CN117106061A - 靶向巨细胞病毒抗原的tcr和表达其的t细胞及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向巨细胞病毒抗原的TCR和表达其的T细胞及应用，具体的本发明公开了一种HLA‑A*0201限制性靶向巨细胞病毒pp65抗原表位的特异性T细胞及其应用，该T细胞携带的T细胞受体可特异性靶向CMV‑pp65，并精准且快速地清除CMV病毒。

Description

靶向巨细胞病毒抗原的TCR和表达其的T细胞及应用
技术领域
本发明涉及能够识别源自巨细胞病毒抗原肽的TCR，表达上述TCR的巨细胞病毒特异性的T细胞，及他们在预防和治疗巨细胞病毒相关疾病中的用途。
背景技术
巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)归属于人疱疹病毒科β亚科，具有明显的宿主种属特异性，是人疱疹病毒科中最大、结构也最复杂的病毒；CMV在人群中感染非常广泛，成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。近年来CMV感染的诊治取得了长足进步，使得移植后CMV感染的发病率有了明显下降，但CMV感染在异基因干细胞移植(allo-HSCT)患者中仍然保持了较高的发生率，其导致的间接效应，如继发性植入功能不良、GVHD、全因死亡率等对患者的预后仍产生巨大的影响。而现有抗CMV药物也存在诸多不足，如剂型单一、靶点相似、可导致粒细胞缺乏/肾损害等。当前抗病毒药物，如acyclovir，ganciclovir等常常引起严重的副作用，如骨髓抑制等。
人巨细胞病毒(HCMV)含有约20-25种蛋白质,其中在介导HCMV感染和病毒复制中有3种蛋白作用最为重要,即由ORF UL83编码的pp65蛋白、ORF UL82编码的磷蛋白pp71和ORF UL69编码的pUL69蛋白。上述3种蛋白共同的特点是启动HCMV对宿主细胞的感染和病毒的复制，同时在逃逸T淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有重要作用。研究表明，在上述3种蛋白中又以pp65蛋白引起移植物血管病变和排斥反应的作用最为严重。因allo-HSCT引起的免疫受损，会使潜伏的HCMV再激活，从而导致严重的临床并发症。
近年来，以免疫检查点抑制剂、CAR-T(Chimeric Antibody Receptor EngineeredT Cell)和以TCR-T(T cell Receptor Engineered T Cell)为代表的细胞免疫治疗在肿瘤治疗领域取得了重大进展。TCR-T治疗即是通过捕获针对肿瘤抗原或特定病毒抗原的特异性TCR，并应用基因工程技术改造T细胞，输注体内后可达到治疗肿瘤或清除病毒感染的目的。
allo-HSCT患者由于免疫功能低下，不能有效清除CMV，易发生原发性CMV感染或潜伏的CMV再激活。HSCT患者的CMV感染/再激活发生后，可引起CMV相关发热直至器官累及的系列相关性疾病，与疾病复发和受试者生存密切相关，且当前常规药物治疗效果较差。因此，如果能将CMV-TCR-T细胞疗法应用于治疗和预防HSCT或其他器官移植后的CMV感染领域，极具临床价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HLA-A*0201限制性靶向巨细胞病毒抗原表位pp65的特异性TCR、表达该TCR的TCR-T细胞及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种T细胞受体(TCR)，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列为CAFPYNNNDMRF(SEQ ID NO.13)；和/或
所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列为CASSLEGYTEAFF(SEQ ID NO.21)。
在另一优选例中，所述TCR特异性结合NLVPMVATV-HLA-A*0201复合物。
在另一优选例中，所述TCRα链可变域的3个互补决定区(CDR)为：
α-CDR1：SSNFYA(SEQ ID NO.9)，
α-CDR2：MTLNGDE(SEQ ID NO.11)，
α-CDR3：CAFPYNNNDMRF(SEQ ID NO.13)。
在另一优选例中，所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：
β-CDR 1：MNHEY(SEQ ID NO.17)，
β-CDR 2：SMNVEV(SEQ ID NO.19)，
β-CDR 3：CASSLEGYTEAFF(SEQ ID NO.21)。
在另一优选例中，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO.7具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO.15具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述TCR包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.7。
在另一优选例中，所述TCR包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.15。
在另一优选例中，所述TCR为αβ异质二聚体，其包含TCRα链恒定区TRAC*01和TCRβ链恒定区TRBC1*01或TRBC2*01。
在另一优选例中，所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在另一优选例中，所述TCR的β链氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
在另一优选例中，所述TCR的α链与β链之间含有人工链间二硫键。
在另一优选例中，所述TCR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供了一种多价TCR复合物，其包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为本发明第一方面所述的TCR。
本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互补序列。
在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ IDNO.8。
在另一优选例中，所述的核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ IDNO.16。
在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRα链的核苷酸序列SEQ ID NO.4。
在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRβ链的核苷酸序列SEQ ID NO.6。
在另一优选例中，所述核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO.2。
本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。
本发明的第五方面，提供了一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。
本发明的第六方面，提供了一种细胞，所述细胞转导本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体；优选地，所述细胞为T细胞或干细胞。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的TCR、本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞。
本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的T细胞受体、或本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞的用途，用于制备治疗巨细胞病毒相关疾病的药物。
