CN106317213A

CN106317213A - 一个植物抗逆相关蛋白、编码基因及应用

Info

Publication number: CN106317213A
Application number: CN201510383556.8A
Authority: CN
Inventors: 卢运明; 王磊; 王维部; 赵军; 赵杨敏; 徐秒云; 郑平; 范云六
Original assignee: Shenzhen Nongke Group Co ltd; Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Shenzhen Nongke Group Co ltd; Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2017-01-11

Abstract

本发明一个植物抗逆相关蛋白、编码基因及应用，该植物抗逆相关蛋白ZmNF-YA14是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与开花相关的由a)衍生的蛋白质。本发明还公开了该植物抗逆相关蛋白的编码基因。该植物抗逆相关蛋白、编码基因是可以显著提高植物的耐受非生物胁迫的能力，在调控植物抗逆性方面具有重要的应用前景。

Description

一个植物抗逆相关蛋白、编码基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体的说，涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白ZmNF-YA14、编码基因及应用。

背景技术

干旱、盐渍和寒冻是作物生长常常遇到的恶劣环境条件，严重影响作物的产量和种植面积。生产实践证明，培育和种植抗逆作物品种是保障作物稳产的最经济有效的途径和迫切需求。大量研究表明，植物在干旱缺水和高盐条件引起的渗透胁迫下，其基因表达会发生一系列变化，大量基因被诱导(Skriver and Mundy，1990；Bray，1993；Bartels and Nelson，1994；Zhu et al，1997)。而其中一些渗透胁迫应答基因也能被低温逆境所诱导(Nordin et al，1991；Thomashow，1994；Giraudat，1995)。这些基因的表达产物可分为二类：一类为功能蛋白，直接参与植物细胞抗逆反应，包括各类渗透调节分子生物合成所需的酶类，LEA蛋白(晚期胚胎丰富的蛋白质)，抗冻蛋白，侣伴分子和抗氧化酶类等；另一类为调控蛋白，它们参与植物对逆境信号应答反应过程中的基因表达调节和信号传导，包括转录因子，蛋白激酶以及磷酸肌醇代谢有关的酶。目前编码这两类蛋白的基因，尤其是第一类许多蛋白的基因已经被克隆。逆境信号途径相互交叉形成调控网络，经交流整合后将逆境信号传递到转录因子，通过后者诱导一系列抗逆相关基因的表达(Ishitani et al，1997；Shinozaki，2000)。

核因子(nuclear factor，NF-Y)是一种真核生物中广泛存在的转录因子，能够特异性的结合CCAAT-box，而CCAAT-box作为一种顺式作用元件存在于大约1/4的真核生物基因启动子中。NF-Y是一个三聚体，它包括NF-YA(CBF-B或HAP2)，NF-YB(CBF-A或HAP3)，NF-YC(CBF-C或HAP5)。NF-Y作为保守的转录因子在植物的生长发育和对逆境胁迫响应中扮演着重要的角色。有研究已经发现玉米中的NF-YB可以在不影响产量减少的情况下提高作物的抗旱能力。NF-YA作为三聚体最为重要的组成因子，在结构上它有富含谷氨酰胺和色氨酸或苏氨酸的氮末端，有一个NF-YB/NF-YC结合域，还有一个DNA结合域，而这两个结合域是NF-YA的保守区域。研究发现拟南芥NF-YA5可以提高其抗旱能力，并且这种调控是由脱落酸(abscisic acid，ABA)介导的。另一个研究表明NFYA可以响应各种非生物胁迫而上调表达，NFYA过表达株系会变得矮小，但这种植株对ABA逆境胁迫信号变得极为敏感，从而使耐受非生物胁迫的能力提高。

发明内容

本发明从玉米中分离了一个NF-YA类转录因子ZmNF-YA14，并对其功能进行了研究，表明该基因可以提高玉米对逆境的抵抗能力。

本发明总的目的是从重要农作物玉米中分离得到一种参与植物抗逆应答的NF-YA类转录调控因子及其编码基因，该调控因子可增强植物对逆境的抵抗力。

本发明所提供的蛋白，名称为ZmNF-YA14，来源于玉米B73，属NF-Y类转录因子的A亚基。

本发明采用cDNA文库PCR扩增的方法，获得了ZmNF-YA14基因的全长cDNA序列。ZmNF-YA14基因的编码(coding sequence，CDS)序列906bp(序列1)，编码301个氨基酸(终止子未计入，序列2)。

本发明所克隆的ZmNF-YA14基因产物在细胞核中表达(图1)。

本发明所克隆的ZmNF-YA14基因在逆境条件下受诱导上调表达，如高盐、干旱、ABA等逆境条件均可诱导其表达(图2)。

本发明把ZmNF-YA14基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301上，启动子为Ubiqutin，得到pUBI:NF-YA14质粒(图3)，将其转化到农杆菌EHA105中，用农杆菌转化玉米并获得了转基因植株(图4)。把转基因植株与未转基因的野生型植株在相同盐胁迫条件下进行比较，结果表明，ZmNF-YA14基因能够提高植物的抗逆性(图5)。

附图说明

以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中：

图1为ZmNF-YA14蛋白的亚细胞定位图；图1(A)为细胞核染料染色与绿色荧光蛋白的对比结果，图1(B)为空白对照组与混合显示的对比结果；

图2为ZmNF-YA14蛋白在逆境条件下的表达结果图；图2(A)、2(B)、2(C)分别为干旱、ABA、盐条件的表达结果图；

图3为pUBI:NF-YA14表达载体图谱；

图4为转基因玉米的检测结果图；图4(A)为转基因玉米与对照组喷洒除草剂Basta后的生长状态图，图4(B)为转基因玉米与对照组Bar试纸条检测的对比结果图；

图5为转基因玉米在逆境条件下的抗性试验生长结果图；图5(A)、5(B)、5(C)分别为盐胁迫、PEG、ABA条件的生长结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、玉米ZmNF-YA14基因的cDNA的克隆

以实验室保存的玉米B73的cDNA文库为模板，用如下的引物对进行RT-PCR扩增：

NF-YA14FW：TGGAGCTCAGTGACACCATTTTGT；

NF-YA14RV：CAAAAGGACTTTGCATATTCTTCGCG；

RT-PCR扩增的扩增条件是：

94℃，3min；

72℃，5min。

把扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收并连接到克隆载体pEASY-T1vector上，转化E.coli.TOP10，酶切鉴定后测序。

对B73cDNA文库的扩增产物的测序结果表明：得到cDNA为序列表中序列1所示的基因，将该基因命名为ZmNF-YA14，全长906bp具体序列如下：

ATGTGCCTTTTACGGGAAATGGAGGATCATTCTGTCCATCCAAAGTCTAAGTCTAACCATGGTTCCTTGTCAGGAAATGGTTATGAGATGAAAAATCCAGGCCATGAAGTTTGTGATAGGGATTCATCATCAGAGTCTGATCGATCTCACCCAGAAGCATCAGCAGTGAGTGAAAGCAGTCTAGATGAACACACATCAACTCAATCAGACAATGATGAAGATCATGGGAAGGATAATCAGGACACATTGAAGCCAGTATTGTCCTTGGGGAAGGAAGGGTCTGCCTTTTTGGCCCCAAAAATAGATTACAACCCGTCTTTTCCTTATATTCCTTATACTGCTGACGCTTACTATGGTGGCGTTGGGGTCTTGACAGGATATGCTCCGCATGCCATTGTCCATCCCCAGCAAAATGATACAACAAATAGTCCGGTTATGTTGCCTGCGGAACCTGCAGAAGAAGAACCAATATATGTCAATGCAAAACAATACCATGCGATCCTTAGGAGGAGGCAGACACGTGCTAAACTGGAGGCGCAGAACAAGATGGTGAAAGGTCGGAAGCCATACCTTCATGAGTCTCGACACCGTCATGCCATGAAGCGGGCCCGTGGCTCAGGAGGGCGGTTCCTCAACACAAAGCAGCAGCTCCAGGAGCAGAACCAGCAGTACCAGGCGTCGAGTGGTTCAATGTGCTCAAAGACCATTGGCGACAGCGTAATCTCCCAAAGTGGCCCCATTTGCACGCCCTCTTCTGACGCTGCAGGTGCTTCAGCAGCCAGCCAGGACCGCGGCTGCTTGCCCTCGGTTGGCTTCCGCCCCACAGCCAACTTCAGTGAGCAAGGTGGAGGCGGCTCGAAGCTGGTCGTGAACGGCATGCAGCAGCGTGTTTCCACCATAAGGTGA

上述基因编码301个氨基酸(终止子未计入，即序列中*号未计入)，编码的蛋白的氨基酸序列如下：

MCLLREMEDHSVHPKSKSNHGSLSGNGYEMKNPGHEVCDRDSSSESDRSHPEASAVSESSLDEHTSTQSDNDEDHGKDNQDTLKPVLSLGKEGSAFLAPKIDYNPSFPYIPYTADAYYGGVGVLTGYAPHAIVHPQQNDTTNSPVMLPAEPAEEEPIYVNAKQYHAILRRRQTRAKLEAQNKMVKGRKPYLHESRHRHAMKRARGSGGRFLNTKQQLQEQNQQYQASSGSMCSKTIGDSVISQSGPICTPSSDAAGASAASQDRGCLPSVGFRPTANFSEQGGGGSKLVVNGMQQRVSTIR*

实施例2、玉米ZmNF-YA14亚细胞定位分析

转录因子的特征之一是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为此，利用原生质体转化的方法在玉米原生质体中对玉米ZmNF-YA14蛋白的亚细胞定位进行了研究。

1、玉米叶片原生质体的制备：待玉米长到3片叶子时，选完整无伤害的第二片叶子，剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5mm宽的叶条。将切好的叶条放入预先配置好的酶解液(1.5％CellμLase R10，0.4％macerozyme R10，0.4M mannitol，20mM KCl，20mM MES，pH 5.7，10mM CaCl2，and 0.1％BSA)中(每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子)。并用镊子使叶子完全浸入酶解液，50转/分钟，震荡条件下酶解5～7h。

2、原生质体的转化：

1)100g离心10分钟使原生质体沉淀在管底，然后用适量MMG溶液(0.4M mannitol，15mM MgCl2，and 4mM MES，pH 5.7)重悬原生质体，使之最终浓度为2×10⁵个/ml。

2)每100μL原生质体加入10μL DNA(10微克约5-10kb的质粒DNA)至2ml离心管中，轻柔混合。

3)加入等体积110μL PEG溶液(40％PEG[v/v]，0.2M mannitol，and0.1M CaCl2)，轻柔拍打离心管完全混合。诱导转化混合物10分钟。

4)100g离心2分钟去上清后，用1ml WI溶液(0.5M mannitol，20mM KCl4mM，MES，pH5.7)轻柔重悬原生质体。

5)室温下(20-25℃)诱导原生质体14小时以上。在诱导12小时的时候取一部分原生质体用5mg/mL核染料Hoechst33342(CalBiochem)染色0.5～2h。以上所有操作均在室温下进行。

3、GFP表达情况观察：在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达，结果表明，ZmNF-YA14定位于细胞核中。图1示出了ZmNF-YA14蛋白的亚细胞定位情况；图1(A)为细胞核染料染色与绿色荧光蛋白的对比结果，图1(B)为空白对照组与混合显示的对比结果，如图1(A)所示，ZmNF-YA14-GFP(绿色荧光蛋白，上部)的显示位置与细胞核染料Hochest的染色结果(蓝色，下部)重叠，相互印证。

实施例3、ZmNF-YA14在非生物逆境条件下的表达分析

1、玉米材料的处理：

取玉米种子，经10％H₂O₂表面消毒，无菌水清洗3遍之后，吸胀6h，然后置于两层滤纸上，28℃黑暗中萌发两天之后，将出芽一致的小苗种植于花盆蛭石中，白天28℃，夜间24℃，14h/10h光周期培养至出两片完整叶子，再转移置1/2Hoagland培养液中，一天后转移至全营养Hoagland继续培养，待长出三叶一芯，进行不同条件的处理。

1)PEG模拟旱处理：将玉米苗置于含16％PEG的培养液中，白天28℃，夜间24℃，14h/10h光周期培养，分别在0h，4h，12h，24h，48h和15天时，取根，用液氮速冻，-80℃保存备用。

2)ABA处理：将玉米苗置于50uM的ABA溶液中，与上面相同条件培养，分别在0h，4h，12h，24h，48h和15天时，取根，用液氮速冻，-80℃保存备用。

3)盐处理：分别将玉米苗置于125mM的NaCl溶液中，与上面相同条件培养，分别在0h，4h，12h，24h，48h和15天时，取根，用液氮速冻，-80℃保存备用。

4)对照的处理：直接取未经任何处理的苗，-80℃冻存，作为对照。

2、RNA的提取及DNA的去除：

1)取约200mg处理的玉米材料，液氮研磨，用Trizol试剂(Invitrogen)提取RNA。

2)将RNA溶于85μL水中，加入10×buffer 10μL和5μL RQ1RNAFree DNase(1U/μL)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

3)加入100μL的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μL的水中。

4)定量RNA的浓度为1μg/μL。

3、RT-qPCR：

按照Promega公司的GoScript^TM Reverse Transcription System(PromegaA5000)进行操作，

1)取1μL Oligo dT₁₈(0.5μg/μL)，5μL RNA(1μg/μL)，1μL dNTP(10mM)，27μL水；65℃，5min；0℃，2min；

2)加入10μL 5×buffer，5μL DTT(100mM)，10U RNase Inhibitor(40U/μL)；42℃，2～5min；

3)加入1μL M-MLV(200μg/μL)；42℃，50min；70℃，15min灭活，备用。

将cDNA稀释3倍作为荧光定量PCR的模板。玉米TubμLin5基因(GRMZM2G099167_T01)作为内参。引物设计如下：

ZmTub5FW：CTCACGCATCGACCACAAG

ZmTub5RV：CTTCCATACCCTCACCGACA

荧光定量用promega公司的qPCR Master Mix在ABI 7500上采用两步法进行。

qPCR反应体系：1μL模板，10μL 2×PCR buffer，0.5μL 10mMprimer FW，0.5μL 10mM primer RV，8μL H₂O。

PCR条件：

95℃，10min；

72℃，5min。

采用2^-ΔΔCt法计算不同处理条件下ZmNF-YA14的表达量。图2示出了ZmNF-YA14蛋白在逆境条件下的表达结果；图2(A)、2(B)、2(C)分别为干旱、ABA、盐条件的表达结果图，结果表明ZmNF-YA14基因在48小时内受干旱、ABA、盐等逆境条件的诱导上调表达，继续逆境处理达到15天时，在盐胁迫条件下ZmNF-YA14仍然维持在上调表达水平，但在干旱和ABA胁迫条件下，ZmNF-YA14下调表达。

实施例4、pUBI:NF-YA14表达载体的构建

1)设计扩增ZmNF-YA14cDNA全长的引物，

ZmNF-YA14FW：5’-TGGAGCTCAGTGACACCATTTTGTAATGC-3’，ZmNF-YA14RV：5’-CAAAAGGACTTTGCATATTCTTCGCG-3’，以cDNA文库为模板，进行PCR扩增；

2)扩增产物进行回收，回收后产物和pEASY-T1连接，转化，通过酶切和测序鉴定转化子获得阳性克隆pTNFYA14。

3)设计将ZmNF-YA14cDNA全长重组克隆到表达载体的引物，在上下游引物的前端分别加上一段载体的序列，

ZmNF-YA14FW2：

GCGTGGATCCGAGCTCACTGGAGCTCAGTGACACCATTTTGT，

ZmNF-YA14RV2:

GTCACCTGTAATTCACACCAAAAGGACTTTGCATATTCTTCGCG；

4)以pTNFYA14为模板，进行PCR扩增；

5)扩增产物进行回收，回收后产物和改造过的pCAMBIA3301m进行重组反应，所用试剂为GBclonart Seamless Cloning Kit，反应体系为GBclonart反应液15μL，PCR产物(40ng/μL)3.5μL，pCAMBIA3301m(100ng/μL)1μL，H₂O 0.5μL，45℃，30min。

6)酶切鉴定阳性克隆，阳性克隆即为pUBI:NF-YA14载体，图3示出了pUBI:NF-YA14表达载体图谱。将阳性克隆进行测序验证，获得阳性质粒，用于后续实验。

实施例5、pUBI:NF-YA14转基因玉米的获得

1、农杆菌转化及玉米转化：将实施案例5中获得的植物表达载体pUBI:NF-YA14转化到农杆菌EHA105中。玉米转化方法参照Frameet al.，进行。

2、转基因玉米PCR检测

正向引物：

ZmNF-YA14FW:5’-TGGAGCTCAGTGACACCATTTTGTAATGC-3’

反向引物：

NOS 60:5’-CAACAGGATTCAATCTTAAGAAAC-3’

反应体系(20μL)：1μL转基因植株DNA(20ng～50ng)；2μL10×buffer；2μL MgCl₂(2.5mM)；0.2μL Taq酶；2μL dNTP(2.5mM)；引物各加10μM；加无菌水至20μL。

反应条件：

94℃，5分钟；

72℃延伸5分钟。

筛选出PCR阳性植株。

3、转基因玉米Basta叶面喷洒检测及Bar试纸条检测

图4示出了转基因玉米的检测结果；图4(A)示出了转基因玉米与对照组喷洒除草剂Basta后的生长状态，图4(B)示出了转基因玉米与对照组Bar试纸条检测的对比结果。

如图4(A)所示，待PCR阳性植株长至5-6片叶时，用1000倍稀释的Basta喷施，每周一次，连续喷施3周后观察植株存活情况，实验组的阳性转基因玉米的生长状态明显好于对照组的阴性玉米。

如图4(B)所示，参照乐士宁公司QualiPlate^TM Kit操作说明，取直径0.5cm左右PCR阳性植株叶片2个、阴性植株叶片1个，于250μL提取缓冲液中研磨30s，待大颗粒沉淀之后，将Bar检测试纸条浸入缓冲液中，立即观察条带显色情况，转化阳性植株具有目的条带，转化阴性植株不具有目的条带。

实施例7、pUBI:NF-YA14转基因玉米耐逆性鉴定

按照实施实例3中所述方法处理玉米材料，待玉米植株长至三叶一芯期，分别用加有17％PEG，100uMABA和175mMNaCl的hoagland溶液，处理4天。图5示出转基因玉米在逆境条件下的抗性试验生长结果图；图5(A)、5(B)、5(C)分别为盐胁迫、PEG、ABA条件的生长结果图，如图所示，过表达ZmNF-YA14玉米株系在盐胁迫条件下生长显著优于野生型对照，在PEG和ABA条件下其抗性也有提高，表明该基因可以提高植物对逆境的抵抗能力。

Claims

1.一种植物抗逆相关蛋白，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与开花相关的由a）衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述植物抗逆相关蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因是如下1）或2）或3）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列1；

2）在严格条件下与序列1限定的DNA片段杂交且与植物抗逆相关蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）的基因具有90％以上的同源性，且编码与植物抗逆相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.权利要求1所述植物抗逆相关蛋白、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述重组表达载体在转基因植物中的应用。