CN116655761A - 枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，公开了枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrTGA2基因是从极抗寒枳（Poncirus trifoliata）中分离、克隆出的转录因子，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因分别构建超表达和干涉载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入柠檬和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrTGA2基因具有控制植物抗寒性的功能。该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用，申请人从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到1个转录调控因子PtrTGA2，将该基因在不抗寒柠檬中超表达，获得的转基因植株抗寒性明显提高。
背景技术
低温是限制作物生长发育及产量的重要环境因素，引起植物褪绿、生长发育受阻，甚至导致植株死亡。在微观层面则表现为低温引起植物体内ROS积累，造成氧化损伤、蛋白质失活变性，进而导致代谢紊乱、光合作用被抑制(Pearce 2001，Foyer et al 2002)。长时间零度以下的低温会引起细胞膜流动性变弱，细胞内冰晶形成，破坏细胞结构，细胞内容物流出，最终导致细胞死亡(Steponkus 1984)。植物通过改变代谢通路基因的表达及积累大量的保护物质(包括脯氨酸、甜菜碱、多胺及可溶性糖等)，以抵御低温带来的伤害，这些抗冻物质通过稳定细胞渗透压，维持低温下的细胞结构、保持细胞膜流动性、促进ROS清除来发挥作用(Kaplan and Guy 2004，Chinnusamy et al 2007，Baier et al 2019，Chai etal 2019)。
转录因子是植物生长发育、逆境响应等生命活动中重要的调控者，通过蛋白-蛋白互作、或靶向调节下游基因表达来行使功能(Zhu et al 2016)。同时，转录因子也可能受其他转录因子调控，或者被蛋白激酶活化/抑制。大量研究发现，转录因子通过调控低温诱导的COR基因，参与植物的逆境应答(Klepikova et al 2019，Wu et al 2021)。
bZIP(basic leucine zipper)转录因子家族具有高度保守的bZIP结构域及亮氨酸拉链结构域的典型特征。作为一个庞大的转录因子家族，bZIP家族的各个成员在植物的生长发育以及应对非生物胁迫中发挥着重要的作用(Jakoby and Vicente-carbajosa2002)。已经多个物种中发现了bZIP家族基因调控低温逆境应答。DgbZIP2/DgbZIP2通过激活DgPOD增强菊花的抗寒性(Bai et al 2022)。除了积极的正调控作用，bZIP转录因子也被发现负调控低温抗性，bZIP68在玉米驯化过程中，启动子区域缺失了一个358bp的片段，导致bZIP68的表达增加，玉米的耐寒性降低(Li et al 2022)。还有研究发现，bZIP家族转录因子HY5(LONG HYPOCOTYL 5)与MYB15-CBFs构成转录级联在番茄低温响应中起重要作用(Zhang et al2020)，HY5还被证实能够激活赤霉素GA失活酶GA2ox4和ABA合酶SlNCED6的表达，通过不同激素信号协同调控植物在低温下的生长(Cataláet al 2011)。CmABF1(Abscisic acid responsive element-binding factor 1)通过CmADC(Argininedecarboxylase，精氨酸脱羧酶)介导的腐胺合成正调控甜瓜的耐寒性(Li et al 2022)。
TGA(TGACG-BINDING FACTOR)基因是植物bZIP转录因子家族的重要成员，在植物的免疫响应中起着主导的调控作用。因其通过启动子上TGACG保守序列的activationsequence-1(as-1)元件调控靶基因而得名(Garretón et al 2002)。TGA基因与SA介导的病原菌信号通路紧密相关，SA信号的转导依赖于TGA转录因子(Fan and Dong 2002)。当植物受到病原菌侵染时，体内的水杨酸快速积累，水杨酸受体NPR1进入细胞核与TGA蛋白结合，共同激活下游防御相关的PRs基因(Kinkema et al 2000)。在拟南芥tga2 tga5 tga6三突变体中，SA诱导的PRs表达不能被激活(Zander et al 2014，Qi et al 2022)。除了在生物胁迫中发挥着至关重要的作用，TGA亚家族成员TGA2、TGA5、TGA6还能通过调控GSTU(glutathione S-transferase Tau subfamily)基因提高ROS清除能力以应对UV胁迫(Herrera-Vásquez et al 2021)。除了传导SA信号，还有研究发现TGA基因可以直接或间接地影响内源SA的水平。OsTGA5可以作为一个负调控因子，通过抑制内源SA的积累，减弱对稻瘟病抗性相关基因转录来降低抗病性(Niu et al 2022)。过表达水稻OsTGAL1影响了SA代谢途径基因的转录，降低了内源SA水平，导致了对病原菌的敏感性增强(Li et al 2022)。然而，TGA转录因子在低温响应方面的研究仍鲜少报道，因此，解析TGA转录因子的低温抗性作用机制，对作物抗寒育种具有重要价值。
由于柑橘植物低温抗性较弱，因此低温是限制柑橘栽培地理分布的主要因素，解析柑橘逆境响应机制，并以此为理论基础培育抗寒品种、开发生产中应用的抗冻保护剂成为了柑橘育种研究的当务之急。枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)作为目前我国最常见的柑橘砧木，低温驯化后可以耐-26℃，被认为是挖掘抗寒基因的重要资源。因此，分离并鉴定枳抗寒相关基因是丰富柑橘抗逆基因资源库，及揭示枳低温抗性机制的关键和基础。
发明内容
本发明目的在于提供了枳转录因子PtrTGA2，所述的枳转录因子PtrTGA2为SEQ IDNO.1所示。
本发明另一目的在于提供了枳转录因子PtrTGA2在控制植物抗寒性状中的应用。将该基因在植物中超表达或沉默表达，可获得抗寒能力增强或减弱的植株。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施
申请人基于植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrTGA2，其中PtrTGA2基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示，核苷酸为SEQ ID NO.1所示，该基因包含1233bp的开放阅读框，编码410个氨基酸，等电点为6.78，预测的分子量为45.49kDa。
表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物质也为本发明的保护范围，所述的物质为含有编码SEQ ID NO.2的多核苷酸的表达框，重组载体或重组微生物。
本发明的保护范围还包括：
SEQ ID NO.2所示蛋白、编码SEQ ID NO.2所示蛋白的多核苷酸或表达SEQ IDNO.2所示蛋白的物质在控制植物抗寒性中的应用；
以上所述的应用中，优选的，所述的植物为枳或柠檬；
以上所述的应用中，优选的，所述的调控是敲除、抑制或者沉默枳中SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来减弱植物的抗寒性。
以上所述的应用中，优选的，所述的沉默是利用权利要求2所述的多核苷酸构建干涉载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在植物中进行干涉。
以上所述的应用中，优选的，所述的调控是增强SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来增强植物的抗寒性。
以上所述的应用中，优选的，所述的增强是构建含有编码SEQ ID NO.2所示蛋白基因的超表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在枳或柠檬中进行表达。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人通过用qRT-PCR技术分析了在低温处理后PtrTGA2基因的相对表达量，结果表明PtrTGA2的表达水平均随低温处理时间的延长而提高。此外，对低温处理前后超表达PtrTGA2转基因植株的表型及相关生理指标进行分析，结果表明：相对于野生型植株，PtrTGA2超表达植株具有更强的抗寒性。此外，与野生型相比，转基因植株Fv/Fm及脯氨酸含量显著较高，电导率、MDA含量较低。然而，PtrTGA2干涉植株的表型和生理数据则与之相反，表明PtrTGA2基因是一个正调控抗寒性的基因。
枳抗寒基因PtrTGA2的克隆分离，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
附图说明
图1是本发明的技术流程图。
图2是本发明PtrTGA2响应低温胁迫处理的表达模式示意图；
其中：A是PtrTGA2基因在低温(4℃)处理下的相对表达量；B，PtrTGA2启动子瞬时转化愈伤的GUS染色；C，量化分析。
图3是本发明PtrTGA2亚细胞定位分析；
其中：A是本发明的PtrTGA2基因亚细胞定位载体构建示意图；B是本发明的PtrTGA2蛋白亚细胞定位结果。
图4是本发明PtrTGA2转录激活活性检测示意图；
其中：A是本发明的PtrTGA2基因转录激活载体构建示意图；B是本发明的PtrTGA2转录激活活性检测的活体荧光成像结果。C是本发明的PtrTGA2转录激活活性检测的LUC/REN检测结果。
图5是本发明VIGS沉默材料(简称TRV2-PtrTGA2)相对表达量分析示意图；
其中：A是本发明的PtrTGA2基因特异引物鉴定阳性植株；B是PtrTGA2干涉材料(TRV2-PtrTGA2)中PtrTGA2表达水平分析，C是PtrTGA2干涉材料(TRV2-PtrTGA2)中的PtrP5CS1表达量分析。
图6是枳PtrTGA2基因沉默植株相对表达量分析及脯氨酸含量示意图；
其中：A是PtrTGA2干涉材料(TRV2-PtrTGA2)中PtrTGA2及PtrP5CS1表达水平分析，B是PtrTGA2干涉材料(TRV2-PtrTGA2)中的脯氨酸含量分析。
图7是枳PtrTGA2基因沉默植株抗寒性分析示意图；
其中：A是低温处理处理前后空载TRV2、干涉植株TRV2-PtrTGA2的表型；B是干涉枳低温处理前后的叶绿素荧光表型图；C是干涉枳低温处理前后的Fv/Fm值；D是干涉枳低温处理前后的相对电导率；E是干涉枳低温处理前后的MDA含量。
图8是本发明PtrTGA2转基因柠檬相对表达量分析示意图；
其中：A是本发明的柠檬遗传转化过程(a-d)：(a)柠檬生芽培养；(b)芽伸长增殖培养；(c)生根培养；B是本发明的PtrTGA2基因特异引物鉴定阳性植株，其中，“M”表示DNAmarker，“P”表示阳性对照质粒(pGWB411-PtrTGA2)；“WT”表示野生型柠檬；“w”表示water(蒸馏水)；C是实时荧光定量检测PtrTGA2过表达柠檬中PtrTGA2的表达水平；D是实时荧光定量检测PtrTGA2过表达柠檬中ClP5CS1的表达水平。
图9是本发明转PtrTGA2基因柠檬低温处理表型和生理指标测定示意图；
其中：A是低温处理前后PtrTGA2转基因柠檬(#5，#6)和野生型柠檬的脯氨酸含量；B是柠檬处理后表型；C是柠檬低温处理前后叶绿素荧光表型图；D是柠檬低温处理前后的Fv/Fm值；E是柠檬处理前后相对电导率；F是柠檬处理前后MDA含量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：枳PtrTGA2基因全长cDNA的克隆
以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：
PtrTGA2-F：5’-ATGGAGAATGCTGTTGACCTTAGC-3’
PtrTGA2-R：5’-CTCCCGTGGCCGGGCCAGCCAGAG-3’
采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒对扩增得到产物进行纯化回收，利用DNA无缝克隆技术，将纯化产物连接到pEASY-Blunt载体，连接体系见表3，然后将连接产物转化DH5α感受态细胞(唯地，中国)，涂板，摇菌，然后进行阳性鉴定(GenStar，中国)，阳性鉴定体系见表4。获得阳性克隆后，送武汉天一华煜基因科技有限公司测序，根据测序结果，获得PtrTGA2的基因全长序列。
测序结果显示，PtrTGA2基因CDS序列长度为1233bp，编码410个氨基酸，该蛋白的分子量为45.49kD，等电点为6.78，多核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
表1基因扩增体系
表2基因扩增PCR程序
表3 pEASY-Blunt载体连接体系
表4阳性鉴定反应体系
实施例2：低温条件处理下PtrTGA2的表达分析
取2个月苗龄且长势相同的野生型枳实生苗，放置于低温培养箱(HP400G-E型，瑞华，中国)中进行低温处理(4℃)，取样时间点为0h、6h、24h、72h、120h。各时间点采取叶片后迅速放入液氮冷冻，之后置于-80℃冰箱冷藏备用，用于后续的基因表达模式分析。
采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对PtrTGA2基因的低温表达模式进行分析，实时荧光定量PCR采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂，方法参照说明书。配制好的反应体系采用QuantStudioTM 7Flex Real-Time PCR荧光定量分析仪进行反应。
以枳中Actin作为内参基因(正向引物：5’-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3’；反向引物：5’-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3’)，采用2-ΔΔCt算法对基因表达进行计算。PtrTGA2实时定量引物(正向引物：5’-GAAAGTACGGGACGCCTGAA-3’；反向引物：5’-CACCAAGCTGAGACTTCCCC-3’)。
表5qRT-PCR反应体系
表6qPCR反应程序
本实验结果表明，PtrTGA2基因表达量(图2中A)表达量持续受低温诱导，在72h时表达量最高，和处理前相比增加了约11倍(图2中A)。表明PtrTGA2是冷诱导基因，可能在植物抗寒胁迫中发挥着重要的作用。
实施例3：PtrTGA2基因启动子瞬时转化愈伤的GUS染色分析
1.载体构建
本实验基于枳壳全基因数据库中PtrTGA2基因启动子序列，设计特异引物，用高保真酶(诺维赞，中国)以枳gDNA为模板进行扩增，扩增反应体系和程序参照表1和表2，连接pEASY中间载体后测序，确认proPtrTGA2启动子序列。扩增引物序列如下：
proPtrTGA2-F：5’-TGACCGTCACGCTTCTTCTC-3’
proPtrTGA2-R：5’-GGTCAACAGCATTCTCCATGTG-3’
采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒(Axygene，USA)对扩增得到产物进行纯化回收，纯化产物与pEASY-Blunt载体(全式金，中国)进行连接，连接体系见表3，室温孵育5min后转化大肠杆菌感受态DH5α。涂板，挑取单克隆，然后进行PCR阳性鉴定，阳性鉴定体系见表4，获得阳性克隆后送武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序，根据测序结果，获得PtrTGA2基因启动子序列。
以上一步测序正确的质粒为模板，设计特异引物扩增在5’端各添加线性化载体末端15-20bp序列作为同源序列，以此引物对扩增得到带有同源序列的插入片段。采用OneStep Cloning Kit(诺唯赞，中国)，插入连接到DX2181G载体上PstⅠ和BamHⅠ两个酶切位点之间，具体方法见表7，构建好的载体经测序正确后转入GV3101感受态。所用引物如下：
proPtrTGA2-DX-F：
5’-CTACAGCGCTAAGCTTGGCTGCAGGGATGATGGTCAGGTGCCTT-3’
proPtrTGA2-DX-R：
5’-AAGGGACTGACCACCCGGGATCCGGTCAACAGCATTCTCCATGTG-3’
表7一步法连接酶反应体系
2.甜橙愈伤瞬时转化
1)悬浮愈伤组织：将生长良好的甜橙愈伤组织转移到50mL的MT液体培养基中进行培养，于常温暗室摇床(25℃，120r/min)上摇散，约5d；
2)活化农杆菌：取-80℃保存的农杆菌，用无菌接种环在LB固体培养基(含载体抗性的抗生素)中划线，于28℃培养箱倒置培养2d至长出单克隆；
扩大培养：挑取第一次划线的单克隆，接种到10mL的LB液体培养基上(含载体抗性的抗性素)小摇活化，再吸取1mL小摇菌液至50mL新鲜培养基28℃过夜大摇培养；
3)制备侵染液：8000r/min，5min，离心集菌，用10mL的MT悬浮培养基清洗一次，离心弃上清，最后悬浮于MT悬浮培养基中，调节OD600值为0.6-0.8，到50mL左右含50mg/LAS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的悬浮培养基(MT+0.5g/L麦芽糖浸粉+1.5g/L L-谷氨酰胺)，28℃摇床200r/min侵染20min；
4)侵染与培养：将摇散的愈伤组织静置45min，轻柔地倒尽上层液体，用无菌的勺子或镊子转移愈伤，平铺于铺有无菌滤纸的玻璃皿中干燥愈伤(超净工作台中低风速静置40min左右，或至吸干水分即可)，再将其倒入农杆菌侵染液中，于28℃摇床侵染10min，再静置30min，同样方法干燥愈伤，再次转移愈伤至铺有无菌滤纸的共培培养基(MT固体培养基+50mg/L AS)中，常温暗室共培养3d。
3.GUS染色分析
采用GUS染色试剂盒(coolaber，SL7160，中国)对甜橙愈伤进行GUS染色，通过Image J软件对GUS染色结果进行量化。
本实验结果表明，未经低温处理的proPtrTGA2:GUS转化的愈伤呈浅蓝色，而proPtrTGA2:GUS转化的愈伤组织在低温后蓝色显著加深，DX2181G空载转化的对照组在低温前后均没有染上颜色(图2中B-C)，表明低温能够增强PtrTGA2启动子活性，进一步证明PtrTGA2受到低温强烈诱导表达。
实施例4：PtrTGA2亚细胞定位和转录激活活性分析
扩增PtrTGA2的CDS区域(不含终止密码子)，并融合到载体pYFP101(含YFP蛋白)上，由CaMV35S启动子驱动表达。以实施例1中获得的测序正确的质粒为模板，设计特异引物扩增在5’端各添加线性化载体末端15-20bp序列作为同源序列，以此引物对扩增得到带有同源序列的插入片段。采用One Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)，插入连接到pYFP101载体上EcoRI和BamHⅠ两个酶切位点之间，具体方法见表7，构建好的载体经测序正确后转入GV3101感受态。所用引物如下：
YFP-PtrTGA2-F(EcoRI)：
5’-ATGGGATCTACTAGTGAATTCATGGAGAATGCTGTTGACCTTAGC-3’
YFP-PtrTGA2-R(BamHⅠ)：
5’-GGGGGTACCGTCGACGGATCCCTCCCGTGGCCGGGCCAGCCAGAG-3’
之后将对照35S:YFP+mCherry，35S:PtrTGA2-YFP+mCherry分别瞬时转化到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的叶片表皮细胞，激光共聚焦显微镜观察荧光发现对照的荧光充满整个表皮细胞，包括细胞质与细胞核，而转化35S:PtrTGA2-YFP+mCherry的荧光仅在核基质中检测到(图3中A)，表明PtrTGA2是细胞核定位蛋白。
为了检测PtrTGA2转录因子的转录激活活性，将PtrTGA2基因CDS全长构建到pBD载体上，该载体含有5个拷贝的GAL4结合元件，由CaMV 35S启动子驱动表达。采用One StepCloning Kit(诺唯赞，中国)，插入连接到pBD载体上AgeI和StuI两个酶切位点之间，具体方法见表7。所用引物如下：
pBD-PtrTGA2-F(AgeI)：
5’-AGTTGACTGTATCGCCGACCGGTATGGAGAATGCTGTTGACCTTAGC-3’
pBD-PtrTGA2-R(StuI)：
5’-TAATGAAACCAGAGTTAAAGGCCTCTCCCGTGGCCGGGCCAGCCAGAG-3’
将构建成功的效应子和报告子(图4中A)转化到含有pSoup辅助质粒的A.tumefaciens GV3101菌株中。将细菌悬浮液注射到本式烟草叶片中，并在22℃下培养2d。将D-luciferine试剂涂抹在叶片的近轴侧，并使用LB983 NightOWL II with indiGOSoftware软件对LUC荧光进行可视化分析。实验结果表明，当含有PtrTGA2的效应子和报告子共同注射烟草后，叶片呈现出较强的LUC荧光信号，证实PtrTGA2具有转录激活活性(图4中B-C)。综上结果表明PtrTGA2是具有转录激活活性，且定位在细胞核的转录因子。
实施例5：VIGS干涉枳阳性苗鉴定
采用VIGS介导的方法，在枳中干涉PtrTGA2基因。
以枳cDNA为模板，设计特异引物扩增PtrTGA2基因3’端非保守区域290bp的片段，并采用One Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)，一步法插入连接到pTRV2载体上BamHI及SmaI两个酶切位点之间，具体方法见表7，构建好的载体经测序正确后转入GV3101感受态，构建pTRV2-PtrTGA2农杆菌，同时将pTRV1、pTRV2分别转入GV3101感受态。
构建载体的引物如下：
pTRV2-PtrTGA2-F(BamHI)：
5’-AGAAGGCCTCCATGGGGATCCTGAGCAGCAGTTGGTAGGC-3’；
pTRV2-PtrTGA2-R(SmaI)：
5’-TGTCTTCGGGACATGCCCGGGCACGAGCTGATTGTCGGGT-3’。
通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对VIGS干涉植株中PtrTGA2基因的表达量进行了检测。荧光定量PCR的引物同实施例2。
结果表明，与对照植株(TRV2)相比，PtrTGA2基因相对于空载被抑制至40％以下(图5中C)，普遍具有较低表达量。以上结果说明，VIGS具有较高的干涉效率，PtrTGA2基因在VIGS植株中成功被干涉。按抑制程度将TRV2-PtrTGA2干涉材料分为2个池——PtrTGA2表达相对高(TRV2-PtrTGA2-1，PtrTGA2表达水平为TRV2空载对照的30％-40％)，PtrTGA2抑制程度更高，即PtrTGA2基因表达更低(TRV2-PtrTGA2-2，PtrTGA2表达水平为TRV2空载对照的0％-20％)，对阳性VIGS植株进行后续抗寒性分析。
实施例6：VIGS干涉枳的抗寒性鉴定
选取干涉效果较好的两个月龄的VIGS植株和对照植株，进行低温抗性鉴定，qRT-PCR结果显示，在正常条件下，表型上没有明显差异。然而，与低温处理(-4℃处理8h)后的TRV2对照相比，VIGS植株表现出显著的冷敏感表型(图6中A)，处理后VIGS植株叶绿素荧光信号较弱(图6中B)，最大光合速率值Fv/Fm显著低于对照植株(图6中C，每组左起第一个为TRV2对照组)，且含有较高的电导率与MDA含量(图6中D，图6中E，每组左起第一个为TRV对照组)。此外，与TRV2空载对照组相比，在TRV2-PtrTGA2植株中，脯氨酸合成基因PtrP5CS1的抑制程度及脯氨酸含量也与PtrTGA2的表达水平相一致(图7中A-B)。综上所述，干涉PtrTGA2基因，降低了植株活性氧的清除能力，且抑制了脯氨酸的合成，严重削弱了植株的抗寒性，综上结果证明了PtrTGA2在提高植物抗寒性中的重要作用，说明沉默或抑制该基因的表达会增加植株的冷敏感性。
实施例7：植物转化载体构建
1.植物转化载体构建
以枳cDNA为模板，设计引物将PtrTGA2基因全长扩增，引物序列为：
pDONR221-PtrTGA2-F：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGAGAATGCTGTTGACCTTA GC-3’
pDONR221-PtrTGA2-R：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTCCCGTGGCCGGGCCAGCCAGA G-3’
扩增回收后与pDONR211中间载体进行BP反应连接，使用方法参见BPClonaseTMⅡ试剂盒说明书，具体的反应体系见表8，将经过测序正确的阳性克隆菌摇菌。之后用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，并与目的载体pGWB411进行LR反应，方法参照/>LR ClonaseTMⅡ(Invitrogen)试剂盒说明书，LR反应体系见表9，随后即可进行大肠杆菌感受态转化，经阳性鉴定后摇菌，提取质粒，获得最后的超表达载体pGWB411-PtrTGA2，其中扩增片段回收、阳性克隆检测及送样测序等步骤的方法参照实施例1，最后将载体转入农杆菌感受态GV3101备用。
表8BP反应体系
表9LR反应体系
实施例8：柠檬遗传转化及阳性苗鉴定
1.柠檬遗传转化
1)植物材料准备
取新鲜柠檬柠檬种子，浸泡于1mol/L NaOH中大约15min，去除果胶，然后用水洗净，将种子置于超净工作台中，用2％的NaClO浸泡灭菌15min，倒掉NaClO用无菌水洗涤3-4次。将灭菌后的种子放置于已加入少许灭菌水的三角瓶中，最后将种子置于4℃冰箱中保存。
在超净工作台上用镊子剥掉种子的外种皮和内种皮，接种于MT固体培养基上，黑暗培养4-6周左右，转化前将其置于光照下7-10d直至实生苗转绿。在此期间活化农杆菌，制备侵染所需的菌液。
2)农杆菌侵染液制备
在无菌操作台上，使用灭菌的接种环挑取-80℃保存的pGWB411-PtrTGA2农杆菌，在含有50mg/L Spec(Spectinomycin，壮观霉素)的培养基上划线活化，将培养基放入28℃培养箱中暗培养2d。挑取单克隆接种于新的含有50mg/L壮观霉素的培养基上，然后置于培养箱继续培养2d。取一个灭菌的100mL的小三角瓶倒入50mL含有20mg/L AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的MT液体培养基。将已长好的农杆菌刮下溶于含有20mg/LAS的MT液体培养基，28℃条件下，200r/min振荡20min(此期间切取柠檬茎段)，用MT液体培养基调整菌液浓度至OD600值为0.6-0.8。
3)外植体准备
将柠檬实生苗取出放置于灭菌后的铺有滤纸的大培养皿中进行切段，将柠檬实生苗切成大约1.5cm左右长的茎段。向灭菌后的三角瓶中加少量MT液体培养基浸没切好的茎段以保湿。
4)侵染与共培养
向装有切好的茎段的三角瓶中加入制备好的农杆菌菌液，震荡大约20min之后完成侵染。倒掉菌液，将茎段取出放在无菌吸水纸上除去茎段表面的菌液。将表面清除菌液后的茎段均匀摆放到铺有滤纸的共培养培养基。之后遮光暗培养，放置于25℃条件下培养3d。
5)筛选培养与再生
将暗培养3d的茎段取出放入灭菌后的小三角瓶中，用无菌水浸泡清洗3-5次。把茎段放置于无菌吸水纸上直至吸干水分，然后用镊子将茎段转移到筛选培养基上，黑暗条件下培养至再生芽大于0.5cm时将其切下，放入生芽培养基中。至再生芽2cm大小时，转移到生根培养基上。实验中所用培养基配方表10所示。
表10转化各阶段所用培养基
2.阳性苗鉴定
当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：
1)取少量叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表11；
2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；
3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈混匀10min，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；
4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；
5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3次，弃酒精，于通风橱内风干；
6)每管加入20-30μL ddH2O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。
浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo,USA)测量，其OD260/OD280比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。
以提取的DNA为模板，利用鉴定引物，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(结果见图8中A和B)，鉴定植株阳性引物序列为：
35S-F：5’-CCCACTATCCTTCGCAAGACC-3’
PtrTGA-R：CTCCCGTGGCCGGGCCAGCCAGAG-3’
表11 CTAB提取液配方
通过实时荧光定量分析了转基因柠檬中PtrTGA2的表达量，结果显示，相对野生型WT，PtrTGA2转基因柠檬(#5，#6)中PtrTGA2基因的相对表达量(图8中C)明显升高，将阳性转基因柠檬OE-PtrTGA2用于后续抗寒性分析。
实施例9：转基因柠檬抗寒性分析
PtrTGA2转基因柠檬(#5，#6)和野生型柠檬(WT)被用于低温抗性鉴定。在低温处理前，WT和OE-PtrTGA2过表达系之间的表型差异不显著，而低温处理(0℃，6h)后，野生型柠檬叶片严重萎蔫、水渍化，甚至死亡，而OE-PtrTGA2植株仍生长良好(图9中B，每组左起第一个为WT组)。叶绿素荧光参数Fv/Fm值用于衡量PSⅡ反应中心光能的转化效率，当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低，与野生型柠檬相比，超表达柠檬显示出更强的叶绿素荧光(图9中C)和更高的Fv/Fm值(图9中D，每组左起第一个为WT组)，说明野生型在低温胁迫下伤害程度更大。在低温处理前，野生型WT和转基因柠檬之间的相对电导率和MDA含量无明显差异，但经过低温处理后，与超表达柠檬相比，野生型柠檬在低温处理后的相对电导率较高(图9中E)，且积累了较低的MDA含量(图9中F)，说明野生型柠檬低温损伤更为严重。此外，在低温处理前，脯氨酸的含量在转基因植株中明显高于WT，并且在低温处理后，OE-PtrTGA2植株积累了更多的渗透保护物质脯氨酸(图9中A)。综上所述，通过表型观察以及各项生理数据测定表明，超表达PtrTGA2基因使转基因柠檬具有更高的耐寒抗冻能力。
Claims (10)
1. 一种从枳（Poncirus trifoliata）中分离出的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸。
3. 根据权利要求2所述的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
4. 表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物质，所述的物质为含有编码SEQ ID NO.2的多核苷酸的表达框，重组载体或重组微生物。
5.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述的物质在控制植物抗寒性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的植物为枳或柠檬。
7. 根据权利要求6所述的应用，所述的调控是敲除、抑制或者沉默SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来减弱植物的抗寒性。
8.根据权利要求7所述的应用，所述的沉默是利用权利要求2所述的多核苷酸构建干涉载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在枳或柠檬中进行干涉。
9. 根据权利要求6所述的应用，所述的调控是增强SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因的表达量来增强植物的抗寒性。
10. 根据权利要求9所述的应用，所述的增强是构建含有编码SEQ ID NO.2所示蛋白基因的超表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化将其在枳或柠檬中进行表达。
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