KR100665054B1 - 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스유사입자 및 그 제조 방법 - Google Patents

유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스유사입자 및 그 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100665054B1
KR100665054B1 KR1020040083994A KR20040083994A KR100665054B1 KR 100665054 B1 KR100665054 B1 KR 100665054B1 KR 1020040083994 A KR1020040083994 A KR 1020040083994A KR 20040083994 A KR20040083994 A KR 20040083994A KR 100665054 B1 KR100665054 B1 KR 100665054B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
gene
swine
recombinant
particle
Prior art date
Application number
KR1020040083994A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060034945A (ko
Inventor
최강석
고영준
나진주
조남인
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020040083994A priority Critical patent/KR100665054B1/ko
Priority to PCT/KR2005/003274 priority patent/WO2006080682A1/en
Priority to EP05856432.9A priority patent/EP1802759B1/en
Priority to CN2005800354452A priority patent/CN101065489B/zh
Publication of KR20060034945A publication Critical patent/KR20060034945A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100665054B1 publication Critical patent/KR100665054B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32323—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스 유사입자(Swine Vesicular Disease Virus-Like Particle) 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 수포병 바이러스 전체 유전자 중에서 구조단백질 전구체(P1) 유전자 및 3CD 프로테아제(protease) 유전자를 베큘로 바이러스 발현벡터에 동시 삽입하여 곤충세포에서 발현함으로써, 발현된 3CD 프로테아제 효소가 구조단백질 전구체를 개별적인 단백질로 절단하여 개별단백질들이 자체적인 조립과정을 통해서 돼지 수포병 바이러스의 캡시드(capsid)를 형성하는 것을 특징으로 하는 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합, 돼지 수포병 바이러스 유사입자, 진단용 항원, 백신개발, 구조단백질 전구체, 3CD 프로테아제

Description

유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스 유사입자 및 그 제조 방법{Construct of swine vesicular disease virus like particle using genetic engineering and the method for manufacturing thereof}
도 1은 돼지 수포병 바이러스의 구조단백질 전구체(P1) 및 3CD 유전자를 동시에 삽입한 베큘로 바이러스 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 돼지 수포병 바이러스 유사입자 제작 전략을 보여주는 모식도이다.
도 3은 유전자 재조합 베큘로 바이러스에서 발현된 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 전자현미경 사진이다.
도 4는 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 분석한 결과이다.
레인 1. 단백질 마커
레인 2. 기니아피그 항혈청에 대한 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 반응성
레인 3. 기니아피그 항혈청에 대한 불활성화 돼지 수포병 바이러스의 반응성
레인 4. 돼지항혈청에 대한 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 반응성
레인 5. 돼지항혈청에 대한 불활성화 돼지 수포병 바이러스의 반응성
본 발명은 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스 유사입자(Swine Vesicular Disease Virus-Like Particle) 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 수포병 바이러스 전체 유전자 중에서 구조단백질 전구체(P1) 유전자 및 3CD 프로테아제(protease) 유전자를 베큘로 바이러스 발현벡터에 동시 삽입하여 곤충세포에서 발현함으로써, 발현된 3CD 프로테아제 효소가 구조단백질 전구체를 개별적인 단백질로 절단하여 개별단백질들이 자체적인 조립과정을 통해서 돼지 수포병 바이러스의 캡시드(capsid)를 형성하는 것을 특징으로 하는 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 제조 방법에 관한 것이다.
돼지 수포병(Swine Vesicular Disease)은 돼지에서 발생하는 전염병으로서 돼지의 코, 발굽, 혀, 입술 등에 수포가 생기는 것을 특징으로 하는 질병이다. 잠복기는 2-7일이며, 체온이 급격히 상승하여 며칠동안 다리를 절고, 식욕이 저하되다가 2-3주 후에는 대개 회복기에 접어든다. 돼지 수포병은 구제역과 임상증상이 유사하여 육안으로 감별이 어렵기 때문에 국제수역사무국(OIE)에서는 A등급 질병으로 분류하고 있다.
1966년에 이태리에서 처음 알려졌을 때에는 '돼지 엔테로바이러스 감염'으로 인식되었다가 돼지 수포병으로 명명되어진 것은 1972년 영국에서 발생한 이후이다. 돼지 수포병의 병인체는 돼지 수포병 바이러스이며, 이 바이러스는 사람의 콕사키바이러스(Coxsackievirus) B5가 돼지에 감염되어 나타난 변형으로 알려져 있다. 미 생물학 분류상 피코르나바이러스과('Picornaviridae' family)의 '엔테로바이러스'속 ('Enterovirus' genus)에 속하고 한 가지 혈청형만이 존재한다. 돼지 수포병 바이러스는 약 7,400개의 염기로 구성된 (+) 단쇄 RNA 바이러스로서, 구제역바이러스와는 달리 주변환경에 매우 안정하여 pH 2.5-12에서는 영향을 받지 않는다.
돼지 수포병 바이러스는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 구성하는 네 개의 주요한 구조단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 가지고 있으며, 감염세포 내에서 주로 발현되어 바이러스 증식에 보조적인 기능들을 수행하는 것으로 알려진 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D와 같은 비구조 단백질도 가지고 있다.
돼지 수포병 바이러스 항체를 검출하는 방법으로는 바이러스 중화시험이 표준검사법으로 공인되어 있으나, 이 방법은 검사기간이 2-3일 정도 소요되고 세포배양 시설을 요구하는 등의 단점 때문에 대량의 시료를 검사하기에는 부적합하였다. 이를 극복하기 위한 대안으로서 효소결합면역측정법이 개발되었다[Journal of Virological Methods, (1995) 52: 155-167]. 그러나, 현재 전 세계적으로 돼지 수포병 바이러스 항체검출법에서 이용되는 효소결합면역측정법에서는 불활성화 돼지 수포병 바이러스를 진단항원으로 사용하고 있다. 이 경우, 진단항원을 제조하는 단계에서 세포배양으로 생바이러스를 증식시켜야 하므로 실험실 사고(병원체 유출 등)를 차단하기 위하여 특수 차폐실험실을 이용하여야 한다. 또한 바이러스를 불활성화시키는 과정에서 바이너리 에틸렌이민(binary ethyleneimine)과 같은 발암물질을 사용하기 때문에 취급자에 대한 위해 요소가 잠재하고 있어서 이는 매우 번거롭고도 위험한 작업이 아닐 수 없다.
따라서, 상기 문제들을 극복하기 위한 대안으로서 유전자 재조합 항원을 개발하여 불활성화 바이러스 항원을 대체하고자 하는 연구가 전 세계적으로 진행중이나, 아직까지는 기존의 불활성화 돼지 수포병 바이러스 항원을 대체할 만한 수준의 재조합 단백질 항원을 제작하지 못한 실정이다.
일례로, 구조단백질 전구체(P1)를 대장균에서 발현하여 진단항원으로 적용하고자 시도한 예가 있다 [Virus Research (1998) 57: 163-170]. 그러나, 돼지 수포병 바이러스는 정이십면체형(icosahedral) 구조를 가지고, 구조단백질을 이루는 4가지 단백질(VP1, VP2, VP3 및 VP4)이 각각 60개씩 서로 맞물리는 형태의 구조를 형성하고 있기 때문에 대부분의 항원부위가 입체적 형태를 띠는 반면에, 상기 대장균 발현 P1 재조합 단백질의 경우에는 개별적인 구조단백질이 절단된 형태가 아닌 전구체의 형태로 발현되어 구조적으로 온전한 바이러스의 항원부위를 유지할 수 없었다. 이를 입증하는 결과로서, 상기 P1 전구체로 면역한 돼지의 혈청에서 바이러스 중화항체가 검출되지 않았다.
지금까지 본 발명에서 이루고자 하는 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 제작은 돼지 수포병 바이러스에서 시도된 바가 없다. 다만, 미생물학적 분류상 돼지 수포병 바이러스가 속한 엔테로바이러스속의 폴리오바이러스, 엔테로바이러스71 등 일부 바이러스에서 연구가 진행되어 왔으며, 폴리오바이러스의 전체유전자(구조단백질과 비구조 단백질을 포함한 6.6kb)를 삽입한 재조합 베큘로 바이러스 [Journal of General Virology (1989) 70: 1453-1463], 구조단백질들인 VP0(VP4+VP2), VP3 및 VP1 코딩유전자들을 각각 삽입한 3개의 재조합 베큘로 바이러스들[Virology (1993) 192: 512-524], 또는 엔테로바이러스 71의 P1 및 3CD 코딩 유전자를 삽입한 각각의 재조합 베큘로 바이러스들 [Biotechnology Letters (2003) 25: 919-925]을 곤충세포에 동시 감염시켜 바이러스 유사입자를 생산하였다.
그러나, 상기 엔테로바이러스들의 바이러스 유사입자 제작 사례들을 심층 분석한 결과, 전체유전자를 삽입한 재조합 베큘로 바이러스를 사용하는 방식의 경우 곤충세포 내에서 대사(metabolism)상의 과부하가 걸리게 되므로 그 발현 양에 한계가 있었다. 또한 구조단백질인 VP0(VP4+VP2), VP3 및 VP1 코딩 유전자들을 각각 삽입한 3개의 재조합 베큘로 바이러스들 또는 엔테로바이러스 71의 P1과 3CD 코딩 유전자를 삽입한 각각의 재조합 베큘로 바이러스들을 사용한 경우에는 최소한 두 종류 이상의 재조합 베큘로 바이러스를 동일세포에 감염시켜야 하므로, 각 베큘로 바이러스의 적정 감염량 및 감염비율을 표준화하기가 어려워 안정적인 생산을 기대할 수 없었고, 바이러스 유사입자의 생산량 또한 매우 낮은 문제점을 가지고 있었다.
본 발명자들은 예비실험을 통하여 돼지 수포병 바이러스의 캡시드를 형성하는 네 가지 구조단백질 각각을 개별적으로 제조한다든가 혹은 구조단백질 전구체(P1)만을 발현하여서는 항원성과 면역원성이 매우 약하기 때문에 재조합 단백질 항원으로서의 활용이 어렵다는 사실을 확인하였다. 따라서, 재조합 단백질 항원을 제조하기 위해서는 본래의 돼지 수포병 바이러스와 형태학적으로 유사한 구조를 가 져야 하고, 그러기 위해서는 바이러스 유사입자 형태로 재조합 단백질을 제작하는 것이 바람직한 접근 방법이라고 결론지었다.
이에 본 발명자들은 돼지 수포병 바이러스의 구조단백질 전구체 P1과 3CD 프로테아제 유전자가 동시에 삽입된 하나의 재조합 베큘로 바이러스를 작성하여 사용할 경우 삽입 유전자의 크기로 인한 과부하 문제를 최소화할 수 있고, 곤충세포에서의 감염량의 적정화가 매우 용이하다는 사실을 발견하였고, 아울러 상기 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시킨 결과, 곤충세포에서 발현된 P1 단백질이 동시에 발현된 3CD 프로테아제 단백질에 의해 절단되어 바이러스 유사입자를 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지 수포병 바이러스의 구조단백질 전구체 P1 및 3CD 프로테아제 유전자를 동시에 삽입하여 제조한 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 발현된 재조합 단백질들에 의해 조립된 돼지 수포병 바이러스 유사입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 돼지 수포병 바이러스의 전체 유전자 중에서 구조단백질 전구체 P1 유전자 및 3CD 프로테아제 유전자를 동시에 삽입하여 제조한 베큘로 바이러스 발현벡터를 이용하여 작성한 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 발현된 재조합 단백질들에 의해 조립된 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 제공한다.
본 발명에 의한 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터(이하 "pFastDual/P1/3CD" 라고 한다)는 돼지 수포병 바이러스의 구조단백질 전구체인 P1 유전자 및 3CD 프로테아제 유전자를 동시에 함유하고 있음을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 재조합 베큘로 바이러스(이하 "Bacmid/P1/3CD"라고 한다)는 돼지 수포병 바이러스의 구조단백질 전구체인 P1 유전자 및 3CD 프로테아제 유전자를 동시에 함유하고 있음을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용한 돼지 수포병 바이러스 구조단백질 전구체 P1 유전자는 1972년 영국에서 분리된 UKG/27/72주 유래로 그 유전자 서열(서열번호 1)은 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 X54521호로 등록되어 공지된 것으로서, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질(서열번호 2)은 851개의 아미노산으로 구성되어 있다.
본 발명에서 사용한 돼지 수포병 바이러스 3CD 프로테아제 유전자(서열번호 3)는 1972년 영국에서 분리된 UKG/27/72주 유래로 그 유전자 서열은 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 X54521호로 등록되어 공지된 것으로서, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질(서열번호 4)은 645개의 아미노산으로 구성되어 있다.
본 발명에 의한 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 돼지 수포병 바이러스의 연구분야에 있어서 세계 최초로 개발에 성공한 것이며, 돼지 수포병 진단을 위하여 종래에 사용되는 효소결합면역측정법(ELISA)의 불활성화 바이러스 항원을 대체할 새로운 진단항원으로서의 활용이 가능하다.
또한, 본 발명에 의한 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 그 제조 과정에서 불활성화 바이러스 항원을 제조하기 위하여 생바이러스를 조작해야 하는 위험성을 배제하였다는 장점이 있으며, 항원성이 본래의 바이러스 항원과 매우 흡사하여 예방백신용 항원으로도 적용이 가능하다.
유전자 재조합 기법을 이용하여 본 발명에 의한 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 제조하기 위한 방법은,
(1) 돼지 수포병 바이러스의 구조단백질 전구체 P1 유전자 및 3CD 프로테아제 유전자를 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)으로 증폭하는 단계;
(2) P1 유전자를 베큘로 바이러스 발현벡터(pFastBacDual)에 삽입하여 pFastBacDual/P1을 제조하는 단계;
(3) 3CD 유전자를 상기 P1 유전자가 삽입된 pFastBacDual/P1에 삽입하여 pFastBacDual/P1/3CD를 제조하는 단계;
(4) 상기 P1 유전자 및 3CD 유전자를 포함한 pFastBacDual/P1/3CD를 베큘로 바이러스 셔틀벡터 유전자(Bacmid)를 함유하고 있는 세포(DH10Bac)에 첨가하여 형질전환(transformation)시켜 재조합 베큘로 바이러스 유전자인 Bacmid/P1/3CD를 제조하는 단계;
(5) 상기 Bacmid/P1/3CD를 곤충세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
(6) 형질감염된 곤충세포의 상층액을 프라크 시험을 거쳐서 순수한 재조합 베큘로 바이러스를 분리하는 단계; 및
(7) 상기 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 돼지 수포병 바이 러스 유사입자를 획득하는 단계;
를 포함함을 특징으로 한다.
이러한 재조합 베큘로 바이러스 제조방법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 유사입자 제조방법은 유전체 구조가 같은 다른 엔테로바이러스에도 동일하게 적용이 가능하므로 그 활용도가 매우 넓다.
상기한 발현벡터 이외에 듀얼(Dual) 발현벡터로서 다른 종류의 베큘로 바이러스 발현벡터를 사용하여도 무방하기 때문에 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
상기한 방법으로 제조한 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 종래의 폴리오바이러스 유사입자 제작에서 나타났던 단점인, 낮은 발현량의 문제점을 극복하였고( 1.0 mg이상/리터), 재조합 베큘로 바이러스를 감염시킨 곤충세포 상층액과 돼지 수포병 바이러스를 감염시킨 숙주세포(IBRS-2) 상층액의 역가를 비교한 실험에서도 재조합 베큘로 바이러스를 이용한 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 역가가 불활성화 돼지 수포병 바이러스와 동등한 역가를 보여주었기 때문에 서브유닛 백신개발도 기대할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 과정도 본 발명의 범주에 포함된다.
[실시예 1] 돼지 수포병 바이러스 RNA 추출
1972년 영국에서 분리한 돼지 수포병 바이러스(UKG/27/72)주를 IBRS-2 세포(국립수의과학검역원, 한국)에 접종한 후, 배양 상층액으로부터 RNeasy RNA 추출 키트(RNeasy RNA extraction kit; Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다.
[실시예 2] 돼지 수포병 바이러스 P1 유전자 cDNA 합성, 증폭 및 클로닝
돼지 수포병 바이러스 P1 유전자의 cDNA 합성은 상기 실시예 1에서 추출한 전체 RNA와 하기 서열번호 6의 역방향 프라이머(reverse primer)를 RT 프리믹스 키트(RT premix kit; 바이오니아)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 하기 서열번호 5의 순방향 프라이머(forward primer) 및 하기 서열번호 6의 역방향 프라이머(reverse primer)를 중합효소연쇄반응을 위한 PCR 프리믹스 키트(PCR premix kit; 바이오니아)의 튜브에 첨가하여 95℃에서 10분간 열처리한 후 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 확장하는 과정을 1 사이클로 하여 PCR 증폭기(PE 2400;Perkin Elmer)에서 30회 반복하여 PCR을 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA 합성을 연장하였다.
상기의 PCR을 실시하기 위하여 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 제 X54521호로 등록된 돼지 수포병 바이러스 P1 유전자 서열을 이용하여 하기의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
순방향 프라이머 : 5'- GGATCC ATGGGAGCTCAAGTGTCAAC-3' (서열번호 5)
역방향 프라이머 : 5'- AAGCTT AAGTGGTTTTCATGGTTGTTA-3' (서열번호 6)
하기의 베큘로 바이러스 발현벡터를 작성하기 위하여 서열번호 5의 순방향 프라이머는 5'말단 ATG 상류의 BamHI 제한효소 작용부위에, 서열번호 6의 역방향 프라이머는 5'말단 종료 코돈 상류의 HindIII 제한효소 작용부위에 의도적으로 삽입하였다. 이렇게 증폭된 P1 유전자 cDNA를 pGEM-T easy(Promega사, USA) 벡터에 클로닝하여 "pGEMT/P1"을 제작하였고, 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 삽입된 유전자의 염기서열을 서열번호 1의 공지된 염기서열과 비교 분석함으로써 P1 유전자 cDNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다.
[실시예 3] 돼지 수포병 바이러스 3CD 유전자 cDNA 합성, 증폭 및 클로닝
돼지 수포병 바이러스 3CD 유전자의 cDNA 합성은 상기 실시예 1에서 추출한 전체 RNA와 하기 서열번호 8의 역방향 프라이머(reverse primer)를 RT 프리믹스 키트(바이오니아)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 하기 서열번호 7의 순방향 프라이머(forward primer) 및 하기 서열번호 8의 역방향 프라이머(reverse primer)를 중합효소연쇄반응을 위한 PCR 프리믹스 키트(바이오니아)의 튜브에 첨가하여 95℃에서 10분간 열처리한 후 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 2분간 확장하는 과정을 1 사이클로 하여 PCR 증폭기(PE 2400;Perkin Elmer)에서 30회 반복하여 PCR을 수행하였고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 연장하였다.
상기의 PCR을 실시하기 위하여 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 제 X54521호로 등록된 돼지 수포병 바이러스 3CD 유전자 서열을 이용하여 하기의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
순방향 프라이머 : 5'-GCC CTCGAG ATGGGTCCAGCGTTTGAGTTC-3' (서열번호 7)
역방향 프라이머 : 5'-GCTC GGTACC TAAAAGGAGTCCAACCACTT-3' (서열번호 8)
하기의 베큘로 바이러스 발현벡터를 작성하기 위하여 서열번호 7의 순방향 프라이머는 5'말단 ATG 상류의 XhoI 제한효소 작용부위에, 서열번호 8의 역방향 프라이머는 5'말단 종료 코돈 상류의 KpnI 제한효소 작용부위에 의도적으로 삽입하였다. 이렇게 증폭된 3CD 유전자 cDNA를 바로 pGEM-Teasy(Promega사, USA) 벡터에 클로닝하여 "pGEMT/3CD"을 제작하였고, 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 삽입된 유전자의 염기서열을 서열번호 3의 공지된 염기서열과 비교 분석함으로써 3CD 유전자 cDNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다.
[실시예 4] 돼지 수포병 바이러스 P1 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터 작성
상기 실시예 2에서 제조한 pGEMT/P1 벡터를 BamHI 및 HindIII 로 처리하여 해당 DNA 단편을 추출하였다. 한편, pFastBacDualTM 벡터(Invitrogen사, USA) 역시, 동일한 제한효소로 절단한 다음 상기의 P1 DNA 단편을 폴리헤드린프로모터(PPH)가 있는 유전자 부위의 하류에 삽입하였다. 이렇게 하여 돼지 수포병 바이러스 P1 유 전자가 삽입된 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터인 pFastBacDual/P1을 제작하였다.
[실시예 5] 돼지 수포병 바이러스 P1 및 3CD 유전자가 동시에 삽입된 재조합 발현벡터 작성
상기 실시예 4에서 제조한 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터 pFastBacDual/P1을 XhoI 과 KpnI 제한효소로 처리하고, 상기 실시예 3에서 사용한 pGEMT/3CD를 동일한 제한효소로 절단한 다음, 상기 단편을 pFastBacDual/P1 상의 P10 프로모터(Pp10)가 있는 유전자 부위의 하류에 삽입하였다. 이렇게 하여 돼지 수포병 바이러스 P1 및 3CD 유전자가 동시에 삽입된 재조합 베큘로 바이러스 발현 벡터인 pFastBacDual/P1/3CD을 제작하였다. 도 1에서는 본 발명에 의한 상기 재조합 베큘로 바이러스 발현벡터(pFastBacDual/P1/3CD)의 구조를 보여준다.
[실시예 6] 곤충세포에서의 발현 및 재조합 베큘로 바이러스 제조
본 발명에 의한 재조합 베큘로 바이러스(bacmid/P1/3CD)는 Bac-to-Bac 베큘로 바이러스 발현시스템(Invitrogen사, USA)을 이용하여 제작하였다. 상기 실시예 5에서 제작한 pFastDual/P1/3CD 벡터를 베큘로 바이러스 유전자(bacmid)를 함유하고 있는 세포(DH10Bac)에 형질도입하여 재조합 베큘로 바이러스 DNA(Bacmid/P1/3CD)를 제작하였다.
상기 재조합 베큘로 바이러스 DNA(bacmid/P1/3CD)를 이용하여 재조합 베큘로 바이러스를 제조하는 과정은 다음과 같다. 무혈청 그레이스 배지 100ul에 정제된 Bacmid/P1/3CD 유전자 1㎍을 첨가한 용액과, 마찬가지로 무혈청 그레이스 배지 100ul에 셀펙틴(CellFectin, Invitrogen) 6㎕를 첨가한 용액을 혼합한 후 실온에서 30분간 방치하였다. 직경 35mm 세포배양용 페트리 디쉬 웰에 2×106 농도로 미리 배양된 나비목해충(Spodoptera frugiperda; 이하 "Sf9"라 한다) 세포주(GibcoBRL)를 무혈청 그레이스 배지로 1회 세척한 후에 배지를 제거하였다.
상기 혼합물에 0.8ml의 무혈청 그레이스 배지를 첨가한 다음, 이를 Sf9 세포에 첨가한 후 27℃에서 5시간 배양함으로서 형질감염시켰다. 배양세포의 상층액을 제거한 다음 10% 우태아 혈청이 함유된 새 그레이스 배지 2㎖를 가하여 27℃에서 6일간 배양하면서 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE) 출현여부를 관찰하였다. 형질감염시킨 세포의 배양 상층액을 수확하고 프라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하여 순수하게 재조합 베큘로 바이러스를 분리하였다. 즉, 3×104 개의 Sf9 세포를 직경 35mm 세포배양용 페트리디쉬 웰에 단층으로 도포한 후, 상기에서 수확한 상층액을 10배 단계로 희석한 희석액을 각각 1ml씩 접종하였으며, 27℃에서 1시간동안 감작한 다음, 상층액을 제거하고 나서 1% 저융점 아가로스가 포함된 그레이스 배지를 그 위에 층을 이루도록 도포(overlay)하여 8일간 27℃에서 배양하여 플라크 형성을 확인하였다. 몇 개의 플라크를 채취하여 Sf9 세포를 감염시켜 4일간 배양하여 CPE 출현여부를 관찰하였고, 이때 수확한 세포 파쇄액을 효소결합면역측정법에 적용하여 돼지 수포병 바이러스 특이 단클론항체와 반응하는 재조합 베큘로 바이러스 (Bacmid/P1/3CD)를 선발하였다.
[실시예 7] 재조합 베큘로 바이러스를 이용한 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 제조
먼저 Sf9 곤충세포를 단층배양시킨 150㎠ 세포배양용 플라스크에 상기 실시예 6에서 제조한 재조합 베큘로 바이러스(Bacmid/P1/3CD)를 0.1 MOI(Multiplicity of Infection)의 농도로 1시간동안 27℃에서 감염시킨 후 그 감염세포들을 수확하여, 미리 2.0×106/㎖ 농도로 준비한 Sf9 곤충세포 200㎖의 회전배양(Spinner culture) 용기에 넣은 후, 27℃에서 4일간 배양하였다. 상기에서 회전배양한 감염세포들을 수확하여 500xg에서 20분간 원심분리한 후 상층액과 감염세포를 분리하여 수확하였다. 상층액은 원액 자체로서 진단항원으로 사용하고, 감염세포는 아래의 일련의 과정을 거쳐서 진단항원으로 제조하였다. 즉, 1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 0.01M 인산완충용액(phospahte buffered saline; PBS)을 세포배양액의 1/20의 비율로 현탁한 다음, 초음파 파쇄기(Sonicator)를 사용하여 세포를 파쇄한 후, 500xg에서 20분간 원심분리하여 상층액만을 수확하여 돼지 수포병 바이러스의 유사입자로서 사용하였다.
[실시예 8] 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 정제 및 전자현미경 촬영
상기 실시예 7과 동일한 방법으로 회전배양용기에서 재조합 베큘로 바이러스 를 감염시킨 Sf9 세포 배양액을 수확한 다음, 냉동과 해동을 3회 반복하여 감염세포를 파쇄한 후 8,000g에서 40분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 상기 수확한 상층액에 0.5M NaCl 23g/l 및 7.5% PEG 75g/l를 첨가하여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이후, 8,000g에서 40분간 원심분리하여 펠렛만을 취하고 배양액 1/50 양의 PBS로 부유하여 2회에 걸쳐 투석하였다. 상기 농축한 샘플을 3,000g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취한 다음 염화세슘(Cesium Chloride; CsCl) 기울기를 이용한 초원심분리법으로 돼지 수포병 바이러스 유사입자만을 정제하였다. 보다 상세하게는 베크만(Beckman, USA)사 초원심분리기의 초원심분리용 SW41 Ti 튜브내에 40%의 CsCl 5.5ml과 5% CsCl 5.5ml을 미리 넣은 후, 그 상층에 상기 농축한 상층액 0.5ml을 조심스럽게 첨가하여 SW41 Ti 로터(Beckmann, USA)를 사용하여 35,000rpm에서 6시간동안 원심분리를 하였다. 하얀 띠를 형성하는 부위를 회수하여 하기와 같이 전자현미경 촬영을 실시하였다.
상층액 20ul을 파라필름에 넣은 후 그리드(grid)를 5분간 띄웠다. 핀셋으로 그리드를 건져내어 1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)에 담갔다가 40분간 실온에서 건조시킨 다음, 전자현미경으로 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 관찰하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 본 발명에서 제조한 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 크기는 25-27nm로 확인되었으며, 핵산을 포함하는 본래의 바이러스 입자 크기인 25-30nm 와 유사하였다.
[시험예 1] 웨스턴 블롯팅에 의한 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 확인
상기 실시예 8에서 정제한 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 전기영동한 후, 상기 겔을 니트로셀룰로오스 막에 전이(transfer)하였다. 5% 탈지유(skimmed milk)를 함유한 블로킹 용액으로 니트로셀룰로오스 멤브레인을 처리한 다음, 기니아피그 양성혈청과 돼지 양성혈청을 각각 전이된 막(membrane)에 반응시켰다. 상기 막을 0.05% 트윈 20(Tween 20)을 함유하는 PBS(PBST)로 세척한 다음, 각 축종에 대한 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase)가 부착된 이차항체(KPL사, USA)를 첨가하여 1시간동안 반응시켰다. 상기 반응물을 세척한 후 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)/NBT(nitroblue tetrazolium) 용액을 첨가하여 발색하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보여지는 바와 같이, 돼지 수포병 항체양성 기니아피그 혈청(레인 2 및 3) 및 돼지 수포병 항체양성 돼지혈청(레인 4 및 5)은 돼지 수포병 바이러스 유사입자(레인 2 및 4) 및 돼지 수포병 바이러스 입자(레인 3 및 5)에 대하여 동일한 양상의 반응을 보이고 있다. 따라서, 상기에서 전자현미경으로 확인한 바이러스 유사입자는 본래의 돼지 수포병 바이러스와 동일한 성분의 돼지 수포병 바이러스 유사입자임을 확인하였다.
[시험예 2] 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 항원성 평가
두 종류의 효소결합면역측정법(Competitive ELISA; C-ELISA)을 적용하여 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자와 종래의 불활성화 돼지 수포병 바이러스 항원과의 항원성을 평가하였다.
1) 경합적 효소결합면역측정법을 이용한 항원성 평가
돼지 수포병 바이러스 단클론항체 5B7(돼지 수포병 바이러스 중화항체)을 4℃에서 하룻밤동안 부착시킨 효소결합면역측정법 플레이트에 돼지 수포병 바이러스 및 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 각각 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. PBST로 세척한 다음, 돼지혈청(돼지 수포병 표준 양성혈청 포함)을 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 고추냉이로부터 분리한 효소인 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 단클론항체 5B7(상기의 코팅에 사용한 것과 동일한 단클론항체임)을 첨가하여 마찬가지로 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 세척 후, 발색제인 오피디(OPD; ortho-phenylenediamine) 용액을 10분간 첨가한 다음 10분간 반응시킨 후에 황산용액으로 반응을 정지한 다음, 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 각 혈청의 항원에 대한 경합 반응성은 하기 수학식 1에 기재된 바와 같이 단클론항체만의 흡광도 대비 혈청시료와 단클론항체 혼합물의 흡광도 저해정도(percent Inhibition; PI)로 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
PI=100-(혈청/단클론항체 혼합물의 흡광도)/(단클론항체의 흡광도)×100
검사혈청 경쟁적 효소결합면역측정법 (PI)
본 발명의 유사입자 돼지 수포병 바이러스
표준혈청 1 4.0 1.5
표준혈청 2 98.9 99.5
표준혈청 3 91.9 93.7
표준혈청 4 79 71.7
표준혈청 5 91 85
표준혈청 6 95.3 94.5
국내 음성혈청 7 20.3 10.3
국내 음성혈청 8 20.1 13.7
※ 두 항원간의 반응성 상관계수 : 0.997 (99.7%)
상기 표 1에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자와 불활성화 돼지 수포병 바이러스 항원과의 항원성 상관계수가 0.997로 두 항원간의 유사성이 매우 높았다.
또한 본 발명의 바이러스 유사입자가 불활성화 돼지 수포병 바이러스와 마찬가지로 동일한 단클론항체에 대해서 포획과 검출이 동시에 이루어지는 것으로 보아 두 가지 이상의 항원부위가 노출되어있음을 알 수 있으며, 이는 바이러스 유사입자의 형성을 간접적으로 입증해주는 결과이기도 하다.
상기에서 사용한 단클론항체 5B7은 돼지 수포병 바이러스에 대한 중화능을 보유한 항체이기 때문에 상기의 결과는 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자가 본래 바이러스가 보유한 중화관련 항원부위를 그대로 보존하고 있음을 확인할 수 있었다.
2) 간접 효소결합면역측정법을 이용한 항원성 평가
다양한 종류의 돼지 수포병 바이러스 단클론항체를 효소결합면역측정법 플레이트에 4℃에서 하룻밤동안 부착시킨 다음, 불활성화 돼지 수포병 바이러스 및 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 각각 첨가한 다음 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 반응물을 PBST로 세척한 후, 페록시다제가 결합된 표준 단클론항체 5B7를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 반응액을 세척한 다음, 발색제로서 오피디(OPD; ortho-phenylenediamine) 용액을 첨가하여 10분간 반응시킨 후에 황산용액으로 반응을 정지시킨 다음, 492nm에서 흡광도를 측정하였으며, 돼지 수포병 바이러스 및 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 검출하였다. 이때, 각 항원의 여러 단클론항체에 대한 반응성은 흡광도를 측정하여 비교 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
단클론항체 간접효소결합면역측정법 (흡광도)
본 발명의 유사입자 돼지 수포병 바이러스
A 0.14 0.3
B 0.14 0.22
C 0.07 0.08
D 0.1 0.12
E 0.12 0.13
F 0.07 0.06
G 0.52 0.55
H 1.84 2.06
I 1.1 1.38
J 0.6 0.66
K 0.09 0.07
L 0.11 0.1
※ 두 항원간의 반응성 상관계수 : 0.995 (99.5%)
상기 표 2에서 보여지는 바와 같이, 두 항원에 대한 반응성을 비교한 결과, 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자와 불활성화 돼지 수포병 바이러스 항원간의 상관계수가 0.995로 항원성이 매우 유사함을 알 수 있었다.
상기의 결과들은 본 발명의 바이러스 유사입자가 효소결합면역측정법의 진단항원으로서 종래의 불활성화 바이러스 항원을 대체할 수 있음을 보여주는 것이다.
이상의 결과를 통해서 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 본래의 돼지 수포병 바이러스와 매우 유사한 구조를 나타내고 있음을 확인하였고, 이러한 결과는 아직까지 상업화되어 있지 않은 돼지 수포병 바이러스 백신의 개발에 있어서 유전자 재조합 백신으로 제조가 가능함을 보여준다.
상기의 실시예를 통하여 살펴본 바와 같이, 돼지 수포병 바이러스 P1 및 3CD유전자가 동시에 삽입된 하나의 재조합 베큘로 바이러스를 이용하는 본 발명에 의한 바이러스 유사입자의 제조방법은 돼지 수포병 바이러스뿐만 아니라 엔테로바이러스속의 여러 바이러스에 있어서도 최초로 도입된 것이다.
본 발명에 의한 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 본래의 돼지 수포병 바이러스 입자와 형태 및 항원성이 매우 유사하기 때문에 돼지 수포병 바이러스와 관련된 여러 분야에 적용이 가능하다.
아울러 질병진단 측면에서 보면, 본 발명에 의한 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 종래의 돼지 수포병 항체 검출 키트에서 진단항원으로 사용되어 왔던 불활성화 돼지 수포병 바이러스 항원을 대체할 수 있다. 따라서, 불활성화 바이러스 항원을 제조하기 위해서 생바이러스를 조작해야만 했던 위험성 및 번거로움을 배제하였다는 장점이 있으며, 일반실험실에서 안전하고 손쉽게 생산할 수 있기 때문에 진 단항원으로서의 효용가치가 크다.
또한 질병예방 측면에서 보면, 본 발명에 의한 유전자 재조합 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 본래의 돼지 수포병 바이러스와 항원성이 유사하기 때문에 서브유닛 예방백신으로의 개발이 가능하다. 실험실에서 손쉽게 유전자 재조합을 통해서 생산하기 때문에 긴급한 상황에서 예방백신을 신속하고 안전하게 생산할 수 있다. 현재까지 돼지 수포병 바이러스 예방백신이 개발되지 않았기 때문에 본 발명의 돼지 수포병 바이러스 유사입자는 최초의 유전자 재조합 백신개발 가능성을 보여주는 것이다.
따라서, 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 의한 바이러스 유사입자 제조방법은 유전체 구조가 돼지 수포병 바이러스와 동일한 엔테로바이러스속의 다른 여러 바이러스들에도 동일하게 적용할 수 있다. 본 발명은 폴리오바이러스와 같이 다른 엔테로바이러스들에서의 바이러스 유사입자 제조에 있어서 보여지던 한계를 극복한 제조방법이기 때문에 실시예에서 제시한 돼지 수포병 바이러스뿐만 아니라 다른 여러 엔테로바이러스에도 동일하게 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명과 마찬가지로 여러 가지 엔테로바이러스 질병의 진단항원으로 사용하거나 유전자 재조합 백신으로서의 개발이 기대되어진다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 돼지 수포병 바이러스 유전자 중 서열번호 1의 구조단백질 전구체(P1) 유전자 및 서열번호 3의 3CD 프로테아제 유전자가 함유되도록 제조된 유전자 재조합 바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 의한 재조합 바이러스 벡터가 형질전환된 재조합 베큘로 바이러스.
  3. 제 2항에 의한 재조합 베큘로 바이러스가 형질감염된 곤충세포.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 곤충세포는 나비목해충(Spodoptera frugiperda)임을 특징으로 하는 곤충세포.
  5. 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 의한 곤충세포에 의해 생산되는 재조합 베큘로 바이러스.
  6. 제 5항에 의한 재조합 베큘로 바이러스를 이용하여 제조된 돼지 수포병 바이러스 유사입자.
  7. (1) 돼지 수포병 바이러스 유전자 중 서열번호 1의 구조단백질 전구체 P1 유전자 및 서열번호 3의 3CD 프로테아제 유전자를 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)으로 증폭하는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계에서 증폭한 P1 유전자를 베큘로 바이러스 발현벡터(pFastBacDual)에 삽입하여 pFastBacDual/P1을 제조하는 단계;
    (3) 상기 (1) 단계에서 증폭한 3CD 유전자를 상기 P1 유전자가 삽입된 pFastBacDual/P1에 삽입하여 pFastBacDual/P1/3CD를 제조하는 단계;
    (4) 상기 P1 유전자 및 3CD 유전자를 포함한 pFastBacDual/P1/3CD를 베큘로 바이러스 셔틀벡터 유전자(Bacmid)를 함유하고 있는 세포(DH10Bac)에 첨가하여 형질전환(transformation)시켜 재조합 베큘로 바이러스 유전자인 Bacmid/P1/3CD를 제조하는 단계;
    (5) 상기 Bacmid/P1/3CD를 곤충세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
    (6) 형질감염된 곤충세포의 상층액을 프라크 시험을 거쳐서 순수한 재조합 베큘로 바이러스를 분리하는 단계; 및
    (7) 상기 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 돼지 수포병 바이러스 유사입자를 획득하는 단계;
    를 포함하는 돼지 수포병 바이러스 유사입자의 제조방법.
KR1020040083994A 2004-10-20 2004-10-20 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스유사입자 및 그 제조 방법 KR100665054B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040083994A KR100665054B1 (ko) 2004-10-20 2004-10-20 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스유사입자 및 그 제조 방법
PCT/KR2005/003274 WO2006080682A1 (en) 2004-10-20 2005-10-05 Construct of swine vesicular disease virus like particle using genetic engineering and the method for manufacturing thereof
EP05856432.9A EP1802759B1 (en) 2004-10-20 2005-10-05 Construct of swine vesicular disease virus like particle using genetic engineering and the method for manufacturing thereof
CN2005800354452A CN101065489B (zh) 2004-10-20 2005-10-05 通过遗传工程构建的猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040083994A KR100665054B1 (ko) 2004-10-20 2004-10-20 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스유사입자 및 그 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060034945A KR20060034945A (ko) 2006-04-26
KR100665054B1 true KR100665054B1 (ko) 2007-01-04

Family

ID=36740666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040083994A KR100665054B1 (ko) 2004-10-20 2004-10-20 유전자 재조합 기법을 이용한 돼지 수포병 바이러스유사입자 및 그 제조 방법

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1802759B1 (ko)
KR (1) KR100665054B1 (ko)
CN (1) CN101065489B (ko)
WO (1) WO2006080682A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201100545A (en) * 2009-06-18 2011-01-01 Nat Univ Tsing Hua Method for preparing enterovirus virus-like particle and use thereof
CN102978227A (zh) * 2012-11-16 2013-03-20 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种猪水泡病病毒vp1 蛋白分泌表达重组质粒及其应用
CN103710384A (zh) * 2013-12-18 2014-04-09 广东华南联合疫苗开发院有限公司 小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途
CN112048004B (zh) * 2020-07-14 2021-10-22 桂林医学院 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用
CN114317571A (zh) * 2021-12-29 2022-04-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种病毒样颗粒及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPN720195A0 (en) * 1995-12-18 1996-01-18 University Of Melbourne, The Equine rhinovirus 1 proteins
US6200576B1 (en) * 1998-07-15 2001-03-13 Development Center For Biotechnology Swine vesicular disease virus and mutant strains and preparation process and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN101065489B (zh) 2010-12-01
EP1802759A1 (en) 2007-07-04
EP1802759B1 (en) 2016-05-18
CN101065489A (zh) 2007-10-31
EP1802759A4 (en) 2009-06-17
WO2006080682A1 (en) 2006-08-03
KR20060034945A (ko) 2006-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Capucci et al. Detection and preliminary characterization of a new rabbit calicivirus related to rabbit hemorrhagic disease virus but nonpathogenic
CA2690668C (en) Vaccines containing canine parvovirus genetic variants
CN109536461B (zh) 一种o型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用
Wang et al. Duck hepatitis A virus structural proteins expressed in insect cells self-assemble into virus-like particles with strong immunogenicity in ducklings
EP1802759B1 (en) Construct of swine vesicular disease virus like particle using genetic engineering and the method for manufacturing thereof
US7763260B2 (en) Murine calicivirus
Skidmore Overview of hepatitis E virus
KR102049147B1 (ko) 신규 약독화 pedv 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물
CN115010813B (zh) 一种肠道病毒71型病毒样颗粒、其制备方法及应用
EP1000168B1 (en) A swine hepatitis e virus and uses thereof
KR100267745B1 (ko) 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법
Wang et al. Hepatitis E virus
KR101316102B1 (ko) 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법
KR20070025122A (ko) 비감염성 돼지수포병 바이러스 유사입자와 하이브리도마세포주가 분비하는 단클론항체를 이용한 돼지수포병바이러스 항체 진단방법
CN116286679B (zh) 一株经分离得到的猪流行性腹泻病毒变异株及其应用
CA2737378C (en) Vaccines containing canine parvovirus genetic variants
US11191824B1 (en) Method of purifying virus-like-particles
Xu et al. Generation, characterization, and application in serodiagnosis of recombinant swine vesicular disease virus-like particles
Zhang Etiological study of cherry stem pitting disease and molecular characterization of sour cherry green ring mottle virus
Kuria Manipulation of Hawaii Virus Capsid Protein and Gene
Ahmad et al. Diagnostic Applications of Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, Gel Electrophoresis and Western Immunoblot for Detection of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant