CN101065489B

CN101065489B - 通过遗传工程构建的猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法

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Publication number: CN101065489B
Application number: CN2005800354452A
Authority: CN
Inventors: 崔康锡; 高荣骏; 罗珍珠; 赵南仁
Original assignee: Republic of Korea
Current assignee: Republic of Korea
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2005-10-05
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2025-10-05
Also published as: EP1802759A1; EP1802759B1; CN101065489A; EP1802759A4; WO2006080682A1; KR100665054B1; KR20060034945A

Abstract

本发明是关于利用基因重组技术制备的猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法。更具体地，本发明是关于制备猪水疱病病毒样颗粒的方法，其中，同时将猪水疱病病毒的结构蛋白前体(P1)基因和3CD蛋白酶基因插入到杆状病毒表达载体中，并在昆虫细胞中表达，以便表达的3CD蛋白酶把结构蛋白前体酶解成单个的蛋白，然后所述单个的蛋白通过自组装过程，形成猪水疱病病毒衣壳。

Description

通过遗传工程构建的猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本发明是关于利用基因重组技术制备的猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法。更具体地，本发明是关于猪水疱病病毒样颗粒的制备方法，其中，同时将猪水疱病病毒总基因中的结构蛋白前体(P1)基因和3CD蛋白酶基因插入到杆状病毒表达载体中，并在昆虫细胞中表达，以便表达的3CD蛋白酶把结构蛋白前体酶解成单个的蛋白，然后所述单个的蛋白通过自组装过程，形成猪水疱病病毒衣壳。

背景技术

猪水疱病是一种高度传染的猪病毒性疾病，表征为在2-7天的潜伏期后，在蹄冠(coronary band)、蹄后跟(heels of feel)，有时在唇、舌、口鼻部(snout)及乳头出现水疱。受感染的猪2-3周内可痊愈。由于猪水疱病的症状与口蹄疫病毒引起的症状在临床上很难区分，世界动物卫生组织(OfficeInternational des Epizooties，OIE)把猪水疱病列为A类疾病。

当猪水疱病1966年最初在意大利被观察到时，被认为是猪的肠道病毒感染，1972年在英国出现后被称作“猪水疱病”。猪水疱病的病因学为猪水疱病病毒是由人的柯萨奇B5病毒(Coxsackievirus B5)感染猪后产生的猪的变种。根据微生物学分类，猪水疱病病毒属于‘小核糖核酸病毒(Picornaviridae)’科的‘肠道病毒’属，并且仅有一种血清型。所述猪水疱病病毒是一种由约7400个碱基组成的正义单链RNA病毒，与口蹄疫病毒不一样，猪水疱病病毒在周围环境条件下非常稳定，以至于它在PH值从2.5到12的范围内不受影响。

猪水疱病病毒含有四个主要的结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)，还含有非结构蛋白，比如2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，已知所述非结构蛋白主要在受感染的细胞中表达，以在病毒的细胞内复制中起到辅助作用。

作为一种检测猪水疱病病毒抗体的方法，病毒中和试验被公认为是一种金标准的检测方法，但是由于需要约2-3天的检测周期和细胞培养设备的缺点，该方法不适合检测大量的样本。作为解决所述缺点的选择，酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay)得以开发[Journal ofVirological Methods，(1995)52：155-167]。然而，在目前国际上通用的检测猪水疱病病毒抗体的酶联免疫吸附测定法中，灭活猪水疱病病毒用作诊断抗原。在此情况下，由于在制备所述诊断抗原的步骤中，需要通过细胞培养来生产活病毒，必须需要生物安全等级(BSL)为3级的实验室以避免实验室事故(病原体的释放等)。此外，由于诸如二元乙烯亚胺(binary ethyleneimine)的致癌物质用在灭活病毒的过程中，潜伏对工作人员有害的因素。由于所述原因，使用灭活的猪水疱病病毒的方法可以被认为是高度危险和复杂的操作。

为了试图解决上述问题，全世界正在进行重组蛋白抗原的开发以及用安全的重组抗原替代灭活病毒抗原的研究。然而迄今为止尚未开发出足以替代灭活猪水疱病病毒抗原的重组蛋白抗原。

例如，有一个例子[Virus Research(1998)57：163-170]，其中，结构蛋白前体(P1)在大肠杆菌中得到表达，并尝试用作诊断性抗原。然而由于猪水疱病病毒具有60个原聚体(protomer)紧密包装(densely-packed)的二十面体排列(arrangement)，每一个原聚体由4种蛋白(VP1、VP2、VP3和VP)组成，而且大多数抗原位点构象依赖，但是，在大肠杆菌中只表达P1重组蛋白的情况下，不能形成病毒抗原位点的构象结构。这可以通过在用P1前体免疫的猪的血清中不能检测到病毒中和抗体的事实中得以证明。

