴定的结果。A为透射电镜观察的结果，在VP2和VP6的质量比介于1：2-1：6的条件下，视野中均为直径60nm左右的双层颗粒2/6-VLP，而在VP2与VP6的质量比为1：10的条件下，视野中则既有直径60nm左右的2/6-VLP，也有直径70nm左右的6-VLP；B和C为实施例4中通过两步法组装的2/6-VLP分析超离的结果，其沉降系数在251-264S，VP2和VP6的最佳质量比为1：2.6。
图9显示了实施例5中最佳条件下2/6-VLP鉴定的结果。A为透射电镜观察的结果，可见大量直径60nm左右的类病毒颗粒，为双层结构，大小和形态与理论相符，均匀一致；B为动态光散射的结果，其水化分子动力学半径为34.27nm，颗粒组装百分比为100%；C为G5000PWXL分子筛层析的结果，2/6-VLP的保留时间为10.821min，组装效率高于95%。
图10显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒免疫后小鼠血清中VP6抗体的滴度，与培养病毒相比，VP6，6-VLP以及2/6-VLP均具有较高的免疫原性。
图11显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒10ug剂量下经肌肉注射免疫三次后母鼠和乳鼠血清中针对VP6的抗体滴度，其中A为不同免疫组母鼠血清抗体滴度，B为不同免疫组乳鼠血清抗体滴度。
图12显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒母传抗体对乳鼠感染轮状病毒后发生腹泻的情况。
图13显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒母传抗体对乳鼠感染轮状病毒后排毒的影响及保护效果，其中A为不同免疫组小肠内溶物通过ELISA检测的病毒滴度的情况，B为不同免疫组与对照组相比排毒量降低的比例。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中
表1：引物列表
下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：VP6在大肠杆菌中的表达和纯化
用作模板的VP6基因的制备
轮状病毒毒株(北京万泰生物药业有限公司)，通过Trizol试剂提取其基因组RNA，以VP6-DR为引物，用MMLV反转录酶进行反转录，按照如下体系55℃反转录30min，得到VP6cDNA。
以上一步所得cDNA为模板，以VP6-DF为正向引物，以VP6-DR为反向引物，在PCR热循环仪（Biometra，T3）中按照如下条件进行PCR反应，扩增VP6的基因。
扩增得到大小特异的1.3kb左右的PCR产物，通过胶回收试剂盒回收后与商售载体PMD18-T（takara）连接，转化大肠杆菌DH5α；提取质粒，通过PstI/EcoR I酶切鉴定，得到含VP6基因的阳性克隆PMD18-T-VP6F。
通过M13F和M13R引物(上海博亚生物工程有限公司)进行测序，结果表明，该基因与A组轮状病毒基因的同源性高于90%。
表达VP6蛋白的非融合表达载体的构建
以前一步骤所得PMD18-T-VP6F为模板，以VP6-1F为正向引物，其5‘端引入BamH I/Nde I酶切位点，以VP6-397R为反向引物，其5’端引入Hind III酶切位点，在PCR热循环仪（Biometra T3）中按照如下条件进行PCR反应。
扩增得到1.2kb左右的大小特异的DNA片段，将该片段与PMD18-T载体连接，转入大肠杆菌DH5α；提取质粒，通过NdeI/Hind III酶切鉴定，得到插入目的基因VP6的阳性克隆PMD18-T-VP6。
利用M13F和M13R引物(上海博亚生物工程有限公司)进行测序，测得PMD18-T-VP6中插入的目的片段的核苷酸序列与PMD18-T-VP6F中插入序列的同源性为100%。
将上述的PMD18-T-VP6质粒通过Nde I/Hind III进行酶切，获得VP6的基因片段。将该片段与Nde I/Hind III酶切的商售载体Pet30a(Novagen)连接，转化大肠杆菌DH5α；提取质粒，通过NdeI/Hind III酶切鉴定，获得插入VP6基因的质粒P-VP6。
VP6蛋白在大肠杆菌中的表达
取1μL P-VP6质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）；挑取单菌落至4mL卡那霉素抗性的LB培养基37℃振荡培养，至OD6000.6左右，从中取0.5ml菌液加入终浓度为10%的甘油于－20℃或-80℃保存，剩余菌体加入IPTG至0.8mM，37℃继续培养2-4h后收集1.5mL菌体，加入100uL ddH2O重悬菌体，加入20uL 6×Loading Buffer混匀，100℃水浴10min，通过10%的SDS-PAGE鉴定，可见清晰的大小约45KD的蛋白条带。