本发明的第九方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的T细胞受体、或本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞、或本发明第七方面所述的药物组合物；
优选地，所述的疾病为巨细胞病毒感染相关的疾病(巨细胞病毒感染症)，如CMV视网膜炎、CMV肺炎、CMV胃肠炎和CMV脑炎等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：CMV-pp65-TCR-T的特异性刺激及筛选流程；
图2：CMV-pp65-TCR-T细胞体外特异性扩增结果；
图3：CMV-pp65-TCR-T载体信息；
图4：CMV-pp65-TCR-T体外结合验证；
图5：CMV-pp65-TCR-T体外激活验证；
图6：CMV-pp65-TCR-T体外杀伤验证；
图7：CMV-pp65-TCR-T体内杀伤验证-皮下植瘤模型；
图8：CMV-pp65-TCR-T体内杀伤验证-转移模型。
具体实施方式
本发明公开了一种HLA-A*0201限制性靶向巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)pp65抗原表位NLVPMVATV的特异性T细胞及其应用，该T细胞携带的T细胞受体(T cellreceptor，TCR)可特异性靶向CMV-pp65，并精准且快速地清除CMV病毒。CMV-pp65高亲和力的TCR基因经慢病毒感染T细胞后，可制备CMV-pp65特异性的TCR-T细胞。CMV-pp65-TCR-T细胞一方面可直接通过精准靶向作用快速清除CMV病毒；另一方面还可间接通过TCR-T细胞介导的免疫重建，对病毒的彻底清除和防止再感染发挥长期保护作用。因此，本发明的pp65抗原表位特异性的pp65-TCR-T细胞，能够特异性的结合并杀伤HLA-A*0201限制性表达CMVpp65抗原的靶细胞，可为CMV相关疾病的TCR-T治疗提供一种新的临床方案，将其应用于治疗和预防HSCT或其他器官移植后的CMV感染领域，极具临床价值和应用前景。
术语
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质，可以是Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子。因此，其对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的MHC，能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
T细胞受体(TCR)，是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义上讲，α和β各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定域序列为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区。
在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。
天然链间二硫键与人工链间二硫键
在天然TCR的近膜区Cα与Cβ链间存在一组二硫键，本发明中称为“天然链间二硫键”。在本发明中，将人工引入的，位置与天然链间二硫键的位置不同的链间共价二硫键称为“人工链间二硫键”。
发明详述
TCR分子
在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后通过MHC分子携带至细胞表面。T细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此，本发明的第一方面提供了一种能够结合NLVPMVATV-HLA-A*0201复合物的TCR分子。优选地，所述TCR分子是分离的或纯化的。该TCR的α和β链各具有3个互补决定区(CDR)。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述TCR的α链包含具有以下氨基酸序列的CDR：
α-CDR1：SSNFYA(SEQ ID NO.9)，
α-CDR2：MTLNGDE(SEQ ID NO.11)，
α-CDR3：CAFPYNNNDMRF(SEQ ID NO.13)。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述TCR的β链包含具有以下氨基酸序列的CDR：
β-CDR 1：MNHEY(SEQ ID NO.17)，
β-CDR 2：SMNVEV(SEQ ID NO.19)，
β-CDR 3：CASSLEGYTEAFF(SEQ ID NO.21)。
可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此，本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。
本发明TCRα链可变域为与SEQ ID NO.7具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本发明TCRβ链可变域为与SEQ ID NO.15具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列。
在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。具体地，一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域，所述α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO.9)、CDR2(SEQ ID NO.11)和CDR3(SEQ ID NO.13)。优选地，所述TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.7。更优选地，所述TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.7。另一方面，所述异质二聚TCR分子的β链包含可变域和恒定域，所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO.17)、CDR2(SEQ ID NO.19)和CDR3(SEQ ID NO.21)。优选地，所述TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.15。更优选地，所述TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.15。
在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子是由α链的部分或全部和/或β链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根据文献中所述，本领域技术人员能够容易地构建包含本发明CDRs区的单链TCR分子。具体地，所述单链TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，优选地按照从N端到C端的顺序连接。
所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO.9)、CDR2(SEQ ID NO.11)和CDR3(SEQ ID NO.13)。优选地，所述单链TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.7。更优选地，所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ IDNO.7。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO.17)、CDR2(SEQ ID NO.19)和CDR3(SEQ ID NO.21)。优选地，所述单链TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.15。更优选地，所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.15。
在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子的恒定域是人或鼠的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如，本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。优选地，本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，和/或β链的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二硫键。应注意，恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键，本发明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。
可以对本发明的TCR恒定区进行改造，以阻止与内源性TCR链的错配。为此，本发明的TCR中，在其α和β链恒定域的残基间引入了人工二硫键。
另外，本发明的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如，有研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此，本发明TCR可包含人可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。因此，在其用于过继性T细胞治疗时应当有调节方案来进行免疫抑制，以允许表达鼠科的T细胞的植入。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
核酸分子
本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一个或多个CDR，α和/或β链的可变域，以及α链和/或β链。
编码本发明第一方面TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下：
αCDR1-TCCAGCAATTTCTACGCC(SEQ ID NO.10)
αCDR2-ATGACCCTCAACGGCGATGAA(SEQ ID NO.12)
αCDR3-TGTGCTTTTCCTTATAACAACAACGATATGAGGTTC(SEQ ID NO.14)
编码本发明第一方面TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下：
βCDR1-ATGAACCATGAATAC(SEQ ID NO.18)
βCDR2-TCTATGAATGTGGAGGTG(SEQ ID NO.20)
βCDR3-TGCGCTTCCTCCCTCGAGGGGTACACCGAGGCATTTTTT(SEQ ID NO.22)
因此，编码本发明TCRα链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.10、SEQID NO.12和SEQ ID NO.14，和/或编码本发明TCRβ链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.22。
本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的，该核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含内含子。优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽，例如编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.8和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQID NO.16。更优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.6。或者，本发明核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
应理解，由于遗传密码的简并，不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以本发明中的其中一个例子来说明，“简并的变异体”是指编码具有SEQ ID NO.1的蛋白序列，但与SEQ ID NO.2的序列有差别的核酸序列。
核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。
载体
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体，包括表达载体，即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
优选地，载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中，例如T细胞中，使得该细胞表达抗原特异性的TCR。理想的情况下，该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。
细胞
本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自：原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞、293T细胞等。
另外，本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞，特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如，该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。
备选地，本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞，如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞表面不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。
有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如，Rosenberg等.，(2008)Nat RevCancer8(4)：299-308)。
巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)相关疾病
本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防CMV相关疾病的方法，其包括过继性转移CMV特异性T细胞至该受试者的步骤。该CMV特异性T细胞可识别主要CMV基质磷蛋白pp65。该CMV特异性T细胞可识别表位NLVPMVATV。
CMV是遍在的人疱疹病毒，其感染约50％的正常个体。在多数病例中，免疫反应能够通过识别CMV衍生的抗原而控制急性感染。该病毒然后以潜伏状态一直存在于宿主的一生当中。外生长受到免疫系统效应因子机制的阻止，包括针对病毒膜蛋白的中和抗体、HLA限制性的CMV特异性辅助和细胞毒性T细胞以及MHC限制性的效应因子。
CMV感染对于某些高危群体是重要的。感染风险的主要范围包括产前或产后婴儿，以及免疫妥协个体，诸如器官移植接受者、白血病患者或感染人免疫缺陷病毒(HIV)的人群。
一般存在三种临床形式的CMV感染，包括：
(1)新生儿CMV包涵体病，其可能是从无症状至影响肝、脾和中枢神经系统、可能产生残疾的严重疾病；
(2)急性获得性CMV感染，其类似于传染性单核细胞增多症，会表现出发烧、不适、骨骼肌疼痛等症状；
(3)免疫妥协人员(例如，移植过器官的人或患有HIV的人)CMV感染，其具有CMV视网膜炎、CMV肺炎、CMV胃肠炎和CMV脑炎的风险。
本发明的TCR可用于治疗和/或预防同种异体造血干细胞移植后潜伏CMV的再活化。
Allo-HSCT接受者的CMV疾病被认为主要产生自潜伏病毒的再活化。病毒的传播可发生自供体骨髓输注或产生自同种异体血液制品。在免疫妥协的骨髓移植接受者中，病毒再活化通常导致渐进的CMV感染，其为这一患者群体中感染性发病率和死亡率的主要原因。渐进CMV感染是这些患者在移植后的免疫抑制和延缓的免疫复原这两者的结果。
在本发明的方法中，例如应用本发明的表达CMV-特异性T细胞受体的T细胞对Allo-HSCT接受者进行过继性免疫治疗。
预防和治疗方法
术语“预防”是指避免、延缓、阻抗或阻碍疾病的进展。例如可以预防或降低CMV感染和/或CMV再活化的可能性。
本文所使用的“治疗”是指用于缓解、治愈或减少疾病的症状，或减少或阻止疾病的进展。
可以通过分离患有相关疾病的病人或志愿者的T细胞，并将本发明的TCR导入上述T细胞中，随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行预防或治疗。
因此，本发明提供了一种治疗CMV相关疾病的方法，包括将分离的表达本发明TCR的T细胞，优选地，该T细胞来源于病人本身，输入到病人体内。一般地，包括：
(1)分离病人的T细胞；
(2)用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞；
(3)将基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。
分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的TCR可直接通过精准靶向作用快速清除CMV病毒；
(2)本发明的TCR体内蛋白表达量高且与内源性TCR链无错配；
(3)表达本发明TCR的T细胞杀伤力能力强，特异性强等，可以有效用于造血干细胞移植(HSCT)患者或其他移植患者CMV感染的治疗。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1体外诱导单核细胞(Monocytes)分化至树突细胞(DC细胞)
(1)使用淋巴细胞分离液(Lymphoprep)密度梯度离心法获取健康供者/患者血液中PBMCs(或复苏已冻存的PBMCs)，使用细胞毒性T淋巴细胞培养基(cytotoxic Tlymphocyte medium)重悬后，350g，5min离心后去除上清，加入适量DC细胞培养基重悬PBMCs至6孔板中，培养箱中培养2h后，吸除培养基和结块的非贴壁细胞。
(2)每孔沿侧壁轻轻加入3ml含终浓度为1×DC Differentiation Supplement(GM-CSF与IL-4)的DC细胞培养基(DC medium)，将6孔板放置于37℃，5％ CO2培养箱中培养5d。
(3)第5天时，在不更换培养基的情况下，每孔加入30μl 100×DC MaturationSupplement至培养基中(DC Maturation Supplement终浓度为1×)。将6孔板放置于37℃，5％ CO2培养箱中诱导成熟2d。
(4)第7天时可收获成熟DC细胞(Mature DC)，移液器大力吹打和重悬孔板底部细胞以收取成熟DC细胞，将收集的成熟DC细胞转移至15毫升离心管，350g，5min离心后去除上清，按2×106cells/ml密度使用DC细胞培养基(DC medium)重悬DC供后续实验。
实施例2人CMV-pp65抗原特异性T细胞的体外刺激和扩增
(1)向上述成熟DC细胞(Mature DC)中加入5μg/ml的CMV-PP65目标肽。封口模(Parafilm)密封后放入旋转器(MACSmix)中，于细胞培养箱中旋转结合4h。mDCs与CMV-PP65目标肽(CMV-peptide)孵育完成后，使用辐照仪以40Gy剂量辐照负载CMV-PP65目标肽的DC细胞(CMV-peptide-loaded DCs)。辐照结束后，离心收集负载CMV-PP65目标肽的DC细胞至15ml离心管中。
(2)使用淋巴细胞分离液(Lymphoprep)密度梯度离心法获取健康供者血液中PBMCs，使用试剂盒(EasySepTM Human CD8 Positive Selection Kit)分离PBMCs中的CD8+T细胞，以DC/T为1:2.5的比例，将负载CMV-PP65目标肽的DC细胞(CMV-peptide-loaded DCs)与CD8+T细胞加至12孔板中培养，培养体系中加入终浓度为30ng/ml的IL-21，以及5μg/ml的CMV-PP65目标肽(CMV-PP65 peptide)。
(3)将12孔板放置在37℃，5％ CO2细胞培养箱中孵育过夜。第一天时，向每个孔中加入10ng/ml的IL-2、IL-7、IL-15，随后置于细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养10天。培养过程中每2-3天进行半量换液。并在第5天及第10天时，往各培养体系中加入终浓度为5μg/ml的CMV-PP65目标肽(CMV-PP65peptide)。
(4)第11天时，参考上述步骤，制备辐照的负载CMV-PP65目标肽的DC细胞(Irradiated CMV-peptide-loaded DCs)与各培养体系中的细胞进行第二轮体外刺激，继续刺激7天。
(5)第18天时，吸取孔板中每孔各500μl细胞，经缓冲液(FACS buffer)洗涤两次后，加入CMV-PP65-HLA:A:0201Dextramer-FITC与CD8a-PE，混匀后4℃避光孵育20min，孵育结束后FACS buffer洗涤3次后，400μl含1×DAPI工作液的缓冲液(FACS buffer)重悬细胞后检测CD8+/Dextramer+(％)比例检测。
实施例3单细胞测序获取HLA:A:0201限制型CMV-pp65抗原特异性TCR
(1)流式分选CD8+/Dextramer+T细胞，10X Genomics单细胞测序技术获取CD8+/Dextramer+T细胞的TCRα与TCRβ链序列。
(2)经单细胞测序得到TCR序列后，对出现频率最高的TCRα/β链序列进行序列优化，对其恒定区进行改造，以避免外源TCR与T细胞内源TCR发生错配；表达序列进行密码子优化，提高蛋白表达量；利用P2A及弗林蛋白酶酶切位点(Furin-cleavage)使得TCRα与TCRβ能在一个表达载体中同时表达，而不产生多余的脯氨酸尾巴。
(3)构建慢病毒表达载体，将上述TCRα与TCRβ序列插入到同一慢病毒表达载体，通过293T细胞进行病毒包装，生产CMV-pp65抗原特异性TCR特异的病毒颗粒。
实施例4感染CMV-pp65-TCR慢病毒至活化T细胞产生CMV-pp65-TCR-T
(1)使用试剂盒(EasySepTM Human CD8 Positive Selection Kit)分离PBMCs中的CD8+T细胞，以1:3CD8+T cell:CD3/28免疫磁珠(Dynabeads)比例，体外使用CD3/28免疫磁珠(Dynabeads)活化CD8+T细胞，37℃刺激活化CD8+T细胞2d。
(2)CMV-pp65-TCR慢病毒颗粒感染活化CD8+T细胞，加入8μg/ml聚凝胺(polybrene)，500×g，90min，30℃进行离心感染。离心结束后置于细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养3天，随后进行CMV-pp65-TCR慢病毒的二轮感染。
(3)CMV-pp65-TCR慢病毒二轮感染3天后，吸取CMV-pp65-TCR-T细胞，经缓冲液(FACS buffer)洗涤两次后，加入CMV-PP65-HLA*A:0201Dextramer-FITC与CD8a-PE抗体染色，FACS检测CD8+/Dextramer+(％)比例，随后流式分选CD8a+/Dextramer+T细胞用于后续体外杀伤实验。
实施例5HLA:A*0201限制型CMV-pp65-TCR-T体外激活实验
A.FACS检测TCR-T细胞CD137、IFNγ及TNF-α的表达水平
(1)通过慢病毒感染K562细胞分别制备K562-A:0201-GFP，K562-A:0201-GFP-mCherry-vector与K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry细胞；
(2)取实施例4中制备的CMV-pp65-TCR-T/Reported-TCR-T细胞，分别按效靶比例1:1，分别接种TCR-T细胞与K562细胞至圆底96孔板中培养。
(3)于共培养24h后进行胞外染色，固定破膜，胞内染色后，FACS检测共培养体系中CD8+T细胞的CD137,TNFα及IFNγ的表达水平，以评估K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry靶细胞是否可在体外特异性激活CMV-pp65-TCR-T细胞。
B.Elispot检测TCR-T细胞IFNγ的释放水平
(1)使用无菌的pH 7.4的无钙镁离子的1×DPBS稀释包被抗体(MabtechIFNγ,1-D1K：1mg/ml)至15μg/ml(1.5μg/100μl)。每孔加入100μl稀释的1-D1K抗体溶液，4～8℃孵育过夜。
(2)去除plate中的抗体，无菌DPBS清洗后，以效靶比1:1比例铺板细胞，每孔加入100μl 1640完全培养基，3×104CMV-pp65-TCR-T cells或K562细胞，轻拍板的边缘使得细胞均匀铺开，放入培养箱，37℃，5％ CO2培养20h。
(3)20h后去除细胞，DPBS清洗4～6遍以完全去除细胞，然后每孔加入100μl，生物素标记的检测抗体7-B6-1-biotin 37℃孵育2h。孵育结束后，DPBS清洗plate 5遍，最后一遍弃掉液体后，轻轻在无菌纸上扣干。随后每孔加入200μl Streptavidin-HRP，37℃孵育1h。
(4)孵育结束后，DPBS清洗plate 5遍，每孔加入100μl底物TMB，直至清晰的spots出现。最后加入去离子水来终止显色反应。Elispots-reader仪器扫描平板后进行统计分析。
实施例6HLA:A*0201限制型CMV-pp65-TCR-T体外特异杀伤pp65-HLA*A0201-K562细胞
(1)通过慢病毒感染K562细胞分别制备K562-A:0201-GFP对照细胞与K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry靶细胞；
(2)取实施例4中制备的CMV-pp65-TCR-T/Reported-TCR-T细胞，分别按1:1及5:1的效靶比例，接种T细胞与K562细胞至圆底96孔板中培养。
(3)于共培养24h后，FACS检测共培养体系中K562-A:0201-GFP或K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry的比例，以评估CMV-pp65-TCR-T及Reported-TCR-T是否可特异杀伤K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry细胞，并比较两种TCR-T的杀伤效率。
实施例7HLA:A*0201限制型CMV-pp65-TCR-T体内特异杀伤pp65-HLA*A0201-K562细胞
(1)通过慢病毒感染K562细胞制备K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase靶细胞；通过慢病毒感染CD8+T细胞制备CMV-pp65-TCR-T效应细胞
(2)小鼠皮下植瘤模型：day0时于NOG小鼠右腋下处皮下注射1×106靶细胞，day3时分别通过侧尾静脉注射5×106primary CD8+T cell(CD8+T day3group)与CMV-pp65-TCR-T cell(pp65-TCR-T day3 group)，另于day7时侧尾静脉注射5×106CMV-pp65-TCR-T cell(pp65-TCR-T day37 group)；肿瘤细胞注射后的d0(+4h)，d7，d14，d21，d28，d35对小鼠进行生物发光成像检测肿瘤细胞中luciferase的表达，并对其luciferase的光子数强度进行定量，以评估CMV-pp65-TCR-T是否可抑制K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase靶细胞的生长。
(3)小鼠尾静脉转移模型：day0时于NOG小鼠侧尾静脉注射1×106靶细胞，day3时分别通过侧尾静脉注射1×107primary CD8+T cell与CMV-pp65-TCR-T cell。肿瘤细胞注射后的d0(+4h)，d28，d35，d42，d49，d56对小鼠进行生物发光成像检测肿瘤细胞中luciferase的表达，并对其luciferase的光子数强度进行定量，以评估CMV-pp65-TCR-T对靶细胞K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase的抑制作用。
实验结果：
CMV-pp65-TCR-T筛选流程：
图1为本发明CMV-pp65-TCR-T的特异性刺激及筛选流程，整个试验由健康HLA-A:0201供者的CD8+T细胞经自体的mDCs负载pp65多肽进行两轮刺激后，使用CMV-PP65-HLA*A:0201Dextramer对CMV-pp65抗原特异性的TCR-T细胞进行特异性的分析。
流式结果(图2)显示，经过两轮mDCs-pp65多肽刺激后，健康供者D6的CD8a+/Dextramer+T比例由0.16％提高至81.3％，表明CMV-pp65特异的TCR-T细胞在体外进行特异性的扩增。
单细胞测序获取CMV-pp65-TCR序列：
经过自体mDCs负载pp65多肽进行两轮刺激后，使用CMV-PP65-HLA*A:0201Dextramer及CD8a抗体对CMV-pp65抗原特异性的TCR-T细胞进行流式分选，分选所得的CMV-pp65-TCR-T细胞经10×Genomics法进行单细胞测序，以获取CMV-pp65-TCR-T细胞的α与βchain序列。
经单细胞测序后，将测序所得的频次前10名进行排序。单细胞测序结果显示分选后CD8a+/Dextramer+T细胞中99.64％的T细胞克隆由一种TCR-T组成，证明此次实验(Antigen-specific T cell priming)特异性良好。该T细胞克隆包含两条α链，其中一条为冗余α链，后续已通过CMV-PP65-HLA*A:0201Dextramer体外结合实验将其排除。
最终获得的TCR序列如下：
CMV-pp65-TCR：
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSLEGYTEAFFGQGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFSSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAFPYNNNDMRFGAGTRLTVEPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO.1)，序列中的C为经人工突变引入的半胱氨酸残基；
经密码子优化后的TCR编码序列如下：
ATGGGGCCCCAGCTTTTGGGTTATGTAGTTCTTTGTCTCCTGGGCGCTGGACCGCTGGAAGCA
CAAGTCACTCAAAACCCTAGGTACCTGATCACCGTGACCGGAAAGAAGCTGACTGTGACCTGCTCTC
AGAACATGAACCATGAATACATGTCATGGTACAGGCAGGATCCTGGGCTCGGACTTAGACAGATTTA
CTACTCTATGAATGTGGAGGTGACAGATAAAGGGGATGTGCCAGAAGGCTATAAGGTCTCCAGGAAG
GAGAAGAGAAACTTTCCCTTGATCTTGGAGTCTCCGTCCCCAAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGCG
CTTCCTCCCTCGAGGGGTACACCGAGGCATTTTTTGGACAGGGGACTAGACTGACCGTGGTGGAGGA
TCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAA
CAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGG
TGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCTGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAG
CTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGC
TGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCA
CACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACA
AGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTT
GTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAGAATTCAAGAGCCAAAAGAGGTTCTGGCG
CCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGAAAAGAA
CCCTCTGGCTGCCCCCCTGTTGATACTGTGGTTCCACCTGGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTC
GAACAGTCCCCTCAGTCTCTGCACGTCCAAGAGGGAGATTCCACCAATTTTACTTGTAGTTTTAGCT
CCAGCAATTTCTACGCCCTGCACTGGTACCGGTGGGAGACCGCCAAGTCTCCCGAAGCCCTCTTTGT
GATGACCCTCAACGGCGATGAAAAAAAAAAAGGGAGAATTAGCGCCACCCTGAACACTAAAGAGGGC
TATTCTTACTTGTATATAAAAGGGTCTCAGCCTGAGGACAGCGCTACATACTTGTGTGCTTTTCCTT
ATAACAACAACGATATGAGGTTCGGGGCCGGAACAAGGTTGACCGTTGAGCCTGACATCCAGAACCC
AGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGAC
TTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAATGCGTGC
TGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCAC
CTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACG
TTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACTCC
GAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT(SEQ IDNO.2)
其中，
α链及其编码序列如下：
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFSSSNFYALHWYRWETA
KSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAFPYNNNDMRFGAGTRLT
VEPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIA
WSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMT
LRLWSS(SEQ ID NO.3)
ATGGAAAAGAACCCTCTGGCTGCCCCCCTGTTGATACTGTGGTTCCACCTGGACTGCGTGAGC
AGCATTCTGAACGTCGAACAGTCCCCTCAGTCTCTGCACGTCCAAGAGGGAGATTCCACCAATTTTA
CTTGTAGTTTTAGCTCCAGCAATTTCTACGCCCTGCACTGGTACCGGTGGGAGACCGCCAAGTCTCC
CGAAGCCCTCTTTGTGATGACCCTCAACGGCGATGAAAAAAAAAAAGGGAGAATTAGCGCCACCCTG
AACACTAAAGAGGGCTATTCTTACTTGTATATAAAAGGGTCTCAGCCTGAGGACAGCGCTACATACT
TGTGTGCTTTTCCTTATAACAACAACGATATGAGGTTCGGGGCCGGAACAAGGTTGACCGTTGAGCC
TGACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTC
TGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCA
CTGACAAATGCGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAA
CCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTT
CCCTGTGATGCCACGTTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGT
CAGTTATGGGACTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCT
GTGGTCCAGT(SEQ ID NO.4)；
β链及其编码序列如下：
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLR
QIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSLEGYTEAFFGQGTRLTV
VEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKES
NYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSAS
YQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS(SEQ ID NO.5)
ATGGGGCCCCAGCTTTTGGGTTATGTAGTTCTTTGTCTCCTGGGCGCTGGACCGCTGGAAGCA
CAAGTCACTCAAAACCCTAGGTACCTGATCACCGTGACCGGAAAGAAGCTGACTGTGACCTGCTCTC
AGAACATGAACCATGAATACATGTCATGGTACAGGCAGGATCCTGGGCTCGGACTTAGACAGATTTA
CTACTCTATGAATGTGGAGGTGACAGATAAAGGGGATGTGCCAGAAGGCTATAAGGTCTCCAGGAAG
GAGAAGAGAAACTTTCCCTTGATCTTGGAGTCTCCGTCCCCAAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGCG
CTTCCTCCCTCGAGGGGTACACCGAGGCATTTTTTGGACAGGGGACTAGACTGACCGTGGTGGAGGA
TCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAA
CAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGG
TGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCTGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAG
CTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGC
TGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCA
CACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACA
AGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTT
GTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAGAATTCA(SEQ ID NO.6)
α链可变区及其编码序列如下：
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFSSSNFYALHWYRWETA KSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAFPYNNNDMRFGAGTRLT VEP(SEQ IDNO.7)
ATGGAAAAGAACCCTCTGGCTGCCCCCCTGTTGATACTGTGGTTCCACCTGGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTCGAACAGTCCCCTCAGTCTCTGCACGTCCAAGAGGGAGATTCCACCAATTTTACTTGTAGTTTTAGCTCCAGCAATTTCTACGCCCTGCACTGGTACCGGTGGGAGACCGCCAAGTCTCCCGAAGCCCTCTTTGTGATGACCCTCAACGGCGATGAAAAAAAAAAAGGGAGAATTAGCGCCACCCTGAACACTAAAGAGGGCTATTCTTACTTGTATATAAAAGGGTCTCAGCCTGAGGACAGCGCTACATACTTGTGTGCTTTTCCTTATAACAACAACGATATGAGGTTCGGGGCCGGAACAAGGTTGACCGTTGAGCCT(SEQ ID NO.8)
其包含的3个CDR序列如下：
α-CDR1：SSNFYA(SEQ ID NO.9)，编码序列为：TCCAGCAATTTCTACGCC(SEQ IDNO.10)
α-CDR2：MTLNGDE(SEQ ID NO.11)，编码序列为：ATGACCCTCAACGGCGATGAA(SEQ IDNO.12)
α-CDR3：CAFPYNNNDMRF(SEQ ID NO.13)，编码序列为：TGTGCTTTTCCTTATAACAACAACGATATGAGGTTC(SEQ ID NO.14)。
β链可变区及其编码序列如下：
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLR QIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSLEGYTEAFFGQGTRLTV V(SEQ IDNO.15)
ATGGGGCCCCAGCTTTTGGGTTATGTAGTTCTTTGTCTCCTGGGCGCTGGACCGCTGGAAGCACAAGTCACTCAAAACCCTAGGTACCTGATCACCGTGACCGGAAAGAAGCTGACTGTGACCTGCTCTCAGAACATGAACCATGAATACATGTCATGGTACAGGCAGGATCCTGGGCTCGGACTTAGACAGATTTACTACTCTATGAATGTGGAGGTGACAGATAAAGGGGATGTGCCAGAAGGCTATAAGGTCTCCAGGAAGGAGAAGAGAAACTTTCCCTTGATCTTGGAGTCTCCGTCCCCAAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGCGCTTCCTCCCTCGAGGGGTACACCGAGGCATTTTTTGGACAGGGGACTAGACTGACCGTGGTG(SEQ ID NO.16)
其包含的3个CDR序列如下：
β-CDR 1：MNHEY(SEQ ID NO.17)，编码序列为：ATGAACCATGAATAC(SEQ ID NO.18)；
β-CDR 2：SMNVEV(SEQ ID NO.19)，编码序列为：TCTATGAATGTGGAGGTG(SEQ IDNO.20)；
β-CDR 3：CASSLEGYTEAFF(SEQ ID NO.21)，编码序列为：TGCGCTTCCTCCCTCGAGGGGTACACCGAGGCATTTTTT(SEQ ID NO.22)。
CMV-pp65-TCR-T载体构建及序列优化：
经测序得到pp65-TCR(SEQ ID NO.1)序列后，对其进行序列优化，具体包括：
(1)对其恒定区进行改造，阻止与内源性TCR链的错配；
(2)表达序列进行人源密码子优化，提高TCR蛋白表达量；
(3)利用P2A及Furin-cleavage使得alpha链和beta链能在一个质粒上同时表达，而不产生因单独使用P2A而产生的末端脯氨酸残留。
随后，将优化完成的pp65-TCR序列(图3)克隆至慢病毒表达载体中。
CMV-pp65-TCR-T体外结合实验：
利用293T细胞进行TCR慢病毒的包装，CMV-pp65-TCR慢病毒两轮感染健康HLA-A:0201供者的PBMC或jurkat T后进行CMV-pp65-HLA*A:0201Dextramer染色，流式结果显示Tetramer+/mTCRβC+jurkatT(图4的子图A)及Dextramer+/primary CD8+T(图4的子图B)细胞分群明显，该结果表明本项目筛选并鉴定的CMV-pp65-TCR-T在健康供者的jurkatT及primary CD8+T细胞中正常表达，并可与CMV-PP65-HLA*A:0201Tetramer/Dextramer结合。
CMV-pp65-TCR-T体外激活实验：
体外制备对照细胞K562-A:0201-GFP，载体对照组细胞K562-A:0201-GFP-mCherry-vector，以及靶细胞K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry，通过将CMV-pp65-TCR-T效应细胞与靶细胞或对照细胞(载体对照及空白对照)进行体外共培养，胞内外染色后，流式检测CMV-pp65-TCR-T细胞的CD137及IFNγ表达的水平。
流式实验结果(图5)表明K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry靶细胞可在体外特异性激活CMV-pp65-TCR-T细胞，激活后CMV-pp65-TCR-T的CD137及IFNγ的表达水平显著增高，而载体对照组K562细胞与对照K562细胞对CMV-pp65-TCR-T细胞无明显激活作用。
此外，IFNγ-Elispot实验结果同样表明K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry靶细胞可在体外特异性激活CMV-pp65-TCR-T细胞，激活后CMV-pp65-TCR-T的IFNγ表达水平显著增高，而对照细胞K562-A:0201-GFP对CMV-pp65-TCR-T无激活作用。
CMV-pp65-TCR-T体外杀伤实验：
体外制备靶细胞K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry，CN102656188A公开的ReportedTCR-T以及本项目的CMV-pp65-TCR-T。
通过将CMV-pp65-TCR-T或Reported TCR-T效应细胞与靶细胞按效靶比1:1及5:1，体外共培养24h后，流式检测GFP+靶细胞的比例，流式实验结果(图6的A、B)表明CMV-pp65-TCR-T与Reported TCR-T细胞均可在体外杀伤表达pp65的K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry细胞，但本项目公开的CMV-pp65-TCR-T在杀伤效果方面优于Reported TCR-T。
随后通过将CMV-pp65-TCR-T与Reported TCR-T效应细胞与靶细胞按效靶比1:1进行体外共培养，24h后进行胞内染色，随后流式检测细胞因子TNF-α的表达，以评估CMV-pp65-TCR-T与Reported TCR-T的细胞因子释放情况。流式实验结果表明本项目筛选并鉴定的CMV-pp65-TCR-T细胞较Reported TCR-T可在体外释放更高水平的TNF-α，特异性的杀伤表达pp65的K562-A:0201-GFP-pp65-mCherry细胞(图6的C)，而CMV-pp65-TCR-T与K562-A0201对照组细胞共培养后并无TNF-α及IFN-γ细胞因子的释放，显示其特异性良好。
CMV-pp65-TCR-T体内杀伤实验-皮下植瘤模型：
体外制备K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase靶细胞及CMV-pp65-TCR-T效应细胞，day0时于NOG小鼠右腋下处皮下注射1×106靶细胞，day3时分别通过侧尾静脉注射5×106primary CD8+T cell(CD8+T day3 group)与CMV-pp65-TCR-T cell(pp65-TCR-T day3group)，另于day7时侧尾静脉注射5×106CMV-pp65-TCR-T cell(pp65-TCR-T day7 group)(图7的A)；肿瘤细胞注射后的第0-5周对小鼠进行生物发光成像检测(图7的B)，并对小鼠的luciferase的光子数强度进行定量。体内实验结果表明本项目的CMV-pp65-TCR-T细胞可在体内特异性的杀伤K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase靶细胞(图7的B、C)，day3或day7注射CMV-pp65-TCR-T均可显著抑制肿瘤细胞K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase的生长，并显著延长小鼠的生存时间，其对靶细胞的杀伤效果显著优于未进行pp65-TCR转导的CD8+T对照组细胞。
CMV-pp65-TCR-T体内杀伤实验-转移模型：
体外制备K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase靶细胞及CMV-pp65-TCR-T效应细胞，day0时于NOG小鼠尾静脉注射1×106靶细胞，day3时分别通过侧尾静脉注射1×107primary CD8+T cell与CMV-pp65-TCR-T cell(图8的A)；肿瘤细胞注射后的第4-8周对小鼠进行生物发光成像检测(图8的B)，并对小鼠的luciferase的光子数强度进行定量。
体内实验结果表明本项目的CMV-pp65-TCR-T细胞可在体内特异性的杀伤K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase靶细胞(图8的B和C)，day3注射CMV-pp65-TCR-T可显著抑制肿瘤细胞K562-A:0201-GFP-pp65-luciferase的生长，其抑制效果显著优于未进行pp65-TCR转导的CD8+T对照组细胞。
技术效果
CMV在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。CMV激活在造血干细胞移植(HSCT)患者中较为常见，部分患者药物治疗效果较差或药物耐受性低，无法完成整个药物治疗疗程。患者由于免疫功能低下，不能有效清除CMV，可引起CMV相关发热直至器官累及的系列相关性疾病，具有很高的病死率。现有抗CMV药物也存在诸多不足，如剂型单一、靶点相似、可导致粒细胞缺乏/肾损害等。因此亟需有新的临床治疗方案用于HSCT患者的CMV感染的治疗。本项目的CMV-TCR-T细胞一方面可精准靶向清除感染CMV病毒的靶细胞；另一方面可间接通过TCR-T细胞介导的免疫重建，对病毒的彻底清除和防止再感染发挥长期保护作用。
本项目发明的CMV-pp65-TCR-T具有以下几个特点：
体内外实验表明CMV-pp65-TCR-T可精准靶向并快速清除表达CMV抗原的靶细胞，体内蛋白表达量高且与内源性TCR链无错配，杀伤力能力强，特异性强等。且体外实验表明本项目的CMV-pp65-TCR-T较CN102656188A公开的Reported-TCR-T对靶细胞的杀伤作用更为显著，可以有效应用于HSCT患者或其他移植患者CMV感染的治疗。
此外，相较于现有相关公开发明，本项目提供了TCR-T领域内公认金标准的ELISPOT(酶联免疫斑点)体外实验证据，说明本项目筛选获得的TCR能够特异识别CMV抗原；同时，本项目发明除了利用尾静脉模型证实装载CMV特异性TCR的T细胞可以特异清除表达CMV抗原的靶细胞外，还利用了更贴近临床CMV感染情形的皮下成瘤模型，同样也证实了装载本项目筛选获得的CMV特异性TCR的T细胞可以特异清除表达CMV抗原的靶细胞。
总体而言，本项目发明提供了完整的、符合领域标准的且更贴近临床CMV感染情形的体内外数据，充分证实筛选获得的CMV抗原特异TCR的特异性、有效性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述T细胞受体包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列为CAFPYNNNDMRF(SEQ ID NO.13)；和/或
所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列为CASSLEGYTEAFF(SEQ ID NO.21)。
2.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCRα链可变域的3个互补决定区(CDR)为：
α-CDR1：SSNFYA(SEQ ID NO.9)，
α-CDR2：MTLNGDE(SEQ ID NO.11)，
α-CDR3：CAFPYNNNDMRF(SEQ ID NO.13)；和/或
所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：
β-CDR 1：MNHEY(SEQ ID NO.17)，
β-CDR 2：SMNVEV(SEQ ID NO.19)，
β-CDR 3：CASSLEGYTEAFF(SEQ ID NO.21)。
3.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，其包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO.7具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或，所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO.15具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
5.一种多价TCR复合物，其特征在于，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为上述权利要求中任一项所述的TCR。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述的TCR分子的核酸序列或其互补序列。
7.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO.8；和/或
所述的核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO.16。
8.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。
9.一种分离的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求8中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求6所述的核酸分子。
10.一种细胞，其特征在于，所述细胞转导权利要求6所述的核酸分子或权利要求8中所述载体；优选地，所述细胞为T细胞或干细胞。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-4中任一项所述的TCR、权利要求5中所述的TCR复合物、权利要求6所述的核酸分子、或权利要求10中所述的细胞。
12.权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体、或权利要求5中所述的TCR复合物或权利要求10中所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗巨细胞病毒感染症的药物。
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