发明内容

根据本发明以完成猪水疱病病毒样颗粒的构建，尚未在猪水疱病病毒上尝试过。但是病毒样颗粒已经在一些病毒上有过研究，比如脊髓灰质炎病毒和肠道病毒(enterovirus)，所述猪水疱病病毒所属肠道病毒属的成员。此外，已经尝试过通过以下几种方式生产病毒样颗粒：或者利用插入有骨髓灰质炎病毒全长基因(包括结构蛋白和非结构蛋白6.6kb大小)的重组杆状病毒感染昆虫细胞[Journal of General Virology(1989)70：1453-1463]，或者利用分别插入有结构蛋白VP0(VP4+VP2)、VP3和VP1编码基因的三种重组杆状病毒共感染昆虫细胞[Virology(1993)192：512-524]，或者利用分别插入有肠道病毒71的P1编码基因和3CD编码基因的两种重组杆状病毒共感染昆虫细胞[Biotechnology Letters(2003)25：919-925]。

然而，作为所述肠道病毒样颗粒的构建实例认真分析的结果，在利用插入全长病毒基因的重组杆状病毒的情况下，昆虫细胞内的新陈代谢超负荷，从而限制了所述基因的表达。此外，在利用分别插入有结构蛋白VP0(VP4+VP2)、VP3和VP1编码基因的三种重组杆状病毒，或者利用分别插入肠道病毒71的P1和3CD编码基因的重组杆状病毒生产病毒样颗粒的情况下，必须要用至少两种杆状病毒共感染同一批细胞。由于所述原因，因为很难标准化合适的用每一种杆状病毒感染的水平和速度，因而就不能保证病毒样颗粒的稳定产量，而且病毒样颗粒的产量也很低。

本发明发明人通过调查目前重组抗原模型发现，通过单独制备组成猪水疱病病毒衣壳的四种结构蛋白中的任何一个，或通过只表达结构蛋白前体(P1)所得到的抗原，都不可能在构象上模拟免疫显性抗原位点。因此可以断定，可用的重组蛋白抗原必须具有与天然猪水疱病病毒的结构在形态学上相似的结构，并且为了达到所述目的，以病毒样颗粒的形式构建的重组蛋白为优选的途径。

基于以上所述事实，发明人发现，当构建并使用插入有结构蛋白前体P1和3CD蛋白酶两个基因的重组杆状病毒时，所述由插入基因的大小造成的代谢负荷问题可以最小化，而且可以以非常容易的方式实现昆虫细胞内感染重组杆状病毒的量的标准化，并且当昆虫细胞受所述杆状病毒感染时，在昆虫细胞中表达的P1蛋白可以被与该P1蛋白同时表达的3CD蛋白酶蛋白降解以生产出病毒样颗粒，由此完成本发明。

因此，本发明的目的是提供一种猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法，所述猪水疱病病毒样颗粒通过用插入猪水疱病病毒结构蛋白前体P1和3CD蛋白酶两种基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组蛋白组装而成。

附图说明

图1为插入有猪水疱病病毒的结构蛋白前体P1和3CD两种基因的杆状病毒表达载体示意图；

图2为展示构建猪水疱病病毒样颗粒策略的示意图；

图3为在基因重组杆状病毒中表达的猪水疱病病毒样颗粒电子显微照片；

图4展示了猪水疱病病毒颗粒蛋白质印迹(Western blotting)分析结果。

泳道1：蛋白标记；

泳道2：猪水疱病病毒样颗粒与几内亚猪(guinea pig)抗血清的反应活性；

泳道3：灭活猪水疱病病毒与几内亚猪抗血清的反应活性；

泳道4：猪水疱病病毒样颗粒与猪抗血清的反应活性；以及

泳道5：灭活猪水疱病病毒样颗粒与猪抗血清的反应活性。

具体实施方式

为了达到上述的目的，本发明提供了用感染重组杆状病毒的昆虫细胞所表达的重组蛋白组装的猪水疱病病毒样颗粒，所述重组杆状病毒用同时插入有猪水疱病病毒的结构前体P1和3CD基因制备的杆状病毒表达载体来构建。

所述重组杆状病毒表达载体(下文称为“pFastDual/P1/3CD”)表征为包括猪水疱病病毒的结构蛋白前体P1基因和3CD蛋白酶基因二者。

根据本发明，所述重组杆状病毒(下文称为“Bacmid/P1/3CD”)表征为包括猪水疱病病毒的结构蛋白前体P1基因和3CD蛋白酶基因二者。

本发明中所用的猪水疱病病毒的结构蛋白前体P1基因来自1972年在英国分离到的UKG/27/72菌株，P1的基因序列(SEQ ID NO：1)已经在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上登记，登记号为X54521，该基因编码的蛋白(SEQ ID NO：2)由851个氨基酸组成。

本发明中所用的猪水疱病病毒的3CD蛋白酶基因(SEQ ID NO：3)来自1972年在英国分离到的UKG/27/72菌株，其基因序列(SEQ ID NO：3)已经在NCBI上登记，登记号为X54521，该基因编码的蛋白质(SEQ ID NO：4)由645个氨基酸组成。

在猪水疱病病毒研究领域，根据本发明在世界上首次成功开发的猪水疱病病毒样颗粒，能用作一种新的诊断性抗原，将代替目前在用于检测猪水疱病病毒抗体的ELLISAs中用到的灭活病毒抗原。