从－80℃冰箱取出上一步骤获得的携带重组质粒P-VP6的甘油菌，化冻后取5uL接入卡那霉素抗性的50mL LB培养基中。200rpm、37℃培养过夜，作为种子液。将种子液按照1：1000的比例接入15瓶500mL自动诱导培养基（每升含10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，0.5g葡萄糖，5mL甘油和5gα-乳糖，通过氢氧化钠溶液调节pH至中性），180rpm、37℃摇瓶培养至OD600约0.6时，调低温度至20℃，20h后离心收集菌体，获得可以表达VP6蛋白的菌体约30g。纯度约85%的VP6蛋白的制备
按1g菌体对应15mL裂解液的比例重悬菌体，在冰水浴条件下通过超声破碎菌体，4min每g菌体，隔2s暂停4s；使用JA－14转头以13000rpm/min离心菌体破碎液15min，留取上清，通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中VP6的纯度约为10%。（如图1，泳道1）。
将裂解上清分装成1ml每管，向其中加入0.05%～0.5%的聚乙烯亚胺（PEI）或10～100mM的MnCl2，MgCl2或CaCl2，混匀，30min后离心，取上清，并加入饱和硫酸铵至40%，混匀，静置0.5～2h，离心，弃上清，将沉淀以1/5体积的缓冲液重新溶解，通过10%的SDS-PAGE检测可知，PEI或金属离子沉淀可去除大量的核酸和杂蛋白，经硫酸铵沉淀后进一步纯化和浓缩，VP6蛋白的纯度得到较大程度的提高，其中以20mM CaCl2条件最佳（如图1B，泳道2）；
在冰水浴条件下向离心后的菌体破碎液中边搅拌边加入2M的氯化钙溶液至终浓度为20mM，30min后，通过JA-14转头13000rpm/min离心15min，留取上清；在冰水浴中，边搅拌边加入固体硫酸铵至25%饱和度，继续冰水浴1-2h，通过JA-14转头13000rpm/min离心15mi，留取沉淀并以1/10体积的50mMTris-HCl缓冲液pH7.0+3MNaCl重悬沉淀，JA-14转头，13000rpm/min离心15min，取上清。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可知，CaCl2沉淀可除去大量的核酸和杂蛋白，经硫酸铵沉淀后进一步纯化和浓缩，VP6的纯度由10%提高至85%左右（如图1，泳道2和3）。
VP6蛋白的色谱纯化
疏水相互作用色谱
仪器系统：GE Healthcare（原Amershan Pharmacia公司）生产的AKTA PuriferUPC-100型制备型液相色谱系统。
层析介质：Phenyl Sepharose 6B High Performance（GE Healthcare公司）。
柱体积：5.5cm×20cm。
缓冲液：50mMTris-HCl，pH7.0，
50mMTris-HCl，pH7.0+4M NaCl。
流速：8mL/min。
检测器波长：280nm。
样品为实施例1中获得的经0.22μm滤膜过滤的，纯度约85%的VP6蛋白溶液。
洗脱程序为：2M NaCl洗脱目的蛋白，50mM Tris-HCl，pH7.0洗脱杂蛋白，收集2MNaCl洗脱产物，经10%SDS-PAGE考马斯亮蓝染色鉴定，纯度约98%（如图1，泳道4）；同时通过DU800测定蛋白的浓度和核酸含量，结果如下：OD280为1.124，OD260为0.638，OD320为0.006，通过公式计算蛋白浓度为1.6mg/mL，核酸含量<0.25%，得率高于50%。
实施例2：VP2蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
P-VP2质粒为本中心构建（厦门大学，李廷栋，轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装，2009），表达菌株为Bl21（DE3）。将P-VP2质粒转化Bl21(DE3)，挑取单克隆至卡那霉素抗性的LB培养基，37℃培养至OD6000.6左右，取0.5mL菌液，加入甘油至终浓度为10%，-80℃保存。从-80℃冰箱取出携带P-VP2质粒的甘油菌，化冻后接种于50mL卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，之后接种于500mL卡那霉素抗性的LB培养基中，培养至OD6000.6左右，将摇床温度调至25℃，冷却后加入0.8mM IPTG进行诱导，继续培养6h，收集菌体。
以TB8.0+150mM NaCl+0.5mM EDTA按照15mL/g菌体的比例重悬菌体，通过超声方式进行菌体破碎，离心，收集上清，搅拌条件下加入终浓度为0.25%的PEI，30min后离心，取上清；在冰水浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度为30%，搅拌1-2h，离心，取沉淀，以1/10的体积的50mM Tris-HCl，pH8.0重悬沉淀，离心，取上清，此时VP2的纯度可达80%以上（如图2，泳道3）。
阳离子交换色谱
仪器系统：GE Healthcare（原Amershan Pharmacia公司）生产的AKTA PurifierUPC-100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SP Sepharose Fast Flow（GE Healthcare公司）。
