CN108373500A - 一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用 - Google Patents

一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用。本发明提供了一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。采用本发明的方法制备的高免抗体可在室温稳定保存一年时间，无需冷链运输和保存，因此更适合非洲基础设施薄弱地区的应用。

Description

一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用。
背景技术
埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)是烈性传染病埃博拉出血热(Ebolahemorrhagic fever，EHF)的病原体。该病毒于1976年首次被发现，1995年在刚果民主共和国爆发后才被人们所认知，2014-15年西非大规模疫情的爆发，让全球开始关注埃博拉病毒。埃博拉病毒感染性极强，传播途径包括体液、接触及气溶胶，可通过野生动物传播给人，并在人与人之间传播蔓延。世界卫生组织已将其列为对人类危害最严重的病毒之一，在生物安全等级上被列为最危险的第4级病毒。2012年有研究证明，将幸存的感染过埃博拉病毒的非人灵长动物血清注入多个动物，可使这些动物抵御致死剂量埃博拉病毒的攻击，提示埃博拉病毒抗血清具有治疗埃博拉感染的潜力。后来有研究人员尝试将多个抗埃博拉病毒糖蛋白(EBOV-GP)的单克隆抗体混合后，用于治疗埃博拉病毒感染病毒，也证明了一定的治疗效果。我国军科院的研究人员采用埃博拉病毒样颗粒(VLP)作为免疫原，免疫马匹制备了高免血清，注入小鼠体内，可使感染埃博拉病毒鼠适应株的小鼠存活。这些研究对于埃博拉的抗体治疗提供了依据和基础。
埃博拉病毒主要流行于非洲，而且主要在雨林或偏远的草原地区。由于偏远地区基础设施滞后、人才不足、资金短缺，缺乏基本的公共卫生保障体系，而且电力供应严重不足，缺乏必要的冷链运输。尽管埃博拉病毒单克隆抗体和马高免血清对于埃博拉病毒感染具有一定的治疗效果，但由于这些抗体需要严格的冷链运输和保存要求，否则极易丢失活性，因此在条件恶劣的非洲应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用。
本发明提供了一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。
所述禽类动物具体可为鸡，更具体可为120日龄蛋鸡。
所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白编码基因替换水疱性口炎病毒基因组中的糖蛋白编码基因得到的重组病毒。
所述埃博拉病毒糖蛋白如序列表的序列2所示。
所述埃博拉病毒糖蛋白编码基因如序列表的序列1所示。
所述水疱性口炎病毒基因组序列如GenBank：J02428.1所示。
所述重组病毒的制备方法具体包括如下步骤：将主质粒VSV-EBOVGP、辅助质粒pCAGGS-N、辅助质粒pCAGGS-P、辅助质粒pCAGGS-L和辅助质粒pCAGGS-T7共转染Vero和293T混合细胞，72h后收集细胞上清液，将上清液重新感染Vero细胞并连续传代直到形成明显细胞病变，收获上清病毒液并进行标定，得到重组病毒。
所述主质粒VSV-EBOVGP、辅助质粒pCAGGS-N、辅助质粒pCAGGS-P、辅助质粒pCAGGS-L和辅助质粒pCAGGS-T7的质量比为6.5μg：10μg：10μg：10μg：10μg。
所述主质粒VSV-EBOVGP的构建方法为：人工合成VSV全基因组序列(GenBank：J02428.1)，并将VSV基因组中的糖蛋白编码基因(基因组位置：3049-4713)替换为埃博拉病毒糖蛋白编码基因(序列表的序列1)，基因组序列5’端连接T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGG)，基因组序列3’端连接序列3中的序列(包含T7终止子和核糖酶编码序列)，将合成的序列通过NdeI/XhoI酶切位点克隆入pcDNA3质粒。
所述辅助质粒pCAGGS-N的构建方法为：将VSV基因组中的N蛋白编码基因(基因组位置：64-1332)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。
所述辅助质粒pCAGGS-P的构建方法为：将VSV基因组中的P蛋白编码基因(基因组位置：1396-2193)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。
所述辅助质粒pCAGGS-L的构建方法为：将VSV基因组中的L蛋白编码基因(基因组位置：4733-11062)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。
所述辅助质粒pCAGGS-T7的构建方法为：将T7RNA聚合酶编码基因(GenBank：M38308.1)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。
所述埃博拉病毒抗体的制备方法中，所述免疫分为四次，每次间隔两周，每次的免疫剂量为103TCID5o-104TCID50。
每次的免疫剂量最佳为104TCID50。
所述免疫方式为肌肉注射。
所述埃博拉病毒抗体的制备方法中，所述免疫完成后，还包括如下步骤：
