CN117534770A - 靶向bcl-w蛋白的嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、car-nk细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向BCL‑W蛋白的嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、CAR‑NK细胞及其应用。所述嵌合抗原受体包括GM‑CSF前导肽、特异性结合BCL‑W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4‑1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。经实验验证，表达所述嵌合抗原受体的CAR‑NK细胞在体外表现出稳定的CAR表达、不受阻碍的增殖以及针对高表达BCL‑W蛋白的HUTU‑80细胞的细胞毒性功能，可显著降低人十二脂肠腺癌小鼠模型的肿瘤负荷且未观察到副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及靶向BCL-W蛋白的嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、CAR-NK细胞及其应用。
背景技术
衰老细胞是人体内细胞周期停滞的细胞，它们不会继续分裂但也无法死亡，并且还会分泌一系列促炎因子，而这些促炎因子可能会重新改造细胞外环境，诱发细胞异常死亡。相关研究表明，衰老细胞还与骨质疏松、粥样硬化、肝脂肪变性、肺纤维化、骨质关节炎的病理发生相关。因此，靶向清除衰老细胞可以成为衰老性疾病的治疗手段。
2017年7月，诺华嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptorT-cell，CAR-T)细胞产品被美国FDA正式批准上市，并在之前的临床研究中展现出对血液瘤良好的治疗效果。相较于CAR-T疗法，自然杀伤细胞(natural killer cells，NK细胞)作为效应细胞具有很多优良特性。首先，NK细胞不会像T细胞一样产生移植物抗宿主反应(graft-versus-hostdisease，GVHD)现象，有望成为通用型细胞治疗手段；其次，NK细胞不受抗原特异性组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制，具有更强的杀伤能力；再者，NK细胞表面CD16低亲和力分子可与靶细胞表面IgG抗体复合物介导ADCC作用；NK细胞也可通过Fas/FasL途径介导细胞凋亡，释放细胞因子。综合上述优点，使用NK细胞改造的嵌合抗原受体NK(chimeric antigen receptor NK-cell，CAR-NK)细胞将更有应用前景。
BCL-W蛋白是抗凋亡因子，可以结合并抑制促凋亡蛋白，导致细胞对促凋亡刺激产生抗性，最终细胞会出现衰老而不是凋亡。许多研究表明，衰老细胞和多种癌细胞中BCL-W蛋白的表达水平显著上升。因此，我们设计一种靶向BCL-W蛋白的CAR-NK细胞，可针对性清除高表达BCL-W蛋白的衰老细胞和癌细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向BCL-W蛋白的嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、CAR-NK细胞及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种靶向BCL-W蛋白的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括GM-CSF前导肽、特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域；
所述GM-CSF前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述CD28铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述CD28跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述CD28共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步的，上述嵌合抗原受体N端到C端由GM-CSF前导肽、特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域依次连接而成。
进一步的，上述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种编码上述嵌合抗原受体的核酸分子，所述核酸分子的碱基序列如SEQ IDNO.1所示。
一种含有上述核酸分子的重组载体，所述重组载体为慢病毒载体。
一种表达上述嵌合抗原受体的CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞含有上述的核酸分子或重组载体。
上述一种CAR-NK细胞的制备方法，其包括如下步骤：
(1)构建含有编码嵌合抗原受体的核酸分子的慢病毒表达载体；
(2)将步骤(1)的慢病毒表达载体与包装质粒pMD2.G质粒、psPAX2质粒共转染293T细胞培养得到重组慢病毒；
(3)将步骤(2)的重组慢病毒与NK细胞共培养得到表达嵌合抗原受体的CAR-NK细胞。
上述的嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体或CAR-NK细胞在制备肿瘤药物中的应用。
本发明的显著优点在于：
本发明用于构建新型免疫细胞治疗的细胞类型是NK细胞，NK细胞免疫原性低，可以进行异体应用，使用范围更广，制备成本更低。经本发明的制备方法所修饰的NK细胞能够对带有其针对的抗原的细胞如肿瘤细胞、衰老细胞等细胞产生特异性更强的杀伤作用，治疗效果更精准。
附图说明
图1为CAR结构示意图。
图2为BCL-W-CAR的重组慢病毒表达质粒结构示意图。
图3为BCL-W-CAR-NK细胞与UTD-NK细胞的增殖曲线示意图。
图4为流式细胞术分析转染效率的示意图。
图5为流式细胞术分析HUTU-80细胞中BCL-W蛋白表达情况的示意图。
图6为UTD-NK细胞和CAR-NK细胞细胞毒性测试结果示意图。
图7为CAR-NK细胞的体内功能分析结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的介绍和说明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。
本发明中所用到的试剂和原料均可由市场购得。如无特别说明，本发明中的制备方法均为常规制备方法，不再详述。
实施例1：嵌合抗原受体(CAR)构建
如图1所示，本发明所提供的CAR包括GM-CSF前导肽、特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域，N端到C端由GM-CSF前导肽、特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域依次连接而成。其中，所述GM-CSF前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区和重链可变区之间通过Linker相连接，所述Linker的氨基酸序列如SEQID NO.11所示；所述CD28铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述CD28跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CD28共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述CAR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：载体重组
委托上海生工合成编码本发明所提供CAR的基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1，与pHRSIN-SFFV-eGFP质粒(addgene，货号：80409)进行连接，插入位点为BamH I；将连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得表达BCL-W-CAR的重组慢病毒表达质粒，质粒图谱如图2所示。
实施例3：包装慢病毒
(1)用含FBS的DMEM完全培养基(89mL DMEM+10mL FBS+1mL100X青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(gibco))复苏及扩增培养293T细胞。
(2)转染前一天，将293T细胞培养瓶中的培养液废弃，用无菌PBS洗涤细胞两遍后，加入适量0.25％胰酶37℃消化1min，显微镜下观察细胞逐渐变圆时，加入2倍0.25％胰酶体积的含FBS的DMEM完全培养基(89mL DMEM+10mL FBS+1mL100X青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(gibco))终止消化，液体收集于无菌离心管中混匀后取少量进行细胞计数，其余细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞加入适量新鲜完全培养基重悬后，按照每孔100uL含2×104个293T细胞的密度铺96孔板，37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)24h后待293T细胞汇合度50％-80％时进行转染，转染前将DMEM培养基和转染试剂(E2691，)恢复室温后，于一无菌EP管中加入80uL DMEM培养基和15uL转染试剂，混匀孵育5min，之后在转染混合液中加入5uL由质量比为2：1：2的psPAX2质粒、pMD2.G质粒和可表达BCL-W-CAR的重组慢病毒表达质粒组成的混合物，立即混匀，室温孵育15min后转染293T细胞，置37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后更换新鲜培养基，48h后收集含有病毒的上清，用0.45um过滤器过滤，过滤后的病毒上清1500rpm离心10min，收集上清液即为慢病毒颗粒上清，保存于-80℃。
实施例4：原代NK细胞分离
(1)取一份新鲜外周血，于2000rpm室温离心10min，去除上层浅黄色血浆后，用生理盐水补到血浆原有的体积，得到稀释的血液。按照稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为2：1将稀释的血液缓慢加入到淋巴细胞分离液(Ficoll)中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液有清晰的分层，800g离心30min，去除上清，用生理盐水洗涤三次，得到外周血单个核细胞。
(2)往2ml外周血单个核细胞悬液中加入100ul的EasySep人NK细胞富集抗体混合物，混匀后室温孵育10min。继续加入200ul的磁珠，混匀后室温孵育5min。加入缓冲液使总体积达到5ml，用移液枪上下轻轻移液2-3次，混匀。然后将管子放入磁铁中，静置2.5min。最后将上清倒入到新的离心管中，即得到富集的NK细胞。往NK细胞里加入适量的NK细胞培养基，使NK细胞密度保持在1.5*106个/ml。其中，所述NK细胞培养基含基础培养基ALyS505NK(BASO)，并添加有500U/ml IL-2、10ng/ml IL-5和10％自体血浆。每2-3天补充一次新鲜NK培养基。
实施例5：慢病毒感染NK细胞
(1)将NK细胞按照0.5*106个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，接着每孔加入慢病毒颗粒上清和polybrene(终浓度为6ug/ml)，于37℃ 5％CO2培养箱中孵育进行感染。
(2)24h后收集NK细胞悬液于无菌离心管中，250g离心10min，去除上清，用新鲜NK细胞培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至新的24孔板中继续培养，即得到嵌合抗原受体NK细胞，即BCL-W-CAR-NK细胞；往BCL-W-CAR-NK细胞里加入适量的NK细胞培养基，使细胞密度保持在1.5*106个/ml，每2-3天补充一次新鲜NK培养基。其中，所述NK细胞培养基配方与实施例4相同。如图3所示，BCL-W-CAR-NK细胞的增殖倍率与未经过慢病毒转导的NK细胞(UTD-NK)的增殖倍率相差无几，说明BCL-W-CAR-NK细胞的增殖是不受阻碍的。
实施例6：流式细胞术检测转导效率
通过流式细胞术检测含绿色荧光蛋白GFP的NK细胞比例即可得出转导效率。将未经过慢病毒转导的NK细胞设置为阴性对照组(UTD-NK组)。将细胞用含0.1％BSA的PBS洗涤两遍后用300ul PBS重悬，然后通过流式细胞术进行定量分析。流式细胞术分析在BDC6plus仪器上进行，并使用Flowjo软件进行数据分析生成数据图。如图4所示，数据显示靶向BCL-W-CAR-NK细胞转导效率为52.18％，这一结果表明所构建的CAR表达质粒被包装成慢病毒颗粒后能成功感染NK细胞，并得到了较好表达，可以用于后续实验。
实施例7：小肠腺癌细胞HUTU-80中BCL-W蛋白表达情况检测首先，将经过复苏、传代得到的小肠腺癌细胞HUTU-80和正常的小肠组织细胞用pbs洗涤两遍，然后分别加入10ulBCL-W-APC单抗(Novus Biologicals)及同型对照IgG1 k-APC(Novus Biologicals)，室温孵育30min，加入PBS，混匀后500g离心3min。弃上清，加入300ul PBS重悬，通过流式细胞术进行定量分析。流式细胞术分析在BD C6 plus仪器上进行，并使用Flowjo软件进行数据分析生成数据图。如图5所示，BCL-W蛋白在HUTU-80细胞和正常小肠组织细胞中的阳性率分别为87.3％和25.3％，HUTU-80细胞高表达BCL-W蛋白，可以用于后续的细胞毒性测定实验。
实施例8：CAR-NK细胞的细胞毒性测定
LDH试剂盒检测CAR-NK细胞靶向杀伤活性：
(1)取一96孔板，按以下分组进行接种：
效应细胞组：50uL效应细胞+50uL培养基
靶细胞自发释放组：50uL靶细胞+50uL培养基
靶细胞最大释放组：50uL靶细胞+50uL培养基+10uL10×裂解液
实验组：50uL靶细胞+50uL效应细胞
体积校正对照组：100uL培养基+10uL10×裂解液
背景对照组：100uL培养基以上实验组中效应细胞与靶细胞细胞数按10:1、5:1、2:1、1:1和0.5:1的比例设置5组，其余组靶细胞及效应细胞的细胞数以实验组中靶细胞及效应细胞数为准。效应细胞分为UTD-NK和BCL-W-CAR-NK两种。靶细胞为HUTU-80细胞。
(2)用多孔板离心机250g离心4min。37℃ 5％CO2培养箱孵育6h。
(3)离心前45min添加10×裂解液至靶细胞最大释放组，250g离心4min。每个孔各取上清50uL转移至另一孔板进行测定。
(4)每孔中添加50uL再次稀释的底物混合物，室温避光孵育30min。
(5)添加50uL终止溶液，450nm测定吸收值，计算效应细胞对靶细胞的杀伤活性。
结果如图6所示，BCL-W-CAR-NK细胞对HUTU-80细胞具有高度细胞毒性。
实施例9：CAR-NK细胞的体内功能分析
为了移植肿瘤细胞，在第0天将0.5*106个HUTU-80(GFP+，Luc+)细胞通过尾静脉注射到NSG小鼠体内，然后在第3天使用1*107个BCL-W-CAR-NK细胞或UTD-NK细胞通过尾静脉注射到NSG小鼠体内。作为体内肿瘤细胞生长的对照，一组小鼠在注射肿瘤细胞后没有接受任何治疗(UT组)。在第7天，第14天和第21天通过生物发光成像评估肿瘤负荷。如图7所示，在第21天，与未治疗的小鼠(UT)或接受未转导的(UTD-NK)细胞的小鼠相比，接受BCL-W-CAR-NK细胞治疗的5只小鼠中，有4只(80％)的肿瘤负荷显著降低。
结论：通过使用慢病毒载体转导血液来源的原代NK细胞而产生的靶向BCL-W蛋白的CAR-NK细胞，在体外表现出稳定的CAR表达、不受阻碍的增殖以及针对高表达BCL-W蛋白的HUTU-80细胞的细胞毒性功能。而且，BCL-W-CAR-NK细胞在小鼠模型中显著降低了肿瘤负荷且没有观察到副作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种靶向BCL-W蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括GM-CSF前导肽、特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域；
所述GM-CSF前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；
所述CD28铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述CD28跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述CD28共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体N端到C端由GM-CSF前导肽、特异性结合BCL-W蛋白的胞外抗原结合结构域、CD28铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域依次连接而成。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种编码权利要求3所述的嵌合抗原受体的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种含有权利要求4所述核酸分子的重组载体，其特征在于：所述重组载体为慢病毒载体。
6.一种表达权利要求3所述嵌合抗原受体的CAR-NK细胞，其特征在于：所述CAR-NK细胞含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体。
7.如权利要求6所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1) 构建含有编码嵌合抗原受体的核酸分子的慢病毒表达载体；
(2) 将步骤(1)的慢病毒表达载体与包装质粒pMD2.G质粒、psPAX2质粒共转染293T细胞培养得到重组慢病毒；
(3) 将步骤(2)的重组慢病毒与NK细胞共培养得到表达嵌合抗原受体的CAR-NK细胞。
8.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的CAR-NK细胞在制备肿瘤药物中的应用。
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