柱体积：5.5cm×20cm。
缓冲液：50mMTris-HCl，pH8.0，
50mMTris-HCl，pH8.0+2M NaCl。
流速：10mL/min。
检测器波长：280nm。
样品为上一步骤中获得的经0.22μm滤膜过滤的，纯度约80%的VP2蛋白溶液。
洗脱程序为：150mM NaCl洗脱杂蛋白，500mM NaCl洗脱VP2蛋白，收集500mM NaCl洗脱产物，经10%SDS-PAGE考马斯亮蓝染色鉴定，纯度约95%（如图2，泳道4），得率高于50%。
实施例3：轮状病毒VP6和VP2蛋白的鉴定
样品为实施例1中获得的纯度高于98%的VP6蛋白和实施例2中获得的纯度高于95%的VP2蛋白。
SDS-PAGE
样品按照以下4种方式分别处理：1）、上样缓冲液有巯基乙醇，100℃水浴10min；2）上样缓冲液有巯基乙醇；3）上样缓冲液无巯基乙醇，100℃水浴10min；4）上样缓冲液无巯基乙醇。经10%的SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色鉴定。由SDS-PAGE结果可以看出，纯化后的VP2以单体形式或疏水性聚体存在，但构象受二硫键的影响，而VP6以聚体的形式存在。
分子筛层析分析
仪器系统：GE Healthcare公司生产的AKTA Purifier UPC-100制备型液相色谱仪
层析柱：Superdex200,10mm×300mm(GE Healthcare），柱体积为24mL
缓冲液：VP2为Tris-HCl,pH8.0+500mM NaCl，VP6为Tris-HCl,pH7.0+2M NaCl
系统流速：0.5mL/min
检测波长：UV280nm
结果显示，纯化后的VP2蛋白和VP6蛋白均为单一组分，保留时间分别为27.34和33.91min，均一性较好。
分析超离
仪器为Beckman XL-A型分析超速离心机，方法为沉降速率法和沉降平衡法，首先通过沉降速率法分析VP2蛋白和VP6蛋白的沉降系数，通过SEDIFIT软件进行C(S)分析，并初步计算VP2蛋白和VP6蛋白的分子量。结果显示，VP2蛋白和VP6蛋白可能分别以二聚体和三聚体的形式存在；在此基础上，进一步通过沉降平衡法分析VP2蛋白和VP6蛋白的精确分子量，通过Origin版的Nonlin软件和SEDPHAT软件进行SE分析，结果显示VP2蛋白和VP6蛋白的分子量分别为204±5.6KD和114.9±1.6KD（图3C和图3D）
天然状态的VP2蛋白以二聚体的形式存在，而VP6蛋白以三聚体的形式存在，理论分子量分别为205KD和135KD，我们纯化后的VP2蛋白经分析超离鉴定分子量为204±5.6KD，与理论分子量相符，但由于SDS可以破坏氢键和疏水作用，因此，在SDS-PAGE中VP2主要体现为单体；而纯化后的VP6经分析超离鉴定分子量为114.9±1.6KD，而SDS-PAGE中以聚体的形式存在，大小介于119和211之间，综合SDS-PAGE和分析超离的结果，纯化后的VP6蛋白以三聚体形式存在。这与分子筛层析中VP2蛋白的保留时间小于VP6蛋白是一致的。由此可见，原核表达的VP2和VP6蛋白保留了其天然构象，且整体工艺简便，便于操作，具有真核表达无法比拟的优势。
实施例4：VP2类病毒颗粒2-VLP的组装
样品为实施例2中所得纯度高于95%的VP2蛋白。
方法：将VP2蛋白4℃条件下透析至组装缓冲液50mMTB8.0+0.2M（NH4）2SO4，每隔12h更换一次缓冲液，透析24h以上，透析结束后，10000rpm离心15min，收集沉淀，并以50mMTB8.0溶解，10000rpm离心15min，收集上清，即为VP2组成的单层类病毒颗粒2-VLP。
实施例5：6-VLP和2/6-VLP的组装
样品为实施例1中获得的纯度高于98%的VP6蛋白，实施例2中获得的纯度高于95%的VP2蛋白以及实施例4中获得的2-VLP。
6-VLP的组装
将VP6蛋白透析至表2所示组装缓冲液，每隔12h更换一次缓冲液，透析24h 以上，离心，收集上清，即为6-VLP。
表2：6-VLP在不同缓冲体系中的组装
2/6-VLP的组装
方法一：将2-VLP与VP6蛋白按照1：3的质量比混合，透析至CN4.0、CN5.0或MES6.0，每隔12h更换一次缓冲液，透析24h以上，透析结束后，10000rpm离心15min，收集上清，即为2/6-VLP。
方法二：将未组装形成VLP的VP2蛋白和VP6蛋白按一定比例混合，透析至组装缓冲液（表3），VP2和VP6的比例见表4，每隔12h更换一次缓冲液，透析24h以上，透析结束后，10000rpm离心15min，收集上清，即为2/6-VLP。
表3：2/6-VLP在不同缓冲体系中的组装
表4：2/6-VLP组装中VP2和VP6比例
实施例6：轮状病毒类病毒颗粒的形态学检测及组装效率评价轮状病毒类病毒颗粒的透射电镜观察
