JP2022545120A - 癌細胞標的化領域とｈｖｅｍの細胞外ドメインとの融合タンパク質を発現可能な発現カセットを有する組換え単純ヘルペスウイルス及びその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質を発現可能な発現カセットを有する組換え単純ヘルペスウイルス及びその用途を開示する。前記融合されたタンパク質は、組換えＨＳＶが癌細胞である標的細胞を感染させて標的細胞内に入ると、ＨＳＶが増殖すると共に融合タンパク質であるアダプターが細胞内で発現し、細胞溶解によってその増殖されたＨＳＶビリオンと共に細胞外部に放出されるか、或いはアダプターがリーダー配列を有する場合には細胞溶解によるビリオン放出以前にも放出される。この細胞外部に放出されたアダプターは、ＨＳＶビリオンを、アダプターの癌細胞標的化領域が認識する標的分子を発現させる周辺癌細胞へと感染を誘導するか、或いは感染効率を上げる作用を有する。

Description

本発明は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質を発現可能な発現カセットを有する組換え単純ヘルペスウイルス及びその用途に関する。
現在、癌治療には手術療法、抗癌化学療法、放射線療法などが広く利用されているが、その殆どが副作用を伴い、不完全な治療効果、癌再発及び転移などの問題点を抱えている。このため、新しくて効果的な癌治療法の開発への要求が続いており、ここ数年間で、抗癌ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療法（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）など、抗癌免疫療法において急速な発展があった。
抗癌免疫療法のうち抗癌ウイルスは、生きているウイルスの遺伝子を操作し、癌細胞で選択的に増殖して癌細胞を溶解する特性を有するウイルスであって、正常細胞での増殖は制限的である。癌細胞を溶解して放出されたウイルスは、周辺癌細胞を継続して感染させることにより、持続的で相乗的な治療効果を奏することができる。また、抗癌ウイルスは、癌細胞を溶解する過程で免疫原性を持つ腫瘍抗原が放出され、人体の免疫反応を刺激させることによって抗癌効果を高めることができ、また、このような抗癌効果は、サイトカイン、ケモカインなどを発現させるように人為的に操作することによって増進してもよい。
開発されている現在の抗癌ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、ワクシニアウイルスを含め、１０種以上に分類できるが、特に、ＨＳＶは、１５２ｋｂサイズの線状の二本鎖ＤＮＡを含む多面体性ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｖｉｒｉｏｎ）であり、ＨＳＶ－１型とＨＳＶ－２型とに分けられる。ＨＳＶは、多くの非必須遺伝子（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ）を有しており、ゲノムのサイズが大きいため、外部遺伝子の操作や運搬が容易であり、複製周期が短く、また、感染効率が高く、細胞付着及び感染に関与する糖タンパク質の操作が容易であることにより、癌細胞に対する標的化を改善させることができるという長所がある。
２０１５年１０月に米国ＦＤＡの承認を受けたＴ－ＶＥＣ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、製品名：イムリジック）は、ＨＳＶ－１を用いた悪性黒色腫に対する抗癌ウイルス治療剤である。Ｔ－ＶＥＣは、病原性を弱化させるためにＩＣＰ３４．５とＩＣＰ４７遺伝子が欠失しており、人体免疫反応を促進するためのＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を発現させる弱化した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ＨＳＶ－１型ウイルスである。しかしながら、Ｔ－ＶＥＣは、一部の遺伝子が消失することにより、ウイルス増殖が制限され、治療効能が低いという限界点がある。
ＨＳＶは外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を持つウイルスであり、ＨＳＶの細胞進入は、外皮に存在する糖タンパク質ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ／ｇＬ及びｇＣの複雑な相互作用によってなされる。まず、ｇＢとｇＣが細胞表面の３－Ｏ－Ｓ ＨＳ（３－Ｏ－ｓｕｌｆａｔｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）に付着すると、ｇＤが細胞受容体であるＨＶＥＭ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ，ＨｖｅＡ）、ネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１，ＨｖｅＣ）、ネクチン－２（ｎｅｃｔｉｎ－２，ＨｖｅＢ）のうち少なくとも一つの受容体と結合してウイルスと細胞膜との融合を誘導することにより、ＨＳＶが細胞に進入する（Ｈｉｒｏａｋｉ Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ）－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ Ｍｕｔａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＨＶＥＭ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｓｃｕｅ ｎｅｃｔｉｎ－１ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００９ Ａｐｒ；８３（７）：２９５１－６１）。
ＨＳＶの細胞受容体のうち、ＨＶＥＭは、腫瘍壊死因子受容体タンパク質ファミリー（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ＴＮＦＲ ｆａｍｉｌｙ）に属し、主に、Ｔ、Ｂリンパ球、マクロファージ、ＤＣ細胞、感覚神経細胞（ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎ）、粘膜上皮細胞（ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に発現する（Ｓｈｕｉ ＪＷ，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ．２０１３．Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ４（２）：１４６－１５１）が、Ｂ、Ｔリンパ腫、黒色腫、直膓癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣の腸液腺癌腫（ｏｖａｒｉａｎ ｓｅｒｏｕｓ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、透明腎細胞癌（ｃｌｅａｒ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）のような様々な腫瘍組織においても多く発現することが知られている（Ｐａｓｅｒｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２．２（４）：４７８－８５，Ｍａｌｉｓｓｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＮＣＯＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ２０１９，ＶＯＬ．８（１２）：ｅ１６６５９７６）。ＨＶＥＭは、ＴＮＦＲファミリーの特徴である４個のＣＲＤ（ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）を有し、このうち２個のＣＲＤがＨＳＶのｇＤと結合してＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２の細胞進入を誘導するとされている（Ｓａｒａｈ Ａ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ＨｖｅＡ（ＨＶＥＭ）．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；７６（２１）：１０８９４－９０４．）。
本発明者らは、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）に対するｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）とＨＳＶ細胞表面受容体の一つであるＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質（ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）を作製し、その融合タンパク質をＨＳＶと共に、ＣＥＡを発現させる細胞株に処理する場合に、その融合タンパク質がアダプター（ａｄａｐｔｅｒ）として作用し、ＨＳＶが当該細胞株を標的して感染させるように誘導することを既に報告したことがある（韓国登録特許第１０－０９３７７７４号及び米国登録特許第８３１８６６２号参照）。
本発明は、上記のアダプターである融合タンパク質（ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）を暗号化する遺伝子をＨＳＶのゲノムに発現可能に挿入し、その融合タンパク質をＨＳＶに感染された細胞内で発現させる場合に、その融合タンパク質がＨＳＶを、ＣＥＡを発現させる細胞株を標的して感染させるように誘導することを確認する一方、ＣＥＡに対するｓｃＦｖに代えてＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）に対するＳｃＦｖとＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質（ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）も同様に、ＨＥＲ２を発現させる細胞株を標的して感染させるように誘導することを確認し、完成したものである。
したがって、本発明の目的は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを発現させることができる、その融合タンパク質の発現カセットを有する組換えＨＳＶを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記組換えＨＳＶを有効成分として含む抗癌治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記薬剤学的組成物を有効量で患者などの対象体に投与する癌予防又は治療方法を提供することにある。
本発明の別の目的や具体的な目的は、以下に提示される。
本発明は、癌細胞標的化領域（癌標的化領域は、本明細書において癌標的化ドメインと同じ意味で使用されたり、本明細書の文脈によってはリガンドと表現されることもある。）とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを発現できる組換え単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）に関する。
本発明の組換えＨＳＶが癌細胞である標的細胞を感染させて標的細胞内に入ると、ＨＳＶが増殖すると共に、融合タンパク質であるアダプターが細胞内で発現し、細胞溶解によって増殖したＨＳＶビリオンと共に細胞外部に放出されるか、或いは、アダプターがリーダー配列を有する場合には、細胞溶解によるビリオン放出以前にも放出される。この細胞外部に放出されたアダプターは、ＨＳＶビリオンを、アダプターの癌細胞標的化領域が認識する標的分子を発現させる周辺癌細胞へと感染を誘導するか、或いは感染効率を上げる作用を有する。
一般に、組換えＨＳＶは、野生型ＨＳＶウイルスと比較して、人為的な突然変異が導入されることにより（すなわち、一部の核酸配列が欠失、置換又は挿入されることにより）一定の機能が喪失又は変更されるか、或いは、意図した目的タンパク質を発現できるように遺伝的に操作されたＨＳＶを意味するが、本発明において、組換えＨＳＶは、ＨＳＶゲノムに、ＨＳＶの増殖を阻害することなく、アダプターの発現カセット（ａｄａｐｔｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ）（すなわち、アダプター遺伝子がそれの発現を可能にするプロモーター配列及びポリアデニル化シグナル配列と作動可能に連結された構成体）を導入（すなわち、挿入）することにより、その組換えＨＳＶが感染された癌細胞内でアダプターを発現させることができるＨＳＶを意味する。このようなウイルスの遺伝子操作とビリオンの生産などの組換えウイルス製造技術は、当業界に非常によく公知されており、具体的には、文献［Ｓａｎｄｒｉ－Ｇｏｌｄｉｎ ＲＭ ｅｔ ａｌ，Ａｌｐｈａ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００６］、文献［Ｒｏｂｉｎ Ｈ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．２００４ Ａｕｇ；８５（４）：１７７－１９０］などを参照できる。これらの文献を含めて本明細書で引用される文献はいずれも本明細書の一部として見なされる。
本発明の組換えＨＳＶは、特に、このようなアダプターを発現させるように操作される他に、進入受容体（ｅｎｔｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としてネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１）を通じて細胞内に進入できず、単にＨＶＥＭ受容体を通じてのみ細胞内に進入するようにさらに操作されてもよい。本発明は、下の実施例においてＨＳＶ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｇＤの配列を操作し、ＨＶＥＭ受容体を通じてのみＨＳＶが細胞内に進入するようにした。具体的に、ｇＤの２２２番位置のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）と２２３番位置のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｍｅ，Ｆ）をそれぞれアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）とイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）に置換させ、ｇＤの機能が変更されるように操作しており、このようなｇＤ機能が変更された組換えＨＳＶは、ＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）受容体を通じてのみ宿主細胞内に入ることができる（Ｈｉｒｏａｋｉ Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ）－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ Ｍｕｔａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＨＶＥＭ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｓｃｕｅ ｎｅｃｔｉｎ－１ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００９ Ａｐｒ；８３（７）：２９５１－６１）。ＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）受容体は正常細胞にはほとんど存在せず、リンパ腫などにのみ存在するのに対し、ネクチン－１は大部分の正常細胞に存在するので、ＨＶＥＭ受容体を通じてのみ細胞進入が可能で、ネクチン－１受容体を通じては細胞進入が不可な、前記ｇＤ機能が変更された組換えＨＳＶは正常細胞を感染させることがないので、安全性の側面で有利な特性を有する。
また、本発明の組換えＨＳＶは、ＨＳＶの増殖（すなわち、生存及び複製）に不要な非必須遺伝子（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ）が欠失したり機能を発揮しないように（すなわち、転写や翻訳が妨害を受けるように）突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）されてもよい。具体的に、このような非必須遺伝子は、ＵＬ３遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８３０．１参照）、ＵＬ４遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８３１．１参照）、ＵＬ１４遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４１．１）、ＵＬ１６遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４３．１参照）、ＵＬ２１遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４８．１参照）、ＵＬ２４遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８５１．１参照）、ＵＬ３１遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８５９．１参照）、ＵＬ３２遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８６０．１参照）、ＵＳ３遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８９１．１参照）、ＵＬ５１遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８８０．１参照）、ＵＬ５５遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８８４．１参照）、ＵＬ５６遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８８５．１参照）、ＵＳ２遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８９０．１）、ＵＳ１２遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２９０１．１；すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子参照）、ＬＡＴ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１参照）、ｇＢ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ７３４７７１．１の５２９９６と５５７１０間の配列）、ｇＬ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８２８．１参照）、ｇＨ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４９．１参照）、ｇＤ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８９４．１参照）などを挙げることができる。
ＨＳＶウイルスの非必須遺伝子についてのより詳細は、文献［ＤＭ Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ ＰＭ Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄ．）Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ｖｏｌ．２）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．２００１．ｐ．２３９９－２４６０）］、文献［Ｓｕｂａｋ－Ｓｈａｒｐｅ Ｊ Ｈ，Ｄａｒｇａｎ Ｄ Ｊ ＨＳＶ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，１９９８，１６（３）：２３９－２５１］、文献［Ｔｒａｖｉｓ Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ及びＤａｖｉｄ Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｅｐａｉｒ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ＩＣＰ８，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；７８（１１）：５８５６－５８６６］などを参照できる。
本発明の組換えＨＳＶは、組換えＨＳＶ－１ウイルス、組換えＨＳＶ－２ウイルス、又はＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２キメラウイルス（すなわち、、ゲノムがＨＳＶ－１に由来したＤＮＡ及びＨＳＶ－２に由来したＤＮＡの両方を含む組換えＨＳＶウイルスである。）でよく、好ましくは、組換えＨＳＶ－１ウイルス、より好ましくは、ＨＳＶ－１ ＫＯＳ菌株に由来した組換えＨＳＶ－１である。ＨＳＶ－１ ＫＯＳ菌株は、ＡＴＣＣ（Ｃａｔ Ｎｏ ＶＲ－１４９３ＴＭ）から購入可能であり、その菌株のゲノム配列は、全配列分析が完了し、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に提示されている（Ｓｔｕａｒｔ Ｊ Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ １ Ｓｔｒａｉｎ ＫＯＳ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ；８６（１１）：６３７１－２）。
ＨＳＶ－１ウイルスのゲノムは、総８４個の遺伝子を暗号化する１５２ｋｂの二本鎖線形ＤＮＡで構成されており、これは、互いに連結された２つの断片、すなわち、長い断片（Ｌ領域）と短い断片（Ｓ領域）とで構成される。長い断片（Ｌ領域）はゲノムの約８２％を占め、短い断片（Ｓ領域）はゲノムの約１８％を占め、長い断片と短い断片は、接合領域である２個のＩＲＬ（（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により結合し、各断片の末端にはＴＲＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｇｍｅｎｔ）が存在する。Ｌ領域（ＵＬ）には、５６個のＵＬ１～ＵＬ５６遺伝子と、１０個の遺伝子（ＵＬ８．５、９．５、１０．５、１２．５、１５．５、２０．５、２６．５、２７．５、４３．５、４９．５）が存在し、Ｓ領域（ＵＳ）には、１２個のＵＳ１～ＵＳ１２遺伝子と２個の遺伝子（ＵＳ１．５、８．５）が存在し、接合領域である２個のＩＲＬに４個の遺伝子（ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ０及びＬＡＴ）が含まれている。
本発明において、アダプター発現カセットは、アダプター遺伝子がそれの発現を可能にするためのプロモーター配列と転写終結信号配列であるポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）配列と作動可能に連結されて構成される。ここで、“作動可能に連結される”とは、発現するアダプター遺伝子の転写及び／又は翻訳が可能なように連結されるという意味である。例えば、あるプロモーターがそれに連結されたアダプター遺伝子の転写に影響を与えるとすれば、そのプロモーターはそのアダプター遺伝子に作動可能に連結されたものである。
一般に、プロモーターは、ある遺伝子の転写始点を基準に上位（５’側）に位置し、ＤＮＡ－依存ＲＮＡ重合酵素に対する結合部位、転写始点、転写因子結合部位などを含む、一つ以上の遺伝子の転写を制御する機能を有する核酸配列を意味する。このようなプロモーターは、真核生物由来の場合に、転写始点上位にあるＴＡＴＡボックス（通常、転写始点（＋１）－２０～－３０位置に存在）、ＣＡＡＴボックス（通常、転写開始部位と比較して略－７５位置に存在）、エンハンサー、転写因子結合部位などを含む。
プロモーターはそれに連結された目的遺伝子を発現できるプロモーターであれば、構成的プロモーター（常時的に遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、誘導性プロモーター（特定外部刺激に反応して目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、組織特異性プロモーター（特徴の組織や細胞で遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、組織非特異的プロモーター（あらゆる組織や細胞で遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、内因性プロモーター（ウイルスが感染される細胞に由来したプロモーター）、外因性プロモーター（ウイルスが感染される細胞以外の細胞に由来したプロモーター）のいずれも使用可能である。このようなプロモーターは、当業界に多くのものが公知されており、公知されたいずれか適切なものを選択して使用することができる。例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＲａｕＳＥ肉腫ウイルス（ＲＳＶ，ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ＴＫ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター、ＣＤ４５プロモーター（造血母細胞特異的プロモーター）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞特異的プロモーター）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ＴＥＲＴ、ＣＸＣＲ４などの癌細胞特異的プロモーター（ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）などを使用することができる。特に、癌細胞特異的プロモーターを使用する場合に、癌細胞でのみアダプターの発現を誘導することによってアダプターが正常細胞で発現することを抑制し、本発明の組換えＨＳＶの安全性を高めることができる。
前記アダプター発現カセットは、プロモーターの他にも転写終結信号配列を含んで構成されるが、転写終結信号配列は、ｐｏｌｙ（Ａ）添加信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）として働く配列で、転写の完結性及び効率性を高めるためのものである。多くの転写終結信号配列が当業界に公知されており、この中で適切なもの、例えばＳＶ４０転写終結信号配列、ＨＳＶ ＴＫ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）の転写終結信号配列などを選択して使用することができる。
前記アダプター発現カセットは、ＨＳＶの増殖を阻害することなく、ＨＳＶゲノムに発現可能なように挿入されるが、このような挿入は、ＨＳＶゲノムの欠失無しで挿入される、或いは、ＨＳＶゲノムのうち非必須遺伝子が一部又は全部欠失し、その欠失した位置に挿入されてよい。アダプター発現カセットがＨＳＶゲノムの欠失無しで挿入される場合に、各遺伝子の間に挿入されてよいが、挿入される位置として好ましい位置は、例えば、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、ＵＳ１とＵＳ２遺伝子の間などを挙げることができる。
アダプター発現カセットが、ＨＳＶゲノムにおいて非必須遺伝子の一部又は全部が欠失しその欠した位置に挿入される場合に、欠失する非必須遺伝子は、先に例示した任意の非必須遺伝子であってよい。
本発明の組換えＨＳＶにおいて、アダプターの癌細胞標的化領域は、標的細胞である癌細胞の標的分子を特異的に認識して結合する部分であり、このような癌細胞標的化領域が認識する標的分子は、癌細胞の表面に存在する任意の抗原又は任意の受容体である。
このような抗原又は受容体は、好ましくは、癌細胞でのみ発現するか、正常細胞に比べて癌細胞で過発現する抗原又は受容体のことを指す。例えば、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）で発現するＥＧＦＲｖIII（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔIII）、逆形成甲状腺癌や乳癌、肺癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）などに過発現するＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、乳頭性甲状腺癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）などで過発現メタスチン受容体（Ｍｅｔａｓｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、乳癌などで過発現するＥｒｂＢ系列の受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）、乳癌、膀胱癌、胆嚢癌（Ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒｓ）、胆管癌（Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、胃食道接合部癌（ｅｓｏｐｈａｇｏｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒｓ）などで過発現するＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、肉頭性腎癌腫などで過発現するチロシンキナーゼ－１８－受容体（ｃ－Ｋｉｔ）、食道腺癌などに過発現するＨＧＦ受容体ｃ－Ｍｅｔ、乳癌などで過発現するＣＸＣＲ４又はＣＣＲ７、前立腺癌で過発現するエンドセリン－Ａ受容体、直膓癌などで過発現するＰＰＡＲ－δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ）、卵巣癌などで過発現するＰＤＧＦＲ－α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）、肝癌、多発性骨髄腫などで過発現するＣＤ１３３、肺癌、大腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、直膓癌、結腸癌、甲状腺髄様癌などで過発現するＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、肝癌、胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌などで過発現するＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、神経芽細胞腫などで過発現するＧＤ２（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、肝細胞癌などで過発現するＧＰＣ３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ３）、前立腺癌などで過発現するＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌などで過発現するＴＡＧ－７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ７２）、黒色腫などで過発現するＧＤ３（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、血液癌、固形癌などで過発現するＨＬＡ－ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ）、進行性固形癌などで過発現するＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ１）、進行性肺癌（ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）などで過発現するＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ１）、鼻咽頭腫瘍（Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）などで過発現するＬＭＰ１（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１）、肺癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、膵癌などで過発現するＴＲＡＩＬＲ２（ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ２（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、肝細胞癌などで過発現するＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などが標的分子であってよく、また、癌幹細胞の表面抗原であるＣＤ４４、ＣＤ１６６なども標的分子であってよい。当業界には正常細胞に比べて癌細胞で過発現する多くの標的分子が知られており、前記例示された以外の標的分子に関するより詳細は、文献［Ａｎｎｅ Ｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｄｅｃ１；６５（２３）：１０９４６－５１］、文献［Ｃｈｅｎｗｅｉ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｆｅｂ １；６７（３）：１０３０－７］、文献［Ｓｈｕｏ Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２０１９ Ｓｅｐ ７；１５（１２）：２５４８－２５６０］、文献［Ｄｈａｖａｌ Ｓ Ｓａｎｃｈａｌａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｓｔｒｉｄｅ Ｔｏｗａｒｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７ Ｍａｙ １６；８：２７０］などを参照できる。
特に、本発明において標的分子は、好ましくはＨＥＲ２又はＣＥＡである。
本発明の組換えＨＳＶがアダプターにより標的化する標的細胞は、本発明におけるアダプターの癌細胞標的化領域が標的できる標的分子を有する任意の癌細胞である。癌細胞であれば食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、黒色腫、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、膵癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）疾患、リンパ腫、多発性骨髄腫、血液癌など、いずれの癌腫であってもよい。
本発明において、アダプターの細胞標的化領域は、標的分子と特異的結合能を有する完全な抗体の他にも、抗体誘導体、抗体類似体であってよい。抗体誘導体は、標的分子と特異的結合能を有する抗体可変領域を少なくとも一つ含む完全な抗体の断片又は変形抗体を意味する。このような抗体誘導体としては、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶｈＨ、ＶＨ、ＶＬなどの抗体断片、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディー、ダイアボディー、トリボディー、テトラボディー、ビス－ｓｃＦｖなどの多価性又は多重特異的変形抗体などを挙げることができる。抗体類似体は、抗体と同様に、標的分子と特異的結合能を有するが、構造上抗体とは違い、一般に抗体に比べて低い分子量を有する人為的ペプチド又はポリペプチドを意味する。このような抗体類似体として、ＡＢＤ、アドヒロン（ａｄｈｉｒｏｎ）、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アルファボディー（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アルマジロ（ａｒｍａｄｉｌｌｏ）反復タンパク質、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、ダルピン（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、Ｋｕｎｉｔｚ領域、プロネクチン（ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ）、リピボディー（ｒｅｐｅｂｏｄｙ）などを挙げることができる。
このような抗体、抗体誘導体、抗体類似体、その製造に関しては、当業界に相当多い文献が蓄積されており、そのような文献としては、例えば、文献［Ｒｅｎａｔｅ Ｋｕｎｅｒｔ ＆ Ｄａｖｉｄ Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ａｐｒ；１００（８）：３４５１－６１］、文献［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ１，Ｈｕｄｓｏｎ ＰＪ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６－３６］、文献［Ｘｉａｏｗｅｎ Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｙｏｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｎｅｒｓ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，１０：２９３－３２０］、文献［Ａｂｄｕｌ Ｒａｓｈｅｅｄ Ｂａｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃｓ：ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ａｎｉｍａｌ－ｓｏｕｒｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６：２６８－２７５］などを挙げることができる。
本発明において、アダプターの細胞標的化領域は、好ましくはｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変領域と軽鎖（ＶＬ）の可変領域とが短いリンカーペプチドを媒介に連結された一本鎖抗体のことを指す。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨのＣ末端はＶＬのＮ末端と連結される、又はＶＬのＣ末端はＶＨのＮ末端と連結される。ｓｃＦｖにおいてリンカーペプチドは、重鎖と軽鎖の固有３次元構造を妨害することなく、重鎖と軽鎖が空間的に隣接して標的分子との特異的な結合能力を持つようにする限り、任意の長さ、任意の配列のリンカーペプチドであってよい。好ましくは、リンカーは、柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）、溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、蛋白分解に対する抵抗性などの側面で、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒなどのアミノ酸のうち１種以上のアミノ酸を含むことが好ましく、長さは、１～３０個アミノ酸、好ましくは３～２５個アミノ酸、より好ましくは８～２０個アミノ酸でよい。
本発明において、特に、ｓｃＦｖは標的分子をＨＥＲ２又はＣＥＡとし、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨと配列番号２のＶＬとがリンカーペプチドを媒介にＶＨ、リンカーペプチドＶＬの順に連結されたもの（すなわち、ＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端とリンカーペプチドを媒介に連結されたもの）が好ましく、ＣＥＡに対するｓｃＦｖは、配列番号３のＶＬと配列番号４のＶＨとがリンカーペプチドを媒介にＶＬ、ペプチドリンカー、ＶＨの順に結合したもの（すなわち、ＶＬのＣ末端がＶＨのＮ末端とリンカーペプチドを媒介に連結されたもの）が好ましい。ここで、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖのリンカーペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有することが好ましく、前記ＣＥＡに対するｓｃＦｖのリンカーペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有することが好ましい。
本発明において、ＨＶＥＭの細胞外ドメインは、下の実施例で使用された、配列番号７のＨｖｅＡ８２（リーダー配列まで含まれたＨｖｅＡ８２配列は、配列番号８に開示されている。）の他、韓国登録特許第１０－０９３７７７４号及び米国登録特許第８３１８６６２号（本文献は、本明細書の一部として見なされる。）が開示する配列番号９のＨｖｅＡ８７（リーダー配列まで含まれたＨｖｅＡ８７配列は、配列番号１０に開示されている。）、配列番号１１のＨｖｅＡ１０２（リーダー配列まで含まれたＨｖｅＡ１０２配列は、配列番号１２に開示されている。）、又は配列番号１３のＨｖｅＡ１０７（リーダー配列まで含まれたＨｖｅＡ１０７配列は、配列番号１４に開示されている。）であってもよい。ＨｖｅＡ８７、ＨｖｅＡ１０２、ＨｖｅＡ１０７はそれぞれ、ＨｖｅＡ８２に比べて５、２０、２５個アミノ酸をさらに含んでおり、前記韓国登録特許第１０－０９３７７７４号においていずれもアダプターのＨＳＶレセプターとして使用可能であることを確認したことがある。
また、本発明において、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの間にリンカー配列が介在されてよいが、このリンカー配列は、それらのアダプターの各ドメインの機能を阻害しない限り、いずれの長さ、いずれの配列のリンカーであってもよい。好ましくは、リンカーは、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ４のアミノ酸のいずれか１種以上のアミノ酸からなってよく、長さは、１～３０個、アミノ酸、好ましくは３～２５個アミノ酸、より好ましくは８～２０個アミノ酸であってよい。
また、本発明のアダプターは、ＮＨ２－癌細胞標的化ドメイン－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順、又はその逆順の構成を有することができる。リンカーペプチドが媒介される場合は、ＮＨ２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順、又はその逆順の構成であってもよい。
本発明のアダプターは、そのＮ末端に、具体的にアダプターの構成がＮＨ２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨ順の場合は、癌細胞標的化ドメインのＮ末端（ｓｃＦｖが使用される場合は、ＶＨ又はＶＬのＮ末端）に、アダプターの構成がＮＨ２－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－リンカーペプチド－癌細胞標的化ドメイン－ＣＯＯＨの順の場合には、ＨＶＥＭ細胞外ドメインのＮ末端にリーダー配列がさらに含まれてよい。このようなリーダー配列は、標的細胞においてアダプターが発現して細胞外にアダプターが流出されるように誘導する作用をする配列であり、標的細胞が溶解されてＨＳＶウイルスが放出されて初めてアダプターがＨＳＶウイルスを隣接標的細胞に感染されるように誘導する作用をするので、省略されてもよい。
また、本発明において、細胞標的化領域として標的分子に対するｓｃＦｖを使用する場合、ＶＨとＶＬとの間に、ＶＨとＶＬとの間にリンカーペプチドが媒介される場合はＶＨ又はＶＬとリンカーペプチドとの間、ｓｃＦｖとＨＶＥＭとの間に、ｓｃＦｖとＨＶＥＭとの間にリンカーペプチドが媒介される場合には、ｓｃＦｖとリンカーとの間、リンカーとＨＶＥＭとの間に、クローニングを容易にするために、任意の制限酵素作用部位に該当するアミノ酸が介在してよい。例えば、下記の実施例のように、制限酵素ＥｃｏＲＩが作用するＥＦ（塩基配列：ＧＡＡＴＴＣ）、ＢａｍＨＩが作用するＧＳ（（塩基配列：ＧＧＡＴＣＣ））が介在してよい。
本発明において、組換えＨＳＶは、癌細胞に対する免疫反応を誘導又は増進させるための因子を単独で又は任意の組合せで発現させるように、当該因子に対する遺伝子がＨＳＶゲノムに挿入されてよい。そのような因子は、サイトカイン、ケモカイン、免疫関門（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）に対する拮抗剤（例えば、抗体、抗体誘導体又は抗体類似体、特に、ｓｃＦｖ）、免疫細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の活性化を誘導できる補助刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、癌細胞に対する免疫反応を抑制するＴＧＦβの機能を阻害できる拮抗剤（例えば、抗体、抗体誘導体又は抗体類似体、特に、ｓｃＦｖ）、固形腫瘍微小環境を構成するヘパランサルフェートプロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）を分解できるヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ－２（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）の機能を阻害できる拮抗剤（例えば、抗体、抗体誘導体又は抗体類似体、特に、ｓｃＦｖ）などを発現させるように操作されてよい。
サイトカインは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２４などのインターロイキン、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなどのインターフェロン、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子などが単独で又は２以上の任意の組合せで組換えＨＳＶにおいて発現するように用いられてよい。
ケモカインは、例えば、ＣＣＬ２（Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ２）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ－１（（Ｘ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ １））などが単独で又は組合せで組換えＨＳＶにおいて発現するように用いられてよい。
免疫関門に対する抗体は、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ－Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＤ２７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７）、ＣＤ２８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２８）、ＣＤ７０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７０）、ＣＤ８０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０）、ＣＤ８６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８６）、ＣＤ１３７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １３７）、ＣＤ２７６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７６）、ＫＩＲｓ（ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＩＴＲＬ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｎ－４）などに対する拮抗剤が単独で又は組合せで組換えＨＳＶにおいて発現するように用いられてよい。
補助刺激因子は、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共同刺激因子）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εなどが単独で又は組合せで組換えＨＳＶにおいて発現するように用いられてよい。
本発明において、組換えＨＳＶは、プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を癌細胞に毒性を示す薬物（ｄｒｕｇ）に転換させるプロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）を発現させるように操作されてよい。このようなプロドラッグ活性化酵素としては、プロドラッグである５－ＦＣ（５－ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）を５－ＦＵ（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）である薬物に転換させるシトシンデアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、プロドラッグであるＣＰＡ（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）をＰＭ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ ｍｕｓｔａｒｄ）である薬物に転換させるラットシトクロムＰ４５０（ｒａｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，ＣＹＰ２Ｂ１）、プロドラッグであるイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，ＳＮ－３８１５０）をＳＮ－３８である薬物に転換させるカルボキシルエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）、プロドラッグであるＢＣ１９５４をＤＮＡ交差結合剤である４－ヒドロキシアミン１５１（４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ１５１）で転換させる細菌ニトロリダクターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、プロドラッグである６－メチルプリン－２’－デオキシリボシド（６－ｍｅｔｈｙｐｕｒｉｎｅ－２’－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ）を６－メチルプリン（６－ｍｅｔｈｙｌｐｕｒｉｎｅ）に転換させる大腸菌から分離されたＰＮＰ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）などを挙げることができる。
また、本発明において、組換えＨＳＶは、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）を発現させるように操作されてもよい。ＴＲＡＩＬは、癌細胞で過発現するそれの受容体に結合して癌細胞の死滅を誘導すると知られている（Ｋａｏｒｕ Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ｊａｎ；２１（１）：６８－７７）。
このような免疫反応を誘導又は増進させるための因子又はプロドラッグ活性化酵素の使用に関するより詳細は、文献［Ｍｉｃｈｅｌｅ Ａｒｄｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５ Ａｕｇ １４；６（２３）：］、文献Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ｍａｒ；２（３）：１７５－８４］、文献［Ｍａｒｉａｎｅｌａ Ｃａｎｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏａｐｏｔｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｔｏ ｕｓｅ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｆｌｔ３Ｌ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ），Ｊ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，２００８，２２：１０７７１３］、文献［Ｄａｎｎｙ Ｎ Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ＣＡＲｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１６ Ｍａｙ；１３（５）：２７３－９０］、文献［Ｐａｕｌ Ｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｌ；３７（７）：４６２－４７６］、文献［Ｃｏｌｅ Ｐｅｔｅｒｓ １，Ｓａｍｕｅｌ Ｄ Ｒａｂｋｉｎ，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．２０１５；２：１５０１０］などを参照できる。
本発明において、免疫反応を誘導又は増進させるための因子又はプロドラッグ活性化酵素は、前述したアダプターにおけるように、その遺伝子の発現カセット（すなわち、その遺伝子がそれの発現を可能にするプロモーター配列及びポリアデニル化シグナル配列と作動可能に連結された構成体）がＨＳＶの増殖を阻害することなくＨＳＶゲノムに挿入されるが、このような挿入は、ＨＳＶゲノムの欠失無しで、又はＨＳＶゲノムのうち非必須遺伝子が一部又は全部欠失し、その欠失した位置に挿入されてよい。このとき、ＨＳＶゲノムの欠失無しで挿入される場合に各遺伝子の間に挿入されてよく、好ましい挿入位置は、例えば、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、ＵＳ１とＵＳ２との間などを挙げることができる。非必須遺伝子が欠失しその欠失した位置に挿入される、或いは非必須遺伝子の欠失無しでその遺伝子中に挿入される場合に、そのような非必須遺伝子は、前述の任意の非必須遺伝子から選択されてよい。
他の側面において、本発明は、前述した組換えＨＳＶを有効成分として含む抗癌用薬剤学的組成物に関する。
本発明の薬剤学的組成物は、組換えＨＳＶが発現するアダプターの標的化領域が標的する標的分子を発現させる癌腫に対して抗癌用途を有する。そのような癌腫は、標的分子と関連して先に説明した通りである。
特に、本発明の組成物は、ＣＥＡ又はＨＥＲ２を発現させる腫瘍細胞を有する癌腫に対して抗癌用途を有することが好ましい。例えば、ＣＥＡを発現させる腫瘍細胞は、大腸癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、直膓癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞などを挙げることができ、また、例えば、ＨＥＲ２を発現させる腫瘍細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形成神経膠芽腫細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、唾液腺腫瘍（ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒ）細胞などを挙げることができる。
本発明において、抗癌は、癌細胞の死滅、癌細胞の生存能低下、癌細胞の増殖抑制による癌が有する病理的症状の抑制や遅延、そのような病理的症状の発病抑制や遅延、癌転移抑制、癌再発抑制を含む意味である。
本発明の薬剤学的組成物は、有効成分である前述した組換えＨＳＶの他に、組換えアダプター分子をさらに含むことができる。組換えアダプター分子は、前述した組換えＨＳＶが発現させるアダプター、すなわち、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質と同一に癌細胞標的化領域を有する融合タンパク質が組換え方法で製造されたものを指す。ここで、組換えＨＳＶが発現させるアダプターと同一に癌細胞標的化領域を有するということは、ＨＳＶが発現させるアダプターの癌細胞標的化領域がＨＥＲ２を標的分子とする場合に、アダプター分子の癌細胞標的化領域もＨＥＲ２を標的分子とするということを意味する。組換え方法によって意図する目的タンパク質の製造方法は、一般に、目的タンパク質を発現可能な発現ベクターを製造し、大腸菌、酵母、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｓｐ２細胞、ＨＥＫ－２９３細胞）などの宿主細胞に形質転換させ、培養後に目的タンパク質を分離する段階などからなるが、このような組換え方法による目的タンパク質の製造方法は、当業界に非常によく公知されており（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２００１））、特に、本発明に用いられる組換えアダプター分子の製造に関しては、韓国登録特許第１０－０９３７７７４号及び米国登録特許第８３１８６６２号を参照できる。本発明の薬剤学的組成物にこのような組換えアダプター分子がさらに含まれ、本発明の有効成分である組換えＨＳＶと組換えアダプター分子が併せて患者に投与される場合に、組換えＨＳＶの初期感染効率が増加する効果がある。
また、本発明の薬剤学的組成物は、許可された抗癌剤と併用又は混合して使用されてよい。そのような抗癌剤には、代謝拮抗剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ拮抗剤、微小管拮抗剤、植物由来アルカロイドなど、癌細胞に細胞毒性を示す任意の抗癌剤、任意のサイトカイン医薬品、任意の抗体医薬品、任意の免疫関門抑制剤医薬品、任意の細胞治療剤（ｃａｒ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｒｐｙ，ｃａｒ－ＮＫ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）医薬品などを含む。具体的に、タキソール、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、ゼピチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、シスプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、ＩＬ－２医薬品、ＩＮＦ－α医薬品、ＩＮＦ－γ医薬品、トラスツズマブ、ブリナツモマブ、イフィリムマブ、ペブロリズマブ、ニボリズマブ、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ベバシズマブ、セツキシマブ、チサゲンレクロイセル（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ、キムリア）、アキシカブタゲンシロルユーセル（Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ、イエスカルタ）などが例示されてよく、これらの例示された抗癌剤の他にも、当業界に公知のいかなる抗癌剤も本発明の薬剤学的組成物と混合又は併用して使用されてよい。
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体又は賦形剤を含み、投与経路によって当業界に公知の通常の方法で経口用剤形又は非経口用剤形に製造されてよい。
かかる薬剤学的に許容可能な担体又は賦形剤は、人体に特に毒性を有しない上に、薬物の活性や特性を阻害しないものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水（例えば、食塩水及び滅菌水）、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、リンゲル液、緩衝剤、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、デキストラン、アルブミン、又はこれらの任意の組合せであってよい。特に、本発明の薬剤学的組成物が液状溶液に製剤化される場合に、適切な担体又は賦形剤としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどの成分のうち一つ以上の成分を単独又は混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の医薬品添加剤などを添加して使用することができる。
本発明の薬剤学的組成物が経口投与剤として製剤される場合には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態で製造でき、非経口投与剤、特に注射剤として製剤化する場合には、単位投薬アンプル又は多回投薬の形態で製造できる。本発明の薬剤学的組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などの形態で製造化してもよい。
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的分野において通常の方法によって患者の身体内投与に適する単位投与型の製剤形態で剤形化させ、当業界における通常の投与方法を用いて、経口投与経路、又は皮膚、病変内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内、直腸経路などの非経口投与経路によって投与されてよい。
本発明の薬剤学的組成物の投与量（有効量）は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方でき、当業者であればこのような要因を考慮して投与量が適切に決定できる。好ましい態様において、本発明の薬剤学的組成物は、単位容量形態の注射剤として製造され、単位容量形態の注射剤として製造される場合に、本発明の薬剤学的組成物の単位容量当たりに含まれる組換えＨＳＶウイルスの量は、１０２～１０１４ｐｆｕの範囲、特に、１０４～１０１１ｐｆｕの範囲であってよい。
他の態様において、本発明は、前述した組換えＨＳＶを含む薬剤学的組成物を有効量で患者などの対象体に投与する段階を含む癌治療又は予防方法（すなわち、腫瘍治療又は予防方法）に関する。
このような癌治療方法は、組換えＨＳＶがそのアダプターの癌細胞標的化領域が標的する標的分子を持つ癌細胞を溶解して死滅させることによって可能になる。したがって、本発明の治療方法は、そのような標的分子を持つ任意の癌腫に対して適用が可能である。特に、本発明の治療方法は、ＣＥＡ又はＨＥＲ２を発現させる癌腫に適用されることが好ましい。
本発明の治療方法は、前記他の癌治療法と制限なく併用されてもよい。例えば、先に例示された細胞毒性抗癌剤、サイトカイン医薬品、抗体医薬品、免疫関門抑制剤医薬品、細胞治療剤（ｃａｒ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｒｐｙ，ｃａｒ－ＮＫ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）医薬品、放射線治療療法、手術療法などが、本発明の薬剤学的組成物の投与前・後又は同時投与方式で併用されてもよい。
本発明の治療方法において、有効量は、その適用対象である患者などに医療専門家などの提言による投与期間に本発明の薬剤学的組成物が投与される時に、癌治療又は予防効果などの意図した医学的効果を奏することができる、本発明の薬剤学的組成物が投与される量のことを指す。このような有効量は、前述したように、患者の年齢、体重、性別、病的状態などによって医療専門家などの当業者が適宜決定できる。
本発明の治療方法において、その薬剤学的組成物は、好ましくは、患者などに注射剤として、非経口投与経路によって、例えば病変内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ、腫瘍内）、静脈内、筋肉内、動脈内などに投与されてよい。
前述したように、本発明によれば、細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質を発現可能な発現カセットを有する組換え単純ヘルペスウイルス及びその用途を提供することができる。
前記融合タンパク質は、組換えＨＳＶが標的細胞を感染させて標的細胞内に入ると、ＨＳＶが増殖すると共に細胞内で発現し、細胞溶解によってその増殖したＨＳＶビリオンと共に細胞外部に放出される、或いはアダプターがリーダー配列を有する場合には細胞溶解によるビリオン放出以前にも放出される。この細胞外部に放出された融合タンパク質は、ＨＳＶビリオンを、その癌細胞標的化領域が認識する標的分子を発現させる周辺癌細胞へと感染を誘導するか、或いは感染効率を上げる作用を有する。
ＫＯＳ－３７ ＢＡＣゲノム構造及びＣｒｅ－ＬｏｘシステムによるＢＡＣ遺伝子除去を示す概要図である。
ＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１であるＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスのゲノム構造の概要図である。
ＥｍＧＦＰを発現させるＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１であるＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム構造の概要図である。
ＥｍＧＦＰを発現させるＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１の蛍光発現及びＨＶＥＭ受容体を持つ細胞への特異点感染を示す結果である。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスのゲノム構造の概要図と、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム構造の概要図である。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターの全配列と当該配列の構成を示す図である。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスのＨＥＲ２発現細胞への特異的感染を示す結果である。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスのＨＥＲ２発現細胞に対する特異的細胞死滅を示す結果である。
野生型ウイルス（ＨＳＶ－１ ＫＯＳ）とＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（Ｈｅｒ２ Ａｄａｐｔｅｒ）のＨＥＲ２発現細胞における細胞死滅程度を比較した結果である。
ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスのＣＥＡ発現細胞への特異的感染を示す結果である。
ＥｍＧＦＰを発現させるＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１であるＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ｇＤ／ＮＩ）とＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスのＣＥＡ発現細胞への特異的感染程度を比較した結果である。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスとＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプターを発現させるＫＯＳ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの特異的感染程度を比較した結果である。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルスのアダプターの細胞外発現を示す結果と周辺癌細胞にウイルス感染が広がることを観察した結果である。
以下、本発明を実施例を参照して説明する。ただし、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞ＨＶＥＭ制限ＨＳＶ－１（ＨＶＥＭ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＨＳＶ－１）作製
ＨＳＶ－１遺伝子は、１５２ｋｂに達する大きな遺伝子で構成されており、外来遺伝子を挿入する或いは特定位置における変異を導入するために、ＫＯＳ－３７ ＢＡＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＦ１５６５８３）（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）を使用した。ＨＳＶ－１ ＫＯＳストレイン（ＨＳＶ－１ ＫＯＳ ｓｔｒａｉｎ）は、その特性がよく知られており、遺伝子の機能及び病因調査に有用な点で、実験室で主に使用されるＨＳＶ－１ストレインの一種である（Ｓｍｉｔｈ ＫＯ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９６４．１１５：８１４－８１６）。ＫＯＳ遺伝子にＢＡＣプラスミドを挿入して作製されたＫＯＳ－３７ ＢＡＣは、ＤＨ１０Ｂバクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によってバクテリアレベルでクローニングを可能にする（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）。ＫＯＳ－３７ ＢＡＣは、ＨＳＶ－１ ＫＯＳゲノムのＵＬ３７とＵＬ３８との間の位置に、ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）が両側にＬｏｘＰサイトと共に挿入されている。今後、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ ｓｙｓｔｅｍを用いてＢＡＣ遺伝子を除去できるように作製された。その概要を図１に示す。
ＨＶＥＭ細胞受容体を通じてのみ細胞進入するＨＶＥＭ制限ＨＳＶ－１を作製するために、ＨＳＶ－１ｇＤアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７８１８、配列番号１５）の２２２番位置のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）と２２３番位置のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｍｅ，Ｆ）をそれぞれアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）とイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）に置換したｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＨＳＶ－１ウイルスを作製した。
このような突然変異によって作られたｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＨＳＶ－１ウイルスは、細胞感染受容体（ｅｎｔｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としてネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１）を使用できず、単にＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）を通じてのみ宿主細胞内に感染可能なため（Ｕｃｈｉｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００９．８３（７）：２９５１－２９６１）、ネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１）受容体を持つ正常細胞を感染させることがなく、安全性においても有利である。
ＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１のゲノム構造の概要を図２に示す。
ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＨＳＶ－１ウイルスの作製は、カウンターセレクションＢＡＣ変形キット（Ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてメーカーのプロトコルに従ってＫＯＳ－３７ ＢＡＣのｇＤ部分にＲ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ突然変異を導入した。
具体的に、ＫＯＳ－３７ ＢＡＣが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を有し得るＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現できるｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）させた（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ｇＤに突然変異を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーｇＤ－ｒｐｓＬ Ｆｏｒ：配列番号１６、逆方向プライマーｇＤ－ｒｐｓＬ Ｒｅｖ：配列番号１７）を用いてｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットは、挿入する位置のｇＤ相同領域と、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に敏感性を有させる選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）であるｒｐｓＬ遺伝子と、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性を有させるｎｅｏ／ｋａｎ遺伝子とで構成される。ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットが挿入されると、ｒｐｓＬ遺伝子によってストレプトマイシン抗生剤に敏感となり、ｎｅｏ／ｋａｎ遺伝子によってカナマイシン抵抗性を有するＥ．ｃｏｌｉが作られる。ＫＯＳ－３７ ＢＡＣとｐＲｅｄＥＴが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させて、相同組換えが可能なようにＲｅｃＥとＲｅｃＴの発現を誘導した後（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）、作製したｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。相同組換えによってｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがＫＯＳ－３７ ＢＡＣのｇＤ位置に挿入される。ＫＯＳ－３７ ＢＡＣにｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性は、ｒｐｓＬ遺伝子のために遮断された状態である。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉは、ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最終的な遺伝子を挿入する段階に進行した。ＫＯＳ３７－ＢＡＣ ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎクローンがあるＥ．ｃｏｌｉにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させ、相同組換えが可能なようにＲｅｃＥとＲｅｃＴの発現を誘導した後、ｇＤにおいて２２２番位置及び２２３番位置でそれぞれＮ及びＩを置換したアミノ酸配列（配列番号１８）に該当するオリゴヌクレオチドであるＲ２２２Ｎ＿Ｆ２２３Ｉ＿ｍｕｔａｎｔを１００ｐｍｏｌを入れ、形質転換をした。既存ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと挿入されたオリゴヌクレオチドが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ｇＤにおいて、２２２番位置及び２２３番位置でそれぞれＮ及びＩが導入されたか否かをＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）及びＤＮＡシーケンシングで確認した。
次に、ウイルス作製は、前記完成されたＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡをラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ０－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、２×１０５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ １ｕｇを形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｗｅｌｌｇｅｎ）を用いて細胞培養をした。前記Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株は、Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ細胞株（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）にＨＶＥＭ遺伝子を挿入させてＨＶＥＭタンパク質発現を誘導した細胞株である。Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭを使用した理由は、細胞のＣｒｅ組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を用いてＫＯＳ３７ ＢＡＣのＢＡＣ遺伝子を除去することができ、ＨＶＥＭ過発現によるＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの感染が効果的なことから、将来、ウイルス量産が容易なためである。遺伝子導入３～４日経過後に、プラーク（ｐｌａｑｕｅ）の形成を確認した後、ウイルスの含まれた細胞を回収し、３回の凍結融解（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ）方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）によって最終的にＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを獲得した。
＜実施例２＞ＥｍＧＦＰを発現させるＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１作製
前記実施例１で作製されたＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの遺伝子ＵＬ２６／ＵＬ２７位置に、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現できる発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を挿入した。これは、マーカーとしてＥｍＧＦＰを用いてウイルスの生産と感染程度の観察を容易にするためのものである。ＥｍＧＦＰカセット作製には、ｐＣＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。
ＵＬ２６／２７－ＥｍＧＦＰを発現させるＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１のゲノム概要を図３に示す。
ＥｍＧＦＰ発現のために、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）の遺伝子プロモーターとＨＳＶ ＴＫ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）のポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）であるｔｋｐＡを用いてｐＣＭＶ－ＥｍＧＦＰ－ｔｋｐＡの構造でＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉに挿入した。
全ての挿入方法は、前記実施例１と同様に、カウンターセレクションＢＡＣ変形キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルに従って行った。
具体的に、ＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ遺伝体が入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を有し得るＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現できるｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ＵＬ２６とＵＬ２７との間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ＿Ｆｏｒ：配列番号１９、逆方向プライマーＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ＿Ｒｅｖ：配列番号２０）を用いてＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。ＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩとｐＲｅｄ／ＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、作製したＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換した。このような相同組換えにより、ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩのＵＬ２６／２７位置に挿入される。ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉはカナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性は、ｒｐｓＬ遺伝子によって遮断された状態である。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉは、ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。
ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉに、ｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導し、その後、ＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶカセット２００ｎｇを形質転換させた。ＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶカセットは、ｐＣＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、正方向プライマーＵＬ２６－ｔｋｐＡ＿Ｆｏｒ（配列番号２１）と逆方向プライマーＵＬ２７－ｐＣＭＶ＿Ｒｅｖ（配列番号２２）を用いて作製したものである。
既存ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと挿入されたＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶが交替される上でｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をした（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）。ＵＬ２６／２７においてｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶの導入有無をＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理及びＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）によって確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。
蛍光タンパク質の正常な発現及びウイルスの生産のために実験を行った。完成されたＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡをラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ０－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、２×１０５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入３日後に、蛍光顕微鏡を用いてＥｍＧＦＰタンパク質の蛍光発現を蛍光顕微鏡を用いて観察し、Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞のプラーク（ｐｌａｑｅ）形成によってウイルス生産を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスの含まれた細胞を回収し、３回の凍結融解方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）及び超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）によってＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを獲得した。
ＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの感染と蛍光発現は、ＨＶＥＭのない細胞株（Ｊ１及びＪ－Ｎｅｃｔｉｎ）とＨＶＥＭが発現する細胞株（Ｊ－ＨＶＥＭ）を使用した。Ｊ１細胞は仔ハムスター腎臓細胞株で、ウイルスＨＳＶ－１レセプターであるＨＶＥＭとＮｅｃｔｉｎ－１が欠乏している細胞株である（Ｐｅｔｒｏｖｉｃ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１９；１３（４）：ｅ１００６３５２）。Ｊ－Ｎｅｃｔｉｎ、Ｊ－ＨＶＥＭ細胞株は、Ｊ１細胞にそれぞれＮｅｃｔｉｎ－１とＨＶＥＭを過発現する細胞株である（Ｐｅｔｒｏｖｉｃ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１９；１３（４）：ｅ１００６３５２）。各細胞株は、ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて培養した。１×１０４の細胞に、前記得られたＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを１０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させて２４時間後に、蛍光タンパク質発現及びウイルス感染程度を蛍光顕微鏡を用いて観察した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
結果を、図４に、蛍光顕微鏡モードで撮影した写真と光学顕微鏡モードで撮影した写真をそれぞれ上下に示した。図４の上の蛍光顕微鏡写真を参照すると、Ｊ１細胞株とＪ－Ｎｅｃｔｉｎ細胞株は感染されず、Ｊ－ＨＶＥＭ細胞株のみ感染されていることが分かる。
このような結果から、意図した通り、ＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスが蛍光タンパク質の発現によってウイルス感染の観察が容易であり、進入経路としてＮｅｃｔｉｎ－１を使用できず、ＨＶＥＭのみを使用して進入することを確認した。
＜実施例３＞ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター、ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させるＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス作製
前記実施例２で作製された、ＥｍＧＦＰ発現カセット（ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶ）が挿入されたＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの遺伝子ＵＬ３／ＵＬ４位置に、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセット、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター発現カセット、ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセットを挿入した。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセットであるｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが挿入されたＫＯＳ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター発現カセットであるｐＣＭＶ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ｂＧＨｐＡが挿入されたＫＯＳ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要、及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセットであるｐＣＭＶ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが挿入されたＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要を、図５に示し、また、図６に、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターの全配列と当該配列の構成を示す。ここで、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨと配列番号２のＶＬとが配列番号５のリンカーペプチドを媒介に連結された構成であり、ＣＥＡに対するｓｃＦｖは、配列番号３のＶＬと配列番号４のＶＨが配列番号６のリンカーペプチドを媒介に連結された構成であり、ＨｖｅＡは、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターにおいてはリーダー配列が除外された配列番号７のＨｖｅＡ８２であり、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプターにおいてはリーダー配列が含まれた配列番号８のＨｖｅ８２である。また、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターにおいては、そのＮ末端、すなわち、ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＶＨとＣＥＡｓｃＦｖのＶＬの前部に配列番号３３のリーダー配列が含まれている。
ＨＥＲ２又はＣＥＡに対するｓｃＦｖ配列とＨｖｅＡ配列のリンカー配列であるＮＨ２－ＧＧＧＧＳ配列の次には、クローニングを容易にするための制限酵素ＥｃｏＲＩ作用部位であるＥＦ（塩基配列：ＧＡＡＴＴＣ）が追加されており、ＨｖｅＡ配列とＨｅｒ２に対するｓｃＦｖ配列のリンカー配列であるＮＨ２－ＧＧＧＧＳ配列の次にも、クローニングを容易にするための制限酵素ＢａｍＨＩ作用部位であるＧＳ（塩基配列：ＧＧＡＴＣＣ）が追加されているが、これもアダプターから除外されても構わない配列である。ｂＧＨｐＡは、ｂｇｈ－ＰｏｌｙＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル配列である。本実施例で用いられたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター全長のアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号２３と配列番号２４に開示されており、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター全長のアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号２５と配列番号２６に開示されており、そしてＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター全長のアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号２７と配列番号２８に開示されている。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセット、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター発現カセット、ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセットの挿入は、前記実施例１及び２と同様に、カウンターセレクションＢＡＣ変形キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルに従って行った。
具体的に、前記実施例２で作製されたＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ遺伝体が入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を果たすＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現させるｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ＵＬ３とＵＬ４との間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーＨＳＶ－１＿ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｆｏｒ：配列番号２９、逆方向プライマーＨＳＶ－１＿ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｒｅｖ：配列番号３０）を用いてＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。ＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩとｐＲｅｄＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、前記作製したＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換した。このような相同組換えによってＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩのＵＬ３／４位置に挿入される。ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉはカナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断される。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉは、ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。
ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉに、ｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨｖｅＡ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ｂＧＨｐＡカセット、及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット２００ｎｇを形質転換させた。前記ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨｖｅＡ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ｂＧＨｐＡカセット及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセットは、ｐＣＤＮＡ３．１－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡプラスミド、ｐＣＤＮＡ３．１－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖプラスミド、ｐＣＤＮＡ３．１－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡプラスミド（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）を鋳型とし、正方向プライマーＨＳＶ－１＿ＵＬ３／４－ＨＭ＿ｐＣＭＶ＿Ｆｏｒ（配列番号３１）と逆方向プライマーＵＬ３／４＿ｂＧＨ＿ｐｏｌｙ＿Ｒ（配列番号３２）を用いて作製した。
既存に挿入されたＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと上に挿入されたＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡ、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨｖｅＡ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ｂＧＨｐＡ及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが交替される上でｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ＵＬ３／４においてＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡ、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨｖｅＡ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ｂＧＨｐＡ及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡの導入の有無を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理及びＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）を用いて確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。
完成されたＫＯＳ３７－ＢＡＣ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ、ＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ＨｖｅＡ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３及びＫＯＳ３７－ＢＡＣ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡを、ラージコンストラクト ＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ０－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、２×１０５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入３日後に、蛍光顕微鏡を用いてＥｍＧＦＰタンパク質の蛍光発現と細胞のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を回収して３回の凍結融解方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）及び超音波破砕を用いてＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス、ＫＯＳ－ＨｖｅＡ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス及びＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを獲得した。
＜実施例４＞アダプター発現抗癌ウイルスを用いたＨＥＲ２又はＣＥＡ発現癌細胞ターゲッティング
＜実施例４－１＞ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現抗癌ウイルスを用いたＨＥＲ２発現癌細胞のターゲッティング
前記実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスがＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させることによって周辺の癌細胞にウイルスの感染を誘導するか否か、感染後細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、次のように実験を行った。
実験に用いられた細胞株は、ＨＥＲ２が発現しない細胞株（Ｊ１、ＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）とＨＥＲ２が発現する細胞株（Ｊ－ＨＥＲ２、ＣＨＯ－ＨＥＲ２、ＳＫ－ＯＶ－３）である。中国ハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９１．７４：１０１３２－１０１４１）は、ＨａＭ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を使用して培養し、Ｊ１、Ｊ－ＨＥＲ２（Ｐｅｔｒｏｖｉｃ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１９；１３（４）：ｅ１００６３５２）、乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２６）、卵巣癌細胞株であるＳＫ－ＯＶ－３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－７７）は、ＤＭＥＭ培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳを用いて培養した。
ＨＥＲ２特異的ウイルス感染のために、１×１０４のＪ細胞株は、１０ＭＯＩ、１．５×１０４のＣＨＯ細胞株は１ＭＯＩ、１×１０４のＳＫ－ＯＶ－３とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は０．１ＭＯＩで、前記実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルスを感染させた。９０分後に、残留する初期ウイルス及びＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを除去するために、新しい培地に交替した。感染３日後に、蛍光発現を用いてそれぞれの細胞株にウイルス感染を蛍光顕微鏡で観察した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
結果を、図７に、光学顕微鏡モードで撮影した写真と蛍光顕微鏡モードで撮影した写真をそれぞれ左右に示した。図７の右の方蛍光顕微鏡写真を参照すると、ＨＥＲ２が発現する細胞株であるＣＨＯ－Ｈｅｒ２、Ｊ－Ｈｅｒ２、ＳＫ－ＯＶ－３にのみ特異的に感染されることが確認できる。ＨＳＶ－１の感染経路は、ｇＢとｇＣが細胞に付着（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）し、ｇＤによって細胞中に進入（Ｅｎｔｒｙ）する作用機序を有する。ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡを発現させるｇＤ Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ変異がなされたウイルスにおいてＨＶＥＭ、Ｎｅｃｔｉｎ－１が欠乏したＣＨＯ－Ｋ１細胞株にやや感染が見られることは、ｇＤの役割の他にも、ｇＢ及びｇＣの細胞付着だけでもやや感染が起き得るためである（（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
また、ＨＥＲ２が発現する細胞株であるＣＨＯ－Ｈｅｒ２、Ｊ－Ｈｅｒ２、ＳＫ－ＯＶ－３は、ＨＶＥＭ受容体が欠乏しているにもかかわらずウイルスが最初感染することは、実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルスを感染させる際に、そのウイルスには、Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞を用いたウイルス生産過程においてＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターがｇＤに結合しているか或いは発現したＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターが微量含まれているためである。
次のウイルスによる細胞死滅を観察するためには、１．５×１０４のＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｈｅｒ２細胞株は、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルス１ＭＯＩ、１×１０４のＳＫ－ＯＶ－３とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルス２ＭＯＩを感染させた。感染３日後に、それぞれの細胞株を光学顕微鏡で撮影し、結果を図８に示した。ＨＥＲ２が発現する細胞株であるＣＨＯ－Ｈｅｒ２及びＳＫ－ＯＶ－３は、ＨＥＲ２が発現しない細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に比べて細胞数が顕著に低いことが分かる。
また、ＨＶＥＭ制限ヘルペスウイルス（ｇＤ／ＮＩ）とＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルス（Ｈｅｒ２ Ａｄａｐｔｅｒ）を、ＨＥＲ２発現細胞株である１×１０４のＳＫ－ＯＶ－３細胞に２ＭＯＩ感染させ、１、２、３、４、５日目のそれぞれの細胞にＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（ｓｉｇｍａ）を用いた細胞の染色によって細胞死滅を測定した結果を、図９に示した。ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルス（Ｈｅｒ２ Ａｄａｐｔｅｒ）の細胞死滅誘導効果が、一般ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１ ＫＯＳ）の細胞死滅誘導効果よりも明確に高いことが分かる。
＜実施例４－２＞ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現抗癌ウイルスを用いたＣＥＡ発現癌細胞のターゲッティング
前記実施例３で作製されたＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスがＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現させることによって周辺の癌細胞にウイルスの感染を誘導するかを確認するために、次のように実験を行った。
実験に用いられた細胞株は、ＣＥＡが発現しない細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１）とＣＥＡが発現する細胞株（ＣＨＯ－ＣＥＡ，ＭＫＮ４５）である。中国ハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＣＥＡ細胞株（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９１．７４：１０１３２－１０１４１）は、ＨａＭ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳを用いて培養し、胃癌細胞株であるＭＫＮ４５（ＪＣＲＢ、ＪＣＲＢ０２５４）は、ＲＰＭＩ－１６４０培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳを用いて培養した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
ＣＥＡ特異的ウイルス感染のために、１．５×１０４のＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＣＥＡ細胞に１０ＭＯＩでウイルスを感染させた。９０分後に、残留する初期ウイルス及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを除去するために新しい培地に交替した。７２時間後に、それぞれの細胞株にウイルス感染程度を蛍光顕微鏡で観察した。
結果を、図１０に、光学顕微鏡モードで撮影した写真と蛍光顕微鏡モードで撮影した写真をそれぞれ左右に示した。図１０の右の方蛍光顕微鏡写真を参照すると、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株はほとんど感染されず、ＣＨＯ－ＣＥＡ細胞株は明確に感染されていることが分かる。
ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡを発現させるｇＤ Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ変異がなされたウイルスにおいてＨＶＥＭ、Ｎｅｃｔｉｎ－１が欠乏しているＣＨＯ－Ｋ１細胞株にやや感染が見られることは、前述したように、ｇＤの役割の他にもｇＢ及びｇＣの細胞付着だけでもやや感染が起き得るためである（（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
また、ＣＥＡ発現癌細胞における特異的な感染を確認するために、６×１０４のＭＫＮ４５細胞株に、前記実施例２で作製されたＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ｇＤ／ＮＩ、比較群）と、前記実施例３で得られたＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ（ｓｃＣＥＡ－ＨｖｅＡ）をそれぞれ１ＭＯＩで感染させた。９０分後に、残留する初期ウイルス及びＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを除去するために新しい培地に交替した。７２時間後に、それぞれの細胞株にウイルス感染程度を蛍光顕微鏡で観察した。
結果を、図１１に、光学顕微鏡モードで撮影した写真と蛍光顕微鏡モードで撮影した写真をそれぞれ左右に示した。右の写真を参照すると、ＭＫＮ４５細胞において比較群であるＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスに比べてＫＯＳ－ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスが特異的に癌細胞に感染されるということが確認できる。
＜実施例５＞ＨＥＲ２アダプター構造変化によるアダプター発現抗癌ウイルスの感染活性変化
前記実施例３で作製された異なる構造の、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩウイルスとＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター発現ＫＯＳ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスが、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ又はＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプターを発現させることにより、アダプター構造による感染の活性変化を確認するために、次のように実験を行った。
実験に用いられた細胞株は、ＨＥＲ２が発現しない細胞株ＣＨＯ－Ｋ１と、ＨＥＲ２が発現する細胞株ＣＨＯ－ＨＥＲ２である。中国ハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９１．７４：１０１３２－１０１４１）は、ＨａＭ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて培養した。
アダプター構造によるウイルス感染活性変化を調べるために、１．５×１０４のＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２細胞株に１ＭＯＩで前記実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター発現ウイルスを感染させた。９０分後に、残留する初期ウイルス及びＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプターを除去するために、新しい培地に交替した。感染３日後に、ウイルス初期遺伝子の転写に必須なタンパク質であるＶＰ１６を染色し、それぞれの構造が異なるアダプター発現ウイルスの感染を蛍光顕微鏡で観察した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
図１２の右のＣＨＯ－ＨＥＲ２細胞においてそれぞれアダプター構造が異なるウイルス感染程度をＶＰ１６染色で観察した写真を参照すると、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ、ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプター発現ウイルスなどの感染程度が類似のレベルと観察された。アダプター発現システムにおいてＨｖｅＡの位置による感染程度の差異はないと確認され、両方の構造ともＨＥＲ２特異的な感染活性が高いことを確認した。ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）は、核酸染色によってＶＰ１６染色の比較観察指標として用いられた。
ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ又はＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを発現させるｇＤ Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ変異がなされたウイルスにおいて、ＨＶＥＭ、Ｎｅｃｔｉｎ－１が欠乏しているＣＨＯ－Ｋ１細胞株にやや感染が見られることは、前述したように、ｇＤの役割の他にもｇＢ及びｇＣの細胞付着だけでもやや感染が起き得るためである（（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。
また、ＨＥＲ２が発現する細胞株であるＣＨＯ－Ｈｅｒ２は、ＨＶＥＭ受容体が欠乏しているにもかかわらずにウイルスが最初感染することは、実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ウイルスを感染させる際に、そのウイルスには、Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞を用いたウイルス生産過程においてＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖアダプターとが結合しているか或いは発現したＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡが微量含まれているためである。
＜実施例６＞アダプター発現ウイルスのアダプターの細胞外発現と周辺癌細胞へのウイルス感染拡散観察
前記実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスによって細胞内に発現したＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターが細胞外部に放出されることを確認するために、次のように実験を行った。
実験に用いられた細胞株は、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）である。Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株は、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｗｅｌｌｇｅｎ）を用いて細胞培養した。２．０×１０５のＶｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞に０．１ＭＯＩでＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉと対照群であるＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを感染させた。９０分後に、残留する初期ウイルス及びＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを除去するために、ＦＢＳが含まれていない新しい培地に交替した。４８時間後に、培地を回収した。回収した培地のＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現を確認するために、ウェスタンブロット方法を用いてタンパク質発現の程度を測定した。
結果を、図１３の上段に示した。図１３の上段に示した結果を見ると、アダプターを含まないＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ｇＤ／ＮＩ）感染群から確保した培地ではアダプターの発現が検出されなかったが、ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）感染群から確保した培地では、細胞外部に放出されたアダプターが検出された。
この結果から、意図した通り、ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの細胞内感染によって挿入されたアダプターの発現と細胞外部への放出が円滑に作動することを確認した。
また、細胞外部に放出されたアダプターと細胞溶解によって放出されたウイルスによって周辺癌細胞にその感染が拡散することを確認するために、次のように実験を行った。
実験に用いられた細胞株は、ＳＫ－ＯＶ－３細胞株である。卵巣癌細胞株であるＳＫ－ＯＶ－３細胞株は、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｗｅｌｌｇｅｎ）を用いて細胞培養をした。
次に、１×１０４のＳＫ－ＯＶ－３細胞株に０．０１ＭＯＩでＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを希釈して感染させた。ここで、ウイルスを希釈して感染させるということは、周辺癌細胞にウイルス感染が拡散することを観察するためのものである。
結果を、図１３の下段に示す。図１３の下段に示した結果を見ると、感染２４時間後に、ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスによって一つの感染群が観察された。その後、４８時間、７２時間が経過しながら、最初感染群の周辺癌細胞にウイルスが感染が急速に拡散することを観察した。
この結果から、意図した通り、ＫＯＳ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの細胞内感染によって挿入されたアダプターが細胞外部に放出されて周辺癌細胞表面の抗原に結合し、細胞溶解によって放出されたウイルスは、既に癌細胞に結合したアダプターを標的するか、或いは、ウイルスに結合したアダプターによって標的分子を発現させる周辺癌細胞に感染が拡散するパターンを確認した。

Claims (20)

  1. 単純ヘルペスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質を発現可能な発現カセットが挿入されている、組換え単純ヘルペスウイルス。
  2. 前記ＨＶＥＭの細胞外ドメインは、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ８２、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ８７、配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ１０２、又は配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ１０７であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  3. 前記融合タンパク質は、その癌細胞標的化領域とそのＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）の細胞外ドメインとが１～３０個アミノ酸を含むリンカーペプチドによって連結されている融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  4. 前記リンカーペプチドのアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びＴｈｒのいずれか一つ以上のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  5. 前記癌細胞標的化領域は、標的細胞である癌細胞の標的分子を特異的に認識して結合する領域であり、
    前記標的分子は、癌細胞でのみ発現するか或いは正常細胞に比べて癌細胞で過発現する癌細胞表面の抗原又は受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  6. 前記抗原又は受容体は、ＥＧＦＲｖIII、ＥＧＦＲ、メタスチン受容体（Ｍｅｔａｓｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、チロシンキナーゼ－１８－受容体（ｃ－Ｋｉｔ）、ＨＧＦ受容体ｃ－Ｍｅｔ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、エンドセリン－Ａ受容体、ＰＰＡＲ－δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ）、ＰＤＧＦＲ－α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）、ＣＤ１３３、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＧＤ２（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ＧＰＣ３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ３）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ－７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ７２）、ＧＤ３（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ）、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ１）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ１）、ＬＭＰ１（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＴＲＡＩＬＲ２（ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ２（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、ＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ４４又はＣＤ１６６であることを特徴とする、請求項５に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  7. 前記癌細胞標的化領域は、標的細胞である癌細胞の標的分子であるＨＥＲ２を特異的に認識して結合するドメインであり、
    その領域は、配列番号１のＶＨと配列番号２のＶＬとがリンカーペプチドを媒介に、ＶＨ、リンカーペプチドＶＬの順に連結されたｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  8. 前記リンカーペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  9. 前記癌細胞標的化領域は、標的細胞である癌細胞の標的分子であるＣＥＡを特異的に認識して結合するドメインであり、
    その領域は、配列番号３のＶＬと配列番号４のＶＨとがリンカーペプチドを媒介に、ＶＬ、リンカーペプチド、ＶＨの順に結合したｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  10. 前記リンカーペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項９に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  11. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、ｇＤ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）のアミノ酸配列２２２番位置のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）及び２２３番位置のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｍｅ，Ｆ）がそれぞれアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）及びイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）に置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  12. 組換え単純ヘルペスウイルスは、その糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ又はｇＨに癌細胞の標的化領域が挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  13. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、組換えＨＳＶ－１ウイルス、組換えＨＳＶ－２ウイルス、又はＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２のキメラウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  14. 前記組換え単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ－１ ＫＯＳ菌株から由来した組換えＨＳＶ－１であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  15. 前記組換え単純ヘルペスウイルスには、単純ヘルペスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、（ｉ）サイトカイン、（ｉｉ）ケモカイン、（ｉｉｉ）免疫関門（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）に対する拮抗剤、（ｉｖ）免疫細胞の活性化を誘導可能な補助刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、（ｖ）癌細胞に対する免疫反応を抑制するＴＧＦβに対する拮抗剤、（ｖｉ）固形腫瘍微小環境を構成するヘパランサルフェートプロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）を分解可能なヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、（ｖｉｉ）血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ－２（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）の機能を阻害可能な拮抗剤、及び（ｖｉｉｉ）プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を癌細胞に毒性を示す薬物（ｄｒｕｇ）に転換させるプロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）から選ばれるものを発現させる発現カセットがさらに挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  16. 前記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２４を含むインターロイキン、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγを含むインターフェロン、ＴＮＦαを含む腫瘍壊死因子、ＧＭ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦのいずれか一つ以上であり、
    前記ケモカインは、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０及びＸＣＬ－１のいずれか一つ以上であり、
    前記免疫関門は、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ－Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＤ２７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７）、ＣＤ２８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２８）、ＣＤ７０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７０）、ＣＤ８０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０）、ＣＤ８６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８６）、ＣＤ１３７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １３７）、ＣＤ２７６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７６）、ＫＩＲｓ（ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＩＴＲＬ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ）及びＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｎ－４）のいずれか一つ以上であり、
    前記補助刺激因子は、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共同刺激因子）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εのいずれか一つ以上であり、
    前記プロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）は、シトシンデアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ラットシトクロムＰ４５０（ｒａｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，ＣＹＰ２Ｂ１）、カルボキシルエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）、細菌ニトロリダクターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及び大腸菌から分離されたＰＮＰ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）のいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  17. 前記融合タンパク質の発現カセットは、前記ウイルスゲノムに、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、ＵＳ１とＵＳ２間に挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  18. 前記発現カセットが前記ウイルスゲノムに、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、又はＵＳ１とＵＳ２間に挿入されており、前記融合タンパク質の発現カセットとは異なる位置に挿入されていることを特徴とする、請求項１５に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  19. 前記融合タンパク質は、ＮＨ２－癌細胞標的化ドメイン－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順又はその逆順であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
  20. 前記融合タンパク質は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとがリンカーペプチドを媒介に連結され、前記融合タンパク質は、ＮＨ２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順又はその逆順であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え単純ヘルペスウイルス。
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