(1)采集卵黄，将卵黄与蒸馏水混合混合，pH调至5.2，静置10小时，离心收集上清，加入正辛酸溶液，过滤除去沉淀，取上清液；
(2)将步骤(1)得到的上清液超滤浓缩10倍，浓缩液经过凝胶过滤层析柱Superdex20，收集目的蛋白(卵黄抗体)溶液；将目的蛋白(卵黄抗体)溶液冻干，得到所述抗体。
所述埃博拉病毒抗体的制备方法中，所述免疫完成后，还包括如下步骤：
(1)采集卵黄，将1体积份的卵黄与8体积份的与蒸馏水混合，pH调至5.2，静置10小时，10000g离心15分钟收集上清，加入1％(体积百分比)正辛酸水溶液，过滤除去沉淀，取上清液；
(2)将步骤(1)得到的上清液经XL小型切向流超滤膜包(密理博)超滤浓缩10倍，将PBS(pH 7.2)以2mL/min流速持续流经凝胶过滤层析柱Superdex200(GE生命科学，货号：17-5175-01)，注入浓缩抗体，收集目的蛋白(卵黄抗体)溶液；将目的蛋白(卵黄抗体)溶液冻干，得到所述抗体。
本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的埃博拉病毒抗体。
本发明还保护埃博拉病毒抗体在制备抗埃博拉病毒的产品中的应用。
本发明还保护一种抗埃博拉病毒的产品，其活性成分为所述埃博拉病毒抗体。
本发明提供了一种具有高度热稳定性的埃博拉病毒高免抗体的制备方法，制备的高免抗体可在室温稳定保存一年时间，无需冷链运输和保存，因此更适合非洲基础设施薄弱地区的应用。
附图说明
图1为实施例2中最优免疫原筛选结果。
图2为实施例3中抗体热稳定性检测结果。
图3为实施例4中动物保护实验检测结果。
图4为实施例5中动物体内代谢动力实验检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、免疫原的制备
一、重组埃博拉病毒糖蛋白
1、重组质粒的制备：将2014年埃博拉病毒流行毒株糖蛋白编码基因(序列表的序列1，编码序列2所示的蛋白质)插入pFast-Bac1载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒(已经测序验证)。
2、将步骤1得到的重组质粒转染sf9昆虫细胞株，收集并标定重组杆状病毒。
pFast-Bac1载体、sf9昆虫细胞株均来自杆状病毒表达系统(Baculovims Expression System，美国invitrogen公司)，重组杆状病毒的制备方法参照杆状病毒表达系统使用说明书。
3、将步骤2制备的重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞株(MOI＝5)，感染96小时后收集并裂解细胞，离心收集裂解上清，分别用镍离子亲和层析和凝胶过滤获得高纯度重组埃博拉病毒糖蛋白。
二、埃博拉病毒VLP
参照已发表文献(Ebola virus-like particles protect from lethal Ebolavirus infection.Proc NatlAcad Sci U SA 100：15889-15894)，分别将编码埃博拉病毒糖蛋白(GP)和基质蛋白(VP40)的真核表达质粒共转染293T细胞，培养68h后收集上清，9500g离心4h，弃去大部分上清，将留存底部混匀即为粗制病毒样颗粒(VLP)，进一步进行10-30-50％蔗糖密度梯度离心，收集30-50％密度范围，即为纯化的埃博拉病毒VLP。
三、DNA疫苗
将埃博拉病毒糖蛋白基因(序列表的序列1)插入pCAGGS载体(赢润生物，货号：VPA0057)的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒pCAGGS/EBOVGP(已经测序验证)。重组质粒pCAGGS/EBOVGP采用可去除内毒素的质粒抽提试剂盒提取。
四、重组腺病毒
重组腺病毒的构建参照文献：A protocol for rapid generationofrecombinant adenoviruses using the AdEasy system.Nature Protocols 2，1236-1247(2007)。
1、将埃博拉病毒糖蛋白基因(序列表的序列1)插入pAdTrack-CMV载体(安捷伦，240009，AdEasy Adenoviral Vector System)的KpnI和HindIII酶切位点之间，得到重组质粒(已经测序验证)。
2、将步骤1的重组质粒采用PmeI酶切，得到线性化重组质粒。
3、将步骤2得到的线性化重组质粒转化BJ5183感受态细菌中(该细菌中含有pAdEasy-1质粒)(淼灵生物，货号：L3707)，采用PacI酶切鉴定，筛选卡那霉素抗性质粒。
4、将步骤3筛选的质粒转化DH5a感受态细胞，然后提取质粒，采用PacI酶切，得到线性化质粒。
5、将步骤4得到的线性化质粒用lipo2000转染293A细胞(赛齐(上海)生物工程有限公司，货号：CBR131537)，约1周后离心收集细胞并冻融细胞，得到重组腺病毒。
6、将步骤5得到的重组病毒感染293A细胞，对获得的病毒进行标定。
五、重组VSV病毒
1、质粒构建
(1)主质粒VSV-EBOVGP：委托金斯瑞生物技术公司人工合成VSV全基因组序列(GenBank：J02428.1)，并将VSV基因组中的糖蛋白编码基因(基因组位置：3049-4713)替换为埃博拉病毒糖蛋白编码基因(序列表的序列1)，基因组序列5’端连接T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGG)，基因组序列3’端连接序列3中的序列(包含T7终止子和核糖酶编码序列)，将合成的序列通过NdeI/XhoI酶切位点克隆入pcDNA3质粒(赛默飞世尔)。
(2)辅助质粒pCAGGS-N：将VSV基因组中的N蛋白编码基因(基因组位置：64-1332)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS(赢润生物)。
(3)辅助质粒pCAGGS-P：将VSV基因组中的P蛋白编码基因(基因组位置：1396-2193)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS(赢润生物)。
(4)辅助质粒pCAGGS-L：将VSV基因组中的L蛋白编码基因(基因组位置：4733-11062)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS(赢润生物)。
(5)辅助质粒pCAGGS-T7：将T7RNA聚合酶编码基因(GenBank：M38308.1)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS(赢润生物)。
2、重组病毒的构建
将步骤1制备的主质粒VSV-EBOVGP(6.5μg)、辅助质粒pCAGGS-N(10μg)、辅助质粒pCAGGS-P(10μg)、辅助质粒pCAGGS-L(10μg)和辅助质粒pCAGGS-T7(10μg)采用转染试剂2000共转染Vero(CCL-81TM)和293T(CRL-3216TM)混合细胞，72h后收集细胞上清液，将上清液重新感染Vero细胞并连续传代直到形成明显细胞病变，收获上清病毒液并进行标定，得到重组病毒VSVΔG/EBOVGP。
重组病毒VSVΔG/EBOVGP中表达埃博拉病毒糖蛋白。
实施例2、免疫方案的筛选
实验动物：120日龄蛋鸡(北京维通利华实验动物技术有限公司)。
1、分组对实验动物进行肌肉注射，每隔2周注射一次(共注射4次)：
VSVΔG/EBOVGP(103TCID50)组：注射实施例1步骤五制备的重组病毒VSVΔG/EBOVGP，每次注射剂量为103TCID50。
VSVAG/EBOVGP(104TCID50)组：注射实施例1步骤五制备的重组病毒VSVΔG/EBOVGP，每次注射剂量为104TCID50。
rEBOVGP组：注射实施例1步骤一制备的重组埃博拉病毒糖蛋白，每次注射剂量为100μg。
pCAGGS/EBOVGP组：注射实施例1步骤三制备的重组质粒pCAGGS/EBOVGP，每次注射剂量为100μg。
EBVO-VLP组：注射实施例1步骤二制备的埃博拉病毒VLP，每次注射剂量为10μg。
Adv5/EBOVGP组：注射实施例1步骤四制备的重组腺病毒，每次注射剂量为1011Vp。
生理盐水组：注射生理盐水，每次注射1000μl。
2、完成步骤1后，采集卵黄，将1体积份的卵黄与8体积份的与蒸馏水混合，pH调至5.2，静置10小时，10000g离心15分钟收集上清，加入1％(体积百分比)正辛酸水溶液，过滤除去沉淀，取上清液。
3、将步骤2得到的上清液经XL小型切向流超滤膜包(密理博)超滤浓缩10倍，将PBS(pH 7.2)以2mL/min流速持续流经凝胶过滤层析柱Superdex 200(GE生命科学，货号：17-5175-01)，注入浓缩抗体，收集目的蛋白(卵黄抗体)溶液。
4、对步骤3得到的各组目的蛋白(卵黄抗体)溶液采用慢病毒中和实验验证抗体的中和活性，具体操作步骤参照已发表文献中的检测方法(Treatment with hyperimmuneequine immunoglobulin or immunoglobulin fragments completely protects rodentsfrom Ebola virus infection.Sci Rep 6：24179)，挑选诱导生成中和抗体滴度最高的免疫原和免疫剂量最为最优免疫方案。
结果如图1所示。结果表明，最优的免疫原为实施例1步骤五构建的可表达埃博拉病毒糖蛋白的重组VSV假病毒，最优的接种剂量为104TCID50，纯化的卵黄抗体溶液稀释30000倍可抑制50％细胞病变。
5、将步骤3得到的重组VSV病毒免疫(接种剂量为104TCID50)的卵黄抗体溶液冻干后得到冻干卵黄抗体。
实施例3、抗埃博拉病毒卵黄抗体稳定性实验
将实施例2得到的冻干卵黄抗体分别置4℃、25℃、37℃、45℃，避光放置1年，每隔一个月检测其中和活性(方法同实施例2的步骤4)。
结果如图2所示。结果表明，抗体具有高度热稳定性，4℃和25℃放置1年其中和活性未发生变化，37℃放置6个月其中和活性未发生变化，提示本发明制备的抗体不需要冷链运输和保存，更适合在非洲高温条件下使用。
实施例4、抗埃博拉病毒卵黄抗体动物保护实验
实验动物：3日龄Balb/c乳鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司购买孕鼠，待其产仔后获得)。
实验动物腹腔注射104TCID50重组VSV病毒，注射后2小时皮下注射2毫克实施例2得到的卵黄抗体，对照组皮下注射等体积的生理盐水，观察7天，统计存活率。
结果如图3所示。生理盐水对照组小鼠全部死亡，而注射抗体实验组小鼠全部存活结果表明，本发明的抗体可用于埃博拉病毒暴露感染后的紧急治疗。
实施例5、抗埃博拉病毒卵黄抗体动物体内代谢动力实验
实验动物：6周龄雌性豚鼠，体重200-300克(北京维通利华实验动物技术有限公司)。
分别将105NAU/kg和106NAU/kg(中和活性/小鼠体重)的实施例2得到的冻干卵黄抗体皮下注射给药(采用生理盐水溶解)，每隔1天，检测血清中埃博拉病毒中和抗体活性(方法同实施例2的步骤4)。
结果如图4所示。结果表明豚鼠体内抗体水平逐渐降低，给药后第三天无法检测到中和抗体。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 埃博拉病毒
<400> 1
atgggtgtta caggaatatt gcagttacct cgtgatcgat tcaagaggac atcattcttt 60
ctttgggtaa ttatcctttt ccaaagaaca ttttccatcc cgcttggagt tatccacaat 120
agtacattac aggttagtga tgtcgacaaa ctagtttgtc gtgacaaact gtcatccaca 180
aatcaattga gatcagttgg actgaatctc gaggggaatg gagtggcaac tgacgtgcca 240
tctgtgacta aaagatgggg cttcaggtcc ggtgtcccac caaaggtggt caattatgaa 300
gctggtgaat gggctgaaaa ctgctacaat cttgaaatca aaaaacctga cgggagtgag 360
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tcatggcttc agaaaattcc tctgcaatgg ttcaagtgca cagtcaagga aggaaagctg 1080
cagtgtcgca tctga 1095
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> 埃博拉病毒
<400> 2
Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg
1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val
35 40 45
Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro
65 70 75 80
Ser Val Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly
115 120 125
Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp
180 185 190
Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu
245 250 255
Asn Glu Thr Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Thr Ser Leu Glu Lys Phe Ala Val Lys
290 295 300
Ser Cys Leu Ser Gln Leu Tyr Gln Thr Asp Pro Lys Thr Ser Val Val
305 310 315 320
Arg Val Arg Arg Glu Leu Leu Pro Thr Gln Arg Pro Thr Gln Gln Met
325 330 335
Lys Thr Thr Lys Ser Trp Leu Gln Lys Ile Pro Leu Gln Trp Phe Lys
340 345 350
Cys Thr Val Lys Glu Gly Lys Leu Gln Cys Arg Ile
355 360
<210> 3
<211> 202
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgtc 60
gtccactcgg atggctaagg gaggggcccc cgcgggggct gctaacaaag cccgaaagga 120
agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 180
acgggtcttg aggggttttt tg 202

Claims (9)

1.一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述禽类动物为鸡。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白编码基因替换水疱性口炎病毒基因组中的糖蛋白编码基因得到的重组病毒。
4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述埃博拉病毒糖蛋白如序列表的序列2所示。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述埃博拉病毒糖蛋白编码基因如序列表的序列1所示。
6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述免疫分为四次，每次间隔两周，每次的免疫剂量为103TCID50-104TCID50。
7.权利要求1至6任一所述的方法制备得到的埃博拉病毒抗体。
8.权利要求7所述的埃博拉病毒抗体在制备抗埃博拉病毒的产品中的应用。
9.一种抗埃博拉病毒的产品，其活性成分为权利要求7所述的埃博拉病毒抗体。
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