使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。将实施例4中获得的2-VLP固定于喷碳的铜网上，用2%的磷钨酸pH7.4负染30min后进行观察，可见大量空心的病毒样颗粒，直径50-60nm（图4）；将实施例5中获得的6-VLP或2/6-VLP固定于喷炭的铜网上，用2%磷钨酸pH4.5负染1min后进行观察，可见大量空心的病毒样颗粒，直径分别为70nm（图5A）和60nm（图6B、8A和9A）左右。
RV病毒样颗粒动态光散射观察
使用的仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪（含温度控制器），使用算法为Regulation算法。样品为实施例5中获得的6-VLP和2/6-VLP。样品经12000rpm离心10min后进行测量。结果显示6-VLP及2/6-VLP的水化分子动力学半径分别为40.36nm（图5B）和34.27nm（图9B），组装效率均为100%。RV病毒样颗粒的分子筛层析分析
仪器系统：安捷伦1200高效液相色谱仪
层析柱：G5000PWXL 7.8mm×30cm（日本TOSOH公司），柱体积为13.4ml
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH6.4+300mMNaCl
流速：0.5ml/min
检测波长：280nm
样品：实施例4中获得的6-VLP和2/6-VLP
结果显示6-VLP的保留时间分别为10.551min，组装效率为94.6%（图5C）；2/6-VLP的保留时间分别为10.821min，组装效率为95.8%（图9C）。
RV病毒样颗粒的分析超速离心分析
仪器为Beckman XL-A型分析超速离心机，样品为实施例5中获得的6-VLP和2/6-VLP，方法为沉降速率法，通过SEDIFIT软件进行C(S)分析。结果显示，在pH4.0-6.0的条件下，在不同的缓冲体系中，类病毒颗粒的沉降速率存在一定差异，6-VLP的沉降速率介于237-240S，而2/6-VLP的沉降速率介于278-290S，在pH4.0-6.0条件下均可组装形成（图6A）。
综上，体外组装的6-VLP和2/6-VLP均一性较好，且组装效率高于90%，其制备工艺简便，便于操作，与真核表达产生多种不同组分的病毒样颗粒相比具有明显的优势。
实施例7：VP6蛋白免疫原性的评价
以小鼠模型评价VP6蛋白的免疫原性。免疫动物为5-8周龄SPF级雌性Balb/C小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司），每组3只，样品为实施例1中获得的VP6蛋白，实施例5中获得的6-VLP和2/6-VLP以及MA104培养的A组轮状病毒。将上述样品与等体积的弗氏佐剂（初次免疫为完全弗氏佐剂，加强免疫为不完全弗氏佐剂）混合，免疫剂量为100μg，免疫途径为皮下免疫；或铝佐剂混合，免疫剂量为1-100μg，免疫途径为肌肉注射。免疫程序均为：0天初免，第7天和第14天各加强免疫一次。
每周抽取小鼠的外周静脉血，分离血清，通过EIA的方法检测血清中VP6抗体的滴度。具体流程如下：
1）包被：样品为实施例1中获得的VP6蛋白，缓冲液为50mM的碳酸盐缓冲液pH9.6，包被浓度为500ng/mL，包被量100μL每孔，包被条件37℃，2h；
2）洗涤：PBST（20mM PBS+0.05%Tween20），一次，扣干；
3）封闭：封闭液为PBS+0.5%酪蛋白，200μL每孔，37℃，2h，封闭结束后扣干；
4）加样：样品：小鼠血清，稀释液PBS+10%小牛血清，10倍梯度稀释，100μL每孔，37℃，30min；
5）洗涤：PBST，5次，扣干；
6）加酶标二抗：酶标二抗为GAM-HRP，稀释液为PBS+0.5%的酪蛋白，稀释倍数为1：5000，100μL每孔，37℃，30min；
7）洗涤：PBST，5次，扣干；
8）显色：TMB显色液100μL每孔，37℃，15min；
9）终止：终止液50μL每孔；
10）数据读取：安图酶标仪，OD450/600。
以OD450/600高于0.2的最大稀释倍数作为小鼠血清抗体滴度，结果表明，与等量的灭活病毒相比，VP6抗原具有较高的免疫原性，且与铝佐剂相比，弗氏佐剂可更大程度的提高VP6蛋白的免疫原性（图10）。
实施例8：VP6蛋白及其类病毒颗粒免疫保护性评价
由于VP6抗体无体外中和活性，成年鼠对轮状病毒的敏感性较差，因此使用孕鼠-乳鼠模型评价VP6蛋白的免疫保护性。将4-5周龄SPF级雌性Balb/c小鼠分成五组，将实施例1中获得的VP6，实施例5中获得的6-VLP和2/6-VLP，MA104细胞培养的A组轮状病毒或PBS与等体积的弗氏佐剂（初次免疫为完全弗氏佐剂，加强免疫时使用不完全弗氏佐剂）混合，免疫方式为皮下免疫，免疫剂量为10μg VP6每只小鼠，免疫程序为：0天初免，10天，20天加强免疫一次，30天以同等剂量与铝佐剂混合的抗原通过肌肉注射方式加强免疫一次。最后一次免疫后两周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检，并将雌鼠与雄鼠合笼，待交配完成后取出雄鼠。乳鼠出生后4-6天进行攻毒，攻毒剂量为5*106TCID50每只乳鼠，病毒为MA104细胞适应培养的人轮状病毒，攻毒后观察并记录乳鼠的健康状况，如腹泻情况，体重变化；并在0，24，48，72hpc各处死一只小鼠，解剖后观察小鼠的组织病变，取小肠组织，通过免疫组化、EIA等方法检测病毒；同时分离血清，通过EIA检测血清抗体的滴度。
