CN118001307A - 肿胀发生抑制型溶瘤病毒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及肿胀发生抑制型溶瘤病毒。本发明的目的为提供肿胀发生抑制型肿瘤治疗用病毒。提供具有编码血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂的基因的溶瘤病毒、及含有该病毒的肿瘤治疗用医药组合物。

Description

肿胀发生抑制型溶瘤病毒

本申请是申请日为2019年3月28日、发明名称为“肿胀发生抑制型溶瘤病毒”的中国发明专利申请No.201980023832.6(PCT申请号为PCT/JP2019/013767)的分案申请。

技术领域

本发明涉及肿胀发生抑制型溶瘤病毒，尤其涉及具有编码VEGF拮抗剂的基因的溶瘤病毒。本发明还涉及使用了该病毒的、用于治疗肿瘤的医药组合物及肿瘤治疗方法。

背景技术

作为使用了病毒的新型肿瘤治疗方法，通过使肿瘤细胞感染病毒、与病毒复制相伴而使病毒破坏肿瘤细胞来对肿瘤进行治疗的研究正不断进展。与现有的肿瘤治疗方法不同，其具有下述特性：除了与病毒复制相伴的直接性细胞杀伤作用以外，还在破坏肿瘤细胞的过程中引发肿瘤细胞特异性的抗肿瘤免疫，介由免疫而在全身起到治疗效果。近年来，开发了向HSV-1、腺病毒这样的病毒的基因组导入人工基因修饰、使肿瘤选择性得以提高的基因重组溶瘤病毒(专利文献1～3、非专利文献1～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4212897号公报

专利文献2：日本专利第4921669号公报

专利文献3：WO2011/101912

非专利文献

非专利文献1：Todo,T.等，(2000).Molecular Therapy,2,588-595.

非专利文献2：Markert,J.M.等，(2000).Gene Therapy,7,867-874.

非专利文献3：Martuza,R.L.等，(2000).Journal of Clinical Investigation,105,841-846.

发明内容

发明所要解决的课题

本申请发明人在对使用了溶瘤病毒的肿瘤治疗方法进行临床开发的过程中，判明了自刚刚施予病毒之后起，在肿瘤及肿瘤周围会产生肿胀。尤其在对脑瘤施以病毒疗法时，若出现肿胀，则存在招致颅内压亢进、暂时性的神经症状恶化的可能性，可能会成为妨碍治疗的因素。自刚刚施予溶瘤病毒之后起在肿瘤及肿瘤周围产生肿胀的情况是本申请发明人在实施临床开发的过程中判明的。

基于上述背景，本发明的目的为提供肿胀发生抑制型溶瘤病毒。

用于解决课题的手段

作为肿瘤及肿瘤周围的肿胀的现有治疗药，存在肾上腺皮质激素(甾体)，但肾上腺皮质激素有抑制免疫的副作用。另一方面，就病毒疗法而言，引发抗肿瘤免疫是重要的治疗机制之一，因此，肾上腺皮质激素不适合与病毒疗法联用。另外，在恶性神经胶质瘤(恶性脑瘤)中，存在出于减轻脑水肿的目的而施予作为抗VEGF抗体医药的贝伐单抗(商品名：阿瓦斯汀(Avastin)(注册商标))，但贝伐单抗有妨碍创伤治愈的副作用，在与通过手术施予病毒的脑瘤的病毒疗法的联用方面存在较多问题。

本申请发明人反复进行了深入研究，结果发现，通过使溶瘤病毒表达与VEGF拮抗的VEGF拮抗剂，能够解决上述课题，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下内容。

[1]

溶瘤病毒，其具有编码血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂的基因。

[2]

如[1]所述的溶瘤病毒，其中，VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体或其片段。

[3]

如[2]所述的溶瘤病毒，其中，VEGF拮抗剂为包含V_H链及V_L链的抗VEGF抗体或单链抗VEGF抗体。

[4]

如[2]或[3]所述的溶瘤病毒，其具有：

编码以下的(i)～(iii)中任一者的多肽的基因，

(i)序列号2的多肽；

(ii)包含在序列号2的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(iii)与序列号2的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽；及

编码以下的(iv)～(vi)中任一者的多肽的基因，

(iv)序列号4的多肽；

(v)包含在序列号4的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(vi)与序列号4的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽。

[5]

如[2]～[4]中任一项所述的溶瘤病毒，其中，抗VEGF抗体为人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。

[6]

如[1]所述的溶瘤病毒，其中，VEGF拮抗剂为可溶性VEGF受体。

[7]

如[6]所述的溶瘤病毒，其具有编码以下的(xiii)～(xv)中任一者的多肽的基因，

(xiii)由序列号26的碱基序列编码的多肽；

(xiv)包含在由序列号26的碱基序列编码的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(xv)与由序列号26的碱基序列编码的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽。

[8]

如[1]～[7]中任一项所述的溶瘤病毒，其为选自由单纯疱疹病毒I型及II型(HSV-1及HSV-2)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、牛痘病毒、塞内卡病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒及柯萨奇病毒组成的组中的病毒的突变体。

[9]

如[1]～[7]中任一项所述的溶瘤病毒，溶瘤病毒为单纯疱疹病毒I型突变体，且具有(a)～(c)中的任意一者以上的特征：

(a)ICP6基因缺失或失活、或者在肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子的控制下表达；

(b)γ34.5基因缺失或失活；

(c)ICP47基因缺失或失活。

[10]

肿瘤治疗用医药组合物，其含有治疗有效量的[1]～[9]中任一项所述的溶瘤病毒。

[11]

如[10]所述的肿瘤治疗用医药组合物，其中，所述肿瘤为选自由神经系统肿瘤、下垂体肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑瘤、前列腺癌、头颈癌、食道癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、皮肤癌、卵巢癌、膀胱癌、肉瘤、扁平上皮癌、神经外胚层、甲状腺肿瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、间皮瘤、表皮样癌及良性肿瘤组成的组中的人肿瘤。

[12]

如[10]所述的肿瘤治疗用医药组合物，其中，所述肿瘤为脑瘤，所述肿瘤治疗用医药组合物为被局部施予的肿胀发生抑制型的肿瘤治疗用医药组合物。

[13]

如[10]～[12]中任一项所述的肿瘤治疗用医药组合物，其与选自化学疗法及放射线疗法中的其他肿瘤治疗方法联用。

本发明还涉及以下的方法及用途。

[14]

肿瘤的治疗方法，其包括将治疗有效量的[1]～[9]中任一项所述的溶瘤病毒施予至需要治疗肿瘤的对象。

[15]

如[14]所述的方法，其中，所述肿瘤为选自由神经系统肿瘤、下垂体肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑瘤、前列腺癌、头颈癌、食道癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、皮肤癌、卵巢癌、膀胱癌、肉瘤、扁平上皮癌、神经外胚层、甲状腺肿瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、间皮瘤、表皮样癌及良性肿瘤组成的组中的人肿瘤。

[16]

如[14]所述的方法，其中，所述肿瘤为脑瘤，所述病毒进行局部施予，所述方法可抑制肿胀发生。

[17]

如[14]～[16]中任一项所述的方法，其与选自化学疗法及放射线疗法中的其他肿瘤治疗方法联用。

[18]

[1]～[9]中任一项所述的溶瘤病毒在制造用于治疗肿瘤的医药中的用途。

[19]

如[18]所述的用途，其中，所述肿瘤为选自由神经系统肿瘤、下垂体肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑瘤、前列腺癌、头颈癌、食道癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、皮肤癌、卵巢癌、膀胱癌、肉瘤、扁平上皮癌、神经外胚层、甲状腺肿瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、间皮瘤、表皮样癌及良性肿瘤组成的组中的人肿瘤。

[20]

如[18]所述的用途，其中，所述肿瘤为脑瘤，所述医药进行局部施予，所述医药为肿胀发生抑制型。

[21]

如[18]～[20]中任一项所述的用途，其中，所述医药与选自化学疗法及放射线疗法中的其他肿瘤治疗方法联用。

发明效果

根据本发明，可提供肿胀发生抑制型溶瘤病毒。由此，能够更加安全且容易地对肿瘤进行治疗。

附图说明

[图1]从抗体表达基因表达抗体的机理(改编自Zitvogel,L.,等，(1994)Humangene therapy 5,1493-1506)。使用口蹄疫病病毒(FMDV)2A序列时，上游和下游的基因表达几乎呈相同水平。蛋白分泌介由信号识别粒子(SRP)进行。H链的Ig kappa前导序列在核糖体处被翻译后，SRP对其进行识别并结合，通过与存在于小泡体上的SRP受体结合，介由膜上的易位子，下游的多肽链被送入糙面小泡体内。此时，N末端侧的前导序列被信号肽酶切割，仅其C末端侧被送入糙面小泡体内。FMDV-2A序列在翻译时被顺式切割。关于L链，其同样地被送入至糙面小泡体内。然后，被送达高尔基体，碱性氨基酸靶序列Arg-X-(Lys/Arg)-Arg被弗林蛋白酶特异性地识别并切割。由此，自切割的2A序列的残基被切离，结果形成双链抗体，分泌至细胞外。

[图2]本实施例中使用的病毒的结构。以在存在于TR_L、IR_L中的2个γ34.5处具有缺失、且具有向在U_L中存在的ICP6插入LacZ基因所导致的失活、并在存在于U_S的α47和与其重复的US11启动子区具有缺失的G47Δ作为基本骨架。T-BV及T-V_HV_L是使ICP6缺失、向缺失区域中插入LacZ、polyA(PA)及反向的巨细胞病毒启动子(CMVP)并在其下游插入各抗体表达基因(图中记为抗体)而制作的(A)。将仅插入LacZ和PA、CMVp的T-01用作对照病毒(B)。

[图3]T-BAC体系。通过将BAC插入G47Δ的基因组的ICP6缺失位点从而使G47Δ基因组容易维持、扩增的T-BAC具有loxP序列和FRT序列，与同样地具有该2个序列、且插入了治疗基因的穿梭载体质粒SV-01混合，通过联用Cre/loxP和FLP/FRT这2个重组酶体系，发生外源基因的插入和BAC的切出，从而能够制作插入了外源基因的G47Δ。KM：卡那霉素抗性基因，CP：氯霉素抗性基因，lmd：λ填充(stuffer)序列，GFP：绿色荧光蛋白

[图4]用于表达抗人VEGF抗体的氨基酸序列的设计。分别自国际免疫遗传信息系统(the international ImMunoGeneTics information system)(IMGT)、美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的数据库获得贝伐单抗的Fab区、人IgG1的Fc区的氨基酸序列。在与重链(H链)、轻链(L链)各自对应的多肽的N末端侧结合Ig kappa前导序列及信号肽酶识别位点作为分泌信号。将二者与基于口蹄疫病病毒(FMDV)2A序列及弗林蛋白酶识别序列结合，设计用于表达抗人VEGF抗体的氨基酸序列。

[图5]用于表达抗VEGF scFv的氨基酸序列的设计。将与Liang,W.C.,等，(2006)The Journal of biological chemistry 281,951-961中记载的抗VEGF抗体G6-31的H链及L链的Fab对应的氨基酸序列用接头连接，在N末端侧结合Ig kappa前导序列及信号肽酶识别位点作为分泌信号，设计用于表达抗VEGF scFv的氨基酸序列。接头使用了scFv中通常使用的GS接头。

[图6]为示出pEX-K-BV的结构的示意图。

[图7]为示出sVEGFR1的cDNA序列的图。

[图8]为示出T-VEGFscFv(V_HV_LC_L)的cDNA序列的图。按照限制性内切酶(下划线)、Kozak序列、起始密码子(方框)、Ig kappa前导序列(下划线)、重链VH、接头(方框)、轻链VL、轻链CL(粗体字)、终止密码子(方框)、限制性内切酶(下划线)的顺序记载。

[图9]抗人VEGF抗体表达基因的cDNA。以图4的氨基酸序列为基础，转换为优化为人密码子的碱基序列后，在N末端结合Kozak序列、起始密码子、BamHI识别序列，在C末端结合NotI识别序列，设计编码抗体表达的cDNA。

[图10]抗VEGF scFv表达基因的cDNA。使用遗传信息处理软件GENETYX从Liang,W.C.,等，(2006)The Journal of biological chemistry 281,951-961中记载的G6-31的氨基酸序列设计cDNA。将与重链、轻链各自对应的cDNA用接头连接，制作抗VEGF scFv表达cDNA。接头使用了scFv中通常使用的GS接头。与T-BV同样地，在VH序列的N末端侧结合Igkappa前导序列及信号肽酶识别序列作为分泌信号。

[图11]使用了转染BV/SV-01而得的HEK293T细胞上清液的Western印迹法。向HEK293T转染BV/SV-01，使用其培养上清液实施了SDS-PAGE及非变性PAGE。阴性对照使用了转染了SV-01的上清液、阳性对照使用了阿瓦斯汀(注册商标)。蛋白质的检测使用了抗人IgG(H+L)抗体。SDS-PAGE(图11A)、非变性PAGE(图11B)中均呈与作为阳性对照的阿瓦斯汀(注册商标)同样的结果，确认到本次制作新型病毒使用的抗人VEGF抗体表达型基因所表达的蛋白质为双链抗体。

[图12]利用使用了病毒感染上清液的ELISA进行的抗人VEGF抗体的表达量的定量。对于接种于6孔板的Vero细胞及U87MG细胞，使T-01、T-BV或mock以MOI 0.2感染，在2mL培养基中培养72小时后，回收上清液，通过超滤浓缩至2.7倍，作为检体。标准品使用了阿瓦斯汀(注册商标)的8阶段稀释系列。使人VEGF在ELISA板的孔中固定化，用抗人IgG(Fc)抗体进行检测。测定450nm的吸光度，算出检体的抗VEGF抗体浓度。关于Vero细胞、U87MG细胞，从T-BV的感染细胞上清液中分别检测到256pg/mL、69pg/mL的抗VEGF抗体，T-01及mock的培养上清液中均为检测限以下。

[图13]从U87MG皮下肿瘤中的T-BV检测抗VEGF抗体。确认Balb/c nu/nu雌小鼠的U87MG皮下肿瘤已成为5mm，以各组9只分成T-01、T-BV及mock组。向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu的病毒，在PID2、4、6，使每组各3只小鼠安乐死，摘出皮下肿瘤，通过ELISA对其中所含的抗人VEGF抗体进行定量。在任一时间点，均从T-BV组观察到抗人VEGF抗体的表达。棒(bar)；SEM

[图14]血管内皮细胞管腔形成试验。将感染T-01或T-BV的Vero细胞的培养上清液用作检体。作为与VEGF作用相关的阴性对照/阳性对照，设定未添加细胞上清液的n.c./添加了未感染病毒的细胞上清液的mock，作为与抗VEGF作用相关的阴性对照/阳性对照，设定T-01的培养上清液/在培养基中以2个阶段的浓度添加有阿瓦斯汀(注册商标)的p.c.1(4ng/mL)·p.c.2(4μg/mL)。将HUVEC-2在添加了各检体的培养基中培养22小时后，用钙黄绿素染色，在荧光显微镜下拍摄管腔形成图像，测定形成的管腔的长度，算出全长。T-BV组中，较之T-01组而言，管腔形成得到显著抑制(p＝0.014)。棒；SEM

[图15]血管内皮细胞迁移试验。使用感染T-01或T-BV的Vero细胞的培养上清液作为检体。作为与VEGF作用相关的阴性对照/阳性对照，设定未添加细胞上清液的n.c./添加了未感染病毒的细胞上清液的mock，作为与抗VEGF作用相关的阴性对照/阳性对照，设定T-01的培养上清液/在培养基中以2个阶段的浓度添加有阿瓦斯汀(注册商标)的p.c.1(4ng/mL)·p.c.2(4μg/mL)。将HUVEC-2在添加了各检体的培养基中培养16小时后，将迁移的HUVEC-2用钙黄绿素染色，然后在荧光显微镜下拍摄，算出荧光强度，进行比较。T-BV组中，较之T-01组而言，迁移得到显著抑制(p＝0.007)。棒；SEM

[图16]抗VEGF抗体的种间交叉性的研究。使用了使T-BV以MOI 3感染HEK293T细胞、培养15小时而得到的上清液。另外，作为对照，使用了作为抗人VEGF抗体的阿瓦斯汀(注册商标)、兔抗小鼠VEGF抗体。另外，为了排除检测抗体与经固相化的VEGF之间的交叉反应导致的假阳性，使mock与2种检测抗体进行反应。测定450nm处的吸光度。抗小鼠VEGF抗体与小鼠VEGF(mVEGF)·人VEGF(hVEGF)这两者结合，而T-BV感染细胞上清液及阿瓦斯汀(注册商标)仅与hVEGF结合。由结果可以认为，与阿瓦斯汀(注册商标)同样，T-BV的表达抗体针对hVEGF的特异性高。

[图17]体外细胞毒性分析。实施了U87MG细胞(图17A)、TGS-01细胞(图17B)、TGS-04细胞(图17C)的体外细胞毒性分析。TGS为游离细胞，因此，使用MTS分析评价细胞杀伤效果。示出各组的存活细胞数量相对于对照组中的存活细胞数量的比例作为致细胞病变效应。可以认为，T-01和T-BV的细胞杀伤效果几乎是同等的。棒；±SD

[图18]体外复制分析。使病毒以MOI 0.01对Vero细胞(图18A)、U87MG细胞(图18B)进行感染，在培养24小时及48小时后将细胞与培养基一同回收，测定其中所含的病毒的效价。任一方的细胞·病毒中均在24小时至48小时的时间段确认到病毒的复制，可以认为，在任一时间点，T-01和T-BV的复制能力均是几乎同等的。棒；SD

[图19]U87MG皮下肿瘤模型中的T-BV的抗肿瘤效果的研究。向Balb/c nu/nu雌小鼠的左侧腹部皮下移植2×10⁶个U87MG细胞，在肿瘤直径增大至6mm的时间点，以每组各10只随机地分成T-BV、T-01、mock这3个组，在每隔3天向肿瘤内施予2×10⁵pfu的病毒，施予2次，每周测定肿瘤直径2～3次，算出肿瘤体积。在病毒施予后第20天的时间点，T-01组中确认到相对于mock而言显著的肿瘤增大抑制效果(p＝0.00749，独立t检验)，并且对于T-BV而言，观察到较之T-01而言显著的肿瘤增大抑制效果(p＝0.0211、独立t检验)。棒；SEM

[图20]U87MG脑内模型中的T-BV的抗肿瘤效果的研究。使用定位脑手术装置，向Balb/c nu/nu雌小鼠的右额叶内移植2×10⁵个U87MG细胞，在移植后第10天以每组各10只随机地分成T-BV、T-01、mock这3个组，向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu的病毒，记录之后的各个体的存活时间。在病毒施予后第27天的时间点，mock组全部死亡，与之相对，在第76天的最终跟踪的时间点，观察到T-01组中有3只存活，T-BV组中有6只存活。T-01、T-BV均显示较之mock而言显著的存活延长效果(均为p<0.001)，相较于T-01而言T-BV可见存活时间延长的趋势(p＝0.163)。

[图21]TGS-01及TGS-04脑内肿瘤模型中的T-BV的抗肿瘤效果的研究。使用定位脑手术装置，向Balb/c nu/nu雌小鼠的右额叶内移植1×10⁵个TGS-01细胞(图21A)或TGS-04细胞(图21B)，分别在移植后第10天及第20天，以每组各10只随机地分成T-BV、T-01、mock这3个组，向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu的病毒，记录各个体的存活时间。TGS-01脑内肿瘤模型中，在T-BV组、T-01组均确认到存活时间较之mock组而言显著延长(均为p<0.01)，并且，确认到T-BV的存活时间与T-01相比也显著延长(p＝0.0475)。TGS-04脑内肿瘤模型中，与mock相比，未观察到T-01中存活延长，但在T-BV中观察到存活时间的显著延长(p＝0.0495)。

[图22]使用了脑瘤细胞株(U87MG细胞)的脑内肿瘤模型的拍摄MRI。使用定位脑手术装置向Balb/c nu/nu雌小鼠的右额叶内移植2×10⁵个U87MG细胞，在移植后第11天拍摄病毒施予前的MRI(pre)，在第12天针对合计20只随机地分成mock组、T-01组、T-BV组及T+A组，在此基础上，向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu的病毒，在PID2、4、6拍摄MRI(T2WI及T1WI(CE))。关于T+A组，自病毒施予日起至第5天，连续每天腹腔内施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)。在病毒施予后观察到肿瘤周围的T2WI中出现高信号区。

