KR20140030100A

KR20140030100A - 혼합 백신으로 사용하기 위한 노로바이러스 캡시드 및 로타바이러스 ｖｐ6 단백질

Info

Publication number: KR20140030100A
Application number: KR1020137012218A
Authority: KR
Inventors: 띠모 베시카리; 베스나 블라체빅; 키르시 누르미넨; 레나 후흐띠; 수비 라빠라이넨; 에바 요켈라
Original assignee: 베스나 블라체빅; 띠모 베시카리
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2011-10-12
Publication date: 2014-03-11
Also published as: CN103260645B; US8895015B2; RU2013121815A; AU2011315405B2; CA2814175A1; CN103260645A; SG189398A1; EP2627353A1; US20120093884A1; FI20106067A0; JP2013540773A; TW201217530A; EP2627353B1; BR112013009164A2; TWI479022B; WO2012049366A1; KR101847472B1; FI122520B; EP2627353A4; MX2013004159A

Abstract

본 발명은 사람의 노로바이러스 및 로타바이러스 감염 및/또는 바이러스-유도성 설사 및 구토 질환을 예방하기 위한 혼합 노로바이러스 및 로타바이러스 백신에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 노로바이러스 항원과 로타바이러스 항원을 포함하는 혼합 백신 조성물, 구체적으로 노로바이러스 VLP와 로타바이러스 재조합 VP6 단백질의 혼합물 또는 이중층 VP2/VP6 VLP를 포함하는 혼합 백신 조성물의 제조 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

혼합 백신으로 사용하기 위한 노로바이러스 캡시드 및 로타바이러스 ＶＰ6 단백질{NOROVIRUS CAPSID AND ROTAVIRUS VP6 PROTEIN FOR USE AS COMBINED VACCINE}

본 발명은 특히 소아에서 위장염을 예방하기 위한 백신 제형에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 적어도 하나의 노로바이러스 항원과 적어도 하나의 로타바이러스 항원을 포함하는 혼합 백신 제형에 관한 것이다.

로타바이러스 위장염은 세계적으로 매년 오십만 명이 넘는 소아 사망자를 유발한다. 레오바이러스과(Reoviridae)의 구성원인 로타바이러스(RV)는 선진국에서도 소아의 심한 설사를 유발하는 가장 중요한 단일 원인 인자로서, 개발도상국보다 사망수는 적지만, 많은 비용이 드는 수많은 입원을 초래한다. 2006년 이후에는 경구 로타바이러스 생백신이 이용가능해졌다. WHO와 많은 개별 국가들은 현재 모든 건강한 아동에게 로타바이러스에 대한 백신접종을 권장한다.

경구 로타바이러스 생백신의 개발에 있어, 탐페레(Tampere) 대학의 티모 베시카리 교수가 주요한 역할을 했다. 임의의 로타바이러스 백신의 최초 임상 실험은 1982년 탐페레에서 수행되었다. 베시카리 교수와 그의 팀은 현재 허가된 2가지 경구 로타바이러스 생백신인 소-사람 재조합 5가 백신 RotaTeq®(Merck) 및 사람 로타바이러스 백신 Rotarix®(GSK)의 효능 및 안전성을 확립한 핵심 실험에서 중요한 역할을 하였다(Vesikari et al. Safety and efficacy of a pentavalent human-bovine(WC3) reassortant rotavirus vaccine. N Engl J Med 2006; 354: 23-33; Vesikari et al. Efficacy of human rotavirus vaccine against rotavirus gastroenteritis during the first 2 years of life in European infants: randomized, double-blind controlled study. Lancet 2007; 370: 1757-63).

현재 이용가능한 약독화된 경구 로타바이러스 생백신은 많은 국가에서 성공적으로 시행되고 있고 효과가 있지만, 종국적으로 사용을 제한할 수 있는 잠재적인 안전성 문제가 있다. 이보다 앞서, 리서스 로타바이러스를 기반으로 하는 경구 로타바이러스 생백신(RotaShield®, Wyeth)은 백신 1차 용량을 투여받은 만 명의 접종자 중 약 1명에서 일어날 수 있는 장중첩증과의 연관성 때문에 1999년 미국에서 퇴출되었다. 현재 허가된 로타바이러스 백신은 이러한 큰 위험을 수반하지는 않지만 드문 연관성을 배제할 수는 없다.

또한, 2010년에는 돼지 서코바이러스(PCV) DNA를 함유하는 허가된 2가지 로타바이러스 생백신이 개발되었다. 이러한 발견의 중요성은 알려지지 않았지만, 두 백신 중 하나의 일시적 보류와 로타바이러스 백신접종의 전반적인 감소를 유발했다. 이러한 문제들 둘 다 오로지 생백신에 고유한 것이며, 함께 로타바이러스 백신의 비-생백신의 대안을 개발할 필요성을 강조한다.

로타바이러스 게놈은 3층 바이러스의 내부 코어에 보유된 이중가닥 RNA의 11개 분절로 이루어진다. 3층은 dsRNA에 결합된 코어 단백질 VP2, 내부 캡시드 단백질 VP6, 및 헤마글루티닌 스파이크 단백질 VP4를 갖는 외부 캡시드 당단백질 VP7로 이루어진다. 주요 캡시드 단백질 VP6은 바이러스 군 특이성을 결정하고 가장 보존적이며 면역원성이며 풍부한 로타바이러스 단백질이다. 외부 캡시드 단백질 VP7 및 VP4는 중화성 에피토프를 함유하고 중화 항체를 기반으로 한 방어 면역을 유도한다.

경구 로타바이러스 생백신에 의해 유도된 활성 방어 기전은 충분히 알려져 있지 않다. 표면 단백질 VP7과 VP4는 혈청형 특이적인 중화 항체를 유도하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 혈청형 간에는 혈청형 특이적 면역에 의해 설명될 수 없는 유의적인 교차 방어가 있다. VP6은 로타바이러스 감염 및 백신접종 후의 면역우성 단백질이다. VP6은 중화 항체를 유도하지 않지만, 이종의 로타바이러스 특이적 면역을 유도한다.

최초 로타바이러스 재조합 VP6(rVP6) 단백질은 20년보다 훨씬 전에 rBV 발현계로부터 생산되었다(Estes M et al. 1987). VP6은 단독으로 가변적인 수의 삼중체(trimer)로 구성된 소관(tubule), 구(sphere) 및 시트(sheet)를 포함한 올리고머 구조를 시험관내에서 형성한다(Lepaualt J, Embo J, 20, 2001). rBV에서 VP2와 VP6의 공동발현은 이중층(double-layered) 바이러스 유사 입자(dl VLP)를 형성시킨다. VP2, VP6 및 VP7(VP4와 함께 또는 VP4 없이)의 공동발현은 천연 감염성 로타바이러스 입자와 유사한 삼중층형 VLP를 생산한다. 동물 모델에서의 대부분의 면역원성 및 백신 효능 연구는 보강제와 여러 로타바이러스 VLP 또는 비-사람 재조합 VP6 단백질을 사용하여 수행되었다. VLP 또는 재조합 VP6 단백질을 사용하는 서브유닛 로타바이러스 단백질 비-생백신을 가지고 수행한 사람 임상 실험은 지금까지 없었다.

많은 분야에서 로타바이러스의 제거 또는 감소 후, 원인 인자로서 노로바이러스의 상대적인 역할이 증가하고 있다. 노로바이러스(norovirus, NV)는 모든 연령 그룹의 사람에서 산발적인 급성 비세균성 위장염을 유발하는 칼리시바이러스과(Caliciviridae)의 구성원으로, 세계적으로 위장염의 발생에 연관성이 있다. NV는 해마다 약 백만건의 입원을 유발하고, 세계적으로 5세 미만의 소아들에게 이십만이 넘는 사망을 유발한다. 로타바이러스 이후, 소아 급성 위장염의 두 번째로 가장 중요한 바이러스 원인은 노로바이러스이다.

노로바이러스 게놈은 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF 1-3)으로 구성된 약 7.6kb의 단일가닥 RNA로 이루어진다. ORF1은 다른 ssRNA 바이러스와 유사하게 RNA-의존적인 RNA 폴리머라제를 암호화하고; ORF2는 주요 캡시드 단백질 VP1을 암호화하며 ORF3은 작은 구조 단백질 VP2를 암호화한다. 사람에게 영향을 미치는 대부분의 NV는 2개의 유전자군(GI 및 GII)에 속하고 이러한 두 유전자군은 적어도 8개의 GI와 17개의 GII 유전자형으로 나뉜다. 최근, 산발적 위장염 증례와 발생 대부분에 주요 역할을 한 것은 유전자형 GII-4였다.

캡시드 VP1 단백질의 독특한 특징은 중공 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)로 자가조립하는 능력이다. 유전자군 I Norwalk 바이러스 캡시드 유전자를 재조합 바큘로바이러스(rBV) 내로 클로닝 시, 20년전 최초의 노로바이러스 VLP(Jiang et al.1992)가 생산되었다. 이러한 VLP는 형태학적 및 항원적으로 천연 NV와 유사하다. 전자동결현미경 및 컴퓨터 영상 처리 기술을 이용하여 검토한 노로바이러스 VLP의 3차원 구조는 노로바이러스 캡시드가 직경이 38nm이고 90개의 이량체로 구성된 VP1 캡시드 단백질 180개 분자를 함유하는 T=3 20면체 대칭 구조를 형성한다는 것을 보여준다. 노로바이러스 VLP는 진단 혈청 분석뿐 아니라 노로바이러스에 대한 후보 백신의 개발을 위해 항원 급원으로서 널리 사용된다. 노로바이러스 결합 및 도입을 위한 수용체는 완전하게 밝혀진 것은 아니지만, 최근 NV는 사람 조직혈액형(HBGA)을 수용체로서 인식한다는 것을 발견했다. HBGA 중에서 가장 흔히 접하는 혈액군은 ABO(ABH) 및 Lewis 이다. 이러한 복합 탄수화물은 적혈구 세포와 점막 상피세포에서 발견되거나 또는 생물학적 유체에서 유리 항원으로서 발견된다. 또한, 최근에는 NV에 의한 HBGA의 인식이 균주 특이적인 것으로 밝혀졌고, 여러 상이한 수용체 결합 패턴이 확인되었다.

노로바이러스의 경우 생백신은 있을 수 없는데, 그 이유는 노로바이러스는 세포 배양으로 배양할 수 없기 때문이다. 따라서, 노로바이러스의 후보 백신은 VLP 백신 또는 가용성 항원 백신 중 어느 하나였고 그럴 가능성이 있다.

비-복제성 서브유닛 백신 및 서브바이러스 입자를 현대 백신 디자인에 사용한 것은 80년대 중반 HB 감염 환자의 혈액에서 발견된 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 입자의 발견으로 시작되었다. 이 백신들은 일반적으로 임의의 생 약독화 또는 불활성화된 바이러스 또는 이들의 유전자 물질이 제거된 것이기 때문에 안전하고 비교적 쉽고 저렴하게 다량으로 생산된다. 서브유닛 단백질 백신의 한 예는 생 바이러스의 중공 외피를 모방하여 생 바이러스와 유사한 항원성 및 면역원성 성질을 보유하는 바이러스 유사 입자(VLP)이다. 백신 유도성 혈청 중화 항체는 바이러스 감염에 대한 방어에 중요하다. VLP의 필수적인 특징은 천연 바이러스와 유사하여 입체구조-의존적인 중화 에피토프를 보유한다는 점을 포함한다.

NV VLP 및 RV VP6 단백질의 여러 흥미로운 특징 또는 주요 속성은 백신 후보로서 가능성이 있게 한다. 이들의 반복적인 다가 구조로 인해, VLP는 극히 면역원성이다. VLP 표면에서 고도로 구성되고 치밀하며 반복적인 배열의 항원의 제시는 매우 낮은 용량에서도 강한 항체 반응을 유발하고, 이에 반해 단량체로서 제시된 동일한 항원은 보통 비면역원성이다. B 세포는 이러한 반복 구조들(육각형으로 구성되고 이보다 고차원 구조, 예컨대 소관으로 충전된 VLP 또는 rVP6 삼량체처럼)에 의해 효과적으로 활성화되어 세포 표면에 B 세포 수용체의 가교를 초래한다. VLP의 미립자 성질, 특히 약 40nm의 크기 범위는 거대음세포작용 및 세포내섭취를 통한 전문적인 항원제시세포(APC), 즉 수지상세포(DC)에 의한 나노입자의 흡수에 최적이다(Fifis T., J Immunol, 2004, 173). 따라서, 생바이러스와 유사하게 VLP는 직접 활성화하고 다른 세포를 필요로 함이 없이 DC를 성숙시킨다. DC는 선천성 면역반응과 후천성 면역반응을 활성화시키는데 중심 역할을 하고 장수하는 기억 IgG 생산에 관여하고 순수 T 세포를 활성화시킬 수 있는 유일한 APC이다. VLP는 세포내 복제의 부재 하에 CTL을 효과적으로 대비시킨다(Keller SA et al., Intro, J Immunol, 2010). 따라서, VLP는 세포매개면역(CMI) 반응 및 체액면역반응 모두를 자극하는데 효과적이다.

이미 앞에서 언급한 바와 같이, VP6은 로타바이러스의 가장 풍부한 면역원성 아군-특이적(subgroup-specific) 항원이다. 다량체 구조를 형성하는 VP6의 능력 및 VP6이 유도해낼 수 있는 강한 면역 반응은 VP6을 우수한 로타바이러스 백신 후보가 되게 한다. VP6은 로타바이러스에 대한 중화 항체를 유도하지 않고, 대신 교차반응 면역을 촉진하는 강한 T 헬퍼(Th) 세포 반응을 유도해내어 이형 교차방어 면역을 유도한다(Burns JW et al., 1996 Science; Parez N et al., 2004, J Virol). VP6-특이적 CD4+ Th 세포는 VP7 분자 및/또는 VP4 분자 상의 에피토프를 중화시키는데 특이적인 B 세포에 동족 보조(cognate help)를 제공한다(Esquirel FR, Arch. Virol 2000, 145, 813). 또한, VP6-특이적 CD4+ Th 세포는 점막에서 직접 세포독성 기전에 의해 또는 항바이러스 사이토카인 생산에 의해 쥐의 로타바이러스 감염에 대해 방어하는 것으로 관찰되었다.

로타바이러스와 노로바이러스 감염의 중증성과 시중에서 입수용이한 백신이부족한 실정을 고려해볼 때, 특히 아동기의 급성 위장염 예방을 위해, 노로바이러스 및 로타바이러스 비-생 백신이 필요하다. NV 및 RV에 대한 면역 반응은 복잡하고 방어의 상관성은 완전하게 밝혀지지 않았다. 종합해보면, 전술한 NV VLP를 비롯한 VLP 및 RV의 VP6 단백질에 기인한 독특한 성질은 이 두 성분으로 이루어진 백신이 NV 및 RV 감염에 대한 면역화에 성공가능한 전략임을 암시한다.

본 발명은 혼합 백신에 포함된 노로바이러스 항원과 로타바이러스 항원이 서로 방해하지 않고 백신에 존재하는 각 항원에 대하여 상승적 면역을 유도한다는 놀라운 발견을 기반으로 한다.

따라서, 본 발명은 적어도 하나의 노로바이러스 VLP 항원과 적어도 하나의 로타바이러스 VP6 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

일부 양태에서, 백신 조성물은 항원성 캡시드 펩타이드 및 항원성 캡시드 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 노로바이러스 항원을 추가로 더 포함한다. 이 항원은 임의의 노로바이러스 균주로부터 유래될 수 있고, 예컨대 GI 및 GII 유전자군과 이의 임의의 유전자형에 속하는 것이다. 일부 양태에서, 노로바이러스 항원은 GII-4 VLP, 바람직하게는 1가 형태이다. 일부 다른 양태에서, 노로바이러스 항원은 1종보다 많은 VLP 형을 포함한다.

일부 양태에서, 로타바이러스 VP6 항원은 rVP6 단백질, 이중층 VP2/VP6 VLP 및 VP6 단백질을 함유하는 VLP로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. rVP6은 소관, 구 또는 시트의 다량체 형태로 존재할 수 있다.

또한, 본 발명은 특히 소아에서 위장염을 예방하는데 사용되는 상기 기술된 백신의 용도를 제공한다. 본 발명의 이 관점은 또한 위장염의 예방을 필요로 하는 피검자에게 본원에 기술된 백신 조성물을 백신접종하는 것을 포함하며, 상기 피검자, 특히 소아의 위장염을 예방하는 방법으로서 사용될 수도 있다.

게다가, 본 발명은 본원에 기술된 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 i) 단일 숙주에서 적어도 하나의 노로바이러스와 적어도 하나의 로타바이러스 항원을 공동발현시키는 단계, 또는 ii) a) 적어도 하나의 노로바이러스 항원을 생산, 분리 및 정제하는 단계; b) 적어도 하나의 로타바이러스 항원을 생산, 분리 및 정제하는 단계; 및 c) 상기 노로바이러스 항원과 로타바이러스 항원을 혼합하는 단계를 포함한다. 이 항원들은 재조합 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포 숙주에서 생산되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 목적, 관점, 세부 사항 및 장점은 다음과 같은 도면, 상세한 설명 및 실시예에서 명백해질 것이다.

이하에 본 발명은 첨부 도면을 참고로 하여 바람직한 양태에 의해 더 상세하게 설명될 것이다:
도 1a는 바큘로바이러스에 의해 발현된 노로바이러스 GII-4 VLP(레인 A), 로타바이러스 rVP6(레인 B), 이중층 VP2/VP6 VLP(레인 C), 칵테일 백신(노로바이러스 GII VLP + rVP6; 레인 D) 및 키메라 백신(공동감염된 노로바이러스 GII-4 캡시드 및 로타바이러스 VP6; 레인 E)의 순도를 입증하는 page 청색 염색된 12% SDS-PAGE 겔의 사진이다. 여러 단백질이 겔의 오른쪽에 화살표머리로 표시되어 있다. 각 단백질의 대응하는 분자량(kDa)은 겔의 왼쪽에 표시되어 있다.
도 1b는 재조합 단백질에 의해 조립된 형태학적 구조의 전자현미경사진을 도시한 것이다. 단백질은 정제했고 구조는 전자현미경으로 조사한 후 3% 우라닐 아세테이트로 염색했다. VLP 구조는 노로바이러스(NV) GII-4 캡시드 및 로타바이러스(RV) VP2/VP6(패널 A 및 C)에서 검출되었고, 소관 구조는 VP6 단백질에서 관찰되었다(패널 B). GII-4 VLP 및 VP6의 소관은 둘 다 패널 D(칵테일 백신 제형) 및 패널 E(키메라 백신 제형)에서 관찰되었다.
도 2는 여러 용량과 경로(근육내, IM 및 피내, ID)의 GII-4 VLP로 BALB/c 마우스를 면역화한 후의 노로바이러스(NV)-특이적 IgG 반응의 ELISA 분석 결과를 예시한 것이다.
도 3은 ID 경로를 통해 여러 용량의 GII-4 VLP로 면역화한 후의 NV-특이적 IgG 혈청 종점 적정 분석 결과를 도시한 것이다.
도 4는 여러 용량의 GII-4 VLP로 면역화되고 ELISA에서 측정된 마우스 혈청 중의 NV-특이적 IgG 면역 반응 발달 동역학을 도시한 것이다. 상단 도면은 ID 면역화 결과를 도시한 것이고 하단 도면은 IM 면역화 결과를 도시한 것이다.
도 5는 ELISA에서 검사된 GII-4 VLP로 IM 면역화 후에 나타나는 NV-특이적 IgG 반응의 지속기간을 도시한 것이다.
도 6은 GII-4 VLP 단독으로 또는 rVP6과의 칵테일 제형 또는 rVP6과의 키메라 제형으로 피내(상단 도면) 또는 근육내(하단 도면) 면역화된 마우스의 실험군으로부터 얻은 혈청의 IgG 종점 적정 분석의 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 7은 rVP6 단독으로 또는 GII-4 VLP와의 칵테일 제형 또는 GII-4 VLP와의 키메라 제형으로 피내(상단 도면) 또는 근육내(하단 도면) 면역화된 마우스의 실험군으로부터 얻은 혈청의 IgG 종점 적정 분석의 ELISA 결과를 도시한 것이다.
도 8은 GII-4 VLP 단독으로 또는 rVP6과의 칵테일 제형 또는 rVP6과의 키메라 제형으로 마우스를 면역화한 후 NV-특이적 대변 IgG 종점 적정 분석 결과를 도시한 것이다.
도 9는 GII-4 VLP 단독, 칵테일 제형 또는 키메라 제형으로 ID(도 9a) 또는 IM(도 9b) 면역화된 마우스의 NV-특이적 IgG1 및 IgG2a 아형 항체 반응의 종점 적정 분석을 도시한 것이다.
도 10은 rVP6, 칵테일 또는 키메라 제형으로 ID(도 10a) 또는 IM(도 10b) 면역화된 마우스의 RV-특이적 IgG1 및 IgG2a 아형 항체 반응의 종점 적정 분석을 도시한 것이다.
도 11은 단독물로 또는 칵테일 또는 키메라 백신 제형으로 면역화 후 GII-4(상단 도면) 또는 rVP6(하단 도면) 특이적 IgG 항체의 평균 결합활성(avidity) 지수(%)를 도시한 것이다. 50% 이상의 결합활성 지수는 높은 결합활성으로 간주한다.
도 12의 상단 도면은 여러 NV 유전자형(GII-12 및 GI-3)에 대하여 GII-4 VLP-유도된 IgG 항체의 교차반응성을 나타낸다. 하단 도면은 여러 사람(G1P8, G2P6, G4P6, G8P10 및 G12P4), 소(BRV) 및 리서스(RRV) 로타바이러스 균주에 대하여 rVP6 유도된 항체의 교차반응성을 ELISA로 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 13은 사람 조직-혈액군 항원(HBGA) H형-3(추정상의 NV GII-4 수용체)에 대한 동종 GII-4 VLP(도 13a) 또는 이종 GI-3 VLP(도 13b)의 결합을 차단하는 NV-GII-4 특이적 혈청 항체의 능력을 도시한 것이다. 도 13c는 H형 3에 대한 GII-4 VLP의 결합을 최대로 차단하는데 필요한 혈청의 종점 역가를 도시한 것이다. 차단 지수는 다음과 같이 계산했다: 100% - (OD[혈청 존재]/OD[혈청 부재] x 100%.
도 14는 여러 백신 제형으로 면역화된 마우스로부터 수확한 비장세포의 ELISPOT 분석 결과를 도시한 것이다. 상단 도면은 세포 수확일에 측정된 GII-4 VLP-특이적 IgG 항체 분비 세포(ASC)를 도시한 것인 반면, 하단 도면은 GII-4 VLP와 배양 4일 후 GII-4 VLP-특이적 ASC의 수를 도시한 것이다. 상단 도면과 하단 도면 간에 ASC의 수의 차이는 기억 B 세포 반응을 나타낸다.

본 발명은 적어도 하나의 노로바이러스(NV) 항원과 적어도 하나의 로타바이러스(RV) 항원을 함유하는 혼합 백신 제형에 관한 것이다.

놀랍게도 노로바이러스와 로타바이러스 항원은 많은 다른 혼합 백신의 경우처럼 서로의 면역원성을 차단하지 않는다는 것을 발견했다. 본 발명의 백신은 그 조합에서 개별 항원 간에 방해가 없어서, 본 발명의 혼합 백신은 이 백신에 존재하는 각 항원에 대하여 면역성을 유도해낼 수 있다. 이 조합에 존재하는 단일 성분에 대한 면역 반응이 개별적으로 측정된 그 성분의 면역 반응의 적어도 50%, 바람직하게는 100% 또는 실질적으로 100%인 것이 적당하다. 면역 반응은 본원의 실시예들에 예시된 바와 같이 항체 반응 등에 의해 적당히 측정할 수 있다. 본 발명의 백신 제형은 각 항원 간에 음의 방해가 없을 뿐만 아니라 시너지(synergistic) 효과도 제공한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 노로바이러스 항원은 항원 캡시드 단백질, 펩타이드, 단량체, 이량체, VLP, 또는 이의 임의의 조합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 노로바이러스 항원은 GI 또는 GII 유전자군에 속하고 원하는 유전자형을 가진 노로바이러스에서 유래될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 노로바이러스 항원은 GII-4, GII-12 및 GI-3 VLP로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 유전자형 GII-4는 세계적으로 급성 노로바이러스 위장염의 주요 원인이기 때문에, 본 발명의 백신에 사용하기에 바람직한 노로바이러스 항원은 GII-4 VLP이다. VLP는 1가인 것이 바람직하다.

로타바이러스 VP6은 교차반응성 항-로타바이러스 반응을 유도하는 가장 풍부하고 면역원성인 로타바이러스 단백질인 아군-특이적 항원이다. 본 발명의 백신 제형으로 면역화된 마우스의 로타바이러스-특이적 혈청 항체는 사람을 감염시키는 대부분의 로타바이러스 혈청형의 경우처럼 아군 1 및 2에 속하는 여러 사람, 소 및 유인원(simian) 로타바이러스 균주들에 대하여 교차반응성이었다(도 12).

로타바이러스 VP6, 다량체 형태 또는 임의의 다른 형태의 재조합 VP6(rVP6), 또는 VP6을 함유하는 임의의 로타바이러스 VLP는 본 발명의 백신 제형 중의 로타바이러스 항원으로서 사용될 수 있다. 재조합 바큘로바이러스에서 VP2와 VP6의 공동발현은 이중층 바이러스-유사 입자(dl VP2/VP6 VLP)를 형성시킨다. 이러한 VLP는 본 발명의 백신 제형에 사용하기에 적합한 로타바이러스 항원으로 포함된다. 로타바이러스 항원은 임의의 로타바이러스 균주에서 유래될 수 있지만, 사람 로타바이러스 유래인 것이 바람직하다.

전술한 노로바이러스 및 로타바이러스 항원은 본 발명의 백신 제형에 임의의 바람직한 조합으로 사용될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 백신 제형은 1가 GII-4 노로바이러스 VLP 및 로타바이러스 rVP6 단백질, 바람직하게는 다량체 형을 포함한다. 일부 다른 양태에 따르면, 백신 제형은 1가 GII-4 노로바이러스 VLP 및 로타바이러스, 이중층 VP2/VP6 VLP를 포함한다.

노로바이러스 항원 및 로타바이러스 항원은 천연 급원으로부터 분리 및 정제될 수 있다. 다른 양태에 따르면, 이 항원들은 적당한 발현계, 예컨대 효모 세포(예, 에스. 세레비지에, 에스. 폼베 또는 피치아 파스토리), 세균 세포(예, 이.콜라이), 곤충 세포(예, Sf9 세포) 및 포유동물 세포(예, CHO 세포)를 비롯하여, 이에 국한되지 않는 적당한 발현계에서 재조합 기술로 생산할 수 있다. 각 발현계에 적당한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 백신은 단일 노로바이러스와 로타바이러스 백신을 임의의 비율, 바람직하게는 동량(1:1)으로 배합한 혼합물을 포함할 수 있다. 혼합 백신은 적어도 2가지 방식으로 조제할 수 있다. 첫 번째 방식으로, 노로바이러스 백신과 로타바이러스 백신은 각각 재조합 단백질(VLP, 단량체, 이량체, 삼량체, 구, 소관, 시트 또는 이의 임의의 조합 형태)로 생산하고 시험관내에서 특정 비율로 혼합하여 "칵테일" 백신이라 불리는 액체 제형으로 생산한다. 두 번째 방식으로, 노로바이러스 캡시드와 로타바이러스 VP6의 키메라 단백질은 적당한 발현계(예, 노로바이러스 캡시드 유전자와 로타바이러스 VP6 유전자를 발현하는 재조합 바큘로바이러스)로 원하는 숙주(예, Sf9 곤충 세포)를 공동감염시켜 수득한다. 이러한 백신 제형을 본원에서는 "키메라" 백신이라 부른다.

형별-특이적(동형) 면역 반응 외에, 교차반응성(이형) 면역 반응의 유도는 노로바이러스 및 로타바이러스와 같은 바이러스들이 불확실한 경우 매우 중요하다. 이 바이러스들은 다수의 다른 유전자형/혈청형 및 균주 순환성을 갖고 있다. 이상적인 백신은 이 백신에서 발견되는 바이러스에 동종 및 이종인 다양한 균주들에 대해 반응을 유도한다. 일부 양태에서, GI-3(노로바이러스 유전자군 I에 속함) 및 GII-12(노로바이러스 유전자군 II에 속함) VLP는 백신 제형에 존재하는 GII-4 VLP에 대한 이종 항원으로서 동정되었다. GII-4 특이적 단독 백신 또는 혼합 백신으로 면역화된 마우스는 이종 항원 둘 모두에 대해, 유전자군에 따라 그리고 서로 간에 반응성인 항체를 생성했다. 로타바이러스 VP6 단독 백신 대비 혼합 백신으로 면역화된 마우스의 혈청에서 GI-3에 대한 교차반응성 면역 반응의 약 50% 증가는 백신 제형에 존재하는 로타바이러스 VP6 단백질의 보강 효과를 나타낸다. 환언하면, 본 발명의 혼합 백신의 항원성 성분은 시너지 효과를 제공한다. 실시예들에서 입증되듯이, RV VP6 단백질은 백신 항원에 의해 유도된 면역 반응을 확대하며 혈청의 차단 활성을 증가시킨다는 점에서 보강제로서 작용하는 능력이 있음을 알 수 있다.

교차반응성 반응 외에, 본 발명의 혼합 백신 제형은 강한, 전신성, 장기 지속성(기억성) 및 차단성 IgG 항체 반응과 임의의 면역화 경로(바람직하게는, ID 및 IM 경로)에 의한 노로바이러스 및 로타바이러스에 특이적인 세포 매개 면역을 유도한다. 이 반응들은 감염 후 생기는 단기적이고 형별 특이적인 천연 반응과 대조적이다. 따라서, 국소 점막 반응 대비 전신 면역 반응은 더 긴 방어 기간에 필수적인 것일 수 있다.

위 내강으로 혈청 IgG 항체의 전달은 위 감염에 대한 방어작용의 중요한 기전을 제공하는 것 같다. 본원에 기술된 바와 같이 비경구(ID/IM) 투여된 백신에 의해 유도되는 전신 면역 반응이 클수록, 전달된 항체 수준이 높고 방어작용이 우수하다는 것을 예측할 수 있다.

게다가, 본 발명의 백신 제형은 면역 반응의 균형잡힌 혼합형, 즉 T 헬퍼(Th) 세포형 1과 Th2형 반응을 유도한다. 이것은 이 두 면역 반응 형 모두가 노로바이러스 및/또는 로타바이러스에 의한 감염에 대해 방어작용을 매개할 가능성이 있는 것을 고려해 보면 중요한 관찰이다.

또한, 본 발명의 백신 제형은 실시예들에서 입증되듯이 고 결합활성 항체의 강력한 유도인자이다. 고 결합활성 항체는 백신의 방어 효능에 유의적인 상관성이 있는 것으로 알려졌다.

또한, 본 발명은 본원에 사용된 백신 제형에 의해 유전자군 간의 교차-방어가 달성될 수 있음을 보여준다. 본원에 기술된 GII-4 VLP(소위 1가 백신)처럼 노로바이러스의 특정 균주/유전자형 유래의 VLP를 이용한 면역화는 백신 제형에 포함되지 않은 다른 유전자형(본원에 사용된 GI-3 및 GII-12)에 대하여 교차반응성 또는 이형 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 이종 바이러스 결합을 차단하고 본원에 기술된 바와 같이 이 바이러스를 중화시킬 것이다.

면역 자극을 유도해내는 활성 성분, 즉 노로바이러스 항원 및 로타바이러스 항원 외에, 본 발명의 제형은 멸균, 비독성, 약제학적 허용성 생리학적 담체를 포함할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 백신 제형은 추가로 세균이나 진균 오염을 방지하기 위해 페놀, 2-페녹시에탄올 또는 티메로살과 같은 보존제 및/또는 악조건에 대하여 백신을 안정화시키고 면역원이 바이엘 벽에 부착하지 않도록 하는 수크로오스, 락토오스, 아미노산 또는 젤라틴과 같은 안정제를 함유할 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명의 백신 제형은 유효량의 하나 이상의 보강제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 보강제 물질의 주요 특징 중 하나는 일반적으로 백신 항원에 의해 유도된 면역 반응을 확대하는 것이다. "유효량의 보강제"이란 용어는 투여된 항원에 대하여 면역 반응을 자극할 수 있는 양의 보강제, 즉 예컨대 본원의 실시예들에서 예시된 바와 같이 혈청 중의 차단 항체 활성 및 교차반응성을 통해 측정된 것처럼, 투여된 항원 조성물의 면역 반응을 증가시키는 양을 포함한다. 적당한 유효 증가는 보강제가 없는 동일한 항원 조성물 대비 5% 초과, 바람직하게는 25% 초과, 특히 50% 초과 증가를 포함한다. 백신 제형에 사용하기에 적합한 보강제는 당업자에게 알려져 있다.

본 발명의 백신 제형은 다양한 형태, 예컨대 수용액 및 건조 분말(동결건조 제형)로 제공될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 수용액은 주사, 비측 전달(예, 분무제 또는 비측 점적제) 및 경구 전달로 투여하기에 적합한 형태로 제공될 수 있다.

백신 제형은 당업자라면 쉽게 이해할 수 있는 다양한 경로로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 제형은 비경구 주사제, 예컨대 근육내(IM), 피내(ID) 또는 경피(SC) 주사를 통해 투여하되, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 백신 제형에는 다양한 투여 방식이 적용될 수 있다. 중증 급성 로타바이러스 위장염과 노로바이러스 위장염은 6개월과 3세 사이에 유사한 최고 발병률을 나타내기 때문에, 혼합 노로바이러스와 로타바이러스 백신은 다음과 같은 비제한적인 2가지 방식으로 상기 연령층의 소아를 목표로 할 수 있다:

a) 주사가능한 노로바이러스 + 로타바이러스 백신은 소아의 정기적인 면역화 일정(schedule)의 일부일 수 있다. 이 백신은 2회 용량이면 유아에게 충분할 것이고, 그 다음 이후 추가 용량도 가능할 것으로 생각한다. 핀란드에서의 정기 면역화 일정은 3개월, 5개월 및 12개월째이다. 본 발명의 노로바이러스+로타바이러스 백신은 이러한 면역화 일정에 적합할 것이다. 다른 국가는 다소 다른 일정을 갖고 있지만, 제안된 백신은 다른 프로그램에 쉽게 적용되어, 2개월, 4개월 및 12개월에, 4개월, 6개월 및 12개월 등에 제공될 수 있다;

b) 주사가능한 노로바이러스+로타바이러스 백신은 12개월 내지 15개월째 로타바이러스의 추가 백신접종 및 노로바이러스 1차 백신접종용으로 사용될 수 있다. 2회 용량이 제공될 수 있다. 경구 로타바이러스 생백신이 2개월 내지 6개월째 로타바이러스에 대한 1차 면역화에 계속 사용되어야 한다면 이 방안이 사용될 수도 있을 것이다. 로타바이러스에 대한 면역성은 2년과 3년이 지나면 사라질 것이므로, 많은 경우에 추가 백신접종이 바람직할 것이다. 하지만, 경구 생백신은 추가 백신접종에 사용될 수 없는데, 그 이유는 더 나이 든 시기에는, 즉 정상 추가 백신접종 시에는 장중첩증(intussusception)의 위험이 더 크기 때문이다.

12개월과 15개월 사이의 연령에 2회 용량으로 제공된 주사가능한 노로바이러스+로타바이러스 백신은 로타바이러스에 대한 추가 백신접종 및 노로바이러스에 대한 1차 백신접종용으로 작용할 것이다. 노로바이러스 위장염은 12개월 미만의 유아에게 일정 비율(소량)로 존재하지만, 대부분의 경우 이 연령 이후에 발생하는데, 이 백신은 소아의 노로바이러스 위장염이 발생하는 대부분의 경우를 예방할 수 있는 잠재력이 여전히 있을 것이다.

본 발명의 백신은 본 발명의 백신 제형의 약학적 유효량을 피검자에게 백신접종하여, 노로바이러스와 로타바이러스 감염, 노로바이러스-유도 및 로타바이러스-유도 설사 및 구토 질환뿐 아니라 위장염을 예방 또는 경감시키고, 노로바이러스 및 로타바이러스에 대한 면역 반응을 필요로 하는 피검자의 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 백신의 "약학적 유효량"은 노로바이러스 및 로타바이러스에 대하여 백신 수용체를 방어하는 면역 반응을 유도해낼 수 있는 양이다.

실시예

기술이 진보함에 따라 본 발명의 개념이 다양한 방식으로 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 본 발명과 이의 양태들은 이하에 기술된 실시예에 제한되지 않고 특허청구 범위 내에서 달라질 수 있다.

실시예 1. 노로바이러스 VLP 생산 및 정제

노로바이러스 GII -4 캡시드 유전자의 추출 및 클로닝

노로바이러스 GII-4는 1999년 핀란드에서 환자 대변으로부터 분리했다. 대변의 RNA는 QiaAmp RNA 바이러스 미니 키트(Qiagen, Germany)로 추출했다. 노로바이러스 VP1 캡시드 유전자의 전체 유전자(1620bp)를 함유하는 DNA 단편은 역전사효소 중합효소 사슬 반응(RT-PCR)에서 다음과 같은 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: JV24 순방향(5'-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3'; 서열번호 1)(Buesa et al., 2002) 및 역방향(5'-TTATAATGCACGTCTACGCCC-3'; 서열번호 2). VP1 캡시드 서열의 전체 길이 DNA 카피는 ABI PRISM™ 310 Genetic anaylzer(Applied Biosystems, USA)로 서열분석하여 수득했다. 당해의 노로바이러스 균주는 EMBL/Genbank 및 European Food-borne Viruses in network(FBVE)에 따라 유전자 클러스터로 분류했다(GenBank 서열 데이터베이스 수탁번호 AF080551). 전체 VP1 캡시드 유전자는 다음과 같은 프라이머: GII-4-fwd(5'-CACAGGATCCATGAAGATGGCGTCGAATGAC-3'; 서열번호 3) 및 GII-4-rev(5'-CTCTGAATTCTTATAATGCACGTCTACGCCCCGCTCCA-3'; 서열번호 4)를 가지고 PTC-200 DNA Engine(MJ Research)을 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 단편은 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하고 바큘로바이러스 pFastBac1 전이 벡터(Invitrogen)에 추가 서브클로닝했다. TOP10 화학적 컴피턴트 이.콜라이 세포에 형질전환 후, VP1은 ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)로 서열분석하여 확인했다.

노로바이러스 GII -12 및 GI -3 캡시드 유전자의 추출 및 클로닝

대변 표본은 핀란드에서 노로바이러스 감염된 환자로부터 수집했다. RNA는 전술한 바와 같이 추출했다(Qiagen). 노로바이러스 GII-12 VP1 캡시드 유전자 및 GI-3 VP1 캡시드 유전자는 다음과 같은 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 증폭시켰다:

GII-12-fwd(5'-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3'; 서열번호 5),

GII-12-rev(5'-TTACTGTACTCTTCTGCGCCC-3'; 서열번호 6),

GI-3 fwd(5'-GTAAATGATGATGGCGTCTAA-3'; 서열번호 7) 및

GI-3 rev(5'-TGGGCCATTATGATCTCCTAAT-3'; 서열번호 8).

앰플리콘(1.6Kb)을 서열분석하여 균주를 EMBL/Genbank 및 FBVE(GenBank 서열 데이터베이스 수탁번호 GII-12 AJ277618 및 GI-3 AF414403)에 따라 분류했다. 노로바이러스 VP1 캡시드 유전자(GII-12 및 GI-3)는 코돈-최적화되었다. GII-12는 pFastBacDual 전이 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고 GI-3은 pFastBac1 전이 벡터(Invitrogen)에 클로닝했다.

노로바이러스 캡시드 재조합 바큘로바이러스 ( BV ) 스톡 생산

재조합 백미드(bacmid)를 제조하기 위해, pFastBac 작제물을 Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현계(Invitrogen)로 제조자의 지시에 따라 DH10BacTM 컴피턴트 이.콜라이를 형질전환시켰다. 백미드 DNA는 PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit(Invitrogen)를 사용하여 2ml 밤샘 LB 배양물로부터 정제했다. 재조합 백미드 DNA는 PCR로 분석하여 백미드 내에 유전자의 존재를 입증했다. pUC/M13을 분석하기 위해 순방향 및 역방향 프라이머(Invitrogen)를 사용했다. VLP는 Bac-to-Bac 발현계에 따라 재조합 바큘로바이러스로 감염된 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 곤충 세포에서 생산했다. 더 정확하도록 Sf9 세포를 다중접시 6웰(Nunc, Thermo Fisher, Denmark)에 1x10⁶ 세포/ml(무혈청 배지)(Sf900 SFM III; Invitrogen)로 접종하고 Cellfectin(Invitrogen)을 사용하여 백미드 DNA(1㎍)로 형질감염시켰다. 세포는 26℃에서 증식시키고 형질감염 72시간 후에 수확했다. 세포 현탁액을 500xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액(P1 바큘로바이러스 스톡)을 분취하여 4℃에서 저장했다. Sf9 세포는 바큘로바이러스 P1 스톡으로 감염시키고 감염후 6일 후(dpi) 세포 현탁액을 500xg에서 5분 동안 원심분리하고 분취한 상청액(P2 바큘로바이러스 스톡)을 4℃에 보관했다. P2 스톡의 감염다중도(MOI)로서 나타낸 바큘로바이러스 역가(플라크 형성 단위; pfu)는 BacPak Rapid Titer 키트(Clontech laboratories, USA)로 측정했다.

재조합(r) 노로바이러스 캡시드 발현 및 VLP 생산과 정제

노로바이러스 VLP를 생산하기 위해, 200ml Sf9 세포 배양물을 1x10⁶ 세포/ml의 밀도로 조성했고, 세포를 MOI 1의 P2 스톡으로 감염시켰다. 6일째, 감염된 세포 배양물은 3000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 청징화했다. 상청액 중의 VLP는 100,000xg로 4℃에서 2시간 동안 초원심분리(L8-60M 초원심분리기, Beckman SW-32.1 Ti 로터)로 농축시키고 펠릿은 3ml 0.2M Tris-HCl(pH 7.3)에 재현탁시켰다. VLP는 10% 내지 60% 불연속 수크로오스 구배 위에 부하하고 100,000xg로 4℃에서 1h 동안 초원심분리했다. 분획은 바닥 구멍으로 수집했다. 약 25개 분획을 수집하고 각 분획은 캡시드 단백질의 발현에 대해 SDS-PAGE로 분석했다. 1차 수크로오스 구배 분획의 표시된 분획들의 분석은 캡시드 단백질의 겉보기 피크가 35% 수크로오스로 이동했음을 보여주었고, 이 분획들을 모았다. 또한, GII-4 VLP는 다른 불연속 수크로오스 구배(35% 내지 60%)로 정제했다. VLP를 함유하는 분획을 모아서 저장했다. 수크로오스는 1L의 인산염 완충 식염수(PBS)에 대하여 밤새 투석하여 제거했다. VLP는 한외여과로 농축했다. 간략히 설명하면, 투석 산물 최고 15ml를 Amicon Ultra 30 kDa 원심분리 여과 장치(Millipore Corporation, Germany)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 농축했다. VLP는 PBS에서 4℃에 보관했다. 총 단백질 농도는 Pierce® BCA Protein Assay(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량분석했다. 순도 및 무결성은 12% SDS-PAGE 이후 농도계 분석 및 EM을 사용하여 입증했다.

실시예 2. 로타바이러스 항원

A. 로타바이러스 rVP6 생산 및 정제

로타바이러스 VP6 의 추출 및 클로닝

VP6 유전자 분절의 전체 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해, 강한 G1[P8] RT-PCR 양성 급성 위장염 환자 유래의 10% 대변 현탁액의 RNA를 QIAamp RNA 바이러스 미니 키트(Qiagen)로 제조자의 지시에 따라 추출했다. 추출된 dsRNA는 VP6의 특이적 프라이머 쌍(Matthijnssens et al., 2006)을 이용하는 RT-PCR 반응으로 처리하여 1362bp의 앰플리콘을 생산했다. 이 앰플리콘을 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)로 정제하고 ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)로 서열분석했다. VP6 앰플리콘의 서열을 코돈 최적화하고 pFastBac1 벡터(Invitrogen)에 클로닝했다.

로타바이러스 VP6 재조합 바큘로바이러스 ( BV ) 스톡 생산

이 생산은 본질적으로 노로바이러스에 대해 전술한 바와 같이 수행했다.

로타바이러스 rVP6 생산 및 정제

재조합 VP6을 생산하기 위해, Sf9 곤충 세포 200ml는 세포 농도 1x10⁶ 세포/ml에서 VP6의 유전자를 함유하는 5pfu/세포 MOI의 재조합 바큘로바이러스로 감염시켰다. 배양 상청액은 6dpi에 수집하고 1000rpm으로 +4℃에서 20분 동안 청징화했다. 재조합 단백질은 100,000xg로 +4℃에서 1.5h 동안 초원심분리로 농축하고 펠릿을 0.2M Tris-HCl(pH 7.3)에 재현탁시키고, 연속 수크로오스 구배(10% 내지 60%)에서 100,000xg로 +4℃에서 16h 동안 정제했다. 다른 수크로오스 구배 정제가 적용될 수도 있다. VP6 단백질을 함유하는 수크로오스 분획을 모아서, PBS에 대하여 밤새 투석하고 Amicon Ultra-50 원심분리 여과 단위(Millipore Corporation)에서 원심분리하여 농축시켰다. 단백질은 PBS에서 4℃에 보관했다. 총 단백질 농도는 Pierce® BCA Protein Assay로 정량분석했다. 순도 및 무결성은 12% SDS-PAGE 이후 농도계 분석 및 EM을 사용하여 입증했다.

B. 이중층 ( dl ) 로타바이러스 VP2 / VP6 VLP 생산 및 정제

로타바이러스 VP2 의 추출 및 클로닝

VP2 유전자 분절의 전체 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 동일한 G1[P8] RT-PCR 양성 급성 위장염 환자의 RNA를 QIAamp RNA 바이러스 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 로타바이러스 rVP6 생산 및 정제에 관하여 기술한 바와 같이 추출했다. RT-PCR 반응은 VP2의 특이적 프라이머 쌍(Matthijnssens et al., 2006)으로 수행하여 2662bp의 앰플리콘을 생산했다. 이 앰플리콘은 VP6과 관련하여 사용했던 바와 유사한 방식으로 정제하고 서열분석했다. VP2 앰플리콘의 서열은 코돈 최적화한 뒤, pFastBacDual 벡터(Invitrogen)에 클로닝했다.

로타바이러스 VP2 재조합 바큘로바이러스 ( BV ) 스톡 생산

이 생산은 본질적으로 노로바이러스와 관련하여 전술한 바와 같이 수행했다.

로타바이러스 dl VP2 / VP6 VLP 생산 및 정제

로타바이러스 이중층(dl) VP2/VP6 VLP를 수득하기 위해, Sf9 곤충 세포를 1x10⁶ 세포/ml의 세포 농도에서 동일한 MOI/세포의 VP2 및 VP6 유전자를 함유하는 재조합 BV로 공동감염시켰다. 배양 상청액은 7dpi에 수집하여 1000rpm으로 +4℃에서 20분 동안 청징화했다. 재조합 VL2/6-VLP를 농축하고 재조합 노로바이러스 VLP와 유사하게 연속 수크로오스 구배에서 정제했다. VP2 및 VP6을 함유하는 수크로오스 분획을 모아서, PBS에 대하여 투석하고 Amicon Ultra-100 원심분리 여과 단위(Millipore Corporation)에서 원심분리하여 농축했다. VLP는 PBS에서 4℃에 보관했다. 총 단백질은 Pierce® BCA Protein Assay(Thermo Scientific)를 사용하여 정량분석했다. VP2/6의 순도 및 무결성은 12% SDS-PAGE 및 EM으로 입증했다. VP2/VP6 샘플 중에 VP6의 비율은 농도계 분석으로 정량분석했다.

실시예 3. 키메라성 단백질( GII -4 캡시드 + VP6 ) 생산 및 정제

키메라성 단백질 제조물은 MOI 5의 노로바이러스 GII-4 rBV와 MOI 5의 로타바이러스 VP6 rBV로 Sf9 곤충 세포를 공동감염시켜 생산했다. 공동감염된 곤충 세포의 상청액은 6dpi에 수확했다. 세포 배양물은 3000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 청징화하고 상청액은 100,000xg로 4℃에서 2시간 동안 초원심분리했다. 펠릿은 0.2M Tris-HCl(pH 7.3)에서 재현탁시키고, 키메라 단백질은 연속 수크로오스 구배(10% 내지 60%)를 사용하여 100,000xg로 4℃에서 3시간 동안 원심분리하여 공동정제했다. 두 재조합 단백질(NV 캡시드 및 RV VP6 각각)을 함유하는 분획은 바닥 구멍으로 수집하고 SDS-PAGE로 분석했다. 키메라 단백질을 함유하는 40% 수크로오스 유래의 분획을 모으고, 수크로오스는 PBS에 대하여 투석하여 제거했다. 투석 산물은 Amicon Ultra 30kDa 원심분리기 여과 장치로 농축시켰다. 산물은 PBS에서 4℃에 보관했다. 총 단백질 농도는 Pierce® BCA Protein Assay(Thermo Scientific)를 사용하여 정량분석했다. 각 단백질의 순도 및 무결성은 12% SDS-PAGE 후 농도계 분석 및 EM을 사용하여 입증했다.

실시예 4. 노로바이러스 및 로타바이러스 VLP 의 특성화

SDS - PAGE 및 농도계 정량분석

샘플은 분리 겔에 12% 아크릴아미드를 갖고 적층 겔에 5% 아크릴아미드를 갖는 폴리아크릴아미드 겔(Biorad Laboratories, USA)을 사용하는 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)으로 진행시켰다. 샘플은 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 62mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% 글리세롤 및 0.01% 브로모페놀 블루(Biorad)를 함유하는 램리 샘플 완충액에서 5분 동안 비등처리했다. 겔은 PageBlueTM Protein Staining Solution(Fermentas, Lithuania)으로 염색했다.

SDS-PAGE 겔에서 진행된 단백질은 AlphaEase® FC Software(Alpha Innotech, USA)로 제조자의 지시에 따라 정량분석했다.

도 1a는 화살표머리로 표시된 예상 분자량을 가진 동정된 단백질이 있는 page 청염색된 겔 사진이다. GII-4 캡시드와 로타바이러스 VP6의 키메라 단백질은 수크로오스 구배의 동일 분획에서 검출되었다. 도 1a는 SDS-PAGE에서 정제된 단백질을 보여준다.

전자 현미경법( EM )

제조물은 3% 우라닐 아세테이트(UA)(pH4.6)로 음성염색했다. 단백질 샘플 3㎕를 탄소 코팅된 그리드(grid)에 30초 동안 적용했다. 그리드를 건조시키고 이 그리드에 UA 3㎕를 추가 30초 동안 적용했다. 과량의 액체는 제거하고, 그리드는 FEI Tecnai F12 전자 현미경(Philips Electron Optics, Holland)을 120kV로 작동시켜 조사했다.

각 단백질은 EM 하에 형태(도 1b)에 대해 조사하고, 고차 구조, 예컨대 GII-4 VLP, rVP6 소관 및 dl VP2/VP6 VLP를 확인했다. rVP6의 소관은 보이지만, rVP6 단백질의 임의의 형태는 삼량체 및 이보다 고차원의 다량체 구조, 예컨대 구 및 시트 등(이에 국한되지 않는다)으로 어셈블리될 수 있다. 1:1 비율의 칵테일로 GII-4 VLP와 rVP6의 혼합은 칵테일 내에서 어느 하나의 형태 또는 단백질 무결성에 손상을 입히지 않았다. 칵테일 백신 및 키메라 백신에서는 유사한 형태학적 특징이 검출되어, rVP6 소관이 GII-4 VLP로 채워져 있는 것을 알 수 있었다. NV 캡시드 및 RV VP6의 다른 구조도 형성될 수 있다.

실시예 5. 마우스 면역화

7주 내지 9주령의 암컷 BALB/c 마우스(4 내지 5마리 마우스/군)를 다른 백신으로 2회, 즉 0주째와 3주째에 피내(ID) 또는 근육내(IM)로 면역화시켰다. 일부 경우에 마우스는 백신 면역화를 1회만 수행하기도 했다. 면역화에 사용된 백신은 다음과 같다: GII-4 VLP, rVP6 단백질, dl VP2/VP6 VLP, 칵테일(GII-4 VLP와 rVP6의 혼합물), 키메라 백신 및 칵테일 VLP(GII-4 VLP와 dl VP2/VP6 VLP의 혼합물). 사용된 백신 용량은 다음과 같다: 50㎍, 10㎍, 1㎍ 및 0.1㎍. 대부분의 경우에, 마우스는 단독 백신 제형 10㎍ 또는 혼합 백신(칵테일 또는 키메라) 20㎍으로 면역화되었다. 칵테일 백신은 각 단독 백신 성분 10㎍을 함유한다. 예컨대, 칵테일 백신을 수득하기 위해 PBS 중의 GII-4 VLP 10㎍을 PBS 중의 rVP6 10㎍과 시험관내에서 혼합하고 +4℃에 보관했다. 혈액(혈청) 샘플과 대변을 0주째(채혈 전, 무면역 혈청), 2주째, 3주째 및 4주째에 수집했다. 마우스는 최종 면역화 2주 후에 안락사시키고, 대변, 전혈액 및 림프구 조직을 수집했다. 백신 제형을 투여하지 않은 순수 마우스는 대조군으로 사용했다.

실시예 6. 백신에 의해 유도된 면역반응의 기간, 용량 반응 및 동역학

마우스 군(5 마우스/군)들을 IM 및 ID 경로로 0일과 21일째 GII-4 VLP 10㎍, 1㎍ 또는 0.1㎍으로 면역화했다. 혈청은 0주, 2주, 3주 및 4주째 수집하고 5주째 종결했다. 각 종결 혈청은 1:200 희석율에서 NV-특이적 IgG에 대해 시험했다. 10㎍ 및 1㎍ 용량에 의해 유도된 반응의 수준은 유사하나, 0.1㎍ 용량에 의한 반응은 다소 낮은 반응이 관찰되었다(도 2). 또한, 상기 마우스 군에서 수집된 혈청의 종점 역가는 유사했다(도 3). 대조군인 순수 마우스는 NV에 어떠한 반응도 나타내지 않았다. 도 4는 매주 수집한 혈청에서 측정된 면역반응의 동역학을 도시한 것이다. 면역화 시점은 화살표로 표시했다. 결과는 1회 용량에 의한 면역화가, 특히 10㎍ 및 1㎍ 용량에서 매우 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다. 50㎍ 용량은 10㎍ 용량과 유사한 반응을 유도했고, 이는 10㎍ 용량이 반응의 정체기인 것으로 측정되었다. 이를 종합해보면, 이 결과들은 다른 용량의 백신 제형이 사용될 수는 있지만, 최적 용량은 10㎍ 및 1㎍ 용량임을 확인시켜준다. 또한, 10㎍ 용량은 25주까지 사라지지 않는 장기 지속적인 면역 반응을 유도했다(도 5).

실시예 7. 대변 분석

IgG의 혈청에서 위 내강으로의 전이는 NV 및 RV와 같은 장 병원균에 대한 방어작용과 연관이 있는 것이었다. RV 감염에 대하여 방어를 매개하거나 질병을 완화시키는 장에 존재하는 IgG의 능력은 아동의 수동 면역글로불린 치료에 의해 입증되었다.

IgG의 가능한 전이에 미치는 단독 백신 제형 또는 혼합 백신의 효과를 시험하기 위해, 새로운 마우스 대변을 100mM NaCl, 1mM CaCl₂, 0.05% Tween, 1% 아프로티닌 및 10μM 류펩틴(모두 시그마-알드리치 제품)을 함유하는 10mM Tris 완충액에 현탁시켜 볼텍싱에 의해 균질화된 10% 대변 현탁액으로 다시 시작했다. 균질화된 현탁액을 얼음 위에서 20분 동안 방치하고 18,000xg로 +4℃에서 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 추출하여 -80℃에 보관했다.

대변 샘플은 일부 변형이 있는 혈청 항체 ELISA에 대해 기술된 바와 같은 ELISA에서 노로바이러스 GII-4 및 로타바이러스 VP6 특이적 IgG에 대해 시험했다. 코팅 및 차단 후, 대변 샘플(10% 대변 현탁액)은 1:2부터 1:32까지 2배씩 연속 희석하고 평판에 첨가했다. 염소 항마우스 IgG-HRP(Sigma-Aldrich)는 1:3000배로 희석하고, 평판을 발색시킨 뒤, 흡광도는 전술한 바와 같이 측정했다.

도 8은 면역화된 마우스의 대변에서 유의적인 수준의 NV-특이적 IgG가 검출되나, 대조군 마우스의 대변에서는 검출되지 않았음을 보여준다.

실시예 8. 혈청 분석

각 단독 백신 제형 또는 혼합 백신으로 전술한 바와 같이 마우스 군을 면역화했다. IgG 아형 IgG1 및 IgG2a는 면역화된 마우스의 혈청으로부터 측정하여 백신 제형에 의해 유도된 면역 반응의 유형을 결정지을 수 있었다. T 헬퍼(Th)1 및 Th2 이분법과 주요 면역글로불린 아이소타입 간의 관계를 측정했다: IgG1은 Th2형 반응으로 분류되고 IgG2a는 Th1형 반응으로 분류된다. Th1형은 세포 매개 면역을 촉진하고 Th2형은 체액 면역을 촉진한다.

노로바이러스 혈청 IgG 및 IgG 아형 ELISA

면역화된 마우스 및 대조군 마우스 유래의 혈청을 효소면역분석법(ELISA)으로 면역글로불린 G(IgG), IgG1 및 IgG2a에 대해 시험했다. 96웰 미량역가 평판(Nunc Immuno Maxisorp, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 코팅(4℃, 밤새)하기 위해, 노로바이러스 GII-4, GII-12 및 GI-3 VLP를 10mM PBS에서 각각 0.2㎍/ml, 0.4㎍/ml 및 1㎍/ml(100㎕/웰)의 농도로 사용했다. 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS(PBS-T)로 3회 세척한 후, 평판을 5% 탈지분유(Sigma-Aldrich)를 함유한 PBS로 실온(RT)에서 1h 동안 차단시켰다. 그 다음, 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 1% 탈지분유를 함유하는 PBS-T에서 1:200 또는 2배 연속 희석물로 희석된 혈청 100㎕와 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 모든 혈청 샘플은 2반복 웰에서 시험했다. 6회 세척 후, 웰에 PBS-T 중의 1% 밀크로 1:4000배 희석한 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 항마우스 IgG(Sigma-Aldrich)을 첨가했다.

항-GII-4 IgG 아형 반응은 PBS-T 중의 1% 밀크로 1:6000배로 희석된 염소 항-마우스 IgG1 또는 IgG2a HRP 접합체(Invitrogen, Carlsbad, California)를 사용하여 측정했다. 항온처리(1h, 37℃) 후 평판은 세척하고, o-페닐렌디아민 이염화물(SIGMAFAST OPD, Sigma-Aldrich) 기질을 0.4mg/ml 농도로 첨가했다. 평판을 암실에서 RT 하에 30분 동안 항온처리하고 반응을 2M 황산(H2SO4)으로 정지시켰다. 490nm 파장에서의 흡광도(광학 밀도, OD)는 미량평판 판독기(Victor2 1420, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 측정했다. 순수 마우스의 공지된 양성 혈청 샘플 및 음성 혈청 샘플을 각각 하나씩 대조군으로 모든 평판에 첨가했다. 블랭크 웰(혈청이 없는 웰)의 배경 신호는 한 평판의 모든 OD 판독값으로부터 감했다. 순수 흡광도 값이 다음과 같이 계산된 세트 컷오프 값 이상이면 샘플은 양성으로 간주했다: 평균 OD(순수 마우스) + 3xSD 및 최소 0.100 OD.

로타바이러스 혈청 IgG 및 IgG 아형 ELISA

VP6 단백질은 중탄산염/탄산염 완충액(0.1mM Na2CO3, 0.8mM NaHCO3, pH9.55)에 1㎍/ml(100㎕/웰)의 농도로 하여 96웰 미량역가 평판을 코팅하는데 사용했다. 상기 단계 후, ELISA는 노로바이러스의 ELISA와 유사하게 수행했다. 교차반응성 로타-특이적 혈청 항체를 검출하기 위해, 폴리클로널 토끼 항-로타바이러스(사람)(DAKO)를 중탄산염/탄산염 완충액으로 1:200으로 희석하고 미량역가 평판을 코팅하기 위해(+4℃, 밤새) 100㎕/웰를 사용했다. PBS-T로 4회 세척한 후, 평판을 전술한 바와 같이 제조된 로타바이러스 항원(4℃ 밤새) 100㎕/웰로 코팅했다. PBS-T로 4회 세척한 후, 평판을 5% 탈지분유를 함유하는 PBS로 1h 동안 +37℃에서 차단시켰다. 이 단계 후 ELISA는 노로바이러스의 혈청 ELISA와 유사하게 수행했다.

혈청 IgG 매그니튜드 ( magnitude ) 및 아형

도 6과 7은 각각 노로바이러스 및 로타바이러스 특이적 혈청 IgG 적정을 도시한 것이다. 종점 역가는 대조군 마우스를 제외한 면역화된 마우스의 각 군에서 인식가능할 정도로 높았다(레시프로칼 역수(reciprocal titer) >4 내지 5 log10). 이러한 결과는 혼합 백신의 성분들이 특이적 면역 반응을 상호 저해 또는 억제하지 않는다는 것을 보여준다.

도 9와 10은 본 발명의 모든 백신 제형이 균형잡힌 혼합형 면역반응, 즉 Th1형 및 Th2형을 유도한다는 것을 보여준다. 이는 면역 반응의 두 형이 NV 및/또는 RV 감염에 대한 방어를 매개할 가능성이 있음을 생각해 볼 때, 중요한 관찰이다. Th 세포는 B 세포에 도움을 주고(세포-대-세포 접촉에 의해 또는 가용성 사이토킨으로), 특히 일반적으로 백신에 의해 유도되도록 목표화된 장기 기억 반응에 필요한 기억 B 세포로의 분화에 도움을 준다. RV VP6-특이적 Th 세포는 쥐의 로타바이러스 감염에 대해 방어를 유도하고 RV의 이형 VP4 또는 VP7 분자 상의 에피토프를 중화시키는데 특이적인 B 세포에 동족 도움을 준다(Esquivel FR, Arch. Virology 2000; Peralta et al., Virology Journal, 2009). 따라서, Th 세포는 이형 면역 반응 유도에 중요하다.

실시예 9. 면역 반응의 결합활성

항체 결합활성은 기능성 항체 성숙 또는 친화력 성숙의 척도이다. 고 결합활성 항체는 백신의 방어 효능에 유의적인 상관성이 있는 것으로 밝혀져 있다(Makidon et al., 2008). 우리는 혈액에 고 결합활성 NV-특이적 IgG 항체가 있는 나이가 더 많은 아동이 저 친화력 항체를 가진 2세 미만의 아동보다 NV 감염이 적다는 것을 이미 밝힌 바 있다(Nurminen et al., 2010).

NV 및 RV 항체의 결합활성을 측정하기 위해, 우레아 용출을 사용하여 저 결합활성 항체를 제거했다[Kanno and Kazuyama, 2002]. ELISA 분석은 추가 우레아 항온처리 단계를 제외하고는 전술한 바와 같이 수행했다. 항원(노로바이러스 GII-4 VLP 또는 로타바이러스 VP6 단백질) 코팅된 평판에서 혈청을 항온처리한 후, 혈청을 평판에서 흡인제거하고 8M 우레아(Sigma-Aldrich) 함유 PBS-T를 첨가했다. 항온처리 5분 후, 상기 처리를 반복했다. 평판을 4회 세척한 후, HRP-접합된 항-마우스 IgG를 첨가하고 평판을 전술한 바와 같이 발색시켰다. 결합활성 지수는 [우레아 존재하의 OD/우레아 부재하의 OD] x 100%로 계산했고, >50% 지수값은 고 결합활성으로 간주했다.

단독 백신 또는 혼합 백신으로 면역화하는 것은 높은 결합활성(각각 >50% 결합활성 지수)의 NV-특이적 및 RV-특이적 IgG 항체를 유도했다. 이 결과는 본 발명의 백신 제형이 방어 특성이 있는 고 결합활성 항체의 강력한 유도인자임을 보여준다(도 11).

실시예 10. 교차반응성 면역 반응

다른 혈청형(G1P8, G2P6, G4P6, G8P10, G12P4, BRV 및 RRV)의 로타바이러스를 태아 리서스 원숭이 신장(MA104) 세포(MA104)에서 배양하여, 교차반응성 연구를 위한 ELISA의 항원으로 사용하기 위해 준비했다.

면역화된 마우스 및 대조군 마우스 유래의 혈청을 실시예 8에 기술된 바와 같은 ELISA에서 노로바이러스 및 로타바이러스 항체에 대해 시험했다. 노로바이러스 GII-4-유도된 혈청 항체는 이종 GI-3 및 GII-12 항원에 대하여 교차반응성이었다(도 12, 상단 도면). 게다가, 백신 제형으로 면역화된 마우스의 로타바이러스-특이적 혈청 항체는 아군 1 및 2에 속하는 여러 사람, 소 및 유인원(simian) 로타바이러스 균주에 대하여 교차반응성이었다(도 12, 하단 도면).

놀랍게도, 로타바이러스 VP6 항원은 로타바이러스 VP6 단독 백신에 비해 혼합 백신으로 면역화된 마우스의 혈청에서 GI-3에 대한 교차반응성 면역 반응에서 대략 50% 증가를 초래했다(도 12, 상단 도면). 이 결과는 본 발명의 혼합 백신의 항원 성분이 시너지 효과를 제공한다는 것을 보여준다.

실시예 11. 차단 분석( blocking assay )

차단 분석은 NV의 대체 중화 분석(neutralization assay)이다. NV는 시험관내 세포 배양물에서 증식할 수 없고, 이에 따라 바이러스가 결합하여 허용 세포를 감염시키는 것을 차단하는 항체를 이용한 고전적 의미의 중화 분석은 수행하는 것이 불가능하다. 사람 조직-혈액 군 항원(HBGA)은 최근에 무엇보다 점막 표면의 세포(예, 장세포)에서 발현된 NV의 수용체로서 발견되었다. 예를 들어, 탄수화물 H형 3은 NV GII-4의 추정상의 수용체로서 동정되었고, 이에 따라 GII-4 VLP는 상기 탄수화물에 결합한다(L Huhti et al., 2010). 상기 수용체에 대한 NV VLP의 결합은 중화 성질이 있는 항체에 의해 차단될 것으로 예상된다. 사실상, H형 3에 대한 GII-4 VLP의 결합은 수인성 급성 위장염 발생 동안 NV에 의해 감염되지 않은 아동들의 혈청에 의해 차단될 수 있었다(K Nurminen et al., 2010). NV 감염에 대한 방어는 혈청의 강한 차단 활성과 상관성이 있었다. 따라서, 항체의 차단 활성은 여러 백신 시도들을 고려할 때 NV 방어의 적절한 대체 마커일 수 있다.

HBGA H형 3에 대한 NV VLP의 결합을 차단하는 분석은 면역화된 마우스 혈청과 대조군 마우스 혈청을 가지고 수행했다. 미량역가 평판에 PBS(pH 7.2) 중의 GII-4 또는 GI-3 VLP를 2㎍/ml 농도로 코팅하고 RT에서 4시간 동안 항온처리했다. 세척 후, 평판을 5% 밀크 함유 PBS로 4℃에서 밤새 항온처리했다. 웰에 1:200부터 1:6400까지 연속 희석한 혈청을 첨가하고 평판을 37℃에서 1h 동안 항온처리했다. 혈청을 흡인제거한 후, 대조군으로서 비오틴화된 H형 3 또는 루이스 B(Leu^b)(Lectinity Holdings, Inc., Moscow, Russia) 100㎕를 1% 밀크를 함유하는 PBS-T에서 20㎍/ml 또는 40㎍/ml 농도로 첨가했다. 37℃에서 4h 후 웰을 세척하고, 스트렙타비딘-접합된 HRP(Thermo Fisher Scientific Inc.) 1:2000 희석물을 첨가하고 37℃에서 1h 동안 항온처리했다. 발색 반응 및 490nm 파장에서 흡광도의 측정은 전술한 바와 같이 수행했다. 혈청 없이 배양된 웰의 OD 판독값은 GII-4 VLP에 대한 H형 3의 결합 중 최대 신호라고 생각되었다. 차단 지수는 다음과 같이 계산했다: 100% - (OD[혈청 존재]/OD[혈청 부재] x 100%). 음성 대조군 Leu^b HBGA에 대한 VLP의 결합은 전혀 검출되지 않았다. 블랭크 웰(HBGA가 없는 웰)의 배경 신호는 시험된 모든 샘플의 OD값에서 감했다.

도 13a 및 13b는 각각 추정상의 수용체 H형 3에 대한 GII-4 및 GI-3 결합의 차단성을 도시한 것이다. 혼합 백신에 비해 단독 백신에 의해 면역화된 마우스는 H형 3에 대한 GII-4 VLP의 결합을 최대한 차단하는데 2배 이상 큰 역가를 필요로 했다(도 13c). 이 결과는 혼합 백신에서 rVP6 단백질이 GII-4 특이적 혈청의 차단 활성을 억제하거나 방해하지 않는다는 것을 보여준다. 이에 반해, 혼합 백신 제형으로 면역화된 마우스 혈청의 놀라운 차단 활성은 이전 실험에서 검출된 것과 유사한 rVP6 단백질의 보강 효과를 시사한다. 게다가, 우리의 데이터는 유전자군 간의 교차-방어가 우리의 연구에 사용된 백신 제형들에서 쉽게 검출된다는 것을 보여준다. 이러한 종류의 관찰은 노로바이러스 백신 연구 분야에서는 매우 특이한 것이다. 또한, 이 결과들은 바이러스의 한 균주/유전자형(소위 1가 백신)이 전술한 바와 같은 백신 제형에 포함되지 않은 다른 균주에 대하여 교차반응성 또는 이형 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 이종 바이러스 결합을 차단하고 중화시킬 것이라는 것도 보여준다.

실시예 12. 항체 분비 세포( ASC ) ELISPOT

항체 분비 세포(ASC)는 병원균에 대한 장기 방어작용에 역할을 하고(기억 반응) 임의의 백신접종에 의해 유도되는 것을 목표로 한 기억 반응의 특징인 재노출 후 병원균에 빠르게 반응할 기억 B 세포와 혈장 B 세포로 분류된다. ELISPOT 분석을 사용하여 면역화된 마우스의 비장에 존재하는 IgG 항체 분비성 혈장 세포 및 기억 B 세포의 빈도를 조사했다.

안락사된 마우스의 비장을 행크스 평형염 용액(HBSS)(Sigma-Aldrich)에 수집했다. 비장의 구조는 메스로 깨뜨리고 70㎛ 세포 스트레이너(strainer)(Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용하여 단세포 현탁액으로 해리시켰다. 현탁액을 300xg로 10분간 원심분리하고, 세포를 HBSS에 재현탁시켰다. 적혈구 세포를 1:10 희석 HBSS로 용해시키고, 그 후 현탁액의 몰농도를 2xHBSS로 회복시켰다. 비장세포 현탁액은 3회 세척하고, 동결 매질(40% FBS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI, Sigma-Aldrich)에서 동결시키고, 향후 사용을 위해 액체 질소에 보관했다.

96웰 PVDF 평판(Millipore)을 40㎍/ml 농도의 노로바이러스 GII-4 VLP 또는 로타바이러스 VP6 단백질 100㎕/웰 부피로 +4℃에서 밤새 코팅했다. 비장세포는 액체 질소로부터 해동시키고 세척하고, 세포 배양 배지(10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 50μM 2-머캅토에탄올 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640)에 현탁시켰다. 평판을 세척 및 차단한 후, 비장세포는 4x10⁵ 세포/웰 농도로 첨가하고 +37℃, 5% CO₂ 하에 밤새 항온처리했다. 평판을 PBS-T로 6회 세척하고, 웰에 1:1000 희석율의 염소 항마우스 IgG-HRP(Sigma-Aldrich)를 첨가했다. RT에서 3시간 항온처리한 후, 평판을 강력하게 세척하고 DAB 기질(SigmaFAST DAB, Sigma-Aldrich)로 발색시키고, 반점을 계수했다. 순수 대조군 동물 유래의 웰에서 나타나는 반점은 실험군의 반점에서 감했다. 이 데이터는 GII-4 VLP 또는 VP6 특이적 항체-분비 세포(ACS)로 나타냈고, 1x10⁶ 세포당 표준화된 것이다.

일부 경우에, 세포는 4일 동안 GII-4 VLP 또는 rVP6과 시험관내에서 항온처리했고, 기억 B 세포 정량에 관해 설명했던 것과 같이 세척하고 평판배양했다. 시험관내 자극이 없는 세포에 의해 수행된 ELISPOT 분석에서 수득된 반점은 능동 분비성 혈장 세포인 것으로 추정되었다. 혈장 세포에 의해 발생된 반점을 감한 후 4일 배양된 세포에서 수득된 반점은 기억 B 세포 활성을 나타낸다.

도 14는 본 발명의 백신 제형이 NV 및 RV 특이적 IgG 항체를 생산하는 혈장 B 세포를 유도한다는 것을 보여준다. 또한, 특이적 IgG 항체를 분비하는 기억 B 세포의 고 빈도는 단독 백신 및 혼합 백신에 의해 유사한 양으로 유도되었고, 이는 유도된 반응이 기억 반응이라는 것을 보여준다.

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Claims

적어도 하나의 노로바이러스 VLP 항원과 적어도 하나의 로타바이러스 VP6 항원을 포함하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 항원성 캡시드 펩타이드와 항원성 캡시드 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 노로바이러스 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 노로바이러스 항원이 GI 및 GII 노로바이러스 및 이의 유전자형들(genotypes)로 이루어진 그룹에서 유래하는 것인 백신 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노로바이러스 항원이 GII-4 VLP인 백신 조성물.
제 4 항에 있어서, GII-4 VLP가 1가인 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 노로바이러스 항원은 1종보다 많은 VLP형을 포함하는 것인 백신 조성물.
제 1 항에 있어서, 로타바이러스 VP6 항원이 rVP6 단백질, 이중층 VP2/VP6 VLP, VP6 단백질을 포함하는 VLP, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 백신 조성물.
제 7 항에 있어서, rVP6이 소관, 구, 시트 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 다량체 형태인 백신 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균된 비독성 약학적 허용성 생리학적 담체를 추가로 포함하는 백신 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 노로바이러스 및 로타바이러스 감염, 바이러스-유도성 설사 및 구토 질환 및 위장염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환을 예방하는데 사용하기 위한 백신 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,
적어도 하나의 노로바이러스 VLP 및 적어도 하나의 로타바이러스 VP6 항원을 단일 숙주에서 공동발현시키는 단계를 포함하거나, 또는
a) 적어도 하나의 노로바이러스 VLP 항원을 생산, 분리 및 정제하는 단계;
b) 적어도 하나의 로타바이러스 VP6 항원을 생산, 분리 및 정제하는 단계; 및
c) 상기 노로바이러스 항원과 로타바이러스 항원을 혼합하는 단계를 포함하는, 백신 조성물을 제조하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 항원들은 재조합 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포 숙주에서 생산된 것인, 백신 조성물을 제조하는 방법.