VP6的免疫原性和母源抗体的传递
通过EIA检测不同免疫组母鼠和乳鼠血清中VP6抗体的滴度，包被抗原为大肠杆菌重组表达的VP6蛋白，包被量为50ng/孔，检测方法同实施例7。图11A显示了母鼠血清中VP6抗体的滴度，VP6，6-VLP和2/6-VLP均具有较高的免疫原性且三者无显著差异，图11B显示了乳鼠血清中VP6抗体的滴度，可见，非黏膜免疫的母源抗体可有效地通过胎盘和母乳传递至子代。
VP6母传抗体对乳鼠腹泻的保护性
攻毒后每天监测乳鼠的腹泻情况，并根据粪便的颜色、形状进行打分，发现攻毒后24h乳鼠腹泻最严重，结果见表5，对照组攻毒后24h内出现明显的腹泻症状，而实验组无腹泻或腹泻症状较轻，VP6、6-VLP、2/6-VLP和灭活病毒母传抗体均可减轻乳鼠腹泻的症状，VP6和2/6-VLP与灭活病毒母传抗体的保护性无显著差异（P值分别为0.070和0.946），而6-VLP免疫保护性显著低于RV（P=0.001）和2/6-VLP（P<0.001）。
表5：轮状病毒感染后24h乳鼠腹泻情况
1.正常粪便；2.棕色成型粪便；3.棕色-黄色软粪便；4.黄色不成型粪便；5.水样便
分数≥3判定为腹泻，分数>3判定为严重腹泻，图12显示了不同免疫组子代小鼠未发生腹泻和严重腹泻的比例，表6显示了不同免疫组母传抗体对乳鼠轮状病毒感染性腹泻和严重腹泻的保护效率，结果表明，VP6，6-VLP，2/6-VLP与灭活病毒母传抗体均可有效预防轮状病毒感染性严重腹泻，且VP6，6-VLP和2/6-VLP的保护性与灭活病毒相比均无显著差异(P值分别为0.159,0.159,1.0)；在预防腹泻方面，2/6-VLP与灭活病毒的保护性最好，且二者无显著差异（P=0.907），VP6具有一定的保护性，但显著低于灭活病毒（P=0.04）和2/6-VLP（P=0.018），而6-VLP无保护性。
表6：VP6母传抗体对轮状病毒感染性腹泻的保护效率
*:与PBS对比具有显著性差异；&：与灭活RV相比具有显著性差异
VP6母传抗体抑制轮状病毒的复制
攻毒后每隔24h处死1-2只乳鼠，观察组织病变，发现对照组肠组织充气严重。取肠组织并通过高压匀浆法将组织进行研磨、破碎，离心，取上清，通过双抗体夹心法对其中的VP6抗原进行检测，具体方法如下：
1）包被：VP6单克隆抗体9F10，缓冲液20mM PB7.4，包被浓度4μg/mL，包被量100μL每孔，包被条件37℃，2h；
2）洗涤：以PBST（20mM PBS+0.05%Tween20），400μL每孔，一次，纸上扣干；
3）封闭：20mM PBS+0.5%酪蛋白，200μL每孔，37℃，2h，封闭结束纸上扣干；
4）加样：将小肠组织匀浆以PBS+10%小牛血清2倍梯度稀释，100μL每孔，37℃，30min；
5）洗涤：PBST，400μL每孔，5次，扣干；
6）加酶标抗体：将HRP标记的VP6单克隆抗体15H10-HRP，稀释液20mM PBS+0.5%酪蛋白，稀释5000倍，100μL每孔，37℃，30min；
7）洗涤：PBST，400μL每孔，5次，扣干；
8）显色：TMB显色液，100μL每孔，37℃，15min；
9）终止：终止液，50μL每孔；
10）数据读取：安图酶标仪，检测OD450/600，取OD450/600读值高于0.2的最大稀释倍数为病毒滴度。
结果表明，VP6抗体可有效的抑制轮状病毒的感染与复制，图13A显示了不同免疫组子代乳鼠感染轮状病毒后不同时间小肠组织病毒滴度的变化趋势，图13B显示了VP6抗体对轮状病毒复制的抑制效率，其中VP6母源抗体对轮状病毒复制的抑制效率为94.7%，而6-VLP、2/6-VLP以及灭活病毒的抑制效率均为100%。
综上所述，VP6、6-VLP和2/6-VLP母传抗体对轮状病毒感染和轮状病毒感染性腹泻均具有保护作用，其中以2/6-VLP的保护效果最好，在预防严重腹泻和腹泻方面与同等剂量的灭活病毒相比均无显著差异。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (15)
1.一种制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法，所述双层类病毒颗粒包含轮状病毒VP2蛋白和VP6蛋白，所述方法包括以下步骤：
a)在原核表达系统中以可溶形式表达VP6，并进行纯化，纯化后的VP6蛋白保持其正确构象，以三聚体形式存在；
b)将纯化后的VP6与非颗粒状态的VP2共组装形成双层颗粒2/6-VLP；
其中所述双层类病毒颗粒2/6-VLP的组装包括将VP6和VP2蛋白混合后，将缓冲液更换至组装缓冲液而组装成双层类病毒颗粒，其中：
i)VP2、VP6为未组装成颗粒的纯化的蛋白，其纯度为95％以上；
ii)组装缓冲液为磷酸盐缓冲液，MES缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，其pH介于4.0～6.4；