[图23]U87MG脑内肿瘤模型中的T-BV的肿胀抑制效果的研究(1)(MRI)。基于U87MG脑内肿瘤模型的MRI数据，对肿胀(水肿)进行定量。使用免费软件Osirix测量T2WI及T1WI(CE)中的高信号区的面积。针对T2WI、T1WI(CE)各自算出各拍摄日的高信号区相对于病毒施予前的高信号区的比例，通过将T2WI中的值除以T1WI(CE)中的值，求出肿胀区域的相对值(图23A)。mock组中几乎未观察到肿胀，相对值在过程中一直大致为1。T-01组中在PID2、4、6观察到相对值的上升，与之相对，T-BV组中在PID4、6、T+A组中在PID2、4、6中相对值显著较低(全部为p<0.05)，可以认为肿胀的发生得到抑制(图23B)。棒；SEM

[图24]U87MG脑内肿瘤模型中的T-BV的肿胀抑制效果的研究(2)(RT-qPCR)。针对使用了Balb/c nu/nu雌小鼠的U87MG脑内肿瘤模型，以每组各6只分成mock、T-01、T-BV及T+A组，向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu的病毒。T+A组中，自病毒施予日起至第5天，连续每天腹腔内施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)。在PID6采集右额叶，使用逆转录酶从提取的RNA制作cDNA，实施针对小鼠AQP4的定量PCR。作为持家基因使用了小鼠β肌动蛋白(mActb)。较之mock组而言，T-01组中小鼠AQP4的表达显著上升(p<0.01)，较之T-01组而言，T-BV组及T+A组中，AQP4的表达显著降低(均为p<0.01)。棒；SEM

[图25]U87MG脑内肿瘤模型中的T-BV和T-VHVL的肿胀抑制效果的比较研究(代表性图像)。使用定位脑手术装置向Balb/c nu/nu雌小鼠的右额叶内移植2×10⁵个U87MG细胞，在移植后第11天拍摄病毒施予前的MRI(pre)，在第12天针对合计20只随机地分成mock组、T-01组、T-BV组及T-VHVL组，在此基础上，向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu的病毒，在PID2、4、6拍摄MRI(T2WI及T1WI(CE))。

[图26]U87MG脑内肿瘤模型中的T-BV和T-VHVL的肿胀抑制效果的比较研究(水肿区域的定量)。关于U87MG脑内肿瘤模型的MRI数据，与前述的实验同样地对肿胀(水肿)进行评价。与T-01进行比较时，T-BV在PID4观察到肿胀区域的显著缩小(p＝0.022)，关于T-VHVL，也可见较之T-01而言肿胀区域缩小的趋势。棒；SEM

[图27]针对U87MG脑内肿瘤模型施予病毒后的基于流式细胞术的巨噬细胞评价(代表性散点图)。针对使用了Balb/c nu/nu雌小鼠的U87MG脑内肿瘤，以每组各9只分成T-01、T-BV、T+A、及mock组，向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu的病毒，在PID2、4、6采集右额叶，制备单细胞悬浮液。关于T+A组，自病毒施予日起至安乐死，连续每天腹腔内施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)。通过散射光的二维制图除去髓磷脂组分，除去连体细胞(doublet)，除去死亡细胞后，将以CD45阳性、CD11b阳性、F4/80阳性设门而得的结果基于Gr-1及CX3CR1展开，将M1(Gr-1highCX3CR1low)、M2(Gr-1lowCX3CR1high)这2个细胞群分离。mock施予组中M2组分一直位于优势，与之相对，病毒施予组中，在PID2，M1组分变得位于优势。

[图28-1]M1/M2之比的经时性推移。针对M1、M2各自算出在CD45阳性细胞中的比例，算出M1/M2之比，评价M1、M2中的哪一方位于优势。mock组中M1/M2的经时性推移为0.04-0.03-0.05，M2一直位于优势的状态，与之相对，病毒施予组中M1/M2>1，M1变得位于优势。T-01组中该M1/M2的值为6.21-1.81-0.13，随着时间经过而降低，从M1位于优势的状态回到M2位于优势的状态，与之相对，T-BV组及T+A组中M1/M2的值分别为6.87-1.64-0.69、6.42-1.41-0.69，随着时间经过而降低，但即使在PID6也仍相对保持了M1的比例，各M1/M2之比高于T-01而位于优势(p<0.05、p<0.01)。棒；SEM

[图28-2]调查了M1位于优势的状态持续对病毒效价造成的影响。针对T-01、T-BV及T+A组调查了PID1,PID3及PID7中的病毒效价，结果，在任一测定日，均未观察到3个组之间的病毒效价具有显著性差异。

[图29]针对U87MG脑内肿瘤施予T-BV后的血清中的抗VEGF抗体的定量。针对Balb/c nu/nu雌小鼠的U87MG脑内肿瘤，设定mock、T-01、T-BV及T+A组，以每组各6只进行分组。向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu的病毒，在PID1、3对各组3只施以静脉采血，通过ELISA对其血清中所含的抗人VEGF抗体进行定量。针对T+A组，在病毒施予日向腹腔内单次施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)。在任一时间点，从T+A组均检测到抗人VEGF抗体，但其他组中全部为检测限以下。棒；SEM

[图30]为示出利用ELISA法确认T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的VEGF阻遏因子蛋白表达的图。使用使T-01、T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染Vero、培养48小时而得到上清液实施ELISA。A.T-sVEGFR1的培养上清液中，检测到sVEGFR1蛋白。B.T-VEGFscFv的培养上清液中检测到VEGFscFv蛋白。任一情况下，mock及T-01的培养上清液中均未检测出。n＝3；误差棒(Error bar),标准偏差；ND,Not detected.

[图31]示出血管内皮细胞管腔形成试验的结果的图。使T-01、T-sVEGFR1及T-VEGFscFv以MOI 0.2感染Vero，回收培养2天而得到的上清液，浓缩40倍后，加至包被有Matrigel Matrix的孔中，然后以成为2×10⁴个细胞/孔的方式接种HUVEC。阳性对照为以成为4μg/ml的方式添加有贝伐单抗的Medium 200/1％LSGS，另外，阴性对照仅添加了Medium200/1％LSGS。培养22小时后，在显微镜下拍摄HUVEC的管腔形成图像(图31A)，算出管腔的长度的总和，进行比较。T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染组中，较之T-01感染组而言，血管形成得到显著抑制(图31B)。n＝3；误差棒,标准偏差；*,p<0.05

[图32]为示出血管内皮细胞迁移试验的结果的图。在上部腔室中，以成为1×10⁵个细胞/孔的方式接种HUVEC。另外，在下部孔中，添加了将以MOI 0.2感染T-01、T-sVEGFR1及T-VEGFscFv、培养2天而得的上清液浓缩40倍的产物。另外，在上部腔室中以成为1×10⁵个细胞/孔的方式接种HUVEC。阳性对照为以成为4μg/ml的方式添加有贝伐单抗的Medium200/1％LSGS，另外，阴性对照仅添加了Medium 200/1％LSGS。培养22小时后，使用钙黄绿素AM溶液将通过上部腔室的膜而迁移至下部孔的HUVEC荧光染色，在荧光显微镜下拍摄(图32A)，测定荧光强度(图32B)。T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染组中，较之T-01感染组而言，HUVEC的迁移得到显著抑制。n＝3；误差棒,标准偏差；*,p<0.05

[图33]为示出T-sVEGFR1、T-VEGFscFv的HT-29中的体外病毒复制分析的结果的图。将HT-29以成为4×10⁵个细胞/孔的方式接种于6孔板，使T-01、T-sVEGFR1及T-VEGFscFv以MOI 0.01感染，培养24小时及48小时后，测定病毒的效价。24小时后及48小时后的任一方中，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染组中，复制的病毒的效价与T-01感染组几乎是同等的。n＝3；误差棒,标准偏差。

[图34]为示出T-sVEGFR1、T-VEGFscFv的HT-29中的体外细胞杀伤分析的结果的图。将HT-29以成为2×10⁵个细胞/孔的方式接种于6孔板，使T-01、T-sVEGFR1及T-VEGFscFv以MOI 0.1及0.01感染。感染后，在4天内，每24小时后各自测定存活细胞，算出相对于Mock而言的细胞数量的比例。T-sVEGFR1及T-VEGFscFv显示出与T-01几乎同等的细胞杀伤效果。n＝3；误差棒,标准偏差。

[图35]为示出T-sVEGFR1及T-VEGFscFv针对HT-29皮下肿瘤模型的抗肿瘤效果的图。向BALB/c nu/nu的左侧腹部皮下施予1×10⁶个细胞/50μl的HT-29，制作皮下肿瘤。在第0天和第3天这二次，向肿瘤内施予1×10⁶pfu/20μl的T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。在第32天，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组中，可见较之T-01施予组而言显著更强的抗肿瘤效果。n＝8；误差棒,标准偏差；**,p<0.01

[图36]为示出HT-29皮下肿瘤的肿瘤内微小血管密度的图。计数HT-29皮下肿瘤的组织切片的CD31阳性细胞，求出肿瘤内微小血管密度，结果，在第3天及第7天，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组中，肿瘤内微小血管均较之T-01施予组而言显著减少。n＝3；误差棒,标准偏差；*,p<0.05

[图37]为示出针对CT26皮下肿瘤的T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的抗肿瘤效果的图。向BALB/c小鼠的左侧腹部皮下施予1×10⁵个细胞/50μl的CT26，制作皮下肿瘤。在第0天和第3天这二次，向肿瘤内施予1×10⁶pfu/20μl的T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。测定肿瘤体积，结果，在第28天，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组中，可见较之T-01而言显著更强的抗肿瘤效果。n＝7；误差棒,标准偏差；*,p<0.05

具体实施方式

以下，基于本发明的实施方式(也称为“本实施方式”)对本发明进行详细说明。以下的实施方式是用于说明本发明的示例，并非旨在将本发明限于这些实施方式。

本实施方式在一个方案中涉及具有编码VEGF拮抗剂的基因的溶瘤病毒。本说明书中，VEGF拮抗剂是指中和、阻断、降低或妨碍血管内皮细胞生长因子(VEGF)的生物学活性的分子，包括妨碍VEGF及VEGF受体间的相互作用的分子，例如，与VEGF或VEGF受体结合从而阻遏VEGF与VEGF受体间的相互作用、或者通过其他方法对其进行阻遏的分子。一个方案中，本实施方式的VEGF拮抗剂以1nM～1μM、优选500nM～1μM的Kd与VEGF或VEGF受体结合。作为VEGF拮抗剂，可举出抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、VEGF受体、可溶性VEGF受体(sVEGFR)、肽配体、具有VEGF阻遏作用的核酸等，优选抗VEGF抗体或sVEGFR。

本实施方式中，“VEGF”不仅包括人VEGF，也包括非人VEGF(例如小鼠、大鼠、人以外的灵长类等的VEGF)。一个方案中，本实施方式的VEGF是作为本实施方式的病毒的施予对象的生物的VEGF，例如，本实施方式中向人施予的情况下，VEGF优选为人VEGF。VEGF存在被称为VEGF家族的7种生长因子、即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PLGF-1及PLGF-2(PLGF：胎盘生长因子)，各自具有不同的物理性质及生物学性质，本实施方式中，VEGF优选为与血管内皮细胞的增殖、促进管腔形成等相关的VEGF-A。

一个方案中，本实施方式的VEGF拮抗剂是以充分的亲和性及特异性与VEGF结合的抗VEGF抗体。作为抗VEGF抗体，可使用市售品(例如贝伐单抗、兰尼单抗、雷莫芦单抗等)，也可使用其他已知的抗VEGF抗体。贝伐单抗是通过与VEGF-A特异性地结合来阻遏VEGF-A与其受体(VEGFR-1及VEGFR-2)之间的结合的抗体。兰尼单抗(Ranibizumab)是针对血管内皮生长因子-A(VEGF-A)的单克隆抗体的Fab片段。雷莫芦单抗是针对VEGFR-2的抗体，除了VEGF-A以外，还对C、D与VEGFR-2的结合进行阻遏，从而阻遏利用VEGF配体的信号转导。此外，作为抗VEGF抗体，可使用利用VEGF抗原通过本领域技术人员已知的方法制得的抗VEGF抗体。一个方案中，本实施方式的VEGF拮抗剂为贝伐单抗。

一个方案中，本实施方式的抗VEGF抗体优选为与VEGF-A结合的抗体、及/或阻遏VEGF与VEGFR-1的结合的抗体。

本实施方式的一个方案中，VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体的情况下，抗体可以是全长抗体，也可以是其片段。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选为单克隆抗体。一个方案中，抗体的种类没有特别限定，可使用人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、来源于其他动物的抗体(例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、绵羊抗体、骆驼抗体、鸡抗体)等任意的抗体，可优选使用针对与作为具有编码该抗体的基因的溶瘤病毒的溶解对象的肿瘤相同的生物的抗体。例如，溶瘤病毒为人肿瘤溶解性的情况下，可使用针对人VEGF的人抗体或人源化抗体。任一种抗体均可使用已知的方法制作。另外，可使用已知的抗体。

本实施方式的一个方案中，VEGF拮抗剂也可以是抗VEGF抗体的片段。本说明书中抗体的片段是指抗体的片段自身、或使抗体的片段与任意的分子结合而成的片段中的任一者、且识别与原本的抗体相同的表位的片段。只要包含原本的抗体的互补性决定区(CDR)即可，没有特别限定，具体而言，可举出由V_L、V_H、C_L及C_H区域组成的Fab片段；进一步包含铰链区的Fab’片段；2个Fab于铰链区经由二硫键而连接的F(ab’)2片段；由V_L及V_H组成的Fv；将V_L及V_H用人工的多肽接头连接而成的单链抗体scFv、以及sdFv、Diabody、sc(Fv)2，但不限于这些，只要具有构成抗体的抗原结合位点的2个可变区即重链可变区(V_H)及轻链可变区(V_L)即可，没有特别限定。

上述均可使用已知的方法进行制作。例如，scFv可将V_H及V_L用已知的接头(GS接头(序列号：11)等)连接而制作。

一个方案中，抗体或其片段优选在肿瘤细胞内中的半衰期长。例如，与单链抗体进行比较的情况下，双链抗体由于存在Fc部分而使半衰期延长，可期待抗体依赖性的免疫反应。

一个方案中，本实施方式的溶瘤病毒具有：

编码以下的(i)～(iii)中任一者的多肽的基因，

(i)序列号2的多肽；

(ii)包含在序列号2的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(iii)与序列号2的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽；及

编码以下的(iv)～(vi)中任一者的多肽的基因，

(iv)序列号4的多肽；

(v)包含在序列号4的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(vi)与序列号4的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽；并且

所述病毒表达上述的多肽。

一个方案中，本实施方式的溶瘤病毒具有：

编码以下的(vii)～(ix)中任一者的多肽的基因，

(vii)序列号30的多肽；

(viii)包含在序列号30的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(ix)与序列号30的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽；及

编码以下的(x)～(xii)中任一者的多肽的基因，

(x)序列号31的多肽；

(xi)包含在序列号31的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(xii)与序列号31的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上90％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽；并且

所述病毒表达上述的多肽。

一个方案中，本实施方式的溶瘤病毒优选具有还编码弗林蛋白酶识别序列(序列号8)及FMDV-2A(序列号9)的多肽的基因，更优选在上述编码(vii)～(ix)中任一者的多肽的基因与编码(x)～(xii)中任一者的多肽的基因之间具有编码这些序列号8及9的多肽的基因。

一个方案中，本实施方式的VEGF拮抗剂为可溶性VEGF受体(sVEGFR)。作为sVEGFR，sVEGFR-1、-2及-3是已知的，一个方案中，sVEGFR优选为具有与VEGF-A及B结合的能力的sVEGFR-1。作为sVEGFR，可使用已知的sVEGFR，例如，可使用Park JE等，(1994)J BiolChem.Vol.269(41):25646-54中记载的sVEGFR、市售品等。

一个方案中，本实施方式的溶瘤病毒是所具有的基因具有以下的(xiii)～(xv)中任一者的多核苷酸，且是表达这些多核苷酸所编码的多肽的病毒。

(xiii)由序列号26的碱基序列编码的多核苷酸；

(xiv)包含在由序列号26的碱基序列编码的多核苷酸中缺失、取代或添加1个或数个碱基而得的碱基序列、且编码具有VEGF结合能力的多肽的多核苷酸；

(xv)与由序列号26的碱基序列编码的多核苷酸具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且编码具有VEGF结合能力的多肽的多核苷酸。

本说明书中，“缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列”的情况下，就缺失、取代或添加的氨基酸的个数而言，只要由该氨基酸序列构成的多肽具有VEGF结合能力即可，没有特别限定，例如，可以是1～5个、1～3个、或1～2个。缺失、取代或添加的位置可以是肽的末端，可以是中间，可以是1处，也可以是2处以上。

同样地，本说明书中，“缺失、取代或添加1个或数个碱基而得的碱基序列”的情况下，就缺失、取代、或添加的碱基的个数而言，只要该碱基序列所编码的多肽具有VEGF结合能力即可，没有特别限定，例如，可以是1～5个、1～3个、或1～2个。缺失、取代或添加的位置可以是多核苷酸的末端，可以是中间，可以是1处，也可以是2处以上。

上述多肽是否具有VEGF结合能力可由本领域技术人员使用已知的方法进行判断。例如，可使用后述的实施例中记载的ELISA进行判断。

本实施方式中，氨基酸除了天然氨基酸以外，也可以是其衍生物、人工的氨基酸、非天然氨基酸。一个方案中，本实施方式的氨基酸优选为天然氨基酸。

本实施方式的溶瘤病毒具有编码VEGF拮抗剂的基因，被施予至肿瘤细胞后，与病毒复制相伴而表达VEGF拮抗剂。作为以表达编码VEGF拮抗剂的基因的方式修饰溶瘤病毒的方法，可使用已知的方法。例如，可将编码VEGF拮抗剂的DNA使用已知的方法(利用限制性内切酶的方法等)插入表达载体中，使该表达载体转染至溶瘤病毒。表达载体可还含有调节目标基因的表达的启动子、复制起点、筛选标记基因等。启动子及复制起点可根据导入基因的溶瘤病毒及载体的种类而适当选择。

例如，VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体或其片段的情况下，可获得所要表达的抗体的氨基酸序列或碱基序列，利用已知的方法使目标区域表达。例如，以从cDNA各自等量地表达重链和轻链从而能够高效地产生抗体的方式，导入编码与抗体的重链及轻链对应的多肽的序列，优选一同导入具有自切割活性的口蹄疫病(FMDV)-2A序列及编码弗林蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，从而可对病毒进行修饰。进一步地，可在与重链及轻链对应的多肽各自的N末端具有用于分泌的信号序列。从这样的抗体表达基因表达抗体的机理的一例示于图1。

就上述基因的导入位置而言，只要溶瘤病毒能维持溶瘤性能即可，没有特别限定，可向例如使病毒的非必需基因缺失的位置导入编码VEGF拮抗剂的基因。病毒为HSV-1的情况下，可使后述的表1所示的非必需基因缺失，导入编码VEGF拮抗剂的基因。导入的基因的表达可如后述的实施例所示，使用已知的方法进行确认。

特别地，在溶瘤病毒为单纯疱疹病毒(HSV)等基因组较大的病毒的情况下，可使用例如Fukuhara,H.等，(2005).Cancer research,65,10663-10668、WO2005/103237号中记载的T-BAC体系或以其为基准的体系。对于HSV病毒而言，使用T-BAC体系的情况下，可通过包括下述步骤的方法简便地制成使目标VEGF拮抗剂在肿瘤细胞中表达的病毒：第一步骤，将具有loxP位点及FRT位点、且在loxP位点与FRT位点之间插入至少1种标记基因的表达盒而成的BAC质粒插入HSV基因组；第二步骤，制作分别插入有至少1种编码目标蛋白质的基因的表达盒、至少1种标记基因、和loxP位点及FRT位点的穿梭载体，使用Cre重组酶将穿梭载体插入HSV基因组的loxP位点；第三步骤，使宿主同时感染HSV基因组、和能表达Flp重组酶的载体，切出该基因组上的被FRT位点夹持的区域，产生目标基因重组HSV。

(溶瘤病毒)

本实施方式中，溶瘤病毒(oncolytic virus，也称为抗癌病毒)是可用于治疗癌症的病毒，只要具有感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中选择性地复制、在病毒复制过程中破坏肿瘤细胞、并感染周围的其他肿瘤细胞而进一步复制的能力即可，没有特别限定，可使用已知的病毒。这样的病毒大多是对天然存在的病毒以提高肿瘤选择性的方式进行基因修饰而成的突变体。也可以是根据需要而弱化毒性、加以用于增强抗肿瘤活性的修饰(组入自杀基因等)的病毒。

例如，作为本实施方式中可使用的溶瘤病毒，可举出选自由单纯疱疹病毒I型及II型(HSV-1及HSV-2)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、牛痘病毒、塞内卡病毒(塞内加谷病毒)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒、柯萨奇病毒组成的组中的病毒或病毒突变体。为了使抗体基因表达，优选为具有可供抗体组入的大小的基因组的病毒(这是因为，通常仅能对基因组的1/10左右进行修饰)，可优选使用HSV-1及HSV-2以及牛痘病毒。

例如，作为属于腺病毒突变体的溶瘤病毒的例子，可举出ONYX-015(Khuri等，(2000).Nat.Med 6(8):879-85等)、H101(Oncorine)(Xia等，(2004).Ai Zheng 23(12):1666-70)、Telomelysin(OBP-301)(Kawashima T.等，(2004)Clim Cancer Res.10:285-292)等。

作为属于脊髓灰质炎病毒突变体的溶瘤病毒的例子，可举出Goetz等，(2010).Cytokine&Growth Factor Reviews 21(2-3):197、Lal,R.等，(2009).Current opinionin molecular therapeutics 11(5):532-9等中记载的病毒。

作为属于麻疹病毒突变体的溶瘤病毒的例子，可举出MV-Edm(McDonald等，(2006).Breast Cancer Treat.99(2):177-84)及使用其的MV-CEA、MV-NIS等、以及HMWMAA(Kaufmann等，(2013).J.Invest.Dermatol.133(4):1034-42)等。

作为属于呼肠孤病毒的溶瘤病毒的例子，可举出Reolysin(Oncolytic Biotech)。

作为属于牛痘病毒突变体的溶瘤病毒的例子，可举出MDRVV002(miRNA依赖性重组牛痘病毒002)及MDRVV003(MAPK依赖性重组牛痘病毒003)、以及D C Mansfield等，(2016).Gene Therapy,23,357-368、SteveH.Thorne(2014).Frontiers in Oncology,4:155等中记载的溶瘤病毒。

作为属于塞内卡病毒的溶瘤病毒的例子，可举出NTX-010(Rudin等，,(2011).Clin.Cancer.Res.17(4):888-95)。

作为属于水疱性口炎病毒(VSV)突变体的溶瘤病毒的例子，可举出Stojdl等，(2000).Nat.Med.6(7):821-5、Stojdl等，(2003).Cancer Cell 4(4):263-75等中记载的病毒。

作为属于新城疫病毒的溶瘤病毒的一例，可举出73-TPV701及HDV-HUJ株、Phuangsab等，(2001).Cancer Lett.172(1):27-36、Lorence等，(2007).Curr.Cancer DrugTargets 7(2):157-67、Freeman等，(2006).Mol.Ther.13(1):221-8等中记载的病毒。

作为属于柯萨奇病毒突变体的溶瘤病毒的例子，可举出属于柯萨奇A(CVA)的CVA21及其修饰体(Kelly EJ.等，(2008)Nat Med,14:1278-1283)、柯萨奇病毒B型3组(CVB3)(Miyamoto S.等，(2012)Cancer Res.72:2609-2621)等。

本实施方式的一个方案中，溶瘤病毒为HSV突变体，优选为HSV-1突变体。溶瘤病毒为HSV-1突变体的情况下，可参考例如专利文献1～3来制作溶瘤性的HSV-1突变体。HSV-1被分类为具有囊膜的双链DNA病毒，具有以下有利于治疗癌症的特征。1)能感染人的任何种类的细胞；2)病毒的生命周期和基因组序列已得到阐明；3)已判明病毒基因中大多数的功能，能施加基因操作；4)病毒基因组大(约152kb)，因此能组入大的基因、多个基因。此外，HSV-1还具有适于临床应用的以下优点：5)能以较低的感染复数(MOI)杀死全部细胞；6)存在抑制增殖的抗病毒药；7)血中抗HSV-1抗体不会影响病毒从细胞向细胞的感染扩大，因此可重复进行施予；8)存在对HSV-1显示敏感性的小鼠、猴，因此可使用动物进行安全性、效果的临床前评价；9)病毒DNA不会被宿主细胞的基因组摄入，而是存在于染色体外。

HSV-1的基因组由82％的长独特区(U_L)和12％的短独特区(Us)这2个固有序列区域、和位于各区域两端的末端重复(terminal repeat)(TR)及反向重复(inverted repeat)(IR)的反向重复序列组成(表1，Todo,T.(2008).a journal and virtual library 13,2060-2064)。L和S这2个区域可以各自独立地取2个方向，因此，HSV-1基因组DNA包含4种异构体。该基因组中，在TR_L上的RL1、RL2、U_L上的UL1～UL56、TR_S上的RS1、U_S上的US1～US12沿单向编码合计84个基因，其中大约一半是对于病毒增殖而言非必需的基因，通过使这些非必需基因部分进行缺失，可以实现致病性的减弱、基因导入(Carson,J.等，(2010).Drugsof the future 35,183-195)。

[表1]

*为极早期基因

溶瘤病毒为HSV-1突变体的情况下，可具有以下特征中的任意一者以上。

–通过与病毒DNA合成相关的酶、例如胸苷激酶(thymidine kinase，TK)、核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RR)、尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase，UNG或UDG)等的失活而获得肿瘤细胞特异性的复制能力。

-通过使编码与HSV-1的致病性相关的蛋白ICP34.5的基因γ34.5缺失来获得肿瘤细胞特异性的复制能力。

-通过使α47缺失来获得抗肿瘤效果。

–出于防止恢复为野生型、提高安全性的目的而使基因缺失或失活(例如，内源性γ34.5基因、ICP47基因、α0基因(ICP0基因)、U_L41基因(vhs基因)、U_L56基因的缺失或失活)。

-通过使免疫刺激基因(IL-4，IL-10，GM-CSF，IL-12，可溶型B7.1等)表达来增强抗肿瘤免疫及延长存活。

-通过使表达血小板因子4、凝血栓蛋白、内皮抑素、显性负性FGF、血管抑素等血管生成抑制因子的基因进行表达来增强血管生成抑制效果及抗肿瘤效果。

-通过使与肿瘤的局部浸润相关的金属蛋白酶阻遏因子表达来增强抗肿瘤效果。

-通过使金属蛋白酶过量表达来促进病毒的感染扩大。

–通过利用肿瘤特异性或者组织特异性的启动子(calponin的启动子、E2F应答性细胞周期依赖性启动子B-myb、Nestin启动子、癌胚胎性抗原(CEA)、α-甲胎蛋白(AFP)、MUC-1、Musashi的增强子/启动子等)控制病毒基因来增强肿瘤细胞特异性的病毒复制能力。

一个方案中，本实施方式的溶瘤病毒是优选具有以下的(a)～(c)的特征中的任意一者以上、更优选具有以下的(a)～(c)的特征的HSV-1。具有这些特征的HSV-1突变体可参考专利文献3等来制作。

(a)ICP6基因缺失或失活、或者在肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子的控制下表达。

(b)γ34.5基因缺失或失活。

(c)ICP47基因缺失或失活。

关于上述(a)及(b)的特征，通过使对于非分裂细胞中的核苷酸代谢及病毒DNA合成而言重要的酶RR的大亚基ICP6、以及/或者、与在病毒感染时产生的磷酸化PKR的功能拮抗的γ34.5缺失，从而形成在正常细胞中无法增殖、仅在分裂旺盛、RR活性上升、PKR的磷酸化被抑制的肿瘤细胞中能够增殖的病毒。另外，关于上述(c)的特征，α47基因所编码的蛋白质具有通过阻遏TAP从而抑制宿主细胞表面的MHC I类的表达来逃避宿主的免疫监视的作用，因此，缺失α47基因的HSV-1中，可期待通过维持宿主细胞的MHC I类表达而使针对免疫细胞的刺激变强。进而，就同时拥有上述(b)及(c)的特征的HSV-1而言，由于α47的缺失，基因组与α47重叠的US11晚期启动子同时缺失，因此，US11基因的表达处于ICP47极早期启动子的控制下，导致表达时期提前，具有使由于γ34.5缺失而减弱的病毒复制能力仅在肿瘤细胞中恢复的作用。

本说明书中，基因的缺失或失活是指使基因的全部或一部分缺失，或通过一部分碱基的取代、修饰、插入不需要的序列等来抑制该基因的表达，可利用已知的方法来实施。

本说明书中，肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子是指在所期望的肿瘤细胞、组织中特异性地、使处于其控制下的基因能够表达的启动子，可根据基因而使用已知的启动子。例如，可使用端粒酶逆转录酶启动子(hTERT启动子)、E2F启动子。

作为包含上述(a)～(c)中记载的、γ34.5基因、ICP6基因及/或ICP47基因的缺失或失活的HSV，可举出使γ34.5基因的2个拷贝均缺失、使ICP6基因失活的G207、包含γ34.5基因的2个拷贝的缺失、ICP6基因的失活、及ICP47基因的缺失的G47Δ。因此，本实施方式的溶瘤病毒也可通过对G207、G47Δ进一步加以修饰来制作。

特别地，G47Δ是在提高安全性的同时，显著改善了肿瘤细胞选择性病毒复制和抗肿瘤免疫的引发的溶瘤性HSV-1，治疗范围宽泛，因此即使对于人的脑内也可安全地以高剂量进行施予(II期试验中)。

(医药组合物)

本实施方式的一个方案涉及含有上述的本实施方式的溶瘤病毒的医药组合物。本实施方式的医药组合物可在肿瘤细胞中特异性地增殖、并且抑制肿胀发生，因此也可容易地进行重复施予。

另外，一个方案中，根据本实施方式的医药组合物，如后述的实施例所示，将具有强抗菌活性、强抗病毒活性、强抗肿瘤效果的M1巨噬细胞维持在较之M2巨噬细胞而言位于优势的状态，并且，即使是M1位于优势的状态，医药组合物中的溶瘤病毒的病毒效价也不会降低，因此能得到高水平的肿瘤治疗效果。一个方案中，本实施方式的病毒较之除了不具有编码VEGF拮抗剂的基因这一点外具有相同的构成的溶瘤病毒而言，具有高水平的肿瘤治疗效果。病毒效价的测定、M1及M2巨噬细胞的比较以及抗肿瘤效果(包括体外(in vitro)的细胞杀伤效果、体内的存活率延长效果)的确认可如后述的实施例所示，利用已知的方法来实施。

此外，一个方案中，根据本实施方式的医药组合物，溶瘤病毒在每次于肿瘤内复制时，在肿瘤局部表达VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)，因此，较之VEGF拮抗剂的全身施予而言，可减轻阻碍创伤治愈等副作用的风险。病毒的复制能力及VEGF拮抗剂的表达量的确认可如后述的实施例所示，利用已知的方法来实施。

作为本实施方式的医药组合物起效的肿瘤，可举出例如神经系统肿瘤(例如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、神经胶质母细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、神经母细胞瘤)、下垂体肿瘤(例如垂体腺瘤)、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑瘤、前列腺癌、头颈癌、食道癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、皮肤癌、卵巢癌、膀胱癌、肉瘤(例如骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤)、扁平上皮癌、神经外胚层、甲状腺肿瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、间皮瘤、表皮样癌、良性肿瘤(例如甲状腺的良性肿瘤或良性前列腺肥大症)等。

本实施方式的医药组合物可抑制肿胀发生，因此，可在既不引起肿胀、也不引起与肿胀相伴的各种症状的情况下进行肿瘤的治疗。例如，作为与脑内的肿胀相伴的症状，除了头痛等轻微症状以外，还包括对周围正常组织的压迫及颅内压亢进导致的麻痹、失语、意识障碍等严重症状，而利用本实施方式的医药组合物，能够在不引起这样的症状的情况下进行肿瘤的治疗，从而不会引起颅内压亢进、暂时性的神经症状的恶化，能够在不降低患者的QOL的情况下进行肿胀的治疗。一个方案中，本实施方式的医药组合物几乎不存在向颅外的转移，对于重视局部治疗的、包括脑瘤在内的颅内肿瘤的治疗尤其有效。

本实施方式中，肿胀包括肿瘤自身的肿大、及肿瘤的周围的浮肿中的任何，是指肿瘤及/或其周围的体积增加、膨胀的状态。本实施方式中，“肿胀发生抑制型”是指抑制肿胀的发生、缩小所产生的肿胀尺寸、及预防肿胀的扩大中的任意一者以上。虽然不拘泥于理论，但本申请发明人发现，在施予溶瘤病毒时尤其会成为问题的肿胀是肿瘤自身的肿大，本实施方式的病毒能够抑制包括这样的肿瘤自身肿大在内的、与溶瘤病毒的施予相伴的肿胀发生。通过注射等将溶瘤病毒局部施予至患部时，在施予后会立刻发生肿胀。而在该肿胀持续的状态下再次对同一位点重复进行局部施予后，肿胀进一步扩大。另一方面，利用本实施方式的病毒，可抑制该肿胀发生，能够更加安全且容易地进行肿瘤治疗。

与上述的肿胀相伴，也可能会发生水肿(水分蓄积而膨胀的状态)。就外形而言，未必能明确区分肿胀与水肿，因此，本实施方式中，肿胀发生的程度也可通过测定水肿发生的程度来确认。即，肿胀发生的程度可在肿胀及水肿的测定中使用本领域技术人员已知的方法来进行测定。如后述的实施例所示，通过例如MRI的T2加权中的高信号区的比较，可确认肿胀(水肿)发生的程度。另外，通过对已确认与肿胀及/或水肿的发生相关的物质进行定量，也能够确认其发生的程度。例如，为脑中的肿胀时，通过对已知与脑水肿有关的水通道蛋白(AQP)1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9、AQP11、AQP12、尤其是AQP4进行定量，能够确认其发生的程度。

本实施方式的医药组合物的施予方法没有特别限定，可向例如静脉内、动脉内、脑室内、腹腔内、胸腔内、髓腔内、皮下、皮内、表皮内、肌肉内、粘膜表面(例如眼、鼻腔内、肺、口腔、肠、直肠、阴道、尿道表面)内施予。优选的是，利用注射、内窥镜或外科性方法来直接局部施予至肿瘤组织。通过进行局部施予，VEGF拮抗剂在肿瘤局部表达，因此，较之VEGF拮抗剂的全身施予而言可减轻阻碍创伤治愈等副作用的风险，尤其具有即使在利用外科性方法施予溶瘤病毒的情况下、与外科性方法相伴的创伤的治愈也不会受到阻碍的优点。

本实施方式的医药组合物可通过用于向包括人在内的哺乳动物的体内导入病毒的已知的制剂化方法来进行制剂化。例如，可含有佐剂、任意的担载体，也可不添加佐剂、担载体而仅用无菌生理盐水或无菌缓冲生理盐水这样的生理学上可允许的溶液进行稀释。也可制成适合长期保存的冷冻制剂、干燥制剂、冻干制剂等。

本实施方式的医药组合物含有治疗有效量的本实施方式的溶瘤病毒。本说明书中，治疗有效量是指下述作用物质的量，基于所述作用物质的量，以某种程度缓和待治疗的肿瘤的一种或多种症状，更具体而言，是指显示出肿瘤大小的缩小、肿瘤转移的阻碍(延迟或停止)、肿瘤增殖的阻碍(延迟或停止)、及与肿瘤相关的一种或多种症状的缓和中至少一者的量。具体的施予量可根据症状的程度、施予对象的年龄、性别、体重、敏感性差异、施予方法、施予时期、施予间隔、制剂的性质、启动子的强度等而由本领域技术人员适当决定。

就本实施方式的医药组合物而言，例如，可以通过注射，各自以1次或分成数次施予约10¹～约10¹²个噬斑形成单位(pfu)、优选约10⁷～约10¹⁰pfu、进一步优选约10⁸pfu～约5×10⁹。本实施方式的医药组合物的施予次数可根据对象患者及对象疾病而适当设定。例如，可在2星期以内施予最初的2次，然后以3～5星期的间隔进行施予。本实施方式的医药组合物为肿胀发生抑制型，因此，具有下述优点：即使在多次施予的情况下，也不存在肿胀在每次施予时增大这样的副作用、在施予时发生的肿胀缩小之前不能进行下一次施予这样的不便。

本实施方式的医药组合物可还含有其他有效成分，也可与含有其他有效成分的医药组合物组合使用。另外，本实施方式的医药组合物可与其他肿瘤治疗方法、例如、手术(肿瘤切除等)、化学疗法、放射线疗法、免疫疗法、激素疗法及它们的组合联合使用。利用本实施方式的医药组合物的病毒疗法基于不同于现有的肿瘤治疗方法的机制，因此，通过与例如放射线疗法、化学疗法等其他治疗方法的联用，肿瘤治疗效果可增强。

本实施方式还涉及使用了肿胀发生抑制型溶瘤病毒的、肿瘤的治疗方法。本实施方式还涉及肿胀发生抑制型溶瘤病毒的、在制造用于治疗肿瘤的医药中的用途。该方法及用途可参考涉及上述医药组合物的记载来实施。

只要没有不同的定义，则本文中使用的全部术语(包括技术用语及科学术语)与本发明所属领域的技术人员以宽泛方式理解的含义相同。就此处使用的术语而言，只要没有明确示出不同的含义，则应解释为将本说明书及相关技术领域中含义意味整合而成的含义，而不应解释为理想化、或过度形式化的含义。

实施例

A.材料

1.细胞株及培养基

使用了非洲绿猴肾细胞株Vero、人大肠癌细胞株HT-29、小鼠大肠癌细胞株CT26、人胶质瘤细胞株U87MG、U251MG、NMC-G1、人胚胎肾细胞株HEK293T、人脐带静脉内皮细胞HUVEC(BD^TM HUVEC-2)、人脐带静脉内皮细胞HUVEC-2以及人胶质瘤干细胞株TGS-01、TGS-04及1123/M。Vero、HT-29、CT26及U87MG均购自美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection)(ATCC)，HEK293T购自理化学研究所生物资源中心，HUVEC购自BDBioscience(USA)，HUVEC-2购自Corning Life Sciences，NMC-G1购自JCRB细胞库。TGS-01及TGS-04是利用在东京大学医学部附属病院脑神经外科施行了开颅肿瘤摘出手术的胶质母细胞瘤患者的摘出组织，用无血清培养基培养，通过基于癌干细胞标记及利用极限稀释的成球(悬浮细胞块)能力评价进行分离而建立的胶质瘤干细胞株，使用了保存于本申请发明人的研究室中的细胞株。1123/M是从少突神经胶质瘤患者的摘出组织建立的干细胞，使用了由俄亥俄州立大学提供的细胞。作为溶瘤性HSV-1病毒的G47Δ使用了保存于本申请发明人的研究室中的病毒。

Vero、U87MG、U251MG、NMC-G1在添加10％胎牛血清(FBS)(Sigma Aldrich)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)(gibco)中培养。HT-29在添加有10％FBS的McCoy’s 5A(改良)培养基中培养，CT26在添加有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。HUVEC、HUVEC-2在添加有1％Low Serum Growth Supplement(LSGS)(gibco)的Medium200PRF(gibco)中培养。TGS-01、TGS-04在下述培养基中培养：在向DMEM/F12(1:1)(gibco)500mL中添加B-27(gibco)10mL、45％D-葡萄糖(Sigma Aldrich)7mL、200mM L-谷氨酰胺(gibco)5mL、胰岛素(gibco)1.875mL而成的培养基中，分别于使用时以1000分之1的量添加EGF(Peprotech)(20ng/mL)、bFGF(Peprotech)(20ng/mL)而得到的培养基(以下为SCM)。1123/M在下述培养基中培养：在向DMEM/F12(1:1)500mL中添加B-2710mL、200mM L-谷氨酰胺5mL、肝素(5mg/mL)(Sigma Aldrich)550μL而成的培养基中，分别于使用时以1000分之1的量添加EGF(20ng/mL)、bFGF(Peprotech)(20ng/mL)而得到的培养基。EGF及bFGF以每3天1次的频率添加至培养基内。全部细胞在孵育器中于5％CO₂、37℃培养。作为病毒培养用无血清培养基，使用了添加1％L-谷氨酰胺(gibco)的VP-SFM(gibco)，作为共转染培养基，使用了Opti-MEM(Sigma Aldrich)。

2.病毒

本实施例中制作及使用的病毒的代表性结构示于图2。任一种病毒均是以作为基因重组HSV-1的G47Δ为基本骨架制作的。T-01是未向ICP6基因的894bp的缺失位点插入外源基因、仅插入LacZ及巨细胞病毒(CMV)启动子而成的对照病毒。本次制作的T-BV及T-V_HV_L分别在CMV启动子的下游插入有抗人VEGF抗体表达基因及抗VEGF单链抗体(VEGF scFv)表达基因。关于插入的抗体表达基因的详情及病毒的制作方法见后述。

3.大肠杆菌、大肠杆菌用培养基及抗生素

作为转染用大肠杆菌，分别使用One shot DH5α-T1感受态细胞(Thermo FisherScientific)和One shot PIR1感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)，作为电穿孔用大肠杆菌，使用ElectroMax DH10B电转感受态细胞(Thermo Fisher Scientific)。作为转染用培养基，使用了SOC培养基(Thermo Fisher Scientific)。大肠杆菌的培养中使用了LB(Thermo Fishier Scientific)培养基。另外，作为向培养基添加的抗生素，使用了卡那霉素硫酸盐(Sigma Aldrich)、氯霉素(Sigma Aldrich)。

4.血清

血清使用了胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)(Sigma Aldrich)。关于热灭活处理，实施了56℃、30分钟的热处理。

5.抗体

作为抗人VEGF抗体的贝伐单抗(商品名：阿瓦斯汀(注册商标))购自中外制药。

关于Western印迹法用抗体，goat anti-human IgG-heavy and light chainmonkey-absorbed antibody购自Bethyl，donkey anti-goat IgG-HRP conjugated购自Santa Cruz。

关于ELISA用抗体，Human VEGF(100-20)、Murine VEGF(450-32)及Rabbit anti-Murine VEGF antibody(500-P131)购自PeproTech，Goat anti-Human IgG-Fc FragmentAntibody HRP conjugated(A80-104P)及Goat anti-Rabbit IgG-Fc Fragment AntibodyHRP conjugated(A120-111P)购自Bethyl。

关于免疫组织化学染色用抗体，兔抗HSV-1抗体(B0114，多克隆)、HRP标记抗兔多聚体(K4003)购自Dako，大鼠抗小鼠CD31抗体(DIA-310，单克隆)购自dianova，大鼠抗小鼠F4/80抗体(ab6640、单克隆)购自abcam，Mouse MAX PO(Rat)(414311)购自NICHIREICORPORATION。

关于流式细胞术分析用抗体，纯化抗小鼠CD16/32抗体(101301)、Pacific Blue抗小鼠CD45抗体(103126)、APC抗小鼠/人CD11b抗体(101212)、Brilliant Violet 570抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)抗体(108431)及PE/Cy7抗小鼠CX3CR1抗体(149015)购自BioLegend，大鼠抗小鼠F4/80:RPE抗体(MCA497PE)购自Bio-Rad。

6.实验动物

使用了出生后5～6星期的雌性BALB/cnu/nu小鼠(裸鼠)。小鼠购自日本CharlesRiver公司或日本SLC，在无特定病原体环境下饲育。动物实验遵守“动物爱护及管理相关法律”，遵循东京大学生物科学委员会的东京大学动物实验实施手册。

B.实验方法

实施例1：病毒的制作

T-BV、T-V_HV_L、T-sVEGFR1的制作使用了T-BAC体系。T-BAC体系是指下述技术：将细菌人工染色体(BAC)(其是以能使大小为100万bp以下的DNA片段以单一拷贝形式稳定地保持在大肠杆菌内的F因子质粒的复制子为基础的克隆载体)插入至G47Δ的基因组的ICP6缺失位点，从而制作容易维持、扩增G47Δ基因组的基因重组HSV-1(Fukuhara,H.等，(2005).Cancer research,65,10663-10668)。该T-BAC中包含loxP序列及FRT序列，与同样具有loxP序列和FRT序列的穿梭载体质粒SV-01混合，利用Cre/loxP及FLP/FRT这2个重组酶体系，从而能够插入被SV-01担载的外源基因，切出BAC，制作插入了外源基因的G47Δ(图3)。

实施例1.1抗体表达cDNA的制作

关于抗人VEGF抗体表达基因的cDNA，分别自国际免疫遗传信息系统(theinternational ImMunoGeneTics information system)(IMGT)、及美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的数据库获得贝伐单抗的Fab区的氨基酸序列及人IgG1 Fc区的氨基酸序列。在与重链、轻链各自对应的多肽的N末端侧结合Ig kappa前导序列及信号肽酶识别位点作为分泌信号，将得到的肽与口蹄疫病病毒(FMDV)-2A序列及弗林蛋白酶识别序列结合。氨基酸序列及整体结构示于图4。最终在转录起始点插入Kozak序列和起始密码子，用限制性内切酶位点BamHI和NotI夹持序列的两端，委托Eurofins Genomics K.K.转换成优化为人密码子的碱基序列，以单链cDNA的形式进行制作。

关于用于表达VEGF scFv的cDNA，基于文献(Liang,W.C.等，(2006).Journal ofBiological Chemistry,281,951-961)中记载的与人·小鼠这两者的VEGF具有结合性的抗VEGF抗体的克隆之一G6-31的重链、轻链的氨基酸序列，使用遗传信息处理软件GENETYX(GENETYX CORPORATION)、制作与各序列对应的cDNA。将与该重链、轻链对应的cDNA与scFv的基础结构、即GS接头(其是将三段4个甘氨酸与1个丝氨酸连结而成的序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号：12))连接而成的)结合，在N末端侧结合Ig kappa前导序列和信号肽酶识别位点。氨基酸序列及整体结构示于图5。最终在转录起始点插入Kozak序列和起始密码子，用限制性内切酶位点BamHI和NotI夹持序列的两端，以单链cDNA的形式进行制作。关于之后的实施例1.2～1.7中的步骤，仅示出与T-BV相关的步骤。T-V_HV_L及T-sVEGFR1如后述的实施例1.8那样进行制作。

实施例1.2担载抗人VEGF抗体表达基因的质粒(pEX-K-BV)的扩增

将抗人VEGF抗体表达基因担载质粒pEX-K-BV(Eurofins Genomics K.K.制)(图6)溶解于TE缓冲液中(相当于1ng)，添加到One shot DH5α-T1感受态细胞于冰上静置30分钟，于42℃热处理45秒后，加入SOC培养基，于37℃培养1小时后，将全部培养液接种至添加有卡那霉素的LB琼脂培养基，于37℃培养过夜。采集菌落，在添加有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养8小时。离心回收沉淀，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)提取质粒DNA。

实施例1.3向穿梭载体SV-01插入抗人VEGF抗体表达基因

对于SV-01，用BamHI、NotI进行限制性内切酶处理，并进行CIAP处理。对于pEX-K-BV，用BamHI、NotI进行限制性内切酶处理时得到的pEX-K、抗人VEGF抗体表达基因的大小为2,507bp、2,261bp，电泳条带接近，因此，出于改善分离的目的，组合使用了识别位点不位于抗人VEGF抗体表达基因内、对pEX-K在大致中间处进行切割的BglII。在1％琼脂糖凝胶中于50V电泳80分钟后，在紫外透射仪(UVP)内切出目标条带，使用QIAquick Gel ExtractionKit(Qiagen)提取目标大小的DNA片段。将提取的DNA片段与DNA Ligation Kit Mighty Mix(Takara)混合后，与One shot PIR1感受态细胞混合，加以热处理后，于37℃培养1小时，接种于添加有卡那霉素的LB琼脂培养基，于37℃培养过夜。采集菌落，在添加有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养24小时后，离心并回收沉淀，使用QIAprep Spin Miniprep Kit提取DNA。将提取的DNA用BamHI、NotI进行限制性内切酶处理后，在1％琼脂糖凝胶中电泳，确认抗人VEGF抗体表达基因向SV-01的插入。

实施例1.4向SV-01插入T-BAC

将确认到抗人VEGF抗体表达基因的插入的SV-01(以下称为“BV/SV-01”)与T-BAC及Cre重组酶混合，使其于37℃反应1小时，通过Cre重组向T-BAC插入BV/SV-01。实施乙醇沉淀后，与ElectroMax DH10B电转感受态细胞混合并装入样品池(cuvette)中，使用GenePulse Xcell电穿孔装置(Bio-Rad)以1.2kV、25mF、200Ω实施电穿孔后，在添加有卡那霉素·氯霉素的LB琼脂培养基中于37℃培养过夜。采集菌落，在添加有卡那霉素的LB培养基中于37℃培养24小时后，离心并回收沉淀，使用QIAprep Spin Miniprep Kit提取BV/SV-01/T-BAC。

实施例1.5 BV/SV-01/T-BAC的重组的确认

通过PCR及限制性内切酶处理确认了结构。PCR以BV/SV-01/T-BAC作为模板，将正向/反向引物分别设定在ICP6内(ICP6-f1)/LacZ内(SV01-r1)或SV-01内(SV01-f1)/LacZ内(SV01-r1)，确认BV/SV-01的单一形式的插入。将T-BAC作为插入的阴性对照，将mock(没有模板DNA)作为PCR的阴性对照。两者的PCR均使用Veriti热循环仪(Thermo FisherScientific)，于94℃热变性2分钟后，执行25个“98℃10秒→57℃30秒→68℃1分钟30秒”的循环，最后于68℃处理7分钟。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中于100V电泳25分钟，确认电泳图谱。

关于限制性内切酶处理，将BV/SV-01/T-BAC用HindIII、KpnI进行限制性内切酶处理后，在0.6％琼脂糖凝胶中于50V电泳过夜。作为阴性对照，使用了T-BAC。

实施例1.6 BV/SV-01/T-BAC、pOG44向Vero的共转染

向BV/SV-01/T-BAC及FLP重组酶表达质粒pOG44(Thermo Fisher Scientific)加入转染试剂FuGENE HD(Promega)，于室温静置15分钟后，将其添加至已更换为Opti-MEM的Vero细胞，于5％CO₂、37℃培养3小时。然后，在添加有10％v/v FBS的DMEM中于5％CO₂、37℃培养过夜，在添加有1％v/v热灭活FBS的DMEM中于5％CO₂、37℃培养72小时。

实施例1.7利用极限稀释法分离单一克隆及纯化病毒

在共转染后确认到50％致细胞病变效应(CPE)，然后使用荧光显微镜BIOREVO(KEYENCE)观察绿色荧光蛋白(GFP)的荧光，确认到由病毒形成的噬斑之中7～8成的荧光消失、即、利用FLP切出BAC后，用细胞刮刀剥离Vero细胞，与培养液一同回收。离心并向沉淀中加入磷酸盐缓冲液(PBS)，重复冷冻·解冻3次后，施加超声波破碎操作，提取细胞内的病毒。然后，通过极限稀释法分离病毒的单一克隆。在96孔板中以每1个孔为1×10⁴个Vero细胞进行接种，对其以0.3pfu/孔的病毒效价进行感染。于室温振荡5分钟，于5％CO₂、37℃培养90分钟后，除去病毒液，加入添加有1％v/v热灭活FBS的DMEM，于5％CO₂、34.5℃培养6天后，以每3张96孔板为3个孔的方式对观察到GFP阴性的单一噬斑的孔进行选择，与培养液一同回收。将该病毒液使用6孔板扩增后，再次使用96孔板进行极限稀释。将上述一系列操作合计重复3次，从而最终分离了可视为单一克隆的病毒。

接下来，对分离的病毒进行纯化。针对以每1个瓶为1×10⁷个细胞接种了Vero细胞的16个T150培养瓶，使分离的病毒以MOI 0.01感染，于室温振荡5分钟后，于5％CO₂、37℃培养90分钟，然后除去病毒液，以25mL/个培养瓶加入添加有L-谷氨酰胺的VP-SFM，于5％CO₂、34.5℃培养。确认到出现CPE后，用细胞刮刀剥离细胞，与培养液一同回收后，于800×g离心并回收沉淀，加入PBS16mL进行悬浮后，重复3次冷冻·解冻，施加超声波破碎操作2分钟。将悬浮液依次用0.8μm过滤器、0.45μm过滤器过滤后，在加入了30％v/v蔗糖(SigmaAldrich)/PBS 4mL的离心管中缓慢且轻轻地覆盖一层，使用超级离心机Avanti HP-26XP(Beckman Coulter)，于4℃、24,000×g离心90分钟。回收沉淀，用冷PBS 5mL洗涤后，加入10％甘油(Merck Millipore)/PBS1.6mL，重复短时间的超声波破碎而将沉淀溶解。以各150μL分注后，用干冰·乙醇冷冻，于-80℃保存，用于以下的评价实验。

实施例1.8 T-V_HV_L及T-sVEGFR1的制成

以上述实施例中的、T-BV的制作步骤为基准，将作为VEGF阻遏因子的可溶型VEGF受体1(sVEGFR1)(Park JE等，(1994)J Biol Chem.Vol.269(41):25646-54)(图7)、或单链抗VEGF抗体VEGFscFv(VH-VL)(16,17,18)的基因的cDNA使用T-BAC体系插入G47Δ的基本骨架的ICP6缺失位点，制作作为VEGF拮抗剂表达型HSV-1的T-sVEGFR1和T-V_H-V_L。由于分泌至T-VH-VL的培养上清液中的VEGFscFv蛋白无法通过ELISA法检测，因此，为了通过针对κ链的ELISA法进行检测，也制作了插入在VEGFscFv(VH-VL)的C末端融合有κ链的VEGFscFv(VH-VLCL)而得的T-VEGFscFv(VH-VLCL)(图8)。

实施例2利用Southern印迹法确认T-BV的结构

关于作为最终产物的T-BV，利用Southern印迹法对结构进行了确认。从纯化病毒(滴度为8.4×10⁸pfu/mL)150μL使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen)提取病毒DNA，通过乙醇沉淀进行浓缩。将浓缩的DNA使用HindIII于37℃经16小时而进行限制性内切酶处理，在0.6％琼脂糖凝胶中于45V电泳13小时。使用紫外透射仪(UVP)确认电泳图谱后，于室温将凝胶在0.25M盐酸中浸泡20分钟，脱去嘌呤。然后，于室温在变性缓冲液(3M NaCl,0.4M NaOH)中浸透30分钟，使DNA变性。使用Turbo Blotter装置(GE Healthcare)，将病毒DNA片段从凝胶转印至Nytran SPC尼龙膜(GE Healthcare)。使用紫外交联仪(UVP)，以254nm、120mJ/cm²照射紫外线2分钟，将DNA固定于Nytran SPC尼龙膜上。关于探针，将BV/SV-01用BamHI、NotI进行限制性内切酶处理，将SV-01用BglI进行限制性内切酶处理，在0.7％琼脂糖凝胶中于100V电泳30分钟，切出各条带，使用QIA Quick Gel Extraction Kit提取DNA。然后，使用AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star(GE Healthcare)标记DNA，分别制作BV探针、LacZ探针。

将预先在杂交孵育器(Taitec)中加热至55℃的杂交缓冲液(GE Healthcare)与Nytran SPC尼龙膜一同装入杂交袋中密封，使其于55℃反应30分钟后，加入已标记的探针于55℃杂交过夜。将Nytran SPC尼龙膜使用一次洗涤液(2M urea,0.1％v/v SDS,50mM Naphosphate(pH7.0),150mM NaCl,1mM MgCl₂,0.2％v/v封闭剂)于55℃洗涤20分钟后，使用二次洗涤液(50mM Tris碱,100mM NaCl)于室温洗涤10分钟。使用Detection Solution(GEHealthcare)于室温处理4分钟后，使用ImageQuant LAS-4000(GE Healthcare)拍摄。

实施例3病毒效价的测定

本实施例中，使用的病毒的效价(滴度)的单位以噬斑形成单位(plaque formingunit)(pfu)表示，如下进行测定。滴度测定的目的在于确认实际的滴度是否与预期滴度有较大差异，在试验中于每次使用病毒时实施。将Vero细胞分别以3.6×10⁵个细胞/2mL接种至添加有10％FBS的DMEM/孔6孔板，在5％CO₂、37℃的条件下培养过夜。在翌日基于预期滴度，使用添加有1％v/v热灭活FBS的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate bufferedsaline)(DPBS)(Sigma Aldrich)制备病毒的3个阶段的稀释系列。以添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS1mL/孔对接种了Vero细胞的板进行洗涤后，以700μL/孔添加稀释成3个阶段的病毒液，各浓度为2孔，合计6孔。将添加有病毒液的6孔板于室温振荡5分钟，于5％CO₂、37℃培养1小时。除去病毒液，以2mL/孔加入向添加有1％v/v热灭活FBS的DMEM中以成为0.1％v/v的方式添加5％人免疫球蛋白G(日本血液制剂机构)而得的培养基，于5％CO₂、34.5℃培养72小时。除去培养基，使用PBS以1mL/孔洗涤1次后，加入1mL/孔的甲醇，于室温静置5分钟，进行固定。除去甲醇并干燥后，用以20分之1倍稀释的吉姆萨染色液(Merck Millipore)染色，用蒸馏水洗涤。干燥后，用显微镜测定噬斑数量，基于稀释倍数而以pfu/mL的形式算出滴度。

实施例4体外的病毒的细胞杀伤效果的研究

实施例4.1U87MG细胞中的细胞杀伤效果的研究

将U87MG细胞以2×10⁵个细胞/2mL添加有10％v/v FBS的DMEM/孔各自接种于6孔板，于5％CO₂、37℃培养过夜。使用添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS制备MOI 0.1、0.01的T-01和T-BV的病毒稀释液，以各病毒、各浓度为3孔、添加700μL/孔的病毒液或mock(添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS)。于室温振荡5分钟，于5％CO₂、37℃培养1小时后，除去病毒液，加入2mL/孔的添加有1％v/v热灭活FBS的DMEM，于5％CO₂、34.5℃培养。自感染起连续4天利用库尔特计数器(Beckman Coulter)测量活细胞数量，以相对于mock的活细胞数量而言的比例的形式算出。

实施例4.2 TGS-01、TGS-04中的细胞杀伤效果的研究

TGS-01、TGS-04出于维持干细胞性的目的而需要在无血清培养基中培养，于使用无血清培养基的培养中形成悬浮细胞块(细胞球)，因此，需要与粘附细胞不同的评价。因此，通过基于使用了四唑鎓化合物([3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓,内盐；MTS)]([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfoph enyl)-2H-tetrazolium,inner salt；MTS])的比色法来测定活细胞数量的MTS试验进行了评价。MTS试验是下述评价方法：MTS经由具有代谢活性的细胞内的NADPH或NADH而被转化成显色性的甲臜(formazan)产物，通过测定所得着色溶液的490nm处的吸光度，对活细胞数量进行定量化。本实验中使用CellTiter96AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit(Promega)进行测定。将TGS细胞以4,000个细胞/SCM 50μL/孔分别接种于非粘附处理96孔板(NUNC)，使用添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS制备MOI 1、0.1、0.01的T-01及T-BV的病毒稀释液，以各病毒、各浓度为3孔添加10μL/孔的病毒液或mock(添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS)。于室温振荡5分钟后，于5％CO₂、37℃培养1小时，加入SCM 50μL，于5％CO₂、37℃培养。自感染起1天后，各自以20μL/孔添加MTS+吩嗪硫酸甲酯(PMS)的混合液(20:1)，然后于5％CO₂、37℃培养24小时，然后使用96孔板检测仪AD200(Beckman Coulter)测定490nm的吸光度。自感染起连续4天实施该试剂的添加和24小时后的测定，以相对于mock的吸光度而言的比例的形式算出。

实施例5在体外的病毒复制试验

将Vero细胞及U87MG细胞以3×10⁵个细胞/2mL添加有10％v/v FBS的DMEM/孔各自接种于6孔板，于5％CO₂、37℃培养过夜。使用添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS制备MOI 0.01的T-01和T-BV的病毒稀释液，以各病毒、各浓度为3孔添加700μL/孔的病毒液或mock(添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS)。于室温振荡5分钟，于5％CO₂、37℃培养1小时后，除去病毒液，加入2mL/孔的添加有1％v/v热灭活FBS的DMEM，于5％CO₂、34.5℃培养。自感染起24小时后及48小时后，用细胞刮刀剥离细胞，与培养液一同按各孔回收。重复3个用干冰·乙醇冷冻及融化的循环后，利用超声波施以细胞破碎处理1分钟，使用得到的试样与前述的方法同样地测定滴度。

实施例6表达蛋白的确认

实施例6.1利用Western印迹法确认表达蛋白

首先，制备检体。将HEK293T细胞以8×10⁵个细胞/2mL添加有10％v/v FBS的DMEM/孔各自接种于6孔板，于5％CO₂、37℃培养8小时后，将1.6μg BV/SV-01及作为对照的SV-01与转染试剂FuGENE HD和OptiMEM混合，滴加至HEK293T细胞，于5％CO₂、37℃培养48小时，将BV/SV-01及SV-01转染至HEK293T细胞。回收上清液，用0.2μm过滤器过滤，使用AmiconUltra-15,10K(Merck Millipore)通过超滤进行浓缩，将产物作为检体保存。作为阳性对照，使用了阿瓦斯汀(注册商标)(中外制药)。

关于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，实施了在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下实施的SDS-PAGE、和不使用SDS的非变性PAGE。

实施例6.1.1SDS-PAGE

调配40％w/v丙烯酰胺/Bis混合溶液(29:1)2.4mL、1M Tris/HCl3mL、蒸馏水2.47mL、SDS(10％v/v)80μL、APS(10％v/v)40μL、TEMED 8μL而制作12％的分离胶，注入制胶用玻璃板组之间，从上方覆盖一层蒸馏水，静置20分钟左右，凝固后除去上层的蒸馏水，覆盖一层调配40％w/v丙烯酰胺/Bis混合溶液(29:1)312.5μL、1M Tris/HCl 312.5μL、蒸馏水1.835mL、SDS(10％v/v)25μL、APS(10％v/v)12.5μL、TEMED 2.5μL而成的5％的浓缩胶，制胶。将凝胶安装于电泳槽后，向阳极槽·阴极槽中注入电泳缓冲液(0.12M Tris·HCl、0.192M甘氨酸、3.47mM SDS)。以加样蛋白量统一为500ng的方式，混合蒸馏水及4x加样缓冲液(0.25M Tris·HCl pH 6.8、8％v/v SDS、40％v/v甘油、20％v/v 2-巯基乙醇、0.2％v/v溴酚蓝)，于100℃沸腾10分钟后，冰上骤冷。将检体加样至孔中，于室温在浓缩胶内以10mA、250V、10W、在分离胶内以20mA、250V、10W电泳。将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(MerckMillipore)浸入甲醇后，在浸入转印缓冲液(0.048M Tris、0.039M Glysin、20％v/v甲醇、SDS(10％)100μL)的状态下，使用Trans-Blot SD Cell(Bio-Rad)在100mA、60分钟的条件下将蛋白质转印至PVDF膜。使用Blocking One于室温封闭50分钟后，以goat anti-humanIgG-heavy and light chain monkey-absorbed antibody(1/2000稀释)作为一抗于4℃反应过夜。洗涤PVDF膜后，以donkey anti-goat IgG-horseradish peroxidase(HRP)conjugated(1/2000稀释)作为二抗于室温反应2小时，洗涤后，使Pierce WesternBlotting Substrate(1:1)(Thermo Fisher Scientific)于室温反应5分钟，使用LAS4000拍摄。

实施例6.1.2非变性PAGE

凝胶使用了预制胶NativePAGE Novex 3-12％Bis Tris Gels(Thermo FisherSientific)。将凝胶安装于电泳槽后，向阳极槽注入阳极缓冲液(0.05M BisTris、0.05MTricine)，向阴极槽注入阴极缓冲液(电泳缓冲液(0.05M BisTris、0.05M Tricine、NativePAGE Cathode Additive(Thermo Fisher Scientific))。以加样蛋白量统一为500ng的方式，混合蒸馏水及4x非变性PAGE试样缓冲液(Thermo Fisher Scientific)。将检体加样至孔中，在最初的60分钟为150V、8-10mA，之后为250V、2-4mA、30～90分钟，为了防止由热导致的变性，全部于4℃低温室内实施电泳。蛋白质向PVDF膜的转印使用Xcell2 BlotModule(Thermo Fisher Scientific)，用转印缓冲液(0.5M Tricine、0.5M Bis-Tris、0.02M EDTA)填满inner chamber，用蒸馏水填满outer chamber，在25V、1小时的条件下将蛋白质转印至PVDF膜。使用Blocking One于室温封闭50分钟后，以goat anti-human IgG-heavy and light chain monkey-absorbed antibody(稀释为1/2000)作为一抗于4℃反应过夜。洗涤PVDF膜后，以donkey anti-goat IgG-HRP conjugated(1/2000稀释)作为二抗于室温反应2小时，洗涤后，使Pierce Western Blotting Substrate Plus(40:1)(ThermoFisher Scientific)于室温反应5分钟，使用LAS4000拍摄。

实施例6.2利用ELISA定量体外的抗人VEGF抗体表达

将U87MG细胞以4×10⁵个细胞/2mL添加有10％v/v FBS的DMEM/孔各自接种于6孔板，于5％CO₂、37℃培养12小时后，使用添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS制作MOI 0.2的T-01和T-BV的病毒稀释液，以各病毒为3孔添加700μL/孔的病毒液或mock(添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS)。于室温振荡5分钟，于5％CO₂、37℃培养1小时后，除去病毒液，加入2mL/孔的DMEM，于5％CO₂、37℃培养72小时。回收上清液，使用Amicon Ultra-15,10K通过超滤浓缩2.7倍，将产物作为检体。作为用于绘制标注曲线的标准品，使用阿瓦斯汀(注册商标)，以原液(25mg/mL)为基准，制作自90ng/mL起8个梯度、每梯度1/3稀释的系列。标准品及检体、检测抗体的稀释使用了Sample/conjugate diluent(Bethyl)。ELISA使用了ELISA StarterAccessory Kit(Bethyl)。向微量滴定孔中各自加入50ng/100μL的重组人VEGF 165(Peprotech)，于室温反应1小时，进行抗原的固相化。使用100μL/孔的ELISA洗涤液洗涤5次后，加入200μL/孔的封闭液，于室温封闭30分钟。使用200μL/孔的ELISA洗涤液洗涤5次后，各自加入100μL/孔的标准品及检体，于室温反应1小时。使用100μL/孔的ELISA洗涤液洗涤5次后，作为检测抗体，各自加入100μL/孔的goat anti-human IgG-Fc fragment antibodyHRP conjugated(1/100000稀释)，于室温反应1小时。5次洗涤之后，各自加入100μL/孔的TMB底物，避光反应15分钟后，各自加入100μL/孔的终止液(0.18M H₂SO₄)，使用96孔板检测仪AD200测定450nm的吸光度。基于使用标准品得到的吸光度绘制标准曲线，算出检体的抗人VEGF抗体浓度。标准曲线使用图像处理免费软件Image J绘制。

实施例7T-BV表达抗体的功能的确认

使用HUVEC-2，实施血管内皮细胞管腔形成试验及血管内皮细胞迁移试验，确认了T-BV所表达的蛋白的VEGF阻遏效果。首先，制备检体。在确认了来自Vero细胞的VEGF表达量几乎与U87MG细胞同等的基础上，使用Vero细胞制备检体。将Vero细胞以8×10⁶个细胞各自接种于T150培养瓶，在37℃、5％CO₂的条件下培养8小时后，使T-01、T-BV、mock(添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS)以MOI 0.2感染，于室温振荡5分钟，在37℃、5％CO₂的条件下培养1小时。除去病毒液，更换为DMEM 15mL，在37℃、5％CO₂的条件下继续培养3天。回收上清液，使用Amicon Ultra-15,10K进行超滤而浓缩40倍。

实施例7.1血管内皮细胞管腔形成试验

使用BD BioCoat Angiogenesis System-Endothelial Cell Tube Formation(BDBioscience)实施。将BD BioCoat Angiogenesis Plate在接种细胞24小时前于4℃溶解后，以2×10⁴个细胞/孔各自接种HUVEC-2。除了在各孔中各自添加有2.5μL制备的检体的3组以外，还有作为阳性对照的、向mock 2.5μL添加10pg/2.5μL或10ng/2.5μL的阿瓦斯汀(注册商标)的2组(各自为p.c.1、p.c.2)、作为阴性对照的、不添加细胞培养上清液的组，针对合计6组进行了评价。各组分别实施了3孔。以各孔的培养液的总量成为50μL的方式加入添加有1％v/v LSGS的Medium200，于37℃、5％CO₂培养17小时。除去培养液，使用100μL/孔的Hanks’Balanced Salt Solution(HBSS)(Thermo Fisher Scientific)重复洗涤2次后，各自加入50μL/孔的8μg/mL钙黄绿素AM(BD Bioscience)，于37℃标记30分钟。除去钙黄绿素AM，使用HBSS100μL/孔洗涤2次后，使用荧光显微镜BIOREVO拍摄各孔，然后测定管腔的长度，以各组3孔的管腔长总和的平均值的形式算出。

实施例7.2血管内皮细胞迁移试验

使用BD BioCoat Angiogenesis System-Endothelial Cell Migration(BDBioscience)实施。在上部腔室以1×10⁵个细胞/孔各自接种HUVEC-2，在下部的孔中，除了各自添加19μL制备的检体的3组以外，还有作为阳性对照的、向mock 19μL添加380pg/19μL或380ng/19μL的阿瓦斯汀(注册商标)的2组(各自为p.c.1、p.c.2)、作为阴性对照的、不添加细胞培养上清液的组，针对合计6组进行了评价。各组分别实施了3孔。以各孔的培养液的总量成为750μL的方式加入添加有1％v/v LSGS的Medium200，于37℃、5％CO₂培养22小时。预先另行准备各自分注有500μL/孔的8μg/mL钙黄绿素AM的24孔板，除去上部腔室中的培养液及附着于膜下表面的培养基，移至添加有钙黄绿素AM的24孔板中，于37℃标记90分钟。使用荧光显微镜BIOREVO测定各孔中的494nm/517nm处的荧光强度，以各组3孔的平均值的形式算出。

实施例8T-BV的表达抗体的种间交叉性的确认

首先，制备检体。将HEK293T细胞以6×10⁶个细胞接种于T150培养瓶，于37℃、5％CO₂培养8小时后，使T-BV以MOI 3感染，于室温振荡5分钟后，于37℃、5％CO₂培养1小时。除去病毒液，加入15mL的VP-SFM，继续培养15小时后，回收上清液，通过超滤浓缩20倍而制作。一抗使用了T-BV的感染上清液浓缩液、阿瓦斯汀(注册商标)及兔抗小鼠VEGF抗体。二抗分别使用了下述抗体进行检测：关于T-BV的感染上清液浓缩液及阿瓦斯汀(注册商标)，由于Fc部分为人源，因此，使用抗人IgG-Fc抗体；关于兔抗小鼠VEGF抗体，使用抗兔IgG-Fc抗体。在针对上述中制作的细胞上清液浓缩液实施的ELISA中，抗人VEGF抗体浓度为8.85ng/mL，基于此，将阳性对照阿瓦斯汀(注册商标)及抗小鼠VEGF抗体的浓度设定为8.85ng/mL和0.885ng/mL这两个阶段。阴性对照使用了VP-SFM。考虑由于固相化的2种VEGF与用于检测的2种二抗之间的交叉反应导致假阳性的可能性，阴性对照中设定了使各VEGF固相化的孔各自与2种二抗进行反应的交叉反应体系。

ELISA试剂盒使用了ELISA Starter Accessory Kit(Bethyl)。向微量滴定孔各自加入50ng/100μL/孔的人VEGF或小鼠VEGF。于室温反应1小时，进行抗原的固相化。使用100μL/孔的ELISA洗涤液洗涤5次后，加入200μL/孔的ELISA封闭液，于室温封闭30分钟。使用200μL/孔的ELISA洗涤液洗涤5次后，各自加入100μL/孔的检体，于室温反应1小时。使用100μL/孔的ELISA洗涤液洗涤5次后，各自加入100μL/孔的各二抗(稀释为1/100000)，于室温反应1小时。使用ELISA洗涤液洗涤5次后，各自加入100μL/孔的TMB底物，在避光条件下反应15分钟后，各自加入100μL/孔的终止液，使用96孔板检测仪AD200测定450nm的吸光度。

实施例9动物实验

对于动物实验中用于治疗的病毒液而言，全部使用以10％的比例添加有经过滤器灭菌的甘油的PBS，关于细胞悬浮液，就TGS而言，使用了DMEM/F12(1:1)，除此以外的细胞株使用了DMEM。另外，关于mock组，在纯化时向Vero细胞加入添加有1％v/v热灭活FBS的DPBS代替病毒液，之后的步骤施予与病毒同样地经过纯化的产物。全身麻醉使用了利用氯胺酮(第一三共)和甲苯噻嗪(Bayer AG)的腹腔内注射、或基于吸入异氟烷(Pfizer Inc.)的麻醉法。

实施例9.1抗肿瘤效果的研究

实施例9.1.1皮下肿瘤模型中的病毒的肿瘤内施予实验

针对经腹腔内施予氯胺酮和甲苯噻嗪而处于全身麻醉下的BALB/c nu/nu小鼠的左侧腹部，使用26G针将悬浮于50μL DMEM中的2×10⁶个U87MG细胞移植至皮下。使用游标卡尺以每周2～3次的频率测量肿瘤，肿瘤体积基于肿瘤长径×短径×厚度(mm³)算出。

确认到肿瘤直径增大至6mm后，随机地以每组10只分成各治疗组，然后实施病毒的肿瘤内施予。在腹腔内施予氯胺酮和甲苯噻嗪造成的全身麻醉状态下，使用安装有30G针的微量注射器#1710(Hamilton)施予用添加有10％v/v甘油的PBS稀释的2×10⁵pfu/20μL的T-01、T-BV或mock。将病毒初次施予日作为第0天，在第3天也在肿瘤内施予了相同量的病毒。病毒施予后也继续以每周2～3次测量肿瘤直径，算出肿瘤体积。

实施例9.1.2脑内肿瘤模型的基于病毒的肿瘤内施予的存活实验

在腹腔内施予氯胺酮和甲苯噻嗪造成的全身麻醉状态下，将BALB/c nu/nu小鼠的头部使用小动物脑定位固定装置MODEL900(David Kopf Instruments)固定，使用微量注射器#1701N(Hamilton)向右额叶内注入悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞。刺入位点为自前囟起右外侧2mm、前方1mm的位点，在其正上方切开长度为4mm左右的皮肤竖切口，剥离骨膜后刺入头部，使穿刺针进至距脑表面深度为3mm处，经2分钟注入细胞悬浮液，保持5分钟后，经2分钟拔去穿刺针。使用5-0VICRYL(Johnson&Johnson)缝合皮肤。关于TGS-01、TGS-04，将悬浮于DMEM 2μL中的1×10⁵个细胞通过相同的操作步骤移植至右额叶内。

以肿瘤增大至2～3mm作为标志，关于U87MG及TGS-01在自肿瘤移植起第10天，关于TGS-04在自肿瘤移植起第20天随机地以每组10只分成各治疗组，然后实施病毒的肿瘤内施予。在腹腔内施予氯胺酮和甲苯噻嗪造成的全身麻醉状态下，将小鼠的头部用小动物脑定位固定装置固定，重新切开肿瘤移植时切开过的皮肤部位，使用微量注射器#1701N，关于U87MG，注入用添加有10％v/v甘油的PBS稀释的1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV或mock，关于TGS-01及TGS-04，注入2×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV或mock。为了防止混入不同的病毒，针对每种病毒准备不同的微量注射器。刺入位点·深度设定为与肿瘤移植时相同。经2分钟注入病毒液，保持5分钟后，经2分钟拔去穿刺针。使用5-0VICRYL缝合皮肤。病毒为单次施予，将施予日作为第0天，记录各小鼠的存活时间。

实施例9.2肿胀抑制效果的研究

实施例9.2.1核磁共振成像法(magneticresonanceimaging；MRI)

实施例9.2.1.1使用了各种人脑瘤细胞株的脑内肿瘤模型的制作及病毒的肿瘤内 施予

为了研究T-BV针对各种人脑瘤的肿胀抑制效果，使用U87MG、U251MG、NMC-G1、TGS-01、1123/M制作BALB/c nu/nu小鼠脑内肿瘤模型，并且使用最容易利用MRI描绘肿瘤的U87MG实施了试验。移植的细胞数量：2×10⁵(个细胞)、病毒施予日：自肿瘤移植起12天后，病毒施予量：1×10⁶(pfu)。通过与前述同样的方法向右额叶内移植了肿瘤细胞。通过MRI确认到肿瘤呈适合施予病毒的大小后，通过与前述同样的方法进行肿瘤内施予。另外，作为阳性对照，设定T-01和阿瓦斯汀(注册商标)联用组(T+A组；自T-01的肿瘤内施予起连续5天腹腔内施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标))。

实施例9.2.1.2MRI的拍摄

在利用异氟烷的吸入麻醉下及呼吸监控下实施MRI拍摄。拍摄使用了小动物用MRIICON 1T^TM(Brucker Biospin)。MRI的拍摄参数设定如下。

T2加权像(T2WI)：重复时间(TR)＝2,000msec；回波时间(TE)＝85msec；6层切片；厚度＝0.7mm；视野(FOV)＝20×20mm；矩阵＝96x 96；平均数(NA)＝8。

T1加权像(T1WI):TR＝400msec；TE＝12msec；6层切片；厚度＝0.7mm；FOV＝20×20mm；矩阵＝96×96；NA＝10。

对于造影T1WI(T1WI(CE))而言，在T2WI拍摄后，将MRI用造影剂Magnevist(注册商标)(Bayer AG)用PBS稀释至20分之1倍，经眼眶静脉施予100μL，然后拍摄。

肿瘤移植后适当拍摄T2WI、T1WI(CE)，确认肿瘤形成。确认到已形成肿瘤后，确定病毒施予日，并在该日前一天对所有个体拍摄T2WI及T1WI(CE)，选出大小及形状适合病毒的肿瘤内施予的个体后，随机地分成mock组及病毒治疗组。在病毒施予2、4、6天后(施予后天数(PID)2、4、6)也以相同的相位拍摄MRI。

实施例9.2.1.3肿胀区域的评价

对于拍摄的图像而言，使用DICOM图像处理免费软件Osirix测量T2WI中的高信号区及T1WI(CE)中的造影区域的面积。针对T2WI及T1WI(CE)各自中的高信号区的面积(mm²)，将在病毒施予前日拍摄的图像分别设为S_2p、S_1p，将在病毒施予后第n天拍摄的图像分别设为S_2n、S_1n，通过(S_2n/S_2p)÷(S_1n/S_1p)以相对值的形式算出肿瘤周围的肿胀(水肿)。

实施例9.2.2利用RT-qPCR定量小鼠水通道蛋白(AQP)4

实施例9.2.2.1 U87MG脑内肿瘤模型的制作及病毒的肿瘤内施予

通过与前述同样的方法，向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞。在肿瘤移植10天后随机地以每组6只分成各治疗组后，通过与前述同样的方法肿瘤内施予1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV或mock。作为阳性对照，设定T+A组。

实施例9.2.2.2 RT-qPCR

在PID6使全部小鼠安乐死，摘出包含肿瘤的右额叶，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)提取RNA。然后，使用逆转录酶ReverTra Ace qPCR RT master mix(Toyobo)从该RNA制作cDNA。PCR引物使用Taqman Gene Expression Assays的小鼠AQP4的引物(Mm_00802131_m1)及小鼠β肌动蛋白的引物(Mm_02619580_g1)，并使用了7500Fast实时PCR装置(Thermo Fisher Scientific)。对于数据分析而言，以小鼠β肌动蛋白作为内参基因，使用循环比较法算出。

实施例9.2.3 T-BV和T-V_HV_L的肿胀抑制效果的比较

通过与前述同样的方法，向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞。关于病毒施予，在肿瘤移植10天后(通过MRI确认到肿瘤呈适合病毒施予的大小)，通过与前述同样的方法肿瘤内施予1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV、T-V_HV_L或mock。关于MRI的拍摄方法、时机及肿胀的评价，与T-BV的肿胀抑制效果确认实验同样地实施。

实施例9.3病毒施予后的针对肿瘤环境的影响

实施例9.3.1针对脑瘤模型的病毒施予后的病理学研究(免疫组织化学染色)

实施例9.3.1.1 U87MG脑内肿瘤模型的制作及病毒的肿瘤内施予、供检载片 (preparation)制作

通过与前述同样的方法，向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞。在肿瘤移植10天后以每组6只分成各治疗组后，通过与前述同样的方法肿瘤内施予1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV或mock。作为阳性对照，设定T+A组，自病毒施予日起直至安乐死为止连续每天施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)。在PID2、4使每组各3只小鼠安乐死，然后摘出脑，使其在中性缓冲甲醛(10)(Sigma-Aldrich)中浸透24小时而固定。使用固定石蜡包埋装置Tissue-Tek VIP-5-Jr(SAKURA SEIKI Co.,Ltd.)实施石蜡包埋，使用石蜡包埋块制作装置Tissue-Tek TECPlus(SAKURA SEIKI Co.,Ltd.)制作石蜡包埋块，使用切片机(Leica)对肿瘤中心部以4μm的厚度切成薄片，制作连续切片。

另外，出于对施予了T-BV、T-V_HV_L的情况下的血管生成进行评价的目的，同样地向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞而制作脑内肿瘤模型，在肿瘤移植10天后以每组6只分成各治疗组后，通过与前述同样的方法肿瘤内施予1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV、T-V_HV_L或mock。以下，同样地制作石蜡切片。

实施例9.3.1.2免疫组织化学染色

将供检载片在43℃的伸展器上整晚伸展·干燥后，在二甲苯中浸泡30分钟而进行脱石蜡处理，在100％乙醇、90％v/v乙醇、70％v/v乙醇中各浸泡10分钟进行亲水化处理。用蒸馏水洗涤后，通过微波法进行抗原赋活处理，使用过氧化物酶封闭液(Dako)实施内源性过氧化物酶的封闭。使用Tris-HCl Buffer Saline(TBS)洗涤10分钟后，于室温在1.5％v/v正常山羊血清(Vector Laboratories)中浸泡15分钟进行封闭。一抗反应用以下的抗体及稀释倍率，于室温反应1小时。抗HSV-1抗体(1:2000)、抗小鼠CD31抗体(1:40)、抗小鼠F4/80抗体(1:2000)。稀释使用了1.5％v/v正常山羊血清。一抗反应后，用TBS洗涤10分钟。二抗反应用HRP标记抗兔多聚体或Mouse MAX PO(Rat)，于室温反应30分钟。用TBS洗涤10分钟后，浸于DAB Substrate Kit(Vector Laboratories)中进行检测。检测后，使用苏木精对比染色7分钟，在70％v/v乙醇、90％v/v乙醇、100％乙醇中依次各浸泡10分钟进行脱水，在二甲苯中浸泡10分钟而浸透后，使用非脂溶性封片剂MOUNT-QUICK(大道产业)封片。

实施例9.3.1.3关于肿瘤血管生成的评价

关于肿瘤血管生成，使用对病毒施予后的U87MG脑内肿瘤模型实施小鼠CD31的免疫组织化学染色而得到的供检载片来测量肿瘤内的血管数量，由此进行评价。血管数量的测量按照Weidner等的方法(Weidner,N.等，(1991)The New England journal ofmedicine 324,1-8)来实施。使用可视化玻片扫描仪Nanozoomer(Hamamatsu PhotonicsK.K.)，针对各组各天n＝3的检体供检载片以200倍的倍率拍摄血管密度最大的部分，计数CD31阳性细胞，算出平均血管数量。

实施例9.3.2针对脑瘤模型施予病毒后的巨噬细胞的变化实施例9.3.2.1 U87MG 脑内肿瘤模型的制作及病毒的肿瘤内施予

通过与前述同样的方法，向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞。在肿瘤移植10天后以每组9只分成各治疗组后，关于病毒施予，通过与前述同样的方法肿瘤内施予1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV或mock。作为阳性对照，设定T+A组，自病毒施予日起最长5天、连续每天施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)至安乐死为止。

实施例9.3.2.2利用流式细胞术的巨噬细胞评价

在PID2、4、6使每组各3只小鼠安乐死，然后迅速摘出包含肿瘤的右额叶，使用Naural tissue dissociation kit(Miltenyi Biotec)及gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)，使组织分散而制备单细胞悬浮液。将细胞悬浮液移至Eppendorf管中，悬浮于PBS1mL中，加入1μL的Fixable Viability Dye eFluor 780(Affymetrix)漩涡振荡，在4℃、遮光条件下反应30分钟，进行死亡细胞的染色。使用Flow Cytometry StainingBuffer(eBioscience)洗涤2次后，悬浮于1mL中作为检体。首先加入2μL抗小鼠CD16/32抗体，在冰上反应5～10分钟，封闭介由Fc受体的抗体的非特异性结合。作为条件研究的结果，确定向每100μL检体添加的抗体量如下。抗CD45抗体(0.5μL)、抗CD11b抗体(1μL)、抗F4/80抗体(5μL)、抗Gr-1抗体(0.5μL)、抗CX3CR1抗体(0.5μL)。除了在各检体管中添加有上述全部抗体而成的染色试样以外，一同准备了出于荧光校正的目的而仅添加有1种抗体的单染色试样、及用于调节灵敏度的未染色试样。通过轻敲混合，在4℃、遮光条件下反应30分钟后，使用Flow Cytometry Staining Buffer洗涤2次。悬浮于Flow Cytometry StainingBuffer 100μL中，加入4％v/v甲醛/PBS10μL固定，使用流式细胞仪CytoFLEX(BeckmanCoulter)进行分析。首先使用未染色检体调节各荧光的灵敏度，并使用单染色试样进行荧光校正，然后分析染色试样。巨噬细胞是CD45阳性、CD11b阳性、F4/80阳性的群体，其中，M1可作为Gr-1^highCX3CR1^low分离，M2可作为Gr-1^lowCX3CR1^high分离。通过散射光的二维制图除去(gate out)髓磷脂组分，通过死亡细胞染色除去死亡细胞后，针对CD45阳性组分，基于CD11b及F4/80展开二维制图，针对双阳性细胞，基于Gr-1及CX3CR1展开二维制图，从而将M1巨噬细胞、M2巨噬细胞分离。针对M1、M2各自算出CD45阳性细胞中的比例，通过算出M1/M2之比，评价巨噬细胞的M1/M2转变情况。

实施例9.3.2.3病毒复制试验及病毒效价的测定(体内)

通过与前述同样的方法，将U87MG细胞移植至小鼠皮下，形成肿瘤。肿瘤移植约20天后，确认到肿瘤直径增大至6mm左右，随机地以每组12只分成各治疗组后，通过与前述同样的方法施予病毒。施予为1×10⁶pfu的T-01、T-BV、mock或T-01+阿瓦斯汀(注册商标)的腹腔内施予(T+A)。T+A组中，以5mg/kg体重的量腹腔内施予阿瓦斯汀(注册商标)5天(自即将接种病毒之前开始施予)。刚刚接种病毒后，在1天后、3天后或7天后回收肿瘤，在300μL的冰冷PBS中均质化，重复3个循环的冷冻和融化后，通过与实施例3同样的方法使用Vero细胞测定效价(于各组的各测定日，n＝3)。

实施例9.4体内的T-BV的抗体表达的确认

实施例9.4.1针对皮下肿瘤模型施予T-BV后的施予局部的抗体表达的确认

通过与前述同样的方法，向BALB/c nu/nu小鼠的左侧腹部移植悬浮于50μL DMEM中的2×10⁶个U87MG细胞。在肿瘤直径增大至5mm的时间点，以每组各9只随机地分成T-01组、T-BV组、mock组，向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu/20μL的T-01、T-BV。在PID2、4、6使每组各3只小鼠安乐死，摘出皮下肿瘤，在添加有1/100量的cOmplete Protease InhibitorCocktail(Roche)及1/1000量的1M二硫苏糖醇(Wako)的冰冷细胞裂解缓冲液(Wako)500μL中破碎后，使用Amicon Ultra-15,10K浓缩至2倍。小鼠的体内检体含有较多的小鼠IgG，为了降低对于ELISA的非特异性反应，利用免疫沉淀法除去小鼠IgG，向检体各自加入10μL的抗小鼠IgG(H&L),F(ab’)2片段(Sepharose Bead Conjugate)(Cell SignalingTechnology)，于4℃翻转混合1小时后离心，将得到的上清液用于ELISA。对于ELISA而言，通过与前述同样的方法，使用将人VEGF固相化的孔，标准品使用了将阿瓦斯汀(注册商标)逐步稀释后的产物。使用96孔板检测仪测量450nm的吸光度，基于标准品使用图像处理免费软件ImageJ绘制标准曲线，算出检体中的抗人VEGF抗体浓度。

实施例9.4.2脑内肿瘤模型中的病毒施予后的表达抗体的血中浓度的确认

将T-BV施予至脑内肿瘤模型时，通过ELISA测定表达的抗人VEGF抗体的血中浓度。通过与前述同样的方法向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植悬浮于DMEM 2μL中的2×10⁵个U87MG细胞，在肿瘤移植10天后以每组6只分成T-01组、T-BV组、T+A组及mock组后，关于病毒施予，肿瘤内施予1×10⁶pfu/5μL的T-01、T-BV或mock。关于T+A组，在病毒施予日向腹腔内单次施予5mg/kg的阿瓦斯汀(注册商标)。在PID1、3对每组各3只施以静脉采血，通过ELISA测定血清中的VEGF浓度。

实施例10 T-V_HV_L及T-sVEGFR1的评价

实施例10中，针对实施例1.8中制作的T-V_HV_L及T-sVEGFR1如下地进行评价。

实施例10.1病毒的效价测定

将Vero细胞以成为3.6×10⁵个细胞/孔的方式接种于6孔板，在37℃、5％CO₂的条件下培养。16小时后，使用添加有1％热灭活FBS(1％IFBS)的PBS洗涤，然后加入10倍的稀释系列的病毒液，在37℃、5％CO₂的条件下培养。1小时后，除去病毒液，作为培养基，加入添加了0.1％人免疫球蛋白的、添加有1％IFBS的DMEM，在34.5℃、5％CO₂条件下培养。3天后，用PBS洗涤，在甲醇中固定。使其干燥后，用使用蒸馏水稀释20倍的吉姆萨液染色，洗涤，干燥，在显微镜下计数噬斑数量，算出病毒效价(pfu/ml)。

实施例10.2利用Sourthern印迹法确认病毒DNA的结构

使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,Netherlands)，按照制造商的方案从纯化的病毒中提取病毒DNA，然后，使用Kpn I进行限制性内切酶处理。使用0.6％琼脂糖凝胶，于35V的电压电泳16小时后，将病毒DNA转印至尼龙膜(Turbo Blotter,Whatman,US)。探针使用碱性磷酸酶标记sVEGFR1及VEGFscFv的DNA片段而各自制作(AlkPhos Direct with CDP-Star,GE Healthcare,USA)，与转印了DNA的膜进行杂交，使用AlkPhos Direct with CDP-Star(GE Healthcare,USA)检测。

实施例10.3 T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的VEGF阻遏因子蛋白质表达确认(体外)

在使T-sVEGFR1感染细胞时，表达可溶型VEGFR1蛋白质的确认使用了HumansVEGF-R1/FLT-1ELISA Kit(BioVendor,USA)，在使T-VEGFscFv感染时，表达单链抗VEGF抗体的确认使用了Human Kappa ELISA Kit(Bethyl Laboratories,USA)。

将Vero细胞以成为3×10⁵个细胞/孔的方式接种于6孔板，在37℃、5％CO₂条件下培养。16小时后，用添加有1％IFBS的PBS洗涤，T-01、使T-sVEGFR1或T-VEGFscFv以感染复数(MOI)0.5感染，在37℃、5％CO₂条件下培养。Mock(阴性对照)加入了添加有1％IFBS的PBS代替病毒液。1小时后，除去病毒液，加入添加有1％IFBS的DMEM，在37℃、5％CO₂条件下培养。48小时后，回收培养上清液，按照制造商的方案，利用ELISA法进行测定。

实施例10.4血管内皮细胞管腔形成试验(体外)

血管内皮细胞管腔形成试验使用BD BioCoat^TM Angiogenesis System-Endothelial Cell Tube Formation(BD Bioscience,USA)实施。将Vero以1×10⁷个细胞接种于T-150培养瓶，在37℃、5％CO₂条件下培养。16小时后，使T-01、T-sVEGFR1或T-VEGFscFv以MOI 0.2感染，在37℃、5％CO₂条件下培养。90分钟后，除去病毒液，加入DMEM(无血清)，在37℃、5％CO₂条件下培养。2天后，回收培养上清液，以成为50μg/ml的方式加入人免疫球蛋白，使病毒失活。将回收的上清液使用Amicon(R)Ultra-15 10K(Merck Millipore,Ireland)进行超滤，浓缩40倍。将HUVEC以成为2×10⁴个细胞/孔的方式接种于包被有Matrigel Matrix的96孔板的每1个孔。向其中加入浓缩的培养上清液2.5μl和47.5μl添加有1％LSGS的Medium 200，在37℃、5％CO₂条件下培养。需要说明的是，作为阳性对照，向各孔添加50μl如下配制的物质：将作为抗VEGF人源化单克隆抗体的贝伐单抗(中外制药，东京)以成为4μg/ml的方式添加至添加有1％LSGS的Medium 200中。另外，作为阴性对照，仅将添加有1％LSGS的Medium 200加入50μl。18小时后，使用BIOREVO(KEYENCE，大阪)拍摄各孔，然后使用Image J软件测定管腔的长度，算出长度的总和，进行比较。

实施例10.5血管内皮细胞迁移试验(体外)

血管内皮细胞迁移试验使用BD BioCoat^TM Angiogenesis System-EndothelialCell Migration(BD Bioscience,USA)实施。将Vero以1×10⁷个细胞接种于T-150培养瓶，在37℃、5％CO₂条件下培养。16小时后，使T-01、T-sVEGFR1或T-VEGFscFv以MOI 0.2感染，在37℃、5％CO₂条件下培养。90分钟后，除去病毒液，加入DMEM(无血清)，在37℃、5％CO₂条件下培养。2天后，回收培养上清液，以成为50μg/ml的方式加入人免疫球蛋白，使病毒失活。将回收的培养上清液使用Amicon(R)Ultra-15 10K超滤，浓缩40倍。在上部腔室中，以成为1×10⁵个细胞/孔的方式接种HUVEC。另外，在下部的24孔板中，每1孔添加19μl浓缩的培养上清液和731μl添加有1％LSGS的Medium 200。需要说明的是，作为阳性对照，向各孔添加750μl如下配制的物质：将贝伐单抗以成为4μg/ml的方式添加至添加有1％LSGS的Medium 200中。另外，作为阴性对照，仅将添加有1％LSGS的Medium 200加入750μl。在37℃、5％CO₂条件下培养22小时后使用钙黄绿素AM溶液将HUVEC荧光染色。使用BIOREVO(KEYENCE，大阪)拍摄各孔，然后以494/517nm测定荧光强度，对通过上部腔室的膜而迁移至下部孔的HUVEC进行评价。

实施例10.6病毒复制试验(体外)

将HT-29以成为4×10⁵个细胞/孔的方式接种于6孔板，在添加有10％FBS的McCoy’s 5A(改良)、37℃、5％CO₂条件下培养。16小时后，使用添加有1％IFBS的PBS洗涤，使T-01、T-sVEGFR1或T-VEGFscFv以MOI 0.01感染，在37℃、5％CO₂条件下培养。1小时后，除去病毒液，加入添加有1％IFBS的McCoy’s 5A(改良)，在37℃、5％CO₂条件下培养。24小时及48小时后，用细胞刮刀刮取细胞，测定与上清液一同回收的病毒的效价。

实施例10.7病毒的细胞杀伤效果的研究(体外)

将HT-29以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，在37℃、5％CO₂条件下培养。16小时后，使用添加有1％IFBS的PBS洗涤，使T-01、T-sVEGFR1或T-VEGFscFv以MOI 0.1及0.01感染，在37℃、5％CO₂条件下培养。Mock添加了添加有1％IFBS的PBS代替病毒液。1小时后，除去病毒液，加入添加有1％IFBS的McCoy’s 5A(改良)，在34.5℃、5％CO₂条件下培养。感染后，在4天内，每24小时后各自使用库尔特计数器(Beckman Coulter,CA,USA)测定存活细胞，算出相对于Mock而言的细胞数量的比例。

实施例10.8HT-29细胞株及CT26细胞株的VEGF表达量的研究(体外)

将HT-29或CT26以成为3×10⁵个细胞/孔的方式接种于6孔板，在37℃、5％CO₂条件下，HT-29在添加有1％IFBS的McCoy’s 5A(改良)中培养，CT26在添加有1％IFBS的RPMI1640中培养。48小时后，回收培养上清液，HT-29使用Human VEGF Quantikine ELISA Kit(R&DSystems,USA)，CT26使用Mouse VEGF Quantikine ELISA Kit(R&D Systems,USA)，对上清液中的VEGF进行定量。

实施例10.9针对HT-29皮下肿瘤模型的抗肿瘤效果的研究

向BALB/c nu/nu(5周龄、雌性、SLC公司、静冈)腹腔内施予甲苯噻嗪和氯胺酮，施以全身麻醉，向小鼠的左侧腹部皮下施予每1只为1×10⁶个细胞/50μl McCoy’s 5A(改良)(无血清)的HT-29。将肿瘤直径达到5mm的14天后作为第0天，将小鼠随机地分成4组，向肿瘤内以每1个肿瘤为1×10⁶pfu/20μl施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv或Mock。需要说明的是，病毒的稀释使用了添加有10％的甘油的PBS。另外，Mock作为阴性对照，使用了在不使病毒感染Vero的情况下施以同样的培养及纯化步骤制得的产物。另外，在自第一次病毒施予起3天后的第3天也同样地施予病毒。皮下肿瘤以每周2次的频率测定长径、短径、厚度，以肿瘤体积(mm³)＝长径×短径×厚度的形式算出。

实施例10.10 HT-29皮下肿瘤模型的CD31免疫组织化学染色

向BALB/c nu/nu(5周龄、雌性、SLC公司、静冈)施以全身麻醉，向小鼠的左侧腹部皮下施予每1只为1×10⁶个细胞/50μl McCoy’s 5A(改良)(无血清)的HT-29。将14天后作为第0天，将小鼠随机地分成4组，向肿瘤内以每1只为1×10⁶pfu/20μl施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv或Mock。在第3天也同样地施予病毒。在第3天(第2次病毒施予前)和第7天通过颈椎脱臼使小鼠安乐死，切出皮下肿瘤组织，用甲醛固定。24小时后，将固定的组织用PBS洗涤，石蜡包埋。将厚度4μm的石蜡切片在98℃的200倍稀释ImmunoSaver(日新EM株式会社，东京)中处理45分钟，实施抗原的赋活。在2％正常山羊血清/TBS中进行封闭后，作为一抗，将兔抗CD31抗体(abcam,UK)用2％BSA/TBS稀释50倍，与组织切片反应1小时，使EnVision+System-HRP Labeled Polymer Anti-Rbbit(Dako,Denmark)反应30分钟，使用DABSubstrate kit(Vector laboratories,Burlingame,CA)检测抗体。关于肿瘤血管生成，基于肿瘤内的微小血管密度进行评价。微小血管密度按照Weidner N等的论文(19)，设为组织切片的显微镜(×20)下每1个视野的微小血管的平均数，使用Nanozoomer(HAMAMATSU,静冈)，对组织切片随机地拍摄10处，对计数CD31阳性细胞的结果取平均值而算出。

实施例10.11利用实时定量链式聚合酶反应(PCR)的病毒DNA的定量

向BALB/c nu/nu(5周龄、雌性、SLC公司、静冈)施以全身麻醉，向小鼠的左侧腹部皮下施予每1只为1×10⁶个细胞/50μl McCoy’s 5A(改良)(无血清)的HT-29细胞。将14天后作为第0天，将小鼠随机地分成4组，向肿瘤内以每1只为1×10⁶pfu/20μl施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv或Mock。在第3天通过颈椎脱臼使小鼠安乐死，切出皮下肿瘤，于-80℃冷冻保存。后日解冻，加入PBS均质化，使用QIAamp DNA Mini Kit，按照制造商的方案提取病毒DNA。用于检测HSV-1的DNA的引物及探针使用了以下的针对HSV-1的编码DNA聚合酶的基因的区域设计的引物及探针。

HSV DNApoly-F：5’-GGCACGCGGCAGTACTTT-3’(序列号27)

HSV DNApoly-R：5’-CCATGCGCTCGCAGAGA-3’(序列号28)

HSV DNApoly-T：5’-AGGTCGACAGGCACCTACAATGCCG-3’TAMRA(报告色素：FAM)(序列号29)

另外，实时定量PCR使用了TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2×)(Applied Biosystems,USA)。对于病毒的基因组拷贝数的定量而言，制作含有HSV-1的编码DNA polymerase的基因的序列的质粒，制作该DNA的稀释系列，制作标准曲线，基于此进行测定。

实施例10.12针对CT26皮下肿瘤模型的抗肿瘤效果的研究

向BALB/c(5周龄、雌性、SLC公司、静冈)腹腔内施予甲苯噻嗪和氯胺酮，施以全身麻醉，向小鼠的左侧腹部皮下施予每1只为1×10⁵个细胞/50μl RPMI1640(无血清)的来源于BALB/c的CT26。将肿瘤直径达到5mm的10天后作为第0天，将小鼠随机地分成4组，向肿瘤内以每1只为1×10⁶pfu/20μl施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。另外，在自第一次病毒施予起3天后的第3天也同样地施予病毒。皮下肿瘤以每周2次的频率测定长径、短径、厚度，以肿瘤体积(mm³)＝长径×短径×厚度的形式算出。

C.统计分析

对于统计分析而言，关于2组间的检验，只要没有特别说明，则使用Excel统计(Microsoft)实施学生t检验，关于多组间的检验，使用SPSS Statistics version 22(IBM)利用Sidak法实施多重检验。使用了MRI的肿胀的评价实验中考虑针对同一个体的反复测定，实施重复方差分析，针对存在交互作用的情况利用Sidak法实施多重检验。关于脑内肿瘤模型的存活时间，使用JMP12(SAS Institute)，通过Kaplan Meier法绘制累积存活率曲线，检验实施了Logrank检验或Wilcoxon检验。p值小于0.05时，在组间存在显著性差异。

D.结果

结果I T-BV的制作

结果Ia抗VEGF抗体表达cDNA的制作(实施例1.1的结果)

用于制作抗VEGF抗体表达型的溶瘤病毒的氨基酸序列设计如图4及图5所示。作为本实施例中使用的抗VEGF抗体，贝伐单抗是如下制作的抗体：用165个残基的人VEGF(VEGF₁₆₅)对小鼠进行免疫，从得到的杂交瘤细胞株中筛选出小鼠抗人VEGF单克隆抗体muMAb A4.6.1产生株，关于其抗体基因，将与抗原特异性相关的互补性决定区(CDR)保持原样，将框架区(FR)人源化，由此制作人源化抗人VEGF单克隆抗体。为了从cDNA高效地产生抗体，重链和轻链必须各自以等量表达，因此，在氨基酸序列设计中，采用了将与重链、轻链各自对应的多肽用FMDV-2A序列及弗林蛋白酶切割位点的氨基酸序列结合的方法(图4、图1)。

基于氨基酸序列制作的抗人VEGF抗体表达基因的cDNA及VEGF scFv表达基因的cDNA的序列信息分别示于图9及10。

结果Ib目标基因向SV-01的插入和来自cDNA的表达蛋白的确认(实施例1.2、实施 例1.3、实施例6.1的结果)

从担载有制作的cDNA的质粒pEX-K-BV中通过限制性内切酶处理切出目标cDNA，插入至SV-01而得到BV/SV-01。然后，出于确认来自目标cDNA的蛋白表达的目的，将BV/SV-01转染至HEK293T细胞，针对得到的培养上清液中所含的蛋白，实施Western印迹法。一般而言，针对抗体的使用Western印迹法的分析中，联用SDS-PAGE、和非变性PAGE这二种电泳。SDS-PAGE中，将蛋白质还原、切断二硫键后进行电泳，但该过程中由于切割将抗体的重链之间、及重链与轻链连接的二硫键，因此可检测到相当于重链(50kDa)、轻链(25kDa)的2条条带。另一方面，非变性PAGE中，以蛋白质未变性的状态进行电泳，因此，能在保持高级结构的情况下进行泳动，仅检测到相当于四聚体(150kDa)的1条条带。本实施例中也通过实施这2种PAGE对来自制作的cDNA的蛋白表达进行了分析。

SDS-PAGE中，转染了作为阴性对照的SV-01的检体中，未检测出条带，与之相对，转染了BV/SV-01的检体及作为阳性对照的阿瓦斯汀(注册商标)中，检测到相当于分子量25kDa和50kDa的2条条带(图11A)。非变性PAGE中，转染了SV-01的检体中，未确认到检测出条带，与之相对，转染了BV/SV-01的检体及阿瓦斯汀(注册商标)中，检测到相当于分子量150kDa的1条条带(图11B)。上述结果显示，本实验中用于基因重组的、来自抗人VEGF抗体表达基因的表达蛋白作为双链抗体并无矛盾。

结果Ic目标基因向G47Δ的插入和病毒纯化(实施例1.4～1.7的结果)

接下来，向T-BAC插入BV/SV-01。SV-01及T-BAC在内部包含loxP位点，通过Cre重组制作BV/SV-01/T-BAC。实施了用于确认该阶段的结构的PCR。在采集的全部10个克隆中确认到BV/SV-01的插入，在其中1个克隆中确认到双重插入。从通过该PCR确认了单一插入的克隆中选择2个克隆，将各自的DNA用HindIII或者KpnI进行限制性内切酶处理，确认电泳图谱。用HindIII处理的DNA中，插入了BV/SV-01时，由于增加了抗人VEGF抗体表达基因的2,261bp，被HindIII切割的位点增加2处，因此14,986bp的条带消失，出现13,151bp、7,958bp、6,233bp的各条带。用KpnI处理的DNA中，仅在插入了BV/SV-01时，由于增加了抗人VEGF抗体表达基因的2,261bp，被KpnI切割的位点增加5处，因此预期3,853bp的条带消失，出现9,010bp、5,122bp、175bp、1,040bp、677bp、728bp的条带，实际上得到了与预期一致的电泳图谱。根据以上的结果，确认到这2个克隆与预期一致地发生了重组，因此，接下来，与FLP重组酶表达质粒pOG44混合，共转染至Vero细胞，除去BAC序列。BAC在内部包含GFP表达基因，因此，使用荧光显微镜确认GFP的表达消失，从而确认BAC的除去。回收病毒，利用极限稀释法提取单一克隆。

结果Id T-BV的结构确认(实施例2的结果)

关于作为最终生成产物的T-BV，使用从病毒提取的DNA，利用Southern印迹法确认结构。探针使用了相当于插入的抗人VEGF抗体表达基因的DNA探针(BV探针)、相当于LacZ基因区域的探针(LacZ探针)。用BV探针进行杂交时，与预期一致，在T-01中未检测到条带，而在T-BV中检测到13,151bp的条带。用LacZ探针进行杂交时，代替T-01中检测到的10,890bp的条带，在T-BV中检测到13,515bp的条带，确认到在与预期一致的位点处插入了抗人VEGF抗体表达基因。

通过以上的步骤，确认到制作了作为目标的T-BV。

结果II T-BV的表达抗体的评价

结果IIa T-BV表达抗体的定量(实施例6.2的结果)

首先，为了对体外的T-BV的抗体表达量进行定量，使用Vero细胞及U87MG细胞的病毒感染细胞培养上清液，实施了针对抗人VEGF抗体的ELISA。关于Vero细胞、U87MG细胞，T-01及mock的培养上清液中均为检测限以下，与之相对，从使T-BV感染而得到的培养上清液中分别检测到256pg/mL、69pg/mL的抗VEGF抗体(图12)。

接下来，对体内的T-BV的抗体表达量进行定量。针对在BALB/cnu/nu小鼠的左侧腹部皮下制作的U87MG皮下肿瘤，以各组9只随机地分成T-01组、T-BV组、mock组后，向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu的病毒。在PID2、4、6从每组各3只中摘出皮下肿瘤，通过ELISA对其中所含的抗人VEGF抗体进行定量。关于T-BV组、T-01组、mock组中的各组，在PID2分别为186.2pg/mL、44.0pg/mL、38.8pg/mL，在PID4分别为93.4pg/mL、19.6pg/mL、41.4pg/mL，在PID6分别为137.8pg/mL、44.1pg/mL、55.7pg/mL(图13)。使用了皮下肿瘤的ELISA中，所使用的组织悬浮液的蛋白浓度高，因此在mock及T-01中可见非特异性反应，但T-BV组中，在任一时间点，测定值均显著高于mock及T-01，显示出抗人VEGF抗体在体内的表达。

结果IIb T-BV表达抗体的功能确认(实施例7的结果)

为了调查T-BV所表达的蛋白的VEGF阻遏作用，实施了血管内皮细胞管腔形成试验及血管内皮细胞迁移试验。

血管内皮细胞管腔形成试验是利用VEGF等血管生成刺激因子可在均匀包被于板内的Matrigel基底膜基质内诱导血管内皮细胞形成管(tube)这一现象，通过对形成的管的长度进行定量而用于筛选血管生成刺激因子的实验方法。本实施例中，管腔的长度的总和(μm)按n.c.、mock、p.c.1、p.c.2、T-01、T-BV的顺序依次为817、26,558、16,408、1,117、24,267、7,358，T-BV与T-01相比显著抑制了管腔形成(p＝0.002)(图14)。

血管内皮细胞迁移试验是下述实验方法：利用血管内皮细胞趋向VEGF等血管生成刺激因子迁移的现象，在用均匀地包被有人纤连蛋白的膜划分出的2个隔室之中，向一方加入VEGF等血管刺激因子，向另一方加入血管内皮细胞，对通过膜的小孔并由于血管刺激因子的刺激而迁移的血管内皮细胞进行定量，从而可用于血管生成刺激因子的筛选。本实施例中，相对于n.c.而言的荧光强度按mock、p.c.1、p.c.2、T-01、T-BV的顺序依次为2.76、2.63、0.62、2.85、1.77，T-BV与T-01相比显著抑制了HUVEC-2的迁移(p＝0.001)(图15)。

上述的实验结果显示，T-BV的表达抗体具有VEGF阻遏作用。

结果IIc T-BV表达抗体的种间交叉性的研究(实施例8的结果)

一般而言，VEGF具有种间交叉性，与之相对，作为抗人VEGF抗体的贝伐单抗与人VEGF的特异性高、且几乎不与小鼠VEGF反应是已知的(Yu,L.,等，(2008).Investigativeophthalmology&visual science 49,522-527)。使用了如本实施例这样移植了人脑瘤细胞株的小鼠模型的情况下，在肿瘤局部可预期人·小鼠两者的VEGF的作用。因此，可以认为，预先确认T-BV所表达的抗体与人及小鼠VEGF的结合性在讨论T-BV的效果的机理方面是重要的。因此，针对T-BV所表达的抗体与人·小鼠各自VEGF的结合性，使用ELISA实施了评价实验。

抗小鼠VEGF抗体与小鼠VEGF、人VEGF这两者结合，与之相对，T-BV所表达的抗体不与小鼠VEGF结合，而仅与人VEGF结合，显示出与阿瓦斯汀(注册商标)同样的结果(图16)。由此可以认为，T-BV表达的抗人VEGF抗体与阿瓦斯汀(注册商标)同样地具有针对人VEGF的高种特异性。

结果III T-BV的作为病毒的评价

结果IIIa体外的T-BV的细胞杀伤效果的研究(实施例4的结果)

为了确认通过基因重组而插入有目标基因的T-BV是否在体外具有与T-01相比同等的细胞杀伤效果，针对U87MG细胞进行了体外细胞毒性分析。另外，为了确认针对胶质瘤干细胞(其对化学疗法和放射治疗均具有抵抗性，被认为是胶质母细胞瘤治疗困难的重要因素)的细胞杀伤效果，一并实施了使用TGS-01细胞、TGS-04细胞的体外细胞毒性分析。

对于U87MG细胞而言，T-01及T-BV以MOI 0.01感染4天后的细胞存活率(与mock组的活细胞数量的比率)分别为60.9％、67.9％，在MOI 0.1的情况下分别为20.8％、19.6％，显示同等高水平的细胞杀伤效果(分别为p＝0.18、p＝0.15)。

对于TGS-01细胞而言，T-01及T-BV在MOI 0.01的情况下分别为25.6％、43.6％，在MOI 0.1的情况下分别为4.1％、6.6％，在MOI 1的情况下分别为2.0％、1.8％(分别为p<0.01、p＝0.10、p＝0.84)。

对于TGS-04细胞而言，T-01及T-BV在MOI 0.01的情况下分别为12.5％、25.8％，在MOI 0.1的情况下分别为5.4％、7.1％，在MOI 1的情况下分别为6.1％、5.5％(分别为p＝0.08、p<0.05、p＝0.33)。

T-BV在任一种细胞株中，与T-01相比均呈现几乎形状相同的图，显示出同等的细胞杀伤效果(图17)。

结果IIIb体外的T-BV的复制能力研究(实施例5的结果)

接下来，实施了Vero细胞及U87MG细胞中的T-01、T-BV的病毒复制试验。Vero细胞中，24小时后分别为9.71×10⁴pfu/mL、1.22×10⁵pfu/mL，48小时后分别为1.32×10⁶pfu/mL、1.24×10⁶pfu/mL(各p＝0.06、0.43)。U87MG细胞中，24小时后分别为6.02×10³pfu/mL、7.81×10³pfu/mL，48小时后分别为2×10⁵pfu/mL、2.16×10⁵pfu/mL(各p＝0.29、0.53)。可以认为，任一种细胞中，T-BV均具有与T-01几乎是同等的复制能力(图18)。这一点在发挥充分的细胞杀伤效果及蛋白表达所实现的功能的方面是重要的，考虑到病毒在复制过程中破坏肿瘤细胞、伴随复制而从治疗基因表达目标蛋白。

结果IV体内的T-BV的抗肿瘤效果的研究

结果IVa U87MG皮下肿瘤模型中的T-BV的抗肿瘤效果的研究(实施例9.1.1的结 果)

制作U87MG皮下肿瘤模型，在肿瘤直径增大至6mm的时间点，以每组各10只随机地分成T-01、T-BV、及mock这3个组，在第0天和第3天这2次肿瘤内施予2×10⁵pfu的病毒。使用Excel统计(Microsoft)利用独立t检验进行比较，结果，在病毒施予后第20天的时间点，T-01组中确认到相对于mock而言显著的肿瘤增大抑制效果(p＝0.00749)，并且对于T-BV而言，观察到较之T-01而言显著的肿瘤增大抑制效果(p＝0.0211)(图19)。

结果IVb U87MG脑内肿瘤模型中的T-BV的抗肿瘤效果的研究(实施例9.1.2的结 果)

使用了U87MG脑内肿瘤模型进行抗肿瘤效果的研究。针对脑瘤模型，在第10天以每组各10只随机地分成T-01、T-BV、及mock这3个组，向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu的病毒。T-01施予组及T-BV施予组观察到较之mock组而言显著的存活时间的延长(均为p<0.01)。T-BV可见存活时间与T-01相比延长的趋势(p＝0.163)(图20)。

以上的结果显示，较之T-01而言，T-BV具有更高的体内的抗肿瘤效果。

结果IVc TGS-01及TGS-04脑内肿瘤模型中的T-BV的抗肿瘤效果的研究(实施例 9.1.2的结果)

使用了作为胶质瘤干细胞的TGS-01及TGS-04的脑内肿瘤模型以较少的细胞数量形成显示向对侧浸润的图像、边界不清晰的肿瘤，呈现接近实际临床中的胶质母细胞瘤的病理图像。另外，胶质瘤干细胞对放射治疗、化学疗法显示抵抗性，也是胶质瘤呈难治性的重要原因。因此，为了研究针对胶质瘤干细胞的体内效果，制作TGS-01及TGS-04的脑内肿瘤模型，实施以每组各10只分组、向肿瘤内单次施予2×10⁶pfu的T-01、T-BV或mock的治疗实验。关于TGS-01脑内肿瘤模型，T-BV、T-01均确认到存活时间较之mock而言显著延长(均为p<0.01)，并且，确认到T-BV的存活时间与T-01相比显著延长(p＝0.0475)。关于TGS-04模型，与mock相比，未观察到T-01中存活延长，但在T-BV中观察到存活时间的显著延长(p＝0.0495)(图21)。

由此表明，较之T-01而言，T-BV针对胶质瘤干细胞在体内具有更高抗肿瘤效果。

结果V T-BV的肿胀抑制效果的研究

针对U87MG脑内肿瘤模型，使用小动物用MRI，评价在施予T-BV时，与施予T-01的情况相比在T2WI中的高信号区产生了怎样的变化。

另外，报道了AQP4与脑水肿发生具有强相关性，因此，确定了一并利用RT-qPCR对小鼠AQP4的表达量进行定量来验证T-BV的肿胀抑制效果的方针。

结果Va利用MRI的肿胀的定量

MRI中，富含血管的肿瘤由于施予顺磁性造影剂导致纵向弛豫时间缩短，因此在T1WI中得到增强而被作为高信号区绘出。另一方面，水肿等含有自由水的组织由于横向弛豫时间长，因此在T2WI中被作为高信号区绘出。针对胶质母细胞瘤的病毒疗法的临床试验中，肿瘤在T1WI(CE)中被作为高信号区绘出，病毒施予后发生的水肿在T2WI中被作为高信号区绘出。因此，本实施例中，在向脑内肿瘤模型的肿瘤内施予病毒后经时性地拍摄MRI，测量T1WI(CE)、T2WI中的肿瘤周围的高信号区，由此对T-BV的肿胀抑制效果进行研究。

结果Vb动物模型的研究

针对U87MG、U251MG、NMC-G1、TGS-01、1123/M各细胞株，使用定位脑手术装置向BALB/c nu/nu小鼠的右额叶内移植细胞，经时性地拍摄MRI，使用了最容易利用MRI描绘肿瘤的U87MG(图22)。需要说明的是，U251MG、NMC-G1中肿胀形成速度慢，难以得到U87MG、TGS-01、1123/M肿瘤的稳定的造影增强。

结果Vc U87MG脑内肿瘤模型中的病毒施予后的MRI评价(实施例9.2.1的结果)

针对U87MG脑内肿瘤模型，在肿瘤移植后第11天拍摄MRI，确认肿瘤的大小、形状后，以每组各6只随机地分成T-01、T-BV、T+A及mock组。在第12天向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu，在PID2、4、6拍摄MRI。基于图像测量面积，基于前述的计算式算出面积比。关于该面积比，在PID2-4-6的过程中，T-01组中以1.32-1.32-1.20推移，与之相对，T-BV组及T+A组中，分别以1.12-1.06-1.04、1.01-1.01-1.04推移，较之T-01组而言，T-BV组、T+A组中呈显著较低的结果(各p＝0.015、0.002)(图23)。该结果显示，通过施予T-BV或对T-01追加阿瓦斯汀(注册商标)全身施予，脑肿胀得以减轻。

结果Vd利用RT-qPCR的病毒施予后的AQP4的定量(实施例9.2.2的结果)

AQP是在1992年发现的、选择性地使水分子透过的膜蛋白。哺乳类中报道了AQP0至AQP12这13种。就结构而言，大多为由300个以下氨基酸构成6次跨膜型膜蛋白，其特征在于，在两处存在被称为NPA盒的天冬酰胺(N)-脯氨酸(P)-丙氨酸(A)这一保守性高的部分。该部分疏水性高，在不跨膜的情况下折叠至膜内而形成水分子的通过孔。已报道了有多种AQP(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9、AQP11、AQP12)在脑中表达，其中，AQP4在脑中的表达量远远多于其他器官，基于其分布，可以认为与血脑屏障中的水的移动等相关。另外，AQP4被报道与脑水肿的发生存在强相关，在脑水肿的初期阶段与其发生相关的可能性高。因此，出于对病毒施予后的肿胀变化进行定量的目的，使用病毒施予后的U87MG脑内肿瘤模型的右额叶，利用与小鼠AQP4相关的RT-qPCR进行定量。

针对U87MG脑内肿瘤模型，设定T-01、T-BV、T+A、mock组，在PID6摘出右额叶并提取RNA，使用逆转录酶制作cDNA，使用针对小鼠AQP及小鼠β肌动蛋白的Taqman引物实施定量PCR。较之mock组而言，T-01组中AQP4表达显著上升(p<0.001)，较之T-01组而言，T-BV组及T+A组中AQP4表达显著降低(p<0.001)(图25)。根据该结果可以认为，通过施予T-BV或将T-01与阿瓦斯汀(注册商标)全身施予联用，可减轻脑的肿胀。

MRI及针对AQP4的RT-qPCR的结果显示，关于针对脑瘤的病毒施予后的肿胀，T-BV具有与阿瓦斯汀(注册商标)的全身施予同等的肿胀抑制作用。

结果VI T-BV及T-V_HV_L的肿胀抑制效果的比较研究(实施例9.2.3的结果)

针对U87MG脑内肿瘤模型，施予1×10⁶pfu的T-01、T-BV、T-V_HV_L或mock，然后经时性地拍摄MRI(图25)。较之T-01而言，T-BV中在PID4观察到肿胀的显著的减少(p＝0.039)。另外，T-V_HV_L中也观察到抑制肿胀的趋势(p＝0.397)(图26)。

结果VIII病毒施予后的针对肿瘤环境的影响

已报道了抗VEGF抗体除了血管生成抑制效果以外对免疫也有作用(Roland,C.L.等，(2009)PloS one 4,e7669,(2009))。因此，使用施予了各种病毒的U87MG脑内肿瘤模型，基于免疫组织化学染色进行血管生成·巨噬细胞的评价。

结果VIIIa免疫组织化学染色(实施例9.3.1的结果)

针对U87MG脑内肿瘤模型，施予T-01、T-BV、T+A或mock，在PID2、4摘出大脑后，制作石蜡切片，进行基于免疫组织化学染色的研究。为了将由病毒施予导致的变化作为评价对象，在通过HSV-1染色确认了病毒对肿瘤的感染的基础上，作为血管生成的评价实施了小鼠CD31染色，作为浸润巨噬细胞的评价实施了小鼠F4/80染色。

关于小鼠CD31染色，mock组中，血管的形状、分布均是均匀的，与之相对，病毒施予组中，血管径粗，呈不均匀的分布。对于血管密度而言，虽然与mock相比病毒施予组中有更高的趋势，但未确认到病毒施予组之间的显著性差异及趋势。另外，T-V_HV_L中也同样地未确认到明显的血管生成的抑制。

浸润巨噬细胞的评价中，mock组中虽然可确认巨噬细胞向肿瘤的浸润，但整体为稀疏且均匀的分布，与之相对，病毒施予组中得到以病毒感染部作为中心密集地集簇的病理图像，在病毒组之间未确认到明显区别。

结果VIIIb流式细胞术(实施例9.3.2的结果)

使用了U87MG脑内肿瘤模型的免疫组织化学染色中，病毒施予组中得到了巨噬细胞以病毒感染部作为中心而集簇的病理图像，因此，利用流式细胞术进行定量。巨噬细胞大致分成M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞被细菌感染、病毒感染等诱导，发挥强的抗菌或者抗病毒活性、抗肿瘤效果。另一方面，M2巨噬细胞具有组织修复、血管生成、肿瘤增殖的促进、免疫抑制的功能。可以认为，由于与肿瘤的进展相伴的各种细胞因子的影响，浸润至肿瘤组织的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage(TAM))从M1转变为M2。因此，在向肿瘤施予病毒时，为了确认TAM如何变化、该变化根据施予的病毒而具有何种区别，使用针对U87MG脑内肿瘤的PID2、4、6的右额叶，实施流式细胞术。代表性的散点图示于图27。mock组中得到了在任何时间点M2均一致位于优势的现象，与之相对，在任一病毒施予组中，在PID2成为M1位于优势的状态。然后，T-01组中，在PID6从M1位于优势的状态接近M2位于优势的原本的状态，与之相对，T-BV组及T+A组中，在PID6仍然保持M1与M2的比例几乎相等的状态，与mock组相比，M1位于优势的状态得以持续(图28-1)。

如上所述，M1巨噬细胞具有抗病毒活性，因此，调查了M1位于优势的状态得以持续对病毒效价造成的影响。关于T-01、T-BV及T+A组，在PID1、PID3及PID7中的任一天均未观察到病毒效价的显著差异(图28-2)。上述结果显示，抗人VEGF抗体的表达不会对病毒效价造成不良影响，通过使巨噬细胞成为M1位于优势，能够向HSV-1赋予抗肿瘤活性。

基于以往的与M1巨噬细胞相关的研究结果，如在本实验中所确认的，维持M1位于优势的状态可以认为是T-BV的高水平的抗肿瘤效果的原因之一。M1巨噬细胞具有吞噬(吞噬作用)活性，因此，可以认为，可能是M1位于优势使得病毒效价降低，而令人意外的是，未发现对于病毒复制的消极性作用，T-BV的高水平的抗肿瘤效果并未伴随对于病毒效价的影响。

结果X体内的T-BV的抗体表达的确认(实施例9.4的结果)

对在将功能附加型病毒施予至生物体时表达的蛋白的分布进行确认这在研究安全性的方面是重要的。因此，在体内将T-BV施予至脑内肿瘤时，对表达的抗人VEGF抗体的来自血中的检测量进行了评价。

针对在BALB/c nu/nu小鼠的右额叶处制作的U87MG脑内肿瘤，以每组6只随机地分成T-01组、T-BV组、T+A组及mock组后，向肿瘤内单次施予1×10⁶pfu的病毒。在PID1、PID3对每组各3只施以静脉采血，通过ELISA对分离的血清中的抗人VEGF抗体进行定量。仅在向腹腔内单次施予了阿瓦斯汀(注册商标)的T+A组中，在PID1、PID3分别检测到114.5ng/mL、106.9ng/mL的抗VEGF抗体，而以T-BV组为代表，其他组中均为检测限以下(图29)。

结果XI T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的评价结果(实施例10的结果)

(1)利用Sourthern印迹法确认T-sVEGFR1、T-VEGFscFv(VH-VL)及T-VEGFscFv(VH-VLCL)的病毒基因组结构

首先，在使用T-sVEGFR1、T-VEGFscFv(VH-VL)及T-VEGFscFv(VH-VLCL)进行实验时，为了确认VEGF阻遏因子的基因是否正确地组入到各病毒DNA中，从纯化的各病毒提取DNA，实施Sourthern印迹。VEGFscFv(VH-VL)探针中，在T-VEGFscFv(VH-VL)及T-VEGFscFv(VH-VLCL)中分别检测到5543bp及5868bp的DNA片段，确认到VEGFscFv(VH-VL)及VEGFscFv(VH-VLCL)的基因的插入(未图示)。另一方面，使用了sVEGFR1探针的Sourthern印迹中，在T-sVEGFR1中检测到6798bp的DNA片段，确认到sVEGFR1的基因的插入(未图示)。由以上可确认，T-sVEGFR1、T-VEGFscFv(VH-VL)及T-VEGFscFv(VH-VLCL)在G47Δ的基本骨架的ICP6缺失位点处正确地插入了VEGF阻遏因子的基因。

(2)T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的VEGF阻遏因子蛋白表达确认(体外)

使T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染细胞时，为了分别确认sVEGFR1及VEGFscFv蛋白是否被分泌至培养上清液中，利用ELISA法进行测定。结果，T-sVEGFR1感染组中以1.66±0.30ng/ml的浓度检测到sVEGFR1(图30A)，T-VEGFscFv感染组中，以87.30±7.99ng/ml的浓度检测到VEGFscFv蛋白(图30B)。

(3)T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的抗VEGF功能的研究(体外)

由于确认了T-sVEGFR1及T-VEGFscFv分别表达VEGF阻遏因子，因此，为了研究它们实际上是否具有抗VEGF功能，实施了血管内皮细胞管腔形成试验及血管内皮细胞迁移试验，与T-01进行比较评价。

a.血管内皮细胞管腔形成试验

为了研究T-sVEGFR1及T-VEGFscFv对于作为血管内皮细胞的HUVEC的管腔形成造成的效果，进行了血管内皮细胞管腔形成试验。将病毒的培养上清液和HUVEC在MatrigelMatrix中共培养，根据22小时后的HUVEC的管腔的长度的总和就病毒培养上清液对管腔形成带来的影响进行比较。结果，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染组中，较之T-01感染组而言，管腔形成得到显著抑制(图31)。

b.血管内皮细胞迁移试验

然后，为了研究T-sVEGFR1及T-VEGFscFv对于HUVEC的迁移造成的效果，进行了血管内皮细胞迁移试验。将病毒的培养上清液和HUVEC共培养，16小时后，将迁移的HUVEC进行荧光染色，然后测定荧光强度，就病毒培养上清液对HUVEC的迁移带来的影响进行比较。结果，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv感染组中，较之T-01感染组而言，迁移被显著抑制(图32)。

由上述实验结果显示，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv在体外具有抗VEGF功能。

(4)病毒复制试验(体外)

已知在病毒中插入基因时，病毒复制能力可能减弱。因此，为了研究T-sVEGFR1及T-VEGFscFv是否具有与T-01同等的复制能力，使用HT-29实施了体外病毒复制分析。对复制的病毒的效价分别进行测定，结果，在24小时后，T-01为感染的病毒量的6.43±0.47倍的病毒效价，T-sVEGFR1为9.94±2.95倍的病毒效价，T-VEGFscFv为16.07±11.28倍的病毒效价。另外，在48小时后，T-01为51.79±3.09倍，T-sVEGFR1为69.04±8.25倍，T-VEGFscFv为88.10±41.70倍(图33)。

以上显示，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv在体外具有与T-01几乎同等的复制能力。

(5)病毒的细胞杀伤效果的研究(体外)

为了研究T-sVEGFR1及T-VEGFscFv是否具有与T-01同等的细胞杀伤效果，使用HT-29进行了体外细胞毒性分析。结果，对于4天后的细胞存活率而言，在MOI 0.1的情况下，T-01感染组中为4.1±0.25％，T-sVEGFR1感染组中为3.9±2.34％，T-VEGFscFv感染组中为8.4±0.78％。另外，在MOI 0.01的情况下，T-01感染组中为38±7.65％，T-sVEGFR1感染组中为43±0.71％，T-VEGFscFv感染组中为49±6.68％(图34)。

以上显示，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv在体外具有与T-01几乎是同等的细胞杀伤效果。

(6)HT-29细胞株及CT26细胞株的VEGF表达量的研究(体外)

接下来，在将表达VEGF阻遏因子的T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的体内的抗肿瘤效果与T-01进行比较研究时，为了确认用于体内的实验的HT-29及CT26是否分泌VEGF蛋白，实施了ELISA。

测定HT-29或CT26的培养上清液中的VEGF蛋白质量，结果，检测到VEGF蛋白(人VEGF:709.5±129.0[pg/ml]、小鼠VEGF:682.7±3.3[pg/ml])，确认了HT-29及CT26是产生VEGF蛋白的细胞株。由此，可以认为这些细胞株适于T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的在体内的抗肿瘤效果研究。

(7)T-sVEGFR1及T-VEGFscFv针对HT-29皮下肿瘤模型的抗肿瘤效果的研究

为了研究T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的体内的抗肿瘤效果，使用确认到产生VEGF的HT-29制作裸小鼠皮下肿瘤模型，观察治疗效果。

向裸小鼠的左侧腹部皮下施予HT-29而制作皮下肿瘤，在作为肿瘤直径达到5mm的14天后的第0天、及其3天后的第3天向皮下肿瘤内施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。

在第32天，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组中，较之T-01而言，可见显著更强的抗肿瘤效果(图35)。需要说明的是，T-sVEGFR1施予组和T-VEGFscFv施予组中，抗肿瘤效果为相同程度。

该结果显示，HT-29皮下肿瘤模型中，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv具有较之T-01而言显著更强的抗肿瘤效果。

(8)利用HT-29皮下肿瘤模型的CD31免疫组织化学染色的肿瘤内血管生成的研究

HT-29皮下肿瘤模型中，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv显示出显著高于T-01的抗肿瘤效果。因此，为了阐明T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的抗肿瘤效果增强的作用机制，对病毒针对肿瘤内血管生成的效果进行了研究。

在研究肿瘤内血管时，向裸小鼠的左侧腹部皮下施予HT-29而制作皮下肿瘤，将肿瘤直径达到5mm的14天后作为第0天，在第0天及第3天向皮下肿瘤内施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。在第3天(第2次病毒施予前)和第7天采集皮下肿瘤组织，甲醛固定后，制作石蜡切片，实施针对血管内皮细胞标记CD31的免疫组织化学染色(图10A)。

对施以免疫染色后的组织切片中的微小血管进行计数，求出肿瘤内微小血管密度。结果，在第3天，在显微镜下(×20)的计数为：Mock感染组为52.3±9.2count，T-01感染组为31.6±5.9count，T-sVEGFR1感染组为13.7±5.8count，T-VEGFscFv感染组为11.8±4.9count。另外，在第7天，Mock感染组为48.0±7.0count，T-01感染组为36.4±11.1count，T-sVEGFR1感染组为11.3±1.7count，T-VEGFscFv感染组为11.0±3.8count。在第3天及第7天，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组中，肿瘤内微小血管均较之T-01施予组而言显著减少(图36)。

由此表明，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv具有肿瘤内血管生成抑制功能，可以认为，该肿瘤血管生成抑制功能是这两种病毒与T-01相比抗肿瘤效果增强的作用机制之一。

(9)利用实时定量PCR的病毒DNA的定量

CD31免疫染色的结果所反映的T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的肿瘤内血管生成抑制功能被认为是这两种病毒与T-01相比抗肿瘤效果增强的作用机制之一。但是，VEGF被报道不仅促进血管生成，还具有促进巨噬细胞等VEGF受体阳性免疫活性细胞的迁移的功能。另外，另一方面，存在巨噬细胞吞噬治疗用病毒从而使治疗用病毒的复制效率降低的报道。还报道了为克服由该巨噬细胞的吞噬作用导致的治疗用病毒的复制效率降低，将作为抗VEGF抗体的贝伐单抗与治疗用HSV联用时，巨噬细胞的肿瘤内浸润减少，病毒的复制效率提高，从而抗肿瘤效果增强。

因此，认为作为T-sVEGFR1及T-VEGFscFv与T-01相比抗肿瘤效果增强的作用机制之一，也可以考虑抑制巨噬细胞的肿瘤内浸润所带来的病毒的感染效率的提高。首先，为了对HT-29皮下肿瘤模型中的病毒的感染效率进行研究，向裸小鼠的左侧腹部皮下施予HT-29而制作皮下肿瘤，将肿瘤直径达到5mm的14天后作为第0天，在第0天向皮下肿瘤内施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。在第3天采集皮下肿瘤并提取DNA，以HSV-1的编码DNA聚合酶的基因作为靶标实施实时PCR，对肿瘤内病毒DNA进行定量。

在病毒施予3天后从肿瘤提取DNA，实施实时PCR，结果，在T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组均检测到与T-01施予组几乎是同等的病毒DNA量。需要说明的是，Mock施予组中，未检测到病毒DNA。

由此可以认为，在T-sVEGFR1及T-VEGFscFv与T-01之间，病毒DNA的复制效率没有显著性差异，其不是抗肿瘤效果增强的主要因素。

(10)T-sVEGFR1及T-VEGFscFv针对CT26皮下肿瘤模型的抗肿瘤效果的研究

根据实时PCR的结果，病毒的复制效率不是在HT-29皮下肿瘤模型中T-sVEGFR1及T-VEGFscFv与T-01相比抗肿瘤效果增强的重要因素。并且，研究了除了前述的肿瘤血管生成阻遏功能以外是否存在T-sVEGFR1及T-VEGFscFv的抗肿瘤效果增强的重要因素。因此，为了调查T-sVEGFR1及T-VEGFscFv对抗肿瘤免疫带来的影响，使用免疫功能正常的BALB/c小鼠和已确认产生VEGF的来源于BALB/c的大肠癌细胞株CT26进行了实验。首先，调查了T-sVEGFR1及T-VEGFscFv针对CT26皮下肿瘤的抗肿瘤效果。向BALB/c的左侧腹部皮下施予CT26而制作皮下肿瘤，将肿瘤直径达到5mm的10天后作为第0天，在第0天及第3天向皮下肿瘤内施予T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及Mock。

测定肿瘤体积，继续观察，结果，在自最初的病毒施予起28天后的第28天，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv施予组中，可见较之T-01施予组而言显著更强的抗肿瘤效果(图37)。

该结果显示，与裸小鼠中的研究同样地，在免疫正常小鼠中，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv仍然具有与T-01相比显著更高的抗肿瘤效果。另外，在第28天，T-sVEGFR1施予组中，7只中的4只的肿瘤消失，T-VEGFscFv施予组中，7只中的6只的肿瘤消失等，存在显示出比裸小鼠中的研究更高的治疗效果的趋势。可以认为，T-sVEGFR1及T-VEGFscFv比T-01更高效地诱导了抗肿瘤免疫，其结果是，有可能提高抗肿瘤效果。

E.讨论

(1)抗VEGF抗体表达溶瘤病毒的制作

溶瘤病毒在肿瘤内于每次复制时在肿瘤局部表达蛋白，因此，与非增殖型病毒载体相比，蛋白表达量明显更多，另一方面，由于蛋白表达止于局部，因此较之全身施予而言，可减轻副作用的风险。如结果X中所示，阿瓦斯汀(注册商标)的腹腔内施予的联用中从血清中以高浓度检测到贝伐单抗，与之相对，T-BV施予中仅从肿瘤局部检测到表达抗体，血清中为检测限以下。

作为抗VEGF，将导入了单链抗体的溶瘤病毒与导入了双链抗体的溶瘤病毒进行比较的情况下，任一种病毒均抑制了肿胀的发生。为导入双链抗体的病毒时，双链抗体由于存在Fc部分而使半衰期延长，更可期待抗体依赖性的免疫反应。

(2)病毒施予后的肿胀发生的机理

虽然不限于我们所知的与在针对肿瘤的病毒疗法中观察到的肿胀相关的报道，针对胶质母细胞瘤的G47Δ的临床试验中，肿胀是在病毒施予后的MRI(T2WI)中作为肿瘤周围的高信号区而屡屡可见的现象。

本实施例中的使用了MRI的病毒施予后的脑的肿胀的评价中，T-BV及阿瓦斯汀(注册商标)的联用示出肿胀抑制效果，T-V_HV_L中示出肿胀抑制趋势，由此表明VEGF与伴随病毒施予的脑的肿胀相关(图22、25)。另外，针对U87MG脑内肿瘤模型的病毒施予后的MRI(T2WI)中观察到肿瘤周围的高信号区的个体中，通过免疫组织化学染色确认到HSV-1感染和血管生成。由此可以认为，通过病毒施予产生的T2WI中的肿瘤周围的高信号区在病毒已感染肿瘤细胞时出现。另外，由于高信号区的出现被抗VEGF抗体的作用抑制，因此可以认为，VEGF与肿胀的发生相关。

产业上的可利用性

根据本发明，能够在不招致肿胀的情况下实施利用溶瘤病毒的肿瘤治疗，在医疗领域中具有产业上的可利用性。

本申请基于2018年3月30日提出申请的日本专利申请第2018-068847号主张优先权，其内容作为参考而并入本文。

[序列表自由文本]

序列号1：用于表达图4中记载的抗人VEGF抗体的氨基酸序列整体

序列号2：图4的V_H链(氨基酸序列)

序列号3：图4的C_H链(氨基酸序列)

序列号4：图4的V_L链(氨基酸序列)

序列号5：图4的C_L链(氨基酸序列)

序列号6：图4的Ig kappa前导序列(氨基酸序列)

序列号7：图4的信号肽酶识别序列(氨基酸序列)

序列号8：图4的弗林蛋白酶识别序列(氨基酸序列)

序列号9：图4的FMDV-2A序列(氨基酸序列)

序列号11：图5的GS接头

序列号10：用于表达图5中记载的抗VEGFscFv的氨基酸序列整体

序列号12：图5的GS接头之中的1个单元

序列号13：图9的抗人VEGF抗体表达基因cDNA

序列号14：图9的V_H的cDNA

序列号15：图9的C_H的cDNA

序列号16：图9的V_L的cDNA

序列号17：图9的C_L的cDNA

序列号18：图9的Ig kappa前导序列(cDNA)

序列号19：图9的信号肽酶识别序列(cDNA)

序列号20：图9的弗林蛋白酶识别序列(cDNA)

序列号21：图9的FMDV-2A序列(cDNA)

序列号22：图10的抗VEGFscFv表达基因cDNA

序列号23：图10的Gs linker(cDNA)

序列号24：图8的T-VEGFsc(V_HV_LC_L)的cDNA

序列号25：图8的CL的cDNA

序列号26：图7的sVEGFR1的cDNA

序列号27：HSV DNApoly-F

序列号28：HSV DNApoly-R

序列号29：HSV DNApoly-T

序列号30：图4的V_H链+C_H链(氨基酸序列)

序列号31：图4的VL链+CL链(氨基酸序列)

Claims (11)

1.溶瘤病毒在肿胀发生抑制型的肿瘤治疗用医药组合物的制造中的用途，其中，所述溶瘤病毒为具有编码血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂的基因的单纯疱疹病毒，

所述肿瘤治疗用医药组合物被直接局部施予至肿瘤。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述肿瘤为脑瘤。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中，VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体或其片段。

4.如权利要求3所述的用途，其中，VEGF拮抗剂为包含V_H链及V_L链的抗VEGF抗体或单链抗VEGF抗体。

5.如权利要求3所述的用途，其中，所述溶瘤病毒具有：

编码以下的(i)～(iii)中任一者的多肽的基因，

(i)序列号2的多肽；

(ii)包含在序列号2的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(iii)与序列号2的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽；及

编码以下的(iv)～(vi)中任一者的多肽的基因，

(iv)序列号4的多肽；

(v)包含在序列号4的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(vi)与序列号4的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽。

6.如权利要求3所述的用途，其中，抗VEGF抗体为人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。

7.如权利要求1或2所述的用途，其中，VEGF拮抗剂为可溶性VEGF受体。

8.如权利要求7所述的用途，其中，溶瘤病毒具有编码以下的(xiii)～(xv)中任一者的多肽的基因，

(xiii)由序列号26的碱基序列编码的多肽；

(xiv)包含在由序列号26的碱基序列编码的多肽中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且具有VEGF结合能力的多肽；

(xv)与由序列号26的碱基序列编码的多肽具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性、且具有VEGF结合能力的多肽。

9.如权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，溶瘤病毒为选自单纯疱疹病毒I型及II型(HSV-1及HSV-2)中的病毒的突变体。

10.如权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，溶瘤病毒为单纯疱疹病毒I型突变体，且具有(a)～(c)中的任意一者以上的特征：

(a)ICP6基因缺失或失活、或者在肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子的控制下表达；

(b)γ34.5基因缺失或失活；

(c)ICP47基因缺失或失活。

11.如权利要求1～10中任一项所述的用途，其中，肿瘤治疗用医药组合物与选自化学疗法及放射线疗法中的其他肿瘤治疗方法联用。