CN110938597A - 一种扩增造血干细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本文提供一种扩增造血干细胞的方法及其应用。具体而言，本文提供一种扩增造血干细胞的方法，所述方法包括将包含造血干细胞的起始细胞与JNK信号通路抑制剂接触。本文还提供包含JNK信号通路抑制剂的用于扩增造血干细胞的培养基和试剂盒，以及通过所述的方法、培养基和/或试剂盒获得的具有扩增的造血干细胞的细胞群和包含所述细胞群的组合物。本文提供的方法、培养基和/或试剂盒能够实现造血干细胞的有效扩增。
Description
技术领域
本发明涉及造血干细胞领域。具体而言，本发明体外扩增造血干细胞的培养方法及其应用。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cell，简称HSC)，是一类具有高度自我更新能力和多谱系分化潜能的血液细胞。根据文献报道，一颗造血干细胞就能重建整个血液系统。其主要来源于人体骨髓(bone marrow，BM)、动员的外周血(peripheral blood，PB)、脐带血(umbilical cord blood，UCB)等组织。
临床上主要应用造血干细胞治疗白血病和淋巴瘤等恶性血液疾病、相关代谢病、自身免疫性疾病和获得性免疫缺陷症等。由于BM和PB中来源的HSC数量有限，导致临床上有40％左右的病人由于HLA配型失败，只能采用保守治疗的方法。近二十年，世界范围内脐带血来源的HSC储存量随时间递增，已经达到一定的数量级别，同时由于UCB来源的HSC免疫原性低，体内重建能力强，已经逐步被公众所关注，开展了上万例的临床探究实验，并取得良好的治疗效果。尽管UCB拥有诸多优点，但是由于一份脐带血中所含的HSC数量有限，极大地限制了其在临床上的广泛应用。体外扩增HSC将解决这个临床应用的重大难题。如何优化和完善体外扩增HSC培养体系，获得更多高质量的HSC是当前最迫切需要解决的问题。
早期研究发现，利用细胞生长因子SCF、Flt-3L、TPO、IL-3、IL-6等，可以体外扩增HSC，但是体内功能验证试验结果不好。后续一些信号通路的激活剂和抑制剂被相继发现在维持和扩增HSC上有正向作用，例如Wnt信号通路激活剂CHIR、mTOR信号抑制剂Rapamycin、AhR通路抑制剂SR1等，虽然取得长足进步，体外扩增效果明显，但是以上小分子或相关蛋白只是扩增了造血祖细胞，而对真正的LT-HSC并没有明显的扩增效果。2014年，UM729/UM171小分子被发现及改造后，已能够实现对LT-HSC的体外扩增，但是由于该小分子的作用机理研究得不够清楚，其临床结果尚有待观察，该领域所面临的HSC不足的问题仍未能有效解决。因此，研究新的化学小分子和相关信号通路以此扩增HSC仍具有重大价值。
发明内容
本文研究发现JNK信号通路抑制剂如JNK-IN-8能够在体外有效扩增HSC，实现体外高效扩增具备长期造血重建能力的HSC(long term HSC，LT-HSC)。
因此，在本发明的一些实施方案中，提供一种扩增造血干细胞的方法，所述方法包括将包含造血干细胞的起始细胞与JNK信号通路抑制剂接触。
如上所述，已经发现JNK信号通路抑制剂如JNK-IN-8能够在体外有效扩增HSC，所述扩增通过特异性JNK信号通路，通过抑制c-Jun蛋白的磷酸化，降低c-Jun mRNA的表达量，实现JNK的抑制作用，达到扩增HSC的结果；已经通过shRNA敲低c-Jun的表达，实现CD34+CD45RA-CD38-CD90+细胞群的扩增。
因此，在本发明的一些实施方案中，所述JNK信号通路抑制剂是特异性JNK信号通路的抑制剂。在本发明的一些实施方案中，所述JNK信号通路抑制剂是抑制c-Jun蛋白的磷酸化的抑制剂。在本发明的一些实施方案中，所述JNK信号通路抑制剂是降低c-Jun mRNA的表达量的抑制剂。在本发明的一些实施方案中，所述JNK信号通路抑制剂不干扰AhR信号通路。在本发明的一些实施方案中，所述JNK信号通路抑制剂不抑制红系基因表达。在本发明的一些实施方案中，所述JNK信号通路抑制剂的非限制性实例包括JNK-IN-5、JNK-IN-6、JNK-IN-7、JNK-IN-8、JNK-IN-9、JNK-IN-10、JNK-IN-11、JNK-IN-12、AS601245、和c-Jun表达抑制剂如shRNA、siRNA、RNAi、Protein。
在本发明的一些实施方案中，所述方法在体内、体外或离体进行。在本发明的一些实施方案中，所述方法包括将含有造血干细胞的起始细胞在JNK信号通路抑制剂存在下进行离体培养，从而扩增造血干细胞。在本发明的一些实施方案中，扩增的造血干细胞可以用于治疗患者相应的疾病。在本发明的一些实施方案中，所述方法是体内方法。在本发明的一些实施方案中，所述方法是体外方法。在本发明的一些实施方案中，所述方法是离体方法。
在本发明的一些实施方案中，本文所述造血干细胞HSC包括多向性干细胞、多能性干细胞和/或特殊的造血细胞系的干细胞。造血干细胞可包括CD34+细胞。造血干细胞可以获自血液产品，例如未分级的骨髓、脐带、外周血、肝、胸腺、淋巴和脾。可用本领域技术人员已知的方法从血液产品富集具有造血干细胞特性的细胞。在本发明的一些实施方案中，所述干细胞是哺乳动物优选人的干细胞。在本发明的一些实施方案中，所述干细胞可以通过不同来源获得，例如来自骨髓，例如来自脐带血，例如来自动员的外周血细胞。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞富含CD34+细胞，例如通过层析或磁珠从脐带血纯化的CD34+细胞。
在本发明的一些实施方案中，提供一种用于扩增造血干细胞的培养基，其包含所述JNK信号通路抑制剂，并任选包含一种或多种外源添加物如LDL和一种或多种细胞因子如Flt3-L、SCF和TPO。在本发明的一些实施方案中，所述培养基包含JNK信号通路抑制剂、外源添加物LDL、细胞因子Flt3-L、SCF和TPO。在本发明的一些实施方案中，所述培养基包括基础培养基如stemspan培养基。在本发明的一些实施方案中，所述每100ml stemspan基础培养基包含10～100ng/ml SCF，10～100ng/ml Flt-3L，10～100ng/ml TPO，1～100ug/ml LDL(低密度脂蛋白)，1～5μMJNK信号通路抑制剂如JNK-IN-8。
在本发明的一些实施方案中，提供一种用于扩增造血干细胞的试剂盒，其包含所述JNK信号通路抑制剂，并任选包含一种或多种外源添加物如LDL和一种或多种细胞因子如Flt3-L、SCF和TPO，和使用说明书。
在本发明的一些实施方案中，提供一种组合物或混合物，其包含造血干细胞和用于扩增所述造血干细胞的JNK信号通路抑制剂。
在本发明的一些实施方案中，提供JNK信号通路抑制剂用于扩增造血干细胞的用途。
在本发明的一些实施方案中，提供通过本文所述的方法、培养基和/或试剂盒获得的具有扩增的造血干细胞的细胞群。
在本发明的一些实施方案中，提供一种组合物，其包含通过本文所述的方法、培养基和/或试剂盒获得的具有扩增的造血干细胞的细胞群和药用载体。
在本发明的一些实施方案中，所述扩增的造血干细胞包括增加干细胞数目，例如至少增加10％以上、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、50倍、100倍或更多。
在本发明的一些实施方案中，提供一种增加干细胞和/或祖细胞数目的方法；所述方法包括使干细胞与JNK信号通路抑制剂接触。
在本发明的一些实施方案中，JNK信号通路抑制剂例如以1pM至10μM、例如10pM至100μM的浓度添加到细胞培养基中。
在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞群在存在JNK信号通路抑制剂的情况下培养约3天至约90天，例如约7至约35天。
在本发明的一些实施方案中，提供通过所述方法、培养基和/或试剂盒获得的具有扩增的造血干细胞的细胞群。在本发明的一些实施方案中，提供包含重悬于适于施用给受试者的赋形剂中的所述细胞群的组合物。在本发明的一些实施方案中，所述组合物包含至少105个细胞、107个细胞、108个细胞或109个细胞的细胞总数，其中总细胞的20-100％是CD34+细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述组合物用于哺乳动物同种异体造血干细胞移植。在本发明的一些实施方案中，所述组合物用于治疗血细胞生成受损的患者。在本发明的一些实施方案中，所述患者患有遗传免疫缺陷、自身免疫病或造血系统病症。在本发明的一些实施方案中，所述造血系统病症包括例如急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤、何杰金病、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、重型珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞性贫血、重症联合免疫缺陷、嗜血细胞性淋巴组织细胞增生和先天性代谢缺陷。在本发明的一些实施方案中，所述组合物适于静脉内输注，所述组合物包含至少104个细胞/kg输液，优选105个细胞/kg和109个细胞/kg。
附图说明
图1：造血干细胞的分化。
图2：JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8体外扩增富集HSC的CD34+CD45RA-CD38-CD90+细胞群，第7天，扩增20倍，相比于对照组，呈现显著性差异。
图3：JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8体内移植重建能力提高，体内重建比例追踪，相比于对照组，扩增组在外周血中重建比例随时间显著提高。
图4：JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8实际扩增LT-HSC约4倍。
具体实施方式
利用小分子高通量筛选平台，本文研究发现JNK信号通路抑制剂如JNK-IN-8能够在体外有效扩增HSC，实现体外高效扩增具备长期造血重建能力的HSC(long term HSC，LT-HSC)。已经发现所述扩增通过特异性JNK信号通路，通过抑制c-Jun蛋白的磷酸化，降低c-Jun mRNA的表达量，实现JNK的抑制作用，达到扩增HSC的结果；已经通过shRNA敲低c-Jun的表达，实现CD34+CD45RA-CD38-CD90+细胞群的扩增。
细胞培养方法：
将50～150ml脐带血以1∶2比例加入磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释；
将稀释液缓慢加入以盛有15ml人淋巴分离液的50ml离心管中，加到50ml刻度线为准；
4～25℃温度下，1500～2000rpm离心15～25min；
取离心管液体中间白色细胞层，吸取干净，并按照1∶3比例稀释于PBS中；
4～25℃温度下，2000rpm离心10min，吸走上清液，取底部细胞团块；
采用磁珠分选方法(MACS)，分离得到CD34+干祖细胞群；
用配好的含有JNK-IN-8的扩增培养基和含有DMSO的培养基培养(DMSO为对照组)，放置于37℃温度，5％CO2浓度的培养箱中；
每2天，半量更换培养基；
培养第7天，检测CD34+CD45RA-CD38-CD90+绝对数量，相对于原代细胞量和对照组计算扩增倍数；
同时，将培养到第10天的扩增后细胞移植到免疫缺陷小鼠骨髓中，每月检测小鼠外周血中人源细胞重建比例；
移植后21周，检测免疫缺陷小鼠骨髓中人源细胞重建比例，计算LT-HSC扩增倍数。
细胞培养基成分：
通过所述方法，发现MAPK信号通路下游的JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8能够实现体外扩增富集HSC的CD34+CD45RA-CD38-CD90+细胞群高达20倍(见图2)，并且体内移植重建能力提高了6倍(见图3、4)。同时，JNK-IN-8，是特异的JNK信号通路抑制剂，通过抑制c-Jun蛋白的磷酸化，降低c-Jun mRNA的表达量，实现JNK的抑制作用，达到扩增HSC的结果。
图2显示JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8体外扩增富集HSC的CD34+CD45RA-CD38-CD90+细胞群，第7天，扩增20倍，相比于对照组，呈现显著性差异。
图3显示体内重建比例追踪，相比于对照组，扩增组在外周血中重建比例随时间显著提高。
图4显示JNK-IN-8实际扩增LT-HSC约4倍。
研究发现JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8能够扩增LT-HSC，维持免疫缺陷小鼠的造血重建时间长达6个月。JNK信号通路抑制剂特异性作用于JNK信号通路的下游靶点c-Jun，通过降低c-Jun蛋白磷酸化，抑制JNK信号通路，从而实现体外扩增HSC。JNK信号通路抑制剂JNK-IN-8在作用机理与以往报道的小分子化合物不同，即不干扰AhR信号通路，也不抑制红系基因表达。已经通过分子实验(shRNA)敲低c-Jun的表达实现CD34+CD45RA-CD38-CD90+细胞群的扩增，从而证明了JNK-IN-8小分子明确的作用机理。
Claims (10)
1.一种扩增造血干细胞的方法，所述方法包括将包含造血干细胞的起始细胞与JNK信号通路抑制剂接触。
2.权利要求1的方法，其中所述JNK信号通路抑制剂包括JNK-IN-5、JNK-IN-6、JNK-IN-7、JNK-IN-8、JNK-IN-9、JNK-IN-10、JNK-IN-11、JNK-IN-12、SP-600125、AS601245、和c-Jun表达抑制剂如shRNA、siRNA、RNAi、Protein。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法在体内、体外或离体进行，优选所述方法包括将含有造血干细胞的起始细胞在JNK信号通路抑制剂存在下进行离体培养。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述干细胞可以来自以下来源：例如来自骨髓，例如来自脐带血，例如来自动员的外周血细胞，优选所述起始细胞富含CD34+细胞，例如通过层析或磁珠从脐带血纯化的CD34+细胞。
5.一种用于扩增造血干细胞的培养基，其包含权利要求1-4任一项限定的JNK信号通路抑制剂，并任选包含一种或多种外源添加物如LDL和一种或多种细胞因子如Flt3-L、SCF和TPO。
6.一种用于扩增造血干细胞的试剂盒，其包含权利要求1-4任一项限定的JNK信号通路抑制剂，并任选包含一种或多种外源添加物如LDL和一种或多种细胞因子如Flt3-L、SCF和TPO，和使用说明书。
7.一种组合物，其包含造血干细胞和用于扩增所述造血干细胞的JNK信号通路抑制剂。
8.JNK信号通路抑制剂用于扩增造血干细胞的用途。
9.通过权利要求1-4任一项所述的方法、权利要求5的培养基和/或权利要求6的试剂盒获得的具有扩增的造血干细胞的细胞群。
10.一种组合物，其包含权利要求9的细胞群和药用载体。
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