iii)组装缓冲液含150mM～2M的NaCl；
iv)VP2和VP6的质量比介于1：1～1：10。
2.权利要求1的方法，其中所述VP6蛋白通过以下步骤制备：
1)在大肠杆菌中表达轮状病毒VP6蛋白；
2)向含VP6蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亚胺或二价或三价金属离子，以沉淀核酸和部分杂蛋白，聚乙烯亚胺的浓度介于0.05％-0.2％；金属离子选自Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+和Al3 +；金属离子的浓度介于10～80mM；
3)离心，使蛋白质上清液经历盐析和色谱层析纯化。
3.权利要求2的方法，其中所述盐析使用饱和硫酸铵进行。
4.权利要求2的方法，其中所述色谱层析选自疏水相互作用色谱和离子交换色谱。
5.权利要求1的方法，其中所述VP2蛋白是通过以下步骤制备的非颗粒状态的VP2蛋白：
1)在大肠杆菌中表达轮状病毒VP2蛋白；
2)向含VP2蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺的浓度介于0.05％-1％；
3)离心，使蛋白上清液经盐析和色谱层析纯化。
6.权利要求5的方法，其中所述盐析使用硫酸铵进行。
7.权利要求5的方法，其中所述色谱层析选自离子交换色谱和疏水相互作用色谱。
8.权利要求2的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度是0.1％。
9.权利要求2的方法，其中所述金属离子为Ca2+，其浓度是20mM。
10.权利要求4的方法，其中色谱层析是疏水作用色谱：3M NaCl条件下经GE的PhenylHP，其中核酸穿透，VP6蛋白在2M NaCl条件下洗脱，杂蛋白在无盐条件下洗脱。
11.权利要求5的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度是0.5％。
12.权利要求7的方法，其中色谱层析是阳离子交换色谱：在pH为8.0的Tris-HCl条件下通过GE的SP FF进行纯化，其中核酸和部分杂蛋白穿透或在150mM NaCl条件下洗脱，VP2蛋白在500mM NaCl条件下洗脱。
13.权利要求1的方法，其中pH为6.4。
14.权利要求1的方法，其中组装缓冲液含300mM NaCl。
15.权利要求1的方法，其中，VP2和VP6的质量比为1：2.6。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210350365.8A CN103667199B (zh) | 2012-09-20 | 2012-09-20 | 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 |
| IN2772DEN2015 IN2015DN02772A (zh) | 2012-09-20 | 2013-06-24 | |
| US14/429,586 US9862933B2 (en) | 2012-09-20 | 2013-06-24 | Method for in-vitro preparation of double-layered virus-like particles of rotavirus |
| PCT/CN2013/077736 WO2014044067A1 (zh) | 2012-09-20 | 2013-06-24 | 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 |
| DK13838213.0T DK2899267T3 (en) | 2012-09-20 | 2013-06-24 | Method for in vitro preparation of rotavirus double-layered virus-like particles |
| EP13838213.0A EP2899267B1 (en) | 2012-09-20 | 2013-06-24 | In vitro preparation method of rotavirus double-layer virus-like particles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210350365.8A CN103667199B (zh) | 2012-09-20 | 2012-09-20 | 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103667199A CN103667199A (zh) | 2014-03-26 |
| CN103667199B true CN103667199B (zh) | 2019-01-22 |
Family
