WO2024038857A1 - 単純ヘルペスウイルスベクターを含む医薬組成物 - Google Patents

単純ヘルペスウイルスベクターを含む医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2024038857A1
WO2024038857A1 PCT/JP2023/029503 JP2023029503W WO2024038857A1 WO 2024038857 A1 WO2024038857 A1 WO 2024038857A1 JP 2023029503 W JP2023029503 W JP 2023029503W WO 2024038857 A1 WO2024038857 A1 WO 2024038857A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
virus
sequence
cancer
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/029503
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
具紀 藤堂
Original Assignee
具紀 藤堂
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 具紀 藤堂 filed Critical 具紀 藤堂
Publication of WO2024038857A1 publication Critical patent/WO2024038857A1/ja

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/763Herpes virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • A61K39/215Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08RNA viruses
    • C07K14/165Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • C12N15/869Herpesviral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to herpes simplex virus vectors.
  • the herpes simplex virus vector according to the present invention can be used as a vaccine.
  • mRNA vaccines and viral vector vaccines are vaccines that administer part of the genetic information of a virus to the human body, and have a different mechanism from conventional vaccines that administer part of the protein of a virus. It is attracting attention as
  • HSV-1 Herpes simplex virus type 1
  • HSV-1 is one of the viruses used in viral therapy for cancer, and is a genetically modified virus that introduces artificial genetic modifications to the virus genome to improve safety and therapeutic efficacy.
  • Oncolytic viruses have been developed (Patent Documents 1 to 4, Non-Patent Documents 1 to 5).
  • Patent No. 4212897 Patent No. 4921669 WO2011/101912 WO2019/189643
  • Viruses used for gene transfer as vaccines are: 1) able to insert large foreign genes into the viral genome; 2) the introduced foreign genes function as an epigenome without being integrated into the human genome; and 3) express one foreign gene.
  • By mixing multiple types of viruses it is possible to achieve the same effect as expressing multiple types of foreign genes, and 4) the same expression effect can be achieved even after repeated administration without being inhibited by immunity against the virus itself. It is desirable to be able to demonstrate this every time.
  • the present inventor has been proceeding with the clinical development of a third-generation herpesvirus G47 ⁇ for cancer treatment in which three viral genes have been modified in HSV-1.
  • We have now completed the present invention by incorporating cDNA encoding the spike of the new coronavirus into this G47 ⁇ and discovering that it can be effectively used as a vaccine virus.
  • the present invention provides the following.
  • a pharmaceutical composition for inducing an immune response (a) ICP6 gene is deleted or inactivated (b) ⁇ 34.5 gene is deleted or inactivated (c) ⁇ 47 gene is deleted or inactivated
  • Herpes simplex virus The pharmaceutical composition according to 1, wherein the vector has all the characteristics of (a) to (c).
  • the pharmaceutical composition according to any one of 1 to 3 which is for producing a foreign polypeptide in non-cancerous cells.
  • the pharmaceutical composition according to any one of 1 to 4 which is a subcutaneous or intramuscular injection.
  • the pharmaceutical composition according to any one of 1 to 5, wherein the foreign polypeptide contains all or part of a protein derived from a pathogen.
  • the pharmaceutical composition according to any one of 1 to 6, wherein the foreign polypeptide comprises all or part of the spike protein derived from SARS-CoV-2.
  • the present invention provides the following. [8] Introducing a foreign polypeptide into non-cancerous cells containing a herpes simplex virus vector containing a region encoding a foreign polypeptide and having two or more characteristics selected from (a) to (c) below.
  • a pharmaceutical composition for producing a peptide (a) ICP6 gene is deleted or inactivated (b) ⁇ 34.5 gene is deleted or inactivated (c) ⁇ 47 gene is deleted or inactivated (9)
  • Herpes simplex virus 9 The pharmaceutical composition according to 8, wherein the vector has all the characteristics of (a) to (c).
  • the pharmaceutical composition according to any one of 8 to 10 which is for producing a foreign polypeptide and inducing an immune response thereto.
  • the pharmaceutical composition according to any one of 8 to 11 which is a subcutaneous or intramuscular injection.
  • the pharmaceutical composition according to any one of 8 to 12 wherein the foreign polypeptide contains all or part of a protein derived from a pathogen.
  • the pharmaceutical composition according to any one of 8 to 13, wherein the foreign polypeptide comprises all or part of the spike protein derived from SARS-CoV-2.
  • a method for producing and inducing an immune response against a foreign polypeptide the method comprising administering to a subject.
  • it For use in a method for producing a foreign polypeptide and inducing an immune response thereto, it contains a region encoding a foreign polypeptide and has two or more characteristics selected from the following (a) to (c).
  • a herpes simplex virus vector containing a region encoding a foreign polypeptide and having two or more characteristics selected from the following (a) to (c) produces a foreign polypeptide and induces an immune response against it.
  • Use in the manufacture of a composition for. (a) ICP6 gene is deleted or inactivated (b) ⁇ 34.5 gene is deleted or inactivated (c) ⁇ 47 gene is deleted or inactivated [16]
  • Herpes simplex virus 16 The method, vector or composition comprising the same, or use according to 15, wherein the vector has all the characteristics of (a) to (c). [17] The method, vector, composition containing the same, or use according to 15 or 16, wherein the region encoding the foreign polypeptide is inserted into the IPC6 gene deletion site.
  • a method of producing a foreign polypeptide in a non-cancerous cell comprising administering to a subject.
  • a herpes simplex virus vector containing a region encoding a foreign polypeptide and having two or more characteristics selected from the following (a) to (c) produces the foreign polypeptide in non-cancerous cells.
  • Use in the manufacture of a composition for. (a) ICP6 gene is deleted or inactivated (b) ⁇ 34.5 gene is deleted or inactivated (c) ⁇ 47 gene is deleted or inactivated
  • Herpes simplex virus 23 The method, vector or composition comprising the same, or use according to 22, wherein the vector has all the characteristics of (a) to (c).
  • a relatively large cDNA encoding a full-length spike protein or the like can be incorporated into the viral vector of the present invention.
  • the immune response to eliminate the virus may promote vaccine efficacy.
  • the virus-derived protein may act as an adjuvant.
  • the viral vector vaccine provided by the present invention may not be attenuated in vaccine efficacy depending on the presence of anti-herpesvirus antibodies in the blood, and therefore repeated administration may be effective.
  • the virus vector of the present invention which uses herpes simplex virus (HSV) as its backbone, has an established technology for inserting any cDNA easily and accurately, and therefore vaccines against new viruses can be produced relatively quickly.
  • the viral vector vaccine provided by the present invention has established methods for mass production and purification at high titers, and is suitable for clinical application.
  • A T-Cov2SSP
  • B T-Cov2SSPF
  • C T-Cov2STH
  • D T-Cov2S1Fc
  • mock T-01: 1/100 dilution.
  • Residual amount of virus in muscle after 8 weeks Pathological image after 8 weeks.
  • HE staining and immunostaining were performed using anti-HSV-1 antibody (green), anti-CD8 antibody (brown), and anti-CD4 antibody (red). The results of a representative 1x10 7 pfu administration are shown. Change in body weight of vaccinated mice Changes in the expression level of anti-Cov2spike protein antibodies Changes in the expression level of Cov2-spike protein.
  • IHC was performed using HE staining and anti-HSV-1 antibody (green), anti-CD8 antibody (brown), and anti-CD4 antibody (red). Many CD8 and CD4 positive cells were observed, probably due to inflammation at the injection site. Almost no HSV-1 positivity was observed. Images of muscles administered with each virus (day 5, 1x10 6 pfu administered). IHC was performed using HE staining and anti-HSV-1 antibody (green), anti-CD8 antibody (brown), and anti-CD4 antibody (red). Many CD8 and CD4 positive cells were observed. Almost no HSV-1 positivity was observed. Time course of viral DNA content in muscle. The amount of virus in the muscle at the injection site remained almost the same from week 1 to week 4, with a trace number of copies.
  • herpes simplex virus In this embodiment, a herpes simplex virus (HSV) containing a region encoding a foreign polypeptide is used.
  • HSV herpes simplex virus
  • viruses When viruses are used as tools to transfer genetic material into nucleic acids, they are sometimes referred to as viral vectors. Viruses that have been genetically manipulated are sometimes called mutant or genetically modified viruses.
  • Herpes simplex virus is classified into the genus Simplevirus, family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae. Two viruses have been isolated so far: type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2). In this embodiment, HSV-1 is preferably used.
  • HSV-1 is enveloped and mature particles are 100-150 nm in size. There is a tegument inside the envelope, and a capsid inside the tegument, and the viral DNA exists inside the capsid.
  • the genome is double-stranded DNA.
  • HSV-1 is known to have the following characteristics. Regarding this, please refer to Attachment 2. (Reference 1). 1) It is capable of infecting all types of human cells. 2) The life cycle and genome sequence of the virus have been elucidated. 3) The functions of most of the viral genes are known, and they can be genetically manipulated. 4) Since the virus genome size is large (approximately 152 kb), large size genes and multiple genes can be integrated.
  • HSV-1 has the following advantages that make it suitable for clinical applications. 5) Antiviral drugs exist that suppress proliferation 6) Vaccine efficacy may not be attenuated depending on the presence of anti-HSV-1 antibodies in the blood, and repeated administration is possible 7) Susceptibility to HSV-1 Because mice and monkeys exist, preclinical evaluation of safety and efficacy can be done in animals. 8) Viral DNA is not incorporated into the genome of host cells and exists outside the chromosome. 9) Large-scale production and purification methods are not available. established
  • HSV-1 genome consists of two unique sequence regions: 82% long unique region ( UL ) and 12% short unique region (Us), and terminal repeat (TR) and inverted repeat (TR) located at both ends of each region.
  • IR Table 1, Todo, T. (2008). a journal and virtual library 13, 2060-2064. Since the two regions L and S can each independently take two orientations, HSV-1 genomic DNA consists of four isomers. This genome has a total of 84 genes in RL1 and RL2 on TR L , U L 1 to U L 56 on U L , R S 1 on TR S , and U S 1 to U S 12 on US. The genes are encoded in a unidirectional manner, and about half of these genes are unnecessary for virus replication. By deleting these non-essential gene parts, pathogenicity can be attenuated or genes can be introduced (Carson, J. et al. (2010). Drugs of the future 35, 183-195).
  • the virus used in this embodiment is an HSV-1 mutant, it may have any one or more of the following characteristics.
  • ⁇ By inactivating enzymes involved in viral DNA synthesis such as thymidine kinase (TK), ribonucleotide reductase (RR), uracil-N-glycosylase (UNG or UDG), etc.
  • loss of viral replication capacity in non-cancerous cells - Deletion of virus replication ability in non-cancerous cells by deleting gene ⁇ 34.5, which encodes ICP34.5, a protein involved in the pathogenesis of HSV-1.
  • genes to prevent reversion to wild type and increase safety e.g., endogenous ⁇ 34.5 gene, ⁇ 47 gene, ⁇ 0 gene (ICP0 gene), U L 41 gene (vhs gene) ), deletion or inactivation of the U L 56 gene).
  • - Enhancement of immunity and prolongation of survival by expressing immune stimulating genes IL-4, IL-10, GM-CSF, IL-12, soluble B7.1, etc.
  • the virus used is an HSV-1 mutant that preferably has at least one, more preferably two or more, and even more preferably all of the following characteristics selected from (a) to (c).
  • the ICP6 gene is deleted or inactivated.
  • the ⁇ 34.5 gene is deleted or inactivated.
  • ⁇ 47 gene is deleted or inactivated.
  • ICP6 a large subunit of RR, which is an important enzyme for nucleotide metabolism in non-dividing cells and viral DNA synthesis, and/or phosphorus produced during viral infection.
  • ⁇ 34.5 which antagonizes the function of oxidized PKR
  • the virus becomes unable to proliferate in normal cells.
  • the protein encoded by the ⁇ 47 gene has the effect of escaping from host immune surveillance by inhibiting TAP and suppressing the expression of MHC class I on the host cell surface. Deleted HSV-1 is expected to stimulate immune cells more strongly by maintaining MHC class I expression in host cells.
  • the deletion of ⁇ 47 simultaneously deletes the US11 late promoter whose genome overlaps with ⁇ 47, so the expression of the US11 gene is ⁇ 47 immediate-
  • the expression timing is accelerated, and it has the effect of restoring the virus replication ability, which has been attenuated by ⁇ 34.5 deletion, only in tumor cells.
  • deletion or inactivation of a gene refers to deletion or inactivation of the gene through deletion of all or part of the gene, substitution of some bases, modification, insertion of unnecessary sequences, etc. It means to suppress the expression.
  • Gene deletion or inactivation can be performed by known methods.
  • the HSV containing deletion or inactivation of the ⁇ 34.5 gene, ICP6 gene and/or ⁇ 47 gene described in (a) to (c) above includes deletion of both copies of the ⁇ 34.5 gene, and the ICP6 gene.
  • Examples include G207, which has an inactivated gene, G47 ⁇ , which has two copies of the ⁇ 34.5 gene deleted, the ICP6 gene inactivated, and the ⁇ 47 gene deleted. Therefore, the virus used in this embodiment can also be produced by further modifying G207 or G47 ⁇ .
  • the virus used has G47 ⁇ as its basic skeleton.
  • G47 ⁇ is known as a restricted propagation type recombinant HSV-1 that expresses the E. coli lacZ gene and has the ⁇ 34.5 gene, ICP6 gene ( UL39 gene), and ⁇ 47 gene (ICP47 gene) deleted or inactivated. It is being Due to its wide therapeutic range, it is possible to safely administer high doses into the human brain. , product name: Approved as Deritact Note).
  • G47 ⁇ was produced from G207 derived from a wild-type virus (HSV-1 F strain) (Todo, T. et al. (2001). Proc Natl Acad Sci USA 98: 6396-6401).
  • a region encoding a foreign polypeptide described below be inserted into the site where the IPC6 gene is deleted or inactivated.
  • a certain region encodes a polypeptide it refers to the case where the base sequence of that region encodes the amino acid sequence of the polypeptide, and the case where the complementary sequence of the base sequence of that region encodes the polypeptide. This includes cases where the amino acid sequence is coded for.
  • a virus having the above feature (a) and having a feature in which a region encoding a foreign polypeptide is inserted into the site where the IPC6 gene is deleted or inactivated means that the virus has, for example, A sequence that has high identity with the base sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing except for Location 5349..9170, and a sequence encoding an immunogenic polypeptide or its complementary sequence in place of Location 5349..9170. It means to have an inserted sequence.
  • SEQ ID NO: 5 and FIG. 14 show the LacZ-fused T-Cov2 spike (A) gene insertion site and the nucleotide sequences before and after it of the virus used in the experiment described in the Examples section.
  • the region encoding the foreign polypeptide, that is, the insertion site is Location 5349..9170 in SEQ ID NO: 5, and in Figure 14, from the doublet TCA to the doublet CAT (the doublet TCA is from beginning to end It is a complementary sequence of the codon, and the double line CAT is a complementary sequence of the start codon.).
  • a virus having the characteristic (b) above means, for example, that all or part of Location 88..834 is deleted, or some bases are substituted or modified in the base sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing. , which has a sequence in which an unnecessary sequence has been inserted, thereby suppressing the expression of the ⁇ 34.5 gene.
  • all or part of the base sequence in IRL corresponding to Location 88..834 of SEQ ID NO: 6 is deleted, or a sequence in which some bases are replaced, modified, or an unnecessary sequence is inserted. This means that the expression of the ⁇ 34.5 gene is suppressed.
  • a virus having the characteristic (b) above means, for example, that it has a sequence with high identity to the sequence obtained by removing Location 177..1128 from the base sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 6 and FIG. 15 show the ⁇ 34.5 gene of the strain from which G47 ⁇ is derived and the base sequences before and after it (inside the TR L region).
  • Location 88..834 is the coding region of the ⁇ 34.5 gene from the start codon to the stop codon, which is shown as shaded in FIG.
  • the deleted site in the basic skeleton of G47 ⁇ (nucleotide numbers 576 to 1527 of GU734771.1) is Location 177..1128 in SEQ ID NO: 6, and is the underlined portion in FIG. 15.
  • the above sequence of TR L and the complementary sequence around the coding region of the ⁇ 34.5 gene of IRL base numbers 124349 to 125798 of GU734771.1) are completely identical.
  • a virus having the characteristic (c) above means, for example, that in the base sequence of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, all or part of Location 218..484 is deleted, some bases are substituted or modified, It has a sequence in which an unnecessary sequence has been inserted, thereby suppressing the expression of the ⁇ 47 gene.
  • a virus having the characteristic (c) above means, for example, that it has a sequence that is highly identical to the base sequence of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, excluding Locations 230..540.
  • SEQ ID NO: 7 and FIG. 16 show the ⁇ 47 gene of the strain from which G47 ⁇ is derived and the nucleotide sequences before and after it.
  • the ⁇ 47 gene is encoded on the complementary strand side.
  • Location 218..484 from the start codon to the stop codon shown as shaded in FIG. 16, is the coding region of the ⁇ 34.5 gene.
  • the site sequence (nucleotide numbers 576 to 1527 of GU734771.1) that is deleted in the basic skeleton of G47 ⁇ is Location 177..1128 in the sequence of SEQ ID NO: 6, and is the underlined portion in FIG.
  • PCR gene amplification method
  • FA highly sensitive fluorescent antibody assay
  • the herpes simplex virus vector contains a region encoding a foreign polypeptide.
  • Foreign means originating from something other than herpes simplex virus.
  • the polypeptide encoded by the region contained in this embodiment can be produced by expression of the region in a subject to which the virus has been administered, and the size and type of the polypeptide can be particularly determined as long as it induces an immune response thereto. Not limited. Inducing an immune response means, unless otherwise specified, that at least one of antibody production and cellular immunity is induced in the administered subject.
  • the property of a polypeptide to induce antibody production or cell-mediated immunity is sometimes referred to as immunogenicity.
  • the polypeptide applied to this embodiment is all or part of a protein derived from a pathogen.
  • Pathogens can be viruses, bacteria, fungi, rickettsiae, parasites, prions.
  • Pathogen-derived includes not only polypeptides constituting pathogens themselves such as viruses and bacteria, but also toxin proteins produced by pathogens.
  • pathogens are: New coronavirus (SARS-CoV-2), influenza A virus, influenza B virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, Streptococcus pneumoniae, Clostridium diphtheria, Clostridium tetani, measles, mumps, rubella, rabies virus, yellow Staphylococcus, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Haemophilus influenzae B (HiB), poliovirus, hepatitis B virus, human papillomavirus (L1, L2, E6, E7), human immunodeficiency virus, Helicobacter pylori, yellow Staphylococcus, pertussis toxin, poliovirus, Staphylococcus aureus, Bordetella pertussis (toxin), poliovirus VP1-4, malaria parasite.
  • SARS-CoV-2 New coronavirus
  • influenza A virus influenza B virus
  • the polypeptide is derived from a cancer-causing pathogen.
  • Infection with certain pathogens is known to cause cancer.
  • liver cancer caused by hepatitis B and C viruses
  • cervical cancer penile cancer
  • vulvar cancer vaginal cancer
  • vaginal cancer anal cancer
  • oral cancer and pharynx cancer caused by human papillomavirus (HPV).
  • Cancer gastric cancer caused by Helicobacter pylori; Burkitt's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, and pharyngeal cancer caused by Epstein-Barr virus (EBV); adult T-cell leukemia-lymphoma caused by human T-cell leukemia virus type I (HTLV-1), etc.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus type I
  • the polypeptide can be a cancer antigen.
  • a cancer antigen refers to a protein, etc. that is expressed more highly in cancer cells than in normal cells, or that is specifically expressed in cancer cells.
  • the use of cancer-derived peptide epitopes, personalized cancer antigen parts, or cancer hotspot antigen parts to treat cancer and suppress cancer recurrence is being considered (e.g., WO2020/ 097291).
  • the foreign polypeptide of this embodiment may be relatively large in size. For example, it may be 500 amino acid residues long, 1000 amino acid residues long, or 1500 amino acid residues long. Because herpes simplex virus has a large genome size, it can incorporate regions encoding large polypeptides or regions encoding multiple polypeptides.
  • the site where the region encoding the foreign polypeptide is introduced is not particularly limited, and for example, the region encoding the foreign polypeptide can be introduced into a site where a non-essential gene of the virus has been deleted or inactivated.
  • the virus is HSV-1
  • the non-essential genes shown in Table 1 above can be deleted and a region encoding a foreign polypeptide can be introduced.
  • a region encoding a foreign polypeptide is inserted into the site where the IPC6 gene has been deleted or inactivated. Expression of the introduced region can be confirmed using known techniques, as shown in Examples below.
  • the G47 ⁇ -BAC system For insertion of a region encoding a foreign polypeptide into herpes simplex virus, for example, the G47 ⁇ -BAC system, T-BAC system, described in Non-Patent Documents 1 to 5, Patent Documents 1 to 4, and WO2005/103237, Or something similar to these can be used.
  • the T-BAC system is a modification of the G47 ⁇ -BAC system (non-patent document 4 cited above), and it produces HSV-1 that has a higher replication ability than the G47 ⁇ -BAC product and has the same replication ability as G47 ⁇ . can.
  • G47 ⁇ This is a technology for producing recombinant HSV-1 that facilitates the maintenance and amplification of the G47 ⁇ genome by inserting it into the ICP6 deletion site of the G47 ⁇ genome.
  • This T-BAC contains loxP and FRT sequences, and can be mixed with a shuttle vector plasmid that also has loxP and FRT sequences to utilize the two recombinase systems of Cre/loxP and FLP/FRT. Insertion of the foreign gene carried in the shuttle vector plasmid and excision of the BAC occur, making it possible to create recombinant HSV-1 in which the foreign gene is inserted into the basic skeleton of G47 ⁇ .
  • a region encoding a foreign polypeptide is introduced into a herpes simplex virus for production in non-cancerous cells.
  • Non-cancerous cells refer to cells that are not cancer cells. Those skilled in the art can appropriately determine whether or not the cells are non-cancerous. Production of the target polypeptide in non-cancerous cells and whether an immune response to it is induced is determined by HSV-1-sensitive mice such as A/J mice, DBA/2 mice, and BALB/c mice. It can be evaluated using experimental animals.
  • the foreign polypeptide is derived from the novel coronavirus (SARS-CoV-2). More specifically, the foreign polypeptide comprises the wild-type leader sequence from SARS-CoV-2, the full length spike, and a double proline (PP) mutation for conformational stabilization of the spike.
  • SARS-CoV-2 novel coronavirus
  • PP double proline
  • polypeptide is, for example, any one of the following polypeptides (i) to (iii): (i) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (ii) An amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, which corresponds to positions 986 and 987 of SEQ ID NO: 1.
  • the foreign polypeptide comprises the wild-type leader sequence from SARS-CoV-2, the full-length spike, a double proline (PP) mutation for conformational stabilization of the spike, and the host cell.
  • PP double proline
  • Such a polypeptide is, for example, any one of the following polypeptides (iv) to (vi): (iv) a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; (v) An amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and positions 683, 685, 986, and 987 of SEQ ID NO: 2 A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the amino acids corresponding to are A, A, P, and P in order, and is capable of inducing an immune response; (vi) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, in which the amino acids corresponding to positions 683, 685, 986, and 987 of SEQ ID NO: 2 are sequentially A, A, A polypeptide consisting of the amino acid sequence P and P, and capable of inducing an immune response.
  • deletion of an amino acid sequence recognized and cleaved by a certain enzyme means deletion of all or part of the amino acid sequence, substitution, modification, or unnecessary deletion of some amino acids. This refers to the insertion of a specific sequence into the enzyme that causes it to no longer be recognized or cleaved by the enzyme.
  • the foreign polypeptide is derived from SARS-CoV-2 and contains a mutation-containing leader sequence, only the spike extracellular domain (ECD), a PP mutation, a furin cleavage site deletion, a C Contains a trimerization domain at the end.
  • Such a polypeptide is, for example, any one of the following polypeptides (vii) to (ix): (vii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; (viii) In the amino acid sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the region excluding the region consisting of amino acids 1 to 20 and the region consisting of amino acids 1219 to 1256 of SEQ ID NO: 1 (i.e., the region consisting of amino acids 21 to 1218) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added (a portion consisting of), and is capable of inducing an immune response; (ix) Consists of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, excluding the region consisting of amino acids 1 to 20 and the region consisting of amino acids 1219 to 1256 (i.e., A polypeptide that can induce an immune response in the region consist
  • the foreign polypeptide comprises the wild-type leader sequence, spike subunit 1 (S1), from SARS-CoV-2, and comprises the Fc region of human IgG at the C-terminus.
  • a polypeptide is, for example, any one of the following polypeptides (x) to (xii): (x) a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; (xi) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and is capable of inducing an immune response; (xii) A polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and capable of inducing an immune response.
  • the amino acid may be a natural amino acid, or a derivative thereof, an artificial amino acid, or a non-natural amino acid.
  • the amino acids of this embodiment are preferably natural amino acids.
  • A is alanine
  • C is cysteine
  • D is aspartic acid
  • E is glutamic acid
  • F is phenylalanine
  • G is Glycine
  • I is isoleucine
  • K is lysine
  • L leucine
  • M methionine
  • N is asparagine
  • P proline
  • Q is glutamine
  • R arginine
  • S is serine
  • T threonine
  • U is selenocysteine.
  • V represents valine
  • W represents tryptophan
  • Y represents tyrosine.
  • any protein is not particularly limited as long as the protein consisting of the amino acid sequence has the desired function, but may be 1 to 250, 1 to 200, 1 to 150, or 1 to 100. 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 9, or 1 to 4, or by substitution with amino acids with similar properties. If so, there may be many more replacements.
  • Means for preparing polynucleotides or proteins according to such amino acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • identity with respect to base sequences (sometimes referred to as nucleotide sequences) or amino acid sequences refers to “identity” in any base sequence or amino acid sequence, unless otherwise specified. It refers to the percentage of identical nucleotides or amino acids shared between two sequences when the sequences are optimally aligned. That is, identity can be calculated as (number of matched positions/total number of positions) ⁇ 100, and can be calculated using a commercially available algorithm. Such algorithms have also been incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410.
  • searches and analyzes regarding the identity of base sequences or amino acid sequences can be performed using algorithms or programs (eg, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW) well known to those skilled in the art. Parameters when using a program can be appropriately set by those skilled in the art, and default parameters for each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art. Gene information processing software GENETIX (registered trademark) (Genetics Co., Ltd.) may be used to calculate identity. Note that if the target sequence for which % identity is to be determined has an additional sequence such as a tag sequence at the end that does not exist in the compared sequence, the additional sequence portion is not included in the calculation of % identity.
  • GENETIX registered trademark
  • nucleotide sequence or an amino acid sequence when referring to a nucleotide sequence or an amino acid sequence as having a high degree of identity, unless otherwise specified, in each case, at least 50%, for example 60% or more, 70% or more, preferably 70% or more. Sequence identity of 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 97.5% or more, and still more preferably 99% or more.
  • Polypeptides, proteins, polynucleotides, DNA, and genes used in the present invention and this embodiment can be produced by methods well known to those skilled in the art.
  • composition relates to a pharmaceutical composition containing a virus used as the vector of this embodiment described above.
  • the pharmaceutical composition may be used to produce a foreign polypeptide in non-cancerous cells, more preferably to induce an immune response against the foreign polypeptide in the administered subject. It can be used to induce cell-mediated immunity in a subject to produce antibodies against a foreign polypeptide.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is suitable for the treatment of the infectious disease caused by the pathogen, preferably for the prevention of the infectious disease. It can be used as a vaccine for
  • Infectious diseases include viral infections (e.g., novel coronavirus infection, influenza, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), adult T-cell leukemia, Ebola hemorrhagic fever, viral hepatitis, viral meningitis, yellow fever, and common cold).
  • viral infections e.g., novel coronavirus infection, influenza, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), adult T-cell leukemia, Ebola hemorrhagic fever, viral hepatitis, viral meningitis, yellow fever, and common cold).
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be used as a vaccine for the prevention of specific cancers.
  • Applicable cancers include liver cancer, cervical cancer, penile cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, anal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, stomach cancer, Burkitt lymphoma, Hodgkin lymphoma, Includes adult T-cell leukemia-lymphoma.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be used therapeutically, preferably as a prophylactic vaccine, for the treatment of a specific cancer. It can be used as a vaccine for the prevention of recurrence, as well as for prevention of recurrence.
  • Cancers that can be expected to be applied include, but are not limited to, the following.
  • treatment in relation to a disease or condition includes prevention, reduction of the risk of onset, treatment, suppression of progression, and prevention of recurrence, unless otherwise specified.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment contains an effective amount of a virus as an active ingredient.
  • an effective amount is an amount that, when administered to a subject, produces the polypeptide of interest in non-cancerous cells in the subject, and an amount that induces an immune response in the subject against the foreign polypeptide. and the amount by which antibodies against the foreign polypeptide are produced in a subject.
  • the specific dosage can be appropriately determined by those skilled in the art, depending on the severity of symptoms, the age, sex, body weight, sensitivity difference of the subject, administration method, administration timing, administration interval, nature of the preparation, strength of the promoter, etc. can.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may contain, for example, about 10 1 to about 10 12 plaque forming units (pfu), preferably about 10 7 to about 10 10 pfu, more preferably about 10 8 to about 5 ⁇ 10 9 pfu. , each can be administered once or in several divided doses by injection.
  • the number of administrations of the pharmaceutical composition of this embodiment can be appropriately set depending on the target patient and target disease. For example, an initial dose can be administered followed by a second dose 2 to 5 weeks later. Further, if necessary, the administration can be repeated every 1 to 8 months, from the third time onwards, as many times as necessary.
  • the method of administering the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, and examples include intravenous, intraarterial, intraventricular, intraperitoneal, intrathoracic, intraspinal, subcutaneous, intradermal, intraepidermal, intramuscular, and on mucosal surfaces. (eg, ocular, intranasal, pulmonary, oral, intestinal, rectal, vaginal, urinary tract surfaces).
  • the pharmaceutical composition is a vaccine for the prevention of infectious diseases, it is preferably administered by subcutaneous or intramuscular injection. If the pharmaceutical composition is a vaccine for the prevention of cancer, it may be administered by subcutaneous or intramuscular injection.
  • the pharmaceutical composition when the pharmaceutical composition is for the treatment of cancer, it can be administered directly to the cancer (intratumoral administration). By intratumoral administration, high efficacy can be expected with a smaller dose.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be formulated by a known formulation method.
  • it may contain an adjuvant or any carrier, or it may simply be diluted with a physiologically acceptable solution such as sterile saline or sterile buffered saline without the addition of an adjuvant or carrier.
  • a physiologically acceptable solution such as sterile saline or sterile buffered saline without the addition of an adjuvant or carrier.
  • It may also be a frozen preparation, a dried preparation, a lyophilized preparation, etc. suitable for long-term storage.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may contain pharmaceutically acceptable additives.
  • additives include buffering agents, tonicity agents, preservatives, antioxidants, stabilizers, absorption enhancers, excipients, binders, lubricants, disintegrants, colorants, flavorings, Examples include emulsifiers, surfactants, solubilizing agents, suspending agents, and the like.
  • the pharmaceutical composition When in the form of a subcutaneous or intramuscular injection, the pharmaceutical composition contains, for example, in one vial (5 mL), in addition to the active ingredient, 6 mg of L-histidine, 2 mg of L-histidine hydrochloride hydrate, 10 mg of sodium chloride, It can be a formulation containing 1 mg of magnesium, 0.2 mg of sodium edetate hydrate, 375 mg of refined white sugar, 20 mg of absolute ethanol, and 805 mg of polysorbate.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can further contain other active ingredients, or can be used in combination with a pharmaceutical composition containing other active ingredients. Furthermore, the pharmaceutical composition of this embodiment can be used in combination with other therapies.
  • A is for T-Cov2SPP virus production and includes the wild-type leader sequence derived from SARS-CoV-2, the full length spike, and a double proline (PP) mutation to stabilize the spike conformation.
  • B is for T-Cov2SPP virus production, and in A, a deletion site (furin cleavage site) consisting of the amino acid sequence RRAR (SEQ ID NO: 8) that is recognized and cleaved by furin, a host cell protease, is added. Including losses.
  • C is for T-Cov2STH virus production, with mu-phosphatase leader sequence, spike extracellular domain (ECD) only, PP mutation, deletion of furin cleavage site, and trimerization domain at the C-terminus.
  • ECD spike extracellular domain
  • D is for T-Cov2S1Fc virus production and contains a wild-type leader sequence, spike subunit 1 (S1), and a human IgG Fc region at the C-terminus.
  • the structure of the virus used in the Examples is shown in Figure 1-2.
  • the virus has two deletions of ⁇ 34.5 present in TR L and IRL , inactivation by inserting the LacZ gene into ICP6 present in UL , and ⁇ 47 present in US and the US11 promoter region overlapping with it.
  • G47 ⁇ which has a deletion in , was used as the basic skeleton.
  • the T-BAC system described above was used for virus production.
  • the virus contains G47 ⁇ at the deletion site of the ICP6 gene in the basic skeleton, LacZ, polyA of SV40 (SV40 pA), the reverse cytomegalovirus promoter (PCMV), and four types A to D downstream of it. It was created by inserting one selected from the following (indicated as SARS-CoV-2 Spike in Figure 1-2) and BGH polyA (BGH pA).
  • virus T-01 in which only LacZ and PCMV were inserted without inserting a foreign gene into the deletion site of the IPC6 gene was used as a control.
  • the LacZ-fused T-Cov2 spike (A) gene insertion site used in the experiment and the nucleotide sequences before and after it are shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing and in FIG. 14. The characteristics of the array are shown below.
  • the dotted line (Location 1..226 of SEQ ID NO: 5) is the upstream sequence of the UL 39 gene coding region, which is reported to include the UL 39 gene promoter, and the underline (Location 227.. 1544) is the amino acid of the UL 39 gene.
  • the coding region (base number ⁇ 87656 of GU734771.1), after the wavy line (from Location 1545) is the inserted sequence, the wavy line is the sequence generated due to genetic recombination (Note 1: including the loxP sequence), and the broken line is the lacZ gene
  • the underlined line is the plasmid vector-derived sequence (Note 2: 3' sequence of lacZ derived from pcDNA6-E/Uni-lacZ), and the dotted line is the plasmid vector-derived sequence (Note 2: pVP22/Uni-lacZ-derived sequence).
  • TGA is the stop codon of the ICP6-lacZ fusion protein
  • the double wavy line is the SV40 polyA sequence derived from pVP22/myc-His2
  • the dashed-double line is pVP22/myc-His2
  • the dotted line is the sequence derived from the plasmid vector (SV40 polyA derived from pVP22/myc-His2 and the surrounding sequence of BGH polyA)
  • the underlined line is the amino acid coding region of the T-Cov2 spike protein (A).
  • the wavy line is the complementary sequence of the adapter sequence and FRT sequence used for genetic recombination, and the part after the dotted line (from base number 88551 of GU734771.1) is the 894bp deletion part (base number of GU734771.1).
  • E. coli ⁇ -galactosidase is expressed as a fusion protein with the N-terminus of ICP6.
  • the parts (9 places) where this sequence differs from GU734771.1 are indicated by ⁇ .
  • the ⁇ 34.5 gene of HSV-1 from which G47 ⁇ is derived and the base sequences before and after it (within the TR L region) are shown in SEQ ID NO: 6 of the sequence listing and FIG. 15.
  • the region from the start codon to the stop codon shown by the shaded area is the coding region of the ⁇ 34.5 gene (Location 88..834 of SEQ ID NO: 6).
  • the deleted site base numbers 576 to 1527 of GU734771.1 in the produced virus is underlined (Location 177..1128 of SEQ ID NO: 6).
  • the non-coding region on the 3' side of the ⁇ 34.5 gene is translated as a meaningless amino acid sequence up to the stop codon (double underlined) that occurs 130 bp downstream.
  • the above sequence of TR L (around the coding region of the ⁇ 34.5 gene; base numbers 400 to 1849 of GU734771.1) and the complementary sequence around the coding region of the ⁇ 34.5 gene of IRL (base numbers 124349 to 125798 of GU734771.1) ) is an exact match.
  • the deletion site of the ⁇ 34.5 gene in IRL is base number 124671 to 125622 (complementary sequence) of GU734771.1. There is no difference between this sequence and GU734771.1.
  • the ⁇ 47 gene of HSV-1 from which G47 ⁇ is derived and the nucleotide sequence before and after it are shown in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing and FIG. 16.
  • the characteristics of the array are shown below.
  • the ⁇ 47 gene is encoded on the complementary strand.
  • the area between the stop codon and the start codon shown in shaded areas is the coding region of the ⁇ 47 gene (Location 218..484 of SEQ ID NO: 7).
  • the deleted site in the produced virus is underlined (Location 230..540 of SEQ ID NO: 7).
  • the ⁇ 47 gene is deleted from the translation initiation site, and no new ORF is generated.
  • the sequence of this part is a gene that expresses the fused human IL-12 gene and E. coli lacZ gene and inactivates the ⁇ 34.5 gene, U L 39 gene, and ⁇ 47 gene approved on May 31, 2019.
  • Biodiversity impact assessment report for “Recombinant human herpes simplex virus type 1 (derived from strain F) (T-hIL12)” https://www.biodic.go.jp/bch/download/lmo/R1.5.31_iyaku_ap1. pdf), 3. Methods for preparing genetically modified organisms, etc., (2) Methods for transferring nucleic acids into hosts, this sequence is derived from HSV-1 strain 17, and this sequence has the base number JN555585.1.
  • Example 3 In vivo experiment, Prepare 1x10 7 pfu or 1x10 6 pfu * /100 ⁇ l of each virus and administer intramuscularly to the hind foreleg of 6-week-old A/J mice (female) using a 27G needle (100 ⁇ l per mouse to both legs). It was administered in divided doses (50 ⁇ l per site). Another dose was given 4 weeks (4w) later. Serum was collected over time after 2, 4, 6, and 8 weeks (see the table below), and the expression level of anti-Cov2-spike protein antibody was measured by ELISA (Cov2-spike protein immobilized, HRP-labeled anti-mouse IgG antibody). Detection). (*Benzonaze-treated virus. During virus production, the recovered virus is enzyme-treated with Benzonase to remove DNA and RNA derived from Vero cells used as host cells.)
  • Figure 4-2 shows changes over time in the amount of antibody produced by individual mice. Here, it is indicated by the OD value in ELISA. OD3 or higher is beyond the measurement limit. A7-2 died after 4w administration. Viruses A, C, and D showed a lot of variation among individuals, while viruses B were relatively stable. In C, C7-1, 5 were positive, and in D, D7-1, 4 were positive. A false positive was observed at T-01 (T7-3).
  • FIG. 7 shows the typical results of 1x10 7 pfu administration, and almost the same results were obtained with 1x10 6 pfu. There was no staining with anti-HSV-1 antibody, anti-CD4 antibody, and anti-CD8 antibody.
  • Body weight change Figure 8 shows the change in body weight of individual mice over time.
  • A One T-Cov2SPP died due to the effects of anesthesia in both cases of administration of 1x10 6 pfu and administration of 1x10 7 pfu.
  • weights were measured under anesthesia for virus administration or blood sampling. The body weight appeared to be lower when no anesthesia was given. During the observation period, there were no abnormalities in behavior or coat appearance. There were no mice that walked strangely.
  • T-Cov2SPPF virus was prepared at 1x10 6 pfu or 1x10 7 pfu/100 ⁇ l and administered intramuscularly to the front thigh of the hind legs of 6-week-old A/J mice (female) (100 ⁇ l per mouse was administered to both legs). (administered in separate doses). Serum was collected over time after 6, 12, and 18 days, and the expression level of anti-Cov2-spike protein antibody was quantified by ELISA (Cov2-spike protein immobilized and detected using HRP-labeled anti-mouse IgG antibody).
  • Example 4 In vivo experiment, Prepare each virus at 1x10 7 pfu/100 ⁇ l and administer intramuscularly to the front thigh of the hind limb of 6-week-old or 19-week-old A/J mice (female) (administer 100 ⁇ l per mouse divided into both legs). did. Muscle and serum were collected after 0,1,2,3 days, and the expression level of Cov2-spike protein (in blood and muscle) was quantified by ELISA (immobilized anti-spikeRBD antibody, HRP-labeled anti-spikeRBD antibody) Detection) and further quantified the amount of virus in the muscle using real-time PCR. As viruses, A:T-Cov2SPP, T-01 and mock were used. A was used because it had the highest expression level in AD.
  • Cov2-spike protein expression level The results are shown in Figure 10-1. Expression is observed within muscle. It was found that the expression level was higher in young mice (6 weeks old) than in old mice (19 weeks old). The expression peaks on the first day of administration, and the expression level decreases over time.
  • T-Cov2SPPF virus was prepared at 1x10 6 pfu or 1x10 7 pfu/100 ⁇ l and administered intramuscularly to the front thigh of the hind limb of 6-week-old or 17-week-old A/J mice (female) (per mouse). (100 ⁇ l was administered in divided doses to both legs). After 1 and 4 days, muscle and whole blood were collected, and the amount of virus in the blood and muscle was quantified by real-time PCR. (B was used because it produced the highest amount of antibodies)
  • Example 5 In vivo experiment, Prepare each virus at 1x10 7 pfu or 1x10 6 pfu/100 ⁇ l and administer intramuscularly to the front thigh of the hind limb of 7-week-old A/J mice (female) (administer 50 ⁇ l per mouse divided between both legs). did. Muscles were collected 0, 1, and 5 days later, and HE staining and IHC were performed using anti-HSV-1 antibody (green), anti-CD8 antibody (brown), and anti-CD4 antibody (red). As viruses, A:T-Cov2SPP, T-01 and mock were used.
  • T-Cov2SPPF virus was prepared at 1x10 6 pfu/100 ⁇ l and administered intramuscularly to the front thigh of the hind leg of a 7- to 8-week-old DBA/2 mouse (female) (100 ⁇ l per mouse was divided between both legs). administration), and the following measurements were performed.
  • Muscles were collected after 1, 2, 3, and 4 weeks, and the amount of virus in the muscles was quantified using real-time PCR.
  • Serum was collected after 1, 2, 3, and 4 weeks, and the expression level of anti-Cov2-spike protein antibody was quantified by ELISA (Cov2-spike protein immobilized and detected using HRP-labeled anti-mouse IgG antibody). .
  • B:T-Cov2SPPF virus was administered intratumorally at 2x10 5 pfu/20 ⁇ l to tumor-bearing mice in which subcutaneous tumors were formed by subcutaneously transplanting the clone M3 cell line (melanoma) into DBA/2 mice. After 3 weeks, serum was collected, and the expression level of anti-Cov2-spike protein antibody was quantified using the above-mentioned ELISA.
  • Both A/J mice and DBA/2 mice are mouse strains that are relatively susceptible to HSV-1, but the vaccine efficacy was similarly obtained even if the mouse strains were different ( Figure 13-1 left) .
  • Intratumoral administration (IT) resulted in a blood antibody concentration that was approximately 35 times higher than that of intramuscular administration (IM) when compared over the same 3 weeks ( Figure 13). -2 right, table below).
  • the present invention provides a new viral vector.
  • This viral vector can be used as a vaccine, and has potential applications in important industrial fields such as pharmaceutical research and development (including regenerative medicine products), pharmaceutical manufacturing, and medical care.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ワクチンとして利用可能なウイルスベクターを提供することを課題とする。外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクター を含む、外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するための、 医薬組成物。(a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている、(b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている、(c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている。

Description

単純ヘルペスウイルスベクターを含む医薬組成物
 本発明は、単純ヘルペスウイルスベクターに関する。本発明に係る単純ヘルペスウイルスベクターは、ワクチンとして使用できる。
 2019年末頃からの新型コロナウイルス感染症(COVID-19)の拡大に伴い、ワクチン開発の重要性が増している。中でも、メッセンジャーRNA(mRNA)ワクチン、及びウイルスベクターワクチンは、ウイルスの遺伝情報の一部を人体に投与するもので、従来のウイルスの一部のタンパク質を投与するタイプのワクチンとは異なる仕組みのワクチンとして注目されている。
 一方、がんの治療法として、手術、化学療法、放射線治療に次ぐ第四の治療法として注目されているのがウイルス療法である。単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は、がんのウイルス療法に用いられるウイルスの一つであり、このウイルスゲノムに人為的遺伝子改変を導入して安全性や治療効果を高めた遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスが開発されている(特許文献1~4、非特許文献1~5)。
特許第4212897号公報 特許第4921669号公報 WO2011/101912 WO2019/189643
Todo, T. et al. (2000). Molecular Therapy, 2, 588-595. Markert, J. M. et al. (2000). Gene Therapy, 7, 867-874. Martuza, R. L. et al. (2000). Journal of Clinical Investigation, 105, 841-846. Fukuhara, H. et al. (2005). Cancer Res, 65 (23), 10663-10668. Fukuhara, H. et al. (2023). Commun Med (London), 3 (1), 40. https://www.nature.com/articles/s43856-023-00270-4(本願の優先日の時点では未公開)
 これまで、単純ウイルス属のウイルスをワクチンウイルスベクタ―として利用することは検討されていない。
 ワクチンとして遺伝子導入に活用するウイルスは、1) 大きな外来遺伝子をウイルスゲノム内に挿入でき、2) 導入した外来遺伝子がヒトのゲノムに組み込まれずにエピゲノムとして機能し、3) 1つの外来遺伝子を発現するウイルスを複数種類混合(mix)することで複数種類の外来遺伝子を発現するのと同様の効果を発揮でき、更に 4) 繰り返し投与してもウイルス自体に対する免疫に阻害されることなく同じ発現効果を毎回発揮できることが望ましい。
 本発明者は、HSV-1において、3つのウイルス遺伝子を改変した第三世代のがん治療用ヘルペスウイルス G47Δの臨床開発を進めてきた。今般、このG47Δに、新型コロナウイルスのスパイクをコードするcDNAを組み込んだところ、ワクチンウイルスとして有効に用い得ることを見出し、本発明を完成した。
 本発明は、以下を提供する。
[1] 外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターを含む、外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するための、医薬組成物。
(a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている
(b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている
(c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている
[2] 単純ヘルペスウイルスベクターが、(a)~(c)のすべての特徴を有する、1に記載の医薬組成物。
[3] 外来ポリペプチドをコードする領域が、IPC6遺伝子欠失部位に挿入される、1又は2に記載の医薬組成物。
[4] 外来ポリペプチドの産生を非がん性細胞で行うためのものである、1から3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[5] 皮下又は筋肉内注射剤である、1から4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[6] 外来ポリペプチドが、病原体由来のタンパク質の全部又は一部を含む、1から5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[7] 外来ポリペプチドが、SARS-CoV-2由来のスパイクタンパク質の全部又は一部を含む、1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
 また、本発明は以下を提供する。
[8] 外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターを含む、非がん性の細胞で外来ポリペプチドを産生するための、医薬組成物。
(a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている
(b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている
(c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている
[9] 単純ヘルペスウイルスベクターが、(a)~(c)のすべての特徴を有する、8に記載の医薬組成物。
[10] 外来ポリペプチドをコードする領域が、IPC6遺伝子欠失部位に挿入される、8又は9に記載の医薬組成物。
[11] 外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するためのものである、8から10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[12] 皮下又は筋肉内注射剤である、8から11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[13] 外来ポリペプチドが、病原体由来のタンパク質の全部又は一部を含む、8から12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[14] 外来ポリペプチドが、SARS-CoV-2由来のスパイクタンパク質の全部又は一部を含む、8から13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
 本発明は、以下を提供する。
[15] 外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターの有効量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する工程を含む、外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するための方法。外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導する方法において使用するための、外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクター又はそれを含む組成物。外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターの、外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における、使用。
(a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている
(b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている
(c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている
[16] 単純ヘルペスウイルスベクターが、(a)~(c)のすべての特徴を有する、15に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[17] 外来ポリペプチドをコードする領域が、IPC6遺伝子欠失部位に挿入される、15又は16に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[18] 外来ポリペプチドの産生を非がん性細胞で行うためのものである、15から17のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[19] 皮下又は筋肉内注射剤である、15から18のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[20] 外来ポリペプチドが、病原体由来のタンパク質の全部又は一部を含む、15から19のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[21] 外来ポリペプチドが、SARS-CoV-2由来のスパイクタンパク質の全部又は一部を含む、15から20のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
 また、本発明は以下を提供する。
[22] 外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターの有効量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する工程を含む、非がん性の細胞で外来ポリペプチドを産生する方法。非がん性の細胞で外来ポリペプチドを産生する方法において使用するための、外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクター又はそれを含む組成物。外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される2以上の特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターの、非がん性の細胞で外来ポリペプチドを産生するための組成物の製造における、使用。
(a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている
(b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている
(c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている
[23] 単純ヘルペスウイルスベクターが、(a)~(c)のすべての特徴を有する、22に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[24] 外来ポリペプチドをコードする領域が、IPC6遺伝子欠失部位に挿入される、22又は23に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[25] 外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するためのものである、22から24のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[26] 皮下又は筋肉内注射剤である、22から25のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[27] 外来ポリペプチドが、病原体由来のタンパク質の全部又は一部を含む、22から26のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
[28] 外来ポリペプチドが、SARS-CoV-2由来のスパイクタンパク質の全部又は一部を含む、22から27のいずれか1項に記載の、方法、ベクター又はそれを含む組成物、又は使用。
 本発明のウイルスベクターには、全長スパイクタンパク質等をコードする比較的大きなサイズのcDNAを組み込むことができる。
 本発明のウイルスベクターをワクチンとして用いることにより、ウイルスを排除するための免疫応答がワクチン効果を促進する可能性がある。
 本発明のウイルスベクターをワクチンとして用いることにより、ウイルス由来のタンパク質がアジュバンドとして働く可能性がある。
 本発明によって提供されるウイルスベクターワクチンは、血中抗ヘルペスウイルス抗体の存在によってはワクチン効果が減弱しない可能性があり、したがって繰り返し投与が有効でありうる。
 単純ヘルペスウイルス(HSV)を骨格とする本発明のウイルスベクターは、容易かつ的確に任意のcDNAを挿入する技術が確立されており、したがって新たなウイルスに対するワクチンを比較的迅速に作製できる。
 本発明によって提供されるウイルスベクターワクチンは、高力価で大量に生産する方法及び精製方法が確立されており、臨床応用に適する。
実験に用いたウイルスベクターに挿入されたコンストラクトにより発現するポリペプチドの構造。 実験に用いたウイルスの構造。 各コンストラクトの発現プラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるポリペプチドの発現。A:スパイクタンパク質としての発現量。 B:ACE2結合タンパク質としての発現量。C:ACE2結合タンパク質としての発現量の、スパイクタンパク質としての発現量に対する比率。 ウイルスを感染したVero細胞におけるポリペプチドの発現。A:スパイクタンパク質としての発現量。B:ACE2結合タンパク質としての発現量。C:ACE2結合タンパク質としての発現量の、スパイクタンパク質としての発現量に対する比率。 抗Cov2spikeタンパク抗体の発現量。 血中抗体濃度(OD450)。A(T-Cov2SSP), B(T-Cov2SSPF): 1/10,000, 1/1,000,000希釈。C(T-Cov2STH), D(T-Cov2S1Fc), mock, T-01: 1/100希釈。 8週間後での筋肉内ウイルス残存量 8週間後での病理像。HE染色、並びに抗HSV-1抗体(緑)、抗CD8抗体(茶色)、抗CD4抗体(赤)を用いて免疫染色を行った。代表的な1x107pfu投与の結果を示す。 ワクチンを投与したマウスの体重変化 抗Cov2spikeタンパク抗体の発現量の変化 Cov2-spikeタンパクの発現量の変化。左:筋肉内スパイクタンパク質の濃度。右:血中スパイクタンパク質濃度。n=3のうち、1匹のみで血中スパイクタンパク質が検出された。 筋肉内でのウイルスDNA量の時間経過 筋肉内でのウイルスDNA量の時間経過。なお、すべてのサンプルで血中ウイルスDNAは検出されなかった。 各ウイルスを投与した筋肉の像(1x107pfu投与、day1)。HE染色ならびに、抗HSV-1抗体(緑)、抗CD8抗体(茶色)、抗CD4抗体(赤)を用いてIHCを行った。T-01, A:T-Cov2SPPともにHSV-1陽性が投与部位に沿って認められた。1x106pfuでもほぼ同様の結果であった。 各ウイルスを投与した筋肉の像(day5、1x107pfu投与)。HE染色ならびに、抗HSV-1抗体(緑)、抗CD8抗体(茶色)、抗CD4抗体(赤)を用いてIHCを行った。投与部位に炎症が起きているのか、CD8, CD4陽性細胞が多く認められた。HSV-1陽性はほぼ認められなかった。 各ウイルスを投与した筋肉の像(day5、1x106pfu投与)。HE染色ならびに、抗HSV-1抗体(緑)、抗CD8抗体(茶色)、抗CD4抗体(赤)を用いてIHCを行った。CD8, CD4陽性細胞が多く認められた。HSV-1陽性はほぼ認められなかった。 筋肉内でのウイルスDNA量の時間経過。投与部位の筋肉中のウイルス量は1週から4週までほぼ同量で、痕跡程度のコピー数であった。 血中抗Cov2spikeタンパク質抗体の発現量。筋肉内投与(IM)では、1-3週で血中抗体濃度の増加が見られ、4週後には減少傾向が見られる。腫瘍内投与(IT)では、筋肉内投与の1/5量投与にも関わらず、血中抗体濃度は同じ3週で比較した場合、35倍程度と高い値を示した。 実験に用いたポリペプチドのアミノ酸配列。 LacZ-融合型T-Cov2 spike(A)遺伝子挿入部位及びその前後の塩基配列。 γ34.5遺伝子及びその前後の塩基配列(TRL領域内)。 α47遺伝子及びその前後の塩基配列。
 以下、本発明の実施形態(本実施形態ともいう。)に基づき、本発明について詳しく説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。
[単純ヘルペスウイルス]
 本実施形態では、外来ポリペプチドをコードする領域を含有する単純ヘルペスウイルス(HSV)を用いる。ウイルスを遺伝物質を核酸に送るためのツールとして使用する場合に、ウイルスベクターということがある。遺伝子的な操作を行ったウイルスを、変異体又は遺伝子組換えウイルスということがある。
 単純ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科単純ウイルス属に分類される。これまでに分離されたウイルスは、1型(HSV-1)と2型(HSV-2)の二つである。本実施形態では、好ましくはHSV-1を用いる。
 HSV-1はエンベロープを有し、成熟粒子は100-150nmの大きさである。エンベロープの内側にテグメント、更にその内側にカプシドがあり、カプシド内にウイルスDNAが存在する。ゲノムは2本鎖DNAである。また、HSV-1 は、以下の特徴を備えていることが知られている。
関しては別紙2に記載する。(文献1)。
1)ヒトのあらゆる種類の細胞に感染可能である
2)ウイルスの生活環とゲノム配列が解明されている
3)ウイルス遺伝子の大半は機能が判明しており、遺伝子操作を加えることが可能である
4)ウイルスゲノムサイズが大きい(約152kb)為に、大きなサイズ遺伝子や複数の遺伝子を組み込むことができる。
 さらに、HSV-1は臨床応用に適した以下の利点を備える。
5)増殖を抑制する抗ウイルス薬が存在する
6)血中抗HSV-1抗体の存在によってはワクチン効果が減弱しない可能性があり、繰り返し投与が可能である
7)HSV-1に感受性を示すマウスやサルが存在するために、動物で安全性や効果の前臨床的評価を行える
8)ウイルスDNAが宿主細胞のゲノムに取り込まれず染色体外に存在する
9)大量に生産する方法及び精製方法が確立されている
 HSV-1のゲノムは、82%のlong unique region(U)と12%のshort unique region(Us)の2つの固有配列領域と、それぞれの両端に位置するterminal repeat(TR)とinverted repeat(IR)の倒置反復配列からなる(表1、Todo, T.(2008). a journal and virtual library 13, 2060-2064)。LとSの2つの領域はそれぞれ独立して2つの方向を取り得るため、HSV-1ゲノムDNAは4つのアイソマーからなる。このゲノムにはTR上のRL1、RL2、U上のU1~U56、TR上のR1、U上のU1~U12に合計84個の遺伝子が一方向性にコードされており、そのうちの約半数がウイルス増殖には不必要な遺伝子であり、これら非必須遺伝子部分を欠損させることで病原性の減弱や、遺伝子導入が可能である(Carson, J. et al. (2010). Drugs of the future 35, 183-195)。
 本実施態様に用いるウイルスがHSV-1変異体である場合、以下の特徴のいずれか一つ以上を有し得る。
・ウイルスDNA合成に関わる酵素例えば、チミジンキナーゼ(thymidine kinase,TK)、リボヌクレオチド還元酵素(ribonucleotide reductase,RR)、ウラシル-N-グリコシラーゼ(uracil-N-glycosylase,UNG又はUDG)等の不活化による、非がん性細胞でのウイルス複製能の欠失。
・HSV-1の病原性に関わるタンパク質ICP34.5をコードする遺伝子γ34.5を欠失させることによる、非がん性細胞でのウイルス複製能の欠失。
・α47を欠失させることによる、ワクチン効果の促進。
・野生型への復帰を防止して安全性を高めるための遺伝子の欠失又は不活化(例えば、内在性γ34.5遺伝子、α47遺伝子、α0遺伝子(ICP0遺伝子)、U41遺伝子(vhs遺伝子)、U56遺伝子の欠失又は不活化)。
・免疫刺激遺伝子(IL-4,IL-10,GM-CSF,IL-12,可溶型B7.1等)を発現させることによる、免疫の増強及び生存延長。
 一態様において、用いるウイルスは、好ましくは以下の(a)~(c)から選択される少なくとも一つ、より好ましくは2つ以上、さらに好ましくはすべての特徴を有するHSV-1変異体である。
(a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている。
(b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている。
(c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている。
 上記(a)及び(b)の特徴に関し、非分裂細胞におけるヌクレオチド代謝及びウイルスDNA合成のために重要な酵素であるRRの大サブユニットであるICP6、並びに/或いは、ウイルス感染の際に生じるリン酸化PKRの機能に拮抗するγ34.5を欠失することで、正常細胞では増殖できないウイルスとなる。また、上記(c)の特徴に関し、α47遺伝子がコードするタンパク質は、TAPを阻害して宿主細胞表面のMHCクラスIの発現を抑制することで宿主の免疫サーベイランスから逃れる作用を有するため、α47遺伝子欠失HSV-1では宿主細胞のMHCクラスI発現の維持により、免疫細胞に対する刺激が強くなると期待される。さらに上記(b)及び(c)の特徴双方を有するHSV-1は、α47の欠失によって、α47とゲノムが重なっているUS11 late promoterが同時に欠失するため、US11遺伝子の発現がα47 immediate-early promoterの制御下におかれることで発現時期が早まり、γ34.5欠失によって減弱したウイルス複製能を腫瘍細胞に限って復元する作用を有する。
 本発明及び本実施態様に関し、遺伝子の欠失又は不活化とは、遺伝子の全部又は一部を欠失させるか、一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入等を通じて、その遺伝子の発現を抑制することをいう。遺伝子の欠失又は不活化は、公知の方法により実施することができる。
 上記(a)~(c)に記載の、γ34.5遺伝子、ICP6遺伝子及び/又はα47遺伝子の欠失又は不活化を含むHSVとしては、γ34.5遺伝子を2コピーとも欠失させ、ICP6遺伝子を不活化させたG207、γ34.5遺伝子の2コピーの欠失、ICP6遺伝子の不活化、及びα47遺伝子の欠失を含むG47Δが挙げられる。従って、本実施形態に用いるウイルスは、G207やG47Δにさらに改変を加えることによって作製することもできる。
 特に好ましい態様においては、用いるウイルスは、G47Δを基本骨格とする。G47Δは、大腸菌lacZ遺伝子を発現し、γ34.5遺伝子、ICP6遺伝子(U39遺伝子)、及びα47遺伝子(ICP47遺伝子)を欠失又は不活化された制限増殖型遺伝子組換えHSV-1として知られている。治療域の広さから、ヒトの脳内にも高用量を安全に投与することが可能であり、2021年6月に日本で悪性神経膠腫を適応症とした再生医療等製品(一般名 テセルパツレブ、製品名 デリタクト注)として承認された。G47Δは、野生株ウイルス(HSV-1 F株)に由来するG207から作製された(Todo, T. et al. (2001). Proc Natl Acad Sci USA 98: 6396-6401)。
 上記(a)の特徴に関し、IPC6遺伝子が欠失又は不活化されている部位には、後述する外来ポリペプチドをコードする領域が挿入されていることが好ましい。なお本発明及び実施態様に関し、ある領域がポリペプチドをコードするというときは、その領域の塩基配列がポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている場合と、その領域の塩基配列の相補配列がポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている場合とを含む。
 ウイルスが上記(a)の特徴を有し、かつIPC6遺伝子が欠失又は不活化されている部位に、外来ポリペプチドをコードする領域が挿入されている特徴を有するとは、例えば、ウイルスが、配列表の配列番号5の塩基配列のLocation 5349..9170を除いた部分と同一性が高く、かつLocation 5349..9170の代わりに免疫原性のあるポリペプチドをコードする配列又はその相補配列が挿入された配列を有することをいう。
 配列番号5及び図14には、実施例の項に掲載した実験で用いたウイルスの、LacZ-融合型T-Cov2 spike(A)遺伝子挿入部位及びその前後の塩基配列を示す。外来ポリペプチドをコードする領域、すなわち挿入部位は、配列番号5では、Location 5349..9170であり、図14では、二重線のTCAから二重線のCATまで(二重線のTCAは終始コドンの相補配列であり、二重線のCATは開始コドンの相補配列である。)である。
 ウイルスが上記(b)の特徴を有するとは、例えば、配列表の配列番号6の塩基配列において、Location 88..834の全部又は一部を欠失させるか、一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入がされた配列を有し、それによりγ34.5遺伝子の発現が抑制されていることをいう。また、配列番号6のLocation 88..834に対応するIR中の塩基配列の全部又は一部を欠失させるか、一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入がされた配列を有し、γ34.5遺伝子の発現が抑制されていることをいう。双方のγ34.5遺伝子配列において、全部又は一部を欠失させるか、一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入がされ、双方の発現が抑制されていることが好ましい。またウイルスが上記(b)の特徴を有するとは、例えば、配列表の配列番号6の塩基配列からLocation 177..1128を除いた配列と同一性の高い配列を有することをいう。
 配列番号6及び図15には、G47Δが由来する株のγ34.5遺伝子及びその前後の塩基配列(TR領域内)を示す。配列番号6の配列では、Location 88..834、図15では網掛けで示す開始コドンから終止コドンまでがγ34.5遺伝子のコード領域である。G47Δの基本骨格では欠失している部位(GU734771.1の塩基番号576~1527)は、配列番号6ではLocation 177..1128であり、図15では下線で示した部分である。TRの上記配列とIRのγ34.5遺伝子のコード領域周辺の相補配列(GU734771.1の塩基番号124349~125798)とは完全に一致する。
 ウイルスが上記(c)の特徴を有するとは、例えば、配列表の配列番号7の塩基配列において、Location218..484の全部又は一部を欠失させるか、一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入がされた配列を有し、それによりα47遺伝子の発現が抑制されていることをいう。またウイルスが上記(c)の特徴を有するとは、例えば、配列表の配列番号7の塩基配列からLocation 230..540を除いた配列と同一性の高い配列を有することをいう。
 配列番号7及び図16には、G47Δが由来する株のα47遺伝子及びその前後の塩基配列を示す。α47遺伝子は相補鎖側にコードされている。配列番号7の配列では、Location 218..484、図16では網掛けで示す開始コドンから終止コドンまでがγ34.5遺伝子のコード領域である。G47Δの基本骨格では欠失している部位配列(GU734771.1の塩基番号576~1527)は、配列番号6の配列ではLocation 177..1128であり、図16では下線で示した部分である。
 ある医薬組成物に用いられているウイルスが、本発明及び実施態様でいう単純ヘルペスウイルスに該当するかは、遺伝子増幅法(PCR)、酵素免疫法、高感度蛍光抗体法(FA)、サザンブロットハイブリダイゼーション、液相(核酸)ハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーション等の当業者にはよく知られた方法により、確認することができる。 
[外来ポリペプチド]
 本実施形態では、単純ヘルペスウイルスベクターは、外来ポリペプチドをコードする領域を含有する。外来とは、単純ヘルペスウイルス以外に由来することをいう。本実施形態で含有される領域にコードされるポリペプチドは、ウイルスが投与された対象において領域の発現により産生され、それに対する免疫応答が誘導されるものであれば、大きさ、種類とも、特に限定されない。免疫応答が誘導されるとは、特に記載した場合を除き、投与された対象において抗体の産生及び細胞性免疫のうち少なくとも一方が誘導されることをいう。ポリペプチドが抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質を免疫原性ということがある。
 本実施態様に適用されるポリペプチドは、病原体由来のタンパク質の全部又は一部である。病原体は、ウイルス、細菌、真菌、リケッチア、寄生虫、プリオンであり得る。病原体由来とは、ウイルス・細菌等の病原体自体を構成するポリペプチドである場合のほか、病原体が産生する毒素タンパク質である場合が含まれる。
 病原体の例は、下記である。
 新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、肺炎連鎖球菌、ジフテリア菌、破傷風菌、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病ウイルス、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム  ディフィシレ、ヒト型結核菌、カンジダ・アルビカンス、インフルエンザ菌B(HiB)、ポリオウイルス、肝炎Bウイルス、ヒトパピローマウイルス(L1、L2、E6、E7)、ヒト免疫不全ウイルス、ピロリ菌、黄色ブドウ球菌、百日咳毒素、ポリオウイルス、黄色ブドウ球菌、百日咳菌(毒素)、ポリオウイルスVP1-4、マラリア原虫。
 一態様では、ポリペプチドは、がんの原因となる病原体由来である。ある種の病原体の感染が、がんの原因となることが知られている。例えば、B型やC型の肝炎ウイルスによる、肝臓がん;ヒトパピローマウイルス(HPV)による、子宮頸がん、陰茎がん、外陰部がん、膣がん、肛門がん、口腔がん、咽頭がん;ピロリ菌による、胃がん;エプスタインバーウイルス(EBV)による、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、咽頭がん;ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-1)による成人T細胞白血病リンパ腫等である。
 一態様では、ポリペプチドは、がん抗原でありうる。がん抗原とは、がん細胞において正常細胞よりも高く発現する、又はがん細胞に特異的に発現するタンパク質等をいう。がん由来のペプチドエピトープ、個別化がん抗原の部分又はがんホットスポット抗原の部分を用いてがんを治療し、またがんの再発を抑制することが検討されている(例えば、WO2020/097291)。 
 本実施態様の外来ポリペプチドは、比較的大きなサイズであってもよい。例えば500アミノ酸残基長であってもよく、1000アミノ酸残基長であってもよく、1500アミノ酸残基長であってもよい。単純ヘルペスウイルスはゲノムサイズが大きい為に、大きなサイズのポリペプチドをコードする領域や複数のポリペプチドをコードする領域を組み込むことができる。
 外来ポリペプチドをコードする領域の導入箇所は、特に限定されず、例えばウイルスの非必須遺伝子を欠失又は不活化させた箇所に外来ポリペプチドをコードする領域を導入することができる。ウイルスがHSV-1である場合、前掲の表1に示す非必須遺伝子を欠損させて、外来ポリペプチドをコードする領域を導入することができる。特に好ましい態様においては、前述のとおり、IPC6遺伝子が欠失又は不活化されている部位に外来ポリペプチドをコードする領域が挿入される。導入した領域の発現は、後述の実施例に示すとおり、公知の手法を用いて確認することができる。
 外来ポリペプチドをコードする領域の単純ヘルペスウイルスへの挿入には、例えば前掲非特許文献1~5、特許文献1~4、及びWO2005/103237号に記載のG47Δ-BACシステム、T-BACシステム、又はこれらに準じたものを用いることができる。T-BACシステムは、G47Δ-BACシステム(前掲非特許文献4)を改変したものであり、それによりG47Δ-BAC産物よりも複製能力が高く、G47Δと同等の複製能力を有するHSV-1が製造できる。
 T-BACシステムは、100万bpまでの大きなDNA断片を大腸菌内に単一コピーで安定して保持させることができるF因子プラスミドのレプリコンに基づくクローニングベクターであるbacterial artificial chromosome(BAC)を、G47ΔのゲノムのICP6欠失部位に挿入することによって、G47Δゲノムの維持や増幅を容易とした遺伝子組換えHSV-1の製造技術である。このT-BACにはloxP配列及びFRT配列が含まれており、同様にloxP配列とFRT配列を持つシャトルベクタープラスミドと混合して、Cre/loxP及びFLP/FRTの2つのリコンビナーゼシステムを利用することで、シャトルベクタープラスミドに搭載された外来遺伝子の挿入とBACの切り出しが起こり、G47Δの基本骨格に外来遺伝子が挿入された遺伝子組換えHSV-1の作製が可能となる。
 一実施態様では、外来ポリペプチドをコードする領域は、非がん性細胞で産生されるために単純