此外，根据本发明，所述猪水疱病病毒样颗粒的优点在于，制备所述猪水疱病病毒样颗粒的过程中，无需操作任何危险化学物质。此外，由于猪水疱病病毒样颗粒的抗原性与天然病毒抗原的抗原性非常相似，所述猪水疱病病毒样颗粒还可以用作抗猪水疱病病毒预防疫苗的抗原。

另一个方面，本发明提供了用基因重组技术制备猪水疱病病毒样颗粒的方法，该方法包括如下步骤：(1)通过聚合酶链式反应(PCR)，扩增猪水疱病病毒的结构蛋白前体P1基因和3CD蛋白酶基因；(2)把P1基因插入到杆状病毒表达载体(pFastBacDual)中以制备pFastBacDual/P1；(3)把3CD基因插入到已插入P1基因的pFastBacDual/P1中以制备pFastBacDual/P1/3CD；(4)用含有P1基因和3CD基因的pFastBacDual/P1/3CD转化含有杆状病毒穿梭载体基因(Bacmid)的细胞(DH10Bac)以制备重组杆状病毒Bacmid/P1/3CD基因；(5)用Bacmid/P1/3CD基因转染昆虫细胞；(6)用被转染昆虫细胞的上清液进行噬菌斑测定，以便分离纯的重组杆状病毒；(7)用所述重组杆状病毒感染昆虫细胞以获得猪水疱病病毒样颗粒。

可以用在制备重组杆状病毒的方法中的实验程序、试剂和反应条件为本领域所公知。本发明所述的用于制备病毒样颗粒的方法可以应用的范围广，因为它还可以应用于具有相同遗传结构的其他肠道病毒。

本发明中所用到的表达载体并不限于上述提到的表达载体，因为其他种类的作为双元表达载体的杆状病毒表达载体也可以用于本发明中。

根据上述方法制备的猪水疱病病毒样颗粒所达到的表达水平超过1.0毫克/升，表明本发明的方法克服了现有技术在构建脊髓灰质炎病毒病毒样颗粒中出现的低水平表达的问题。此外，在重组杆状病毒感染的昆虫细胞上清液与猪水疱病病毒感染的寄主细胞(IBRS-2)上清液之间滴度的比较测试中，利用重组杆状病毒制备的猪水疱病病毒样颗粒表现出与灭活猪水疱病病毒相等的滴度。因此，本发明的病毒样颗粒可被开发为亚单位疫苗。

下文将通过实施例详细描述本发明。然而，本领域技术人员显而易见所述实施例并不解释为限制本发明的范围，在不违背所附权利要求中所述的本发明的范围和实质的条件下，可能进行各种修改、添加和替换。

实施例1：从猪水疱病病毒中提取RNA

利用1972年英国分离的猪水疱病病毒(UKG/27/72)菌株接种IBRS-2细胞(国立兽医科学检疫院，韩国)，然后利用RNeasy RNA抽提试剂盒(Qiagen，德国)，根据厂商提供的操作手册，从培养物的上清液中提取总RNA。

实施例2：猪水疱病病毒P1基因cDNA的合成、扩增和克隆

为合成猪水疱病病毒P1基因的cDNA，将实施例1中提取的总RNA和SEQ ID NO：6的反向引物加到RT premix试剂盒(Bioneer，韩国)的试管中，然后在其中根据厂商的操作手册合成cDNA的第一条链。然后将所述cDNA的第一条链、正向引物DEQ ID NO：5和反向引物SEQ ID NO：6加入到PCRpremix试剂盒(Bioneer)的试管中在95℃下加热处理10分钟，以便进行聚合酶链式反应(PCR)。然后，所述cDNA在PCR扩增仪(PE 2400；PerkinElmer)中扩增，以94℃变性1分钟、55℃复性1分钟、72℃延伸2分钟进行30个循环后，最后在72℃下延伸5分钟。

为了实施上述PCR反应，根据美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI，Genbank)登记的登记号为X54521的猪水疱病病毒P1基因序列合成下述PCR引物：

正向引物：5′-GGATCCATGGGAGCTCAAGTGTCAAC-3′(SEQ ID NO：5)

反向引物：5′-AAGCTTAAGTGGTTTTCATGGTTGTTA-3′(SEQ ID NO：6)

为了便于构建下述的杆状病毒表达载体，将正向引物SEQ ID NO：7和反向引物SEQ ID NO：8分别有意插入到5’末端ATG上游的BamHI限制酶切位点和5’末端终止子上游HindIII限制酶切位点。如此扩增的P1基因cDNA，被克隆到pGEM-T easy载体(Promega，USA)上以构建“pGEMT/P1”，并利用自动测序仪(ABI 377，USA)对插入基因的碱基序列与已知碱基序列SEQ ID NO：1进行比较分析，以确认P1基因cDNA是否正确插入。

实施例3：猪水疱病病毒3CD基因cDNA的合成、扩增和克隆

为合成猪水疱病病毒3CD基因的cDNA时，将实施例1中提取的总RNA和反向引物SEQ ID NO：8加到RT premix试剂盒(Bioneer，韩国)的试管中，然后在其中根据厂商的操作手册合成cDNA的第一条链。然后将所述cDNA的第一条链、正向引物DEQ ID NO：7和反向引物SEQ ID NO：8加入到PCR premix试剂盒(Bioneer)的试管中在95℃下加热处理10分钟，以便进行聚合酶链式反应(PCR)。然后，所述cDNA的扩增是在PCR扩增仪(PE 2400；Perkin Elmer)中扩增，以94℃变性1分钟、55℃复性1分钟、72℃延伸2分钟进行30个循环后，最后在72℃下延伸5分钟。

为了实施上述PCR反应，根据美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI，Genbank)上登记的登记号是X54521的猪水疱病病毒P1基因序列合成下述PCR引物：

正向引物：5′-GCCCTCGAGATGGGTCCAGCGTTTGAGTTC-3′(SEQID NO：7)

反向引物：5′-GCTCGGTACCTAAAAGGAGTCCAACCACTT-3′(SEQID NO：8)

为了便于构建下述的杆状病毒表达载体，将正向引物SEQ ID NO：7和反向引物SEQ ID NO：8分别有意插入到5’末端ATG上游的XhoI限制酶切位点和5’末端终止子上游KpnI限制酶切位点。如此扩增的3CD基因cDNA，被克隆到pGEM-T easy载体(Promega，USA)上以构建“pGEMT/3CD”并利用自动测序仪(ABI 377，USA)对插入基因的碱基序列与已知碱基序列SEQ ID NO：3进行比较分析，以确认3CD基因cDNA是否正确插入。

实施例4：插入有猪水疱病病毒P1基因的重组表达载体的构建

利用BamHI和HindIII限制酶消化实施例2中制备的pGEMT/P1载体以提取P1DNA片段。同时利用两种同样的限制酶消化pFastBacDual^TM载体(Invitrogen，USA)，并将所得的P1 DNA片段插入到包含多角体蛋白启动子(P_PH)的载体的基因位点下游，，从而构建插入猪水疱病病毒P1基因的重组杆状病毒表达载体pFastBacDual/P1。

实施例5：插入有猪水疱病病毒P1基因和3CD基因的重组表达载体的构建

利用XhoI和KpnI限制酶消化实施例4中制备的重组杆状病毒表达载体pFastBacDual/P1，并利用两种同样的限制酶消化实施例3中构建的pGEMT/3CD，然后插入到含有P10启动子(P_P10)的pFastBacDual/P1的基因位点下游，从而构建插入猪水疱病病毒的P1和3CD两种基因的重组杆状病毒表达载体pFastBacDual/P1/3CD。图1展示了根据本发明重组杆状病毒表达载体(pFastBacDual/P1/3CD)的结构。

实施例6：在昆虫细胞中的表达和重组杆状病毒的制备

根据本发明的重组杆状病毒(bacmid/P1/3CD)利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen，USA)按下述方式构建。将实施例5中构建的pFastDual/P1/3CD载体转染到含有杆状病毒基因(bacmid)的细胞(DH10Bac)中，以便构建重组杆状病毒DNA(Bacmid/P1/3CD)。

利用重组杆状病毒DNA(bacmid/P1/3CD)制备重组杆状病毒的过程如下：将100μl含有1μg纯化的Bacmid/P1/3CD基因的无血清grace’s培养液与100μl溶解有6μg CellFectin(Invitrogen)的无血清grace’s培养液混合，所得混合液在室温下放置30分钟。同时将在35-mm直径Petri细胞培养皿孔中预培养的浓度达2×10⁶个细胞的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(下文称为“Sf9”)细胞系(GibcoBRL)，用无血清grace’s培养基洗一遍，然后移去培养基。

向所述混合液中加入0.8ml无血清grace’s培养基。然后将所述混合液加入Sf9细胞，然后通过在27℃下培养5小时转染所得细胞。除去所述培养细胞的上清液后，加入含有10％胎牛血清的新鲜grace’s培养基2ml，并将所述细胞在27℃下培养6天，培养过程中观察细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的是否出现。收集转染细胞培养物的上清液进行噬菌斑测定，以便分离得到纯的重组杆状病毒。即，将3×10⁴的Sf9细胞单层应用到35-mm直径的Petri细胞培养皿孔中，然后利用1ml稀释10倍的上述收集的上清液接种Sf9细胞，并在27℃下1小时使所述细胞敏感化。去除上清液后，用含有1％低熔点琼脂糖的grace’s培养液覆盖在所述细胞培养基以在其上形成层，将所得细胞在27℃下培养8天，以证实嗜菌斑的形成。收集一些嗜菌斑后，用这些嗜菌斑转染Sf9细胞后，并将所述细胞培养4天，用于观察是否出现CPE。将收集到的细胞匀浆进行ELISA实验，以选出与猪水疱病病毒特异性单克隆抗体反应的重组杆状病毒(Bacmid/P1/3CD)。

实施例7：利用重组杆状病毒制备猪水疱病病毒样颗粒

首先，利用实施例6中制备的重组杆状病毒(Bacmid/P1/3CD)感染在150-cm²细胞培养瓶中单层培养的Sf9昆虫细胞，在27℃下培养1小时，至感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.1。收集所述感染的细胞，并把所述细胞置于含有200ml细胞浓度为2.0×10⁶/Ml的Sf9昆虫细胞的旋转培养瓶中，接着在27℃下培养4天。收集旋转培养的感染细胞，在500xg下离心20分钟，然后分别收集上清液和感染细胞。所述上清液自身可用作诊断性抗原，所述感染细胞经过以下一系列步骤以制备成诊断性抗原。即，将所述感染细胞以1(细胞培养基)∶20(PBS)的比例悬浮在含有1％Triton X-100的0.01M磷酸缓冲液(PBS)中，然后用超声波破碎仪破碎。然后，将所述细胞培养基在500xg下离心20分钟以只收集到的上清液用作猪水疱病病毒样颗粒。

实施例8：猪水疱病病毒样颗粒的纯化和电子显微照相术(electronmicrophotography)

收集按照与实施例7中相同的方式，在旋转培养瓶中利用重组杆状病毒感染的Sf9细胞培养基。然后，将收集到的培养基反复冻融3次以破碎感染细胞，接着以8000xg离心40分钟以收集上清液。向收集的上清液中加入23g/l的0.5M NaCl和75g/l的7.5％PEG，所得混合物在4℃下反应16小时。然后将反应物以8,000xg离心40分钟以收集富集细胞(pellet)。然后，以1培养基∶50(PBS)的比例在PBS中悬浮所述富集细胞，然后透析两次。以3000xg将所得浓缩的样品离心5分钟以收集上清液。利用氯化铯(CsCl)梯度对所述上清液进行超速离心以纯化猪水疱病病毒样颗粒。更具体地，首先向超速离心机(Beckman，USA)的SW41 Ti超速离心管中加入5.5ml 40％CsCl和5.5ml 5％CsCl，然后小心地向CsCl溶液的上层加入0.5毫升上述浓缩的上清液，并将混合物用SW41Ti转子(Beckmann，USA)以35000rpm的转速离心6小时。回收表现为白色带的部分，按照下述方法进行电子显微照相。

在石蜡膜(parafilm)上加20μl量的上清液，将网格(grid)放在其上漂浮5分钟。用小镊子将网格夹出，并浸泡在1％的乙酸双氧铀中，接着取出在室温下干燥40分钟。然后，利用电子显微镜观察网格上的猪水疱病病毒样颗粒，结果如图3所示。观察结果显示，本发明中制备的猪水疱病病毒样颗粒的大小为25-27nm，与含有核酸的天然病毒的大小(25-30nm)相当。

检测实施例1：利用蛋白质印迹(Western blotting)分析猪水疱病病毒样颗粒

实施例8中纯化的猪水疱病病毒样颗粒蛋白质在NuPAGE NovexBis-Tris胶(Invitrogen，USA)上经电泳分离，然后从电泳胶上转移到硝酸纤维素膜上。用含有5％脱脂乳的封闭液处理所述硝酸纤维素膜，然后分别与转移有几内亚猪阳性血清和猪阳性血清的膜反应。将膜用含有0.05％土温20的PBS(PBST)洗涤，与各种结合碱性磷酸酶的二抗(KPL，USA)反应1小时。用PBST洗涤步骤后，通过加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，BCIP)/氮蓝四唑(Nitrobluetetrazolium，NBT)溶液显影膜上特异性抗原抗体反应的结果，所述结果如图4所示。

从图4中可以看出，用猪水疱病抗体阳性的几内亚猪血清(泳道2和泳道3)和猪水疱病抗体阳性的猪血清(泳道4和泳道5)表现出与猪水疱病病毒样颗粒(泳道2和泳道4)的反应性，该反应性条带(pattern)与猪水疱病病毒颗粒(泳道3和泳道5)的相同。这表明如上所述用电子显微镜观察到的病毒样颗粒是与天然猪水疱病病毒具有相同组分的猪水疱病病毒样颗粒。

检测实施例2：猪水疱病病毒样颗粒抗原性的评价

利用竞争性ELISA实验(competitive ELISA assays，c-ELISA assays)评价并比较根据本发明制备的猪水疱病病毒样颗粒和现有的灭活猪水疱病病毒的抗原性。

1)利用竞争性ELISA实验评价抗原性

用猪水疱病病毒单克隆抗体5B7(猪水疱病病毒中和抗体)包被酶标板(ELISA Plate)在4℃下过夜。然后把猪水疱病病毒和猪水疱病病毒样颗粒分别加到酶标板上，然后与抗体在37℃下反应1小时。用PBST洗涤后，加入猪血清(包括猪水疱病标准阳性血清)在37℃下反应1小时。再向反应混合物中加入辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗体5B7(与上面包被用到的相同)，在37℃下反应1小时。用PBST洗涤后，加入邻苯二胺(OPD)溶液作为染色剂10分钟，然后反应10分钟后，加入硫酸溶液终止反应。然后利用在492nm下的吸光度测量可见反应(visualized reaction)。如下面的公式1所示，每种血清的抗原竞争性反应活性通过血清样品/单克隆抗体混合物的吸光度与单克隆抗体的吸光度成比例的抑制百分比(percent inhibition，PI)计算，结果见下表1。

公式1

PI＝100-(血清/单克隆抗体混合物的吸光度)/(单克隆抗体的吸光度)×100

表1

※两种抗原的反应相关系数：0.997(99.7％)

从表1中可以看出，本发明的猪水疱病病毒样颗粒与灭活猪水疱病病毒抗原的抗原性相关系数为0.997，表明这两种抗原的相似性非常高。

此外，本发明的病毒样颗粒和灭活猪水疱病病毒一样同时被同一种单克隆抗体捕获和检测。这表明本发明的病毒样颗粒至少有两个可以被同一种单克隆抗体识别的暴露的抗原位点，这一点间接地证明了所形成的是病毒样颗粒。

由于上面用到的单克隆抗体5B7对猪水疱病病毒具有中和活性，上述结果表明，本发明的猪水疱病病毒样颗粒具有同天然病毒相同的中和抗原位点。

2)通过间接ELISA实验评价抗原性

用各种猪水疱病病毒单克隆抗体包被酶标板在4℃下过夜。然后把灭活猪水疱病病毒和本发明的猪水疱病病毒样颗粒分别加到酶标板上，然后与抗体在37℃下反应1小时。用PBST洗涤步骤后，加入过氧化物酶偶联单克隆抗体5B7，在37℃下反应1小时。利用PBST洗涤步骤后，加入邻苯二胺(OPD)溶液作为染色剂，反应10分钟后加入硫酸溶液终止反应。然后用在492nm下测量反应溶液的吸光度，并检测猪水疱病病毒和病毒样颗粒。在这点上，通过测量吸光度，比较分析了每种抗原对各种单克隆抗体的反应活性，分析结果如表2所示。

表2

※两类抗原的反应相关系数：0.995(99.5％)

从表2中可以看出，通过比较两种抗原的反应活性可以发现本发明的猪水疱病病毒样颗粒与灭活猪水疱病病毒抗原的反应相关系数为0.995，表明这两种抗原的抗原性非常相似。

以上结果还表明，在进行ELISA实验时，本发明的病毒样颗粒作为诊断性抗原可以代替现有常用的失活病毒。

从以上结果中可以看出，本发明的猪水疱病病毒样颗粒的结构与天然猪水疱病病毒高度相似，在尚未商业化的猪水疱病毒疫苗的开发中，本发明病毒样颗粒的作用使基因重组疫苗的开发成为可能。

工业实用性

从上述实施例中可以看出，利用插入有猪水疱病病毒的P1和3CD两种基因的重组杆状病毒制备本发明病毒样颗粒的本发明方法，在属于肠道病毒属的各种病毒中，尚属首次。

由于本发明的猪水疱病病毒样颗粒与天然猪水疱病病毒的结构和抗原性高度相似，可以把所述猪水疱病病毒样颗粒应用到各种与猪水疱病病毒相关的领域。

根据本发明，在疾病诊断方面，可以用所述猪水疱病病毒样颗粒代替现有的灭活猪水疱病病毒抗原，后者已被用作检测猪水疱病抗体的试剂盒中的诊断性抗原。这样，本发明的病毒样颗粒还具有一个优点在于，制备所述病毒样颗粒不需要进行制备灭活病毒抗原时必须的处理活病毒细胞的危险且复杂的操作。此外，由于本发明病毒样颗粒可以在普通实验室中以安全而简易的方式制备，因而本发明病毒样颗粒作为诊断性抗原高度实用。

在疾病预防方面，由于通过基因重组技术制备的本发明猪水疱病病毒病毒样颗粒具有与天然猪水疱病病毒相似的抗原性，因而它也可以开发为预防性亚单位疫苗。此外，由于在实验室里可以通过基因重组很容易地制备本发明病毒样颗粒，因而使在紧急情况下预防性疫苗的快速安全生产成为可能。另外，由于尚未开发出抗猪水疱病病毒的预防疫苗，因而本发明的猪水疱病病毒样颗粒显示出领先基因重组疫苗的开发可能性。

从前面的叙述中可以看出，本发明制备病毒样颗粒的方法同样可能用于其他各种病毒以及与猪水疱病病毒具有相同遗传结构的肠道病毒属病毒成员。由于本发明的制备方法克服了制备其他肠道病毒属病毒(比如脊髓灰质炎病毒)病毒样颗粒的局限性，因而本发明方法可能也同样适用于除实施例中猪水疱病病毒以外的其他各种肠道病毒。因此，本发明方法有望使各种肠道病毒疾病的诊断性抗原的开发或基因重组疫苗的开发成为可能。

序列表

<110>大韩民国(管理：国立兽医科学检疫院)

<120>通过遗传工程构建的猪水疱病病毒样颗粒及其制备方法

<130>P7506YOL

<150>KR 10-2004-0083994

<151>2004-10-20

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2553

<212>DNA

<213>猪水疱病病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2553)

<400>1

atg gga gct caa gtg tca aca caa aag acc ggt gct cat gag acc agc 48

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Thr Ser

1 5 10 15

ttg agt gca gcg ggc aac tca gtc att cat tac aca aac ata aac tac 96

Leu Ser Ala Ala Gly Asn Ser Val Ile His Tyr Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

tac aag gat gct gct tcg aat tca gca aat aga caa gac ttc aca cag 144

Tyr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Ser Ala Asn Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

gac ccg ggg aag ttc acc gaa cct gtg aaa gac atc atg gtc aaa tcc 192

Asp Pro Gly Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Ile Met Val Lys Ser

50 55 60

atg cct gct ctc aat tcc cca tca gca gag gag tgt ggc tac agt gac 240

Met Pro Ala Leu Asn Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

agg gta aga tcc atc acc tta ggg aat tcg acc ata aca act caa gaa 288

Arg Val Arg Ser Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

tgt gca aac gtg gta gtt gga tat ggg gtg tgg cca act tac ttg aag 336

Cys Ala Asn Val Val Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Thr Tyr Leu Lys

100 105 110

gat gaa gag gca aca gca gag gat caa ccc act caa cca gat gtg gcc 384

Asp Glu Glu Ala Thr Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala

115 120 125

acg tgc agg ttt tac acg ctc gaa tcc gtg atg tgg caa cag agt tca 432

Thr Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Met Trp Gln Gln Ser Ser

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cca ggc tgg tgg tgg aag ttc cct gac gcg ttg tcc aac atg ggg cta 480

Pro Gly Trp Trp Trp Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu

145 150 155 160

ttt ggg caa aat atg cag tac cac tac ctt ggg aga gcc gga tac acg 528

Phe Gly Gln Asn Met Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ala Gly Tyr Thr

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180 185 190

gtg gta tgt gtg cca gaa gca gag atg ggg tgt gcc acg ttg gcc aat 624

Val Val Cys Val Pro Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Th r Leu Ala Asn

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Glu Ser Gln Asn Ser Thr Gly Glu Thr Ala Val Gln Ala Asn Val Ile

225 230 235 240

aat gct ggc atg ggt gtt ggt gtt ggt aat cta act atc ttc ccc cat 768

Asn Ala Gly Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His

245 250 255

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Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro

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370 375 380

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405 410 415

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Ile Leu Asn Tyr Tyr Ala His Trp Ser Gly Ser Ile Lys Leu Thr Phe

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Ser Pro Pro Gly Ala Gly Ala Pro Thr Thr Arg Lys Glu Ala Met Leu

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<213>猪水疱病病毒

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<400>3

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cat gta gga ggg aat gga cac caa ggg ttt tca gcg gca ctc ctc aga 528

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tac ttc agg gca gat gaa cag tac cca ttt ttg gtc cat cct gtc atg 1728

Tyr Phe Arg Ala Asp Glu Gln Tyr Pro Phe Leu Val His Pro Val Met

565 570 575

cca atg aag gat ata cac gaa tcc att agg tgg act aaa gat cct aag 1776

Pro Met Lys Asp Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Pro Lys

580 585 590

aac aca cag gat cac gtg cgc tcg ctg tgt cta ttg gcc tgg cac aac 1824

Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn

595 600 605

ggg gag cac gaa tat gag gag ttt att cgt aag atc aga agc gtc cgc 1872

Gly Glu His Glu Tyr Glu Glu Phe Ile Arg Lys Ile Arg Ser Val Arg

610 615 620

gta ggg cgc tgc ttg tcc ctc cct gcg ttt tca acg ctg cgc agg aag 1920

Val Gly Arg Cys Leu Ser Leu Pro Ala Phe Ser Thr Leu Arg Arg Lys

625 630 635 640

tgg ttg gac tcc ttt 1935

Trp Leu Asp Ser Phe

645

<210>4

<211>645

<212>PRT

<213>猪水疱病病毒

<400>4

Gly Pro Ala Phe Glu Phe Ala Val Ala Met Met Lys Arg Asn Ala Ser

1 5 10 15

Thr Val Lys Thr Glu Tyr Gly Glu Phe Thr Met Leu Gly Ile Tyr Asp

20 25 30

Arg Trp Ala Val Leu Pro Arg His Ala Lys Pro Gly Pro Thr Ile Leu

35 40 45

Met Asn Asp Gln Val Val Gly Val Leu Asp Ala Lys Glu Leu Val Asp

50 55 60

Lys Asp Gly Thr Asn Leu Glu Leu Thr Leu Leu Lys Leu Asn Arg Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Leu Ala Arg Glu Glu Val Glu

85 90 95

Val Asn Glu Ala Val Leu Ala Ile Asn Thr Ser Lys Phe Pro Asn Met

100 105 110

Tyr Ile Pro Val Gly Arg Val Thr Asp Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Gly

115 120 125

Gly Thr Pro Thr Lys Arg Met Leu Met Tyr Asn Phe Pro Thr Arg Ala

130 135 140

Gly Gln Cys Gly Gly Val Leu Met Ser Thr Gly Lys Val Leu Gly Ile

145 150 155 160

His Val Gly Gly Asn Gly His Gln Gly Phe Ser Ala Ala Leu Leu Arg

165 170 175

His Tyr Phe Asn Glu Glu Gln Gly Glu Ile Glu Phe Ile Glu Ser Ser

180 185 190

Lys Asp Ala Gly Phe Pro Val Ile Asn Thr Pro Ser Lys Thr Lys Leu

195 200 205

Glu Pro Ser Val Phe His His Val Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala

210 215 220

Val Leu Arg Asn Gly Asp Pro Arg Leu Lys Ala Asn Phe Glu Glu Ala

225 230 235 240

Ile Phe Ser Lys Tyr Ile Gly Asn Val Asn Thr His Val Asp Glu Tyr

245 250 255

Met Met Glu Ala Val Asp His Tyr Ala Gly Gln Leu Ala Thr Leu Asp

260 265 270

Ile Ser Thr Glu Pro Met Lys Leu Glu Asp Ala Val Tyr Gly Thr Glu

275 280 285

Gly Leu Glu Ala Leu Asp Leu Thr Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Val

290 295 300

Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Ser Lys Lys Thr Arg Asp

305 310 315 320

Leu Thr Lys Leu Lys Glu Cys Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asn Leu Pro

325 330 335

Met Val Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Ala Asp Lys Val Ala

340 345 350

Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val

355 360 365

Ala Met Arg Gln Thr Phe Gly Asn Leu Tyr Lys Thr Phe His Leu Asn

370 375 380

Pro Gly Ile Val Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asp Pro Asp Val Phe

385 390 395 400

Trp Ser Lys Ile Pro Val Met Leu Asp Gly His Leu Ile Ala Phe Asp

405 410 415

Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Thr Cys Leu

420 425 430

Lys Leu Leu Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Thr Asn Lys Glu Thr Asn Tyr

435 440 445

Ile Asp Tyr Leu Cys Asn Ser His His Leu Tyr Arg Asp Lys His Tyr

450 455 460

Phe Val Arg Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe

465 470 475 480

Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Thr Leu Met Leu Lys Val

485 490 495

Tyr Lys Gly Ile Asp Leu Asp Gln Phe Arg Met Ile Ala Tyr Gly Asp

500 505 510

Asp Val Ile Ala Ser Tyr Pro Trp Pro Ile Asp Ala Ser Leu Leu Ala

515 520 525

Glu Ala Gly Lys Asp Tyr Gly Leu Ile Met Thr Pro Ala Asp Lys Gly

530 535 540

Glu Cys Phe Asn Glu Val Thr Trp Thr Asn Val Thr Phe Leu Lys Arg

545 550 555 560

Tyr Phe Arg Ala Asp Glu Gln Tyr Pro Phe Leu Val His Pro Val Met

565 570 575

Pro Met Lys Asp Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Pro Lys

580 585 590

Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn

595 600 605

Gly Glu His Glu Tyr Glu Glu Phe Ile Arg Lys Ile Arg Ser Val Arg

610 615 620

Val Gly Arg Cys Leu Ser Leu Pro Ala Phe Ser Thr Leu Arg Arg Lys

625 630 635 640

Trp Leu Asp Ser Phe

645

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>P1基因的正向引物

<400>5

ggatccatgg gagctcaagt gtcaac 26

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>P1基因的反向引物

<400>6

aagcttaagt ggttttcatg gttgtta 27

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3CD基因的正向引物

<400>7

gccctcgaga tgggtccagc gtttgagttc 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3CD基因的反向引物

<400>8

gctcggtacc taaaaggagt ccaaccactt 30

Claims

1.一种基因重组载体，该基因重组载体中插入的基因为猪水疱病病毒的结构蛋白前体基因和3CD蛋白酶基因，所述猪水疱病病毒的结构蛋白前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒转化有权利要求1所述的基因重组载体。

3.一种昆虫细胞，该昆虫细胞转染有权利要求2所述的重组杆状病毒。

4.根据权利要求3所述的昆虫细胞，其中，所述昆虫细胞为草地夜蛾。

5.一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒由权利要求3或4所述的昆虫细胞生产。

6.一种制备猪水疱病病毒样颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)通过聚合酶链式反应扩增猪水疱病病毒的结构蛋白前体P1基因和3CD蛋白酶基因，所述猪水疱病病毒的结构蛋白前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)使用BamHI和HindIII限制性酶消化杆状病毒表达载体pFastBacDual，之后将P1基因插入到消化后的杆状病毒表达载体pFastBacDual中；

(3)将3CD基因插入到步骤(2)得到的已插入有P1基因的表达载体中；

(4)利用步骤(3)得到的含有P1基因和3CD基因的表达载体转化含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的细胞DH10Bac，得到重组杆状病毒基因；

(5)用步骤(4)中得到的重组杆状病毒基因转染昆虫细胞；

(6)对被转染的昆虫细胞的上清液进行嗜菌斑测定，以分离纯的重组杆状病毒；

(7)用所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，以获得猪水疱病病毒颗粒。

7.一种猪水疱病病毒样颗粒，该猪水疱病病毒样颗粒是由权利要求6所述方法制备的。