ID=50305974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210350365.8A Active CN103667199B (zh) | 2012-09-20 | 2012-09-20 | 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9862933B2 (zh) |
| EP (1) | EP2899267B1 (zh) |
| CN (1) | CN103667199B (zh) |
| DK (1) | DK2899267T3 (zh) |
| IN (1) | IN2015DN02772A (zh) |
| WO (1) | WO2014044067A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104592366A (zh) * | 2014-12-24 | 2015-05-06 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种鸡传染性法氏囊病毒vp2蛋白初步纯化方法 |
| CN108431214B (zh) * | 2015-10-05 | 2022-03-01 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 人轮状病毒g9p[6]毒株和作为疫苗的用途 |
| CN109517043B (zh) * | 2018-11-23 | 2022-06-14 | 艾美诚信生物制药有限公司 | 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 |
| CN116497003A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-07-28 | 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 | 一种从溶液中纯化目标蛋白的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2806087B1 (fr) | 2000-03-07 | 2002-10-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Particules pseudovirales de rotavirus et leur utilisation pour vectoriser des proteines ou des acides nucleiques |
| EP1576877A1 (en) | 2004-03-04 | 2005-09-21 | Bioprotein Technologies | Preparation of recombinant rotavirus proteins in milk of transgenic non-human mammals |
| FI122520B (fi) | 2010-10-15 | 2012-03-15 | Vesna Blazevic | Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena |
-
2012
- 2012-09-20 CN CN201210350365.8A patent/CN103667199B/zh active Active
-
2013
- 2013-06-24 DK DK13838213.0T patent/DK2899267T3/en active
- 2013-06-24 WO PCT/CN2013/077736 patent/WO2014044067A1/zh active Application Filing
- 2013-06-24 EP EP13838213.0A patent/EP2899267B1/en active Active
- 2013-06-24 IN IN2772DEN2015 patent/IN2015DN02772A/en unknown
- 2013-06-24 US US14/429,586 patent/US9862933B2/en active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Andrea Bertolotti-Ciarlet等.Immunogenicity and protective efficacy of rotavirus 2/6-virus-like particles produced by a dual baculovirus expression vector and administered intramuscularly, intranasally, or orally to mice.《Vaccine》.2003,3885-3900. |
| Assembly of recombinant rotavirus proteins into virus-like particles and assessment of vaccine potential;M.J. Redmond等;《Vaccine》;19931231;273-281 |
| 轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装;李廷栋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20091215;第19页第7节，第41-42页，第46-56页第3.1-3.5节，第63-64页第4节 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9862933B2 (en) | 2018-01-09 |
| US20150252334A1 (en) | 2015-09-10 |
| DK2899267T3 (en) | 2019-01-07 |
| EP2899267A1 (en) | 2015-07-29 |
| EP2899267B1 (en) | 2018-10-10 |
| EP2899267A4 (en) | 2016-04-27 |
| WO2014044067A1 (zh) | 2014-03-27 |
| IN2015DN02772A (zh) | 2015-09-04 |
| CN103667199A (zh) | 2014-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105263506B (zh) | 稳定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚体疫苗及其使用方法 | |
| CN104404074B (zh) | 口蹄疫病毒衣壳蛋白串联共表达和病毒样颗粒的制备方法 | |
| KR101782451B1 (ko) | 인간 엔테로바이러스에 대한 백신 | |
| CN103667199B (zh) | 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法 | |
| US10421790B2 (en) | Feline calicivirus vaccine | |
| NO313917B1 (no) | Antigen-presenterende kapsid med fusert MS2-kappeprotein | |
| CN103849631B (zh) | 含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN105462936B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒my01株及其应用 | |
| CN102101888A (zh) | 一种新型抗eb病毒所致肿瘤多肽及其应用与制备方法 | |
| CN102816246B (zh) | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN106167518B (zh) | 截短的轮状病毒vp4蛋白及其用途 | |
| EP3193922A1 (en) | Vaccine | |
| CN108026538A (zh) | 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物 | |
| CN101293098A (zh) | 一种重组牛o型口蹄疫病毒融合蛋白疫苗 | |
| WO2002038770A1 (en) | Yeast derived vaccine against ipnv | |
| CN101899466B (zh) | 登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗及其制备方法 | |
| CN102464721A (zh) | 针对人肠道病毒71型的重组广谱性疫苗 | |
| CN104258387A (zh) | 人用轮状病毒疫苗及其制备方法 | |
| CN101624581B (zh) | 基于Vasohibin基因的伪病毒及其制备方法和应用 | |
| CN106939046B (zh) | 一种乙型脑炎病毒的保护性单克隆抗体及其抗原位点的应用 | |
| CN112011572A (zh) | 柯萨奇病毒a7的病毒样颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN104211783B (zh) | 一种蓝耳病亚单位疫苗的制备 | |
| CN105400799B (zh) | 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用 | |
| CN108373500A (zh) | 一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用 | |
| TWI750500B (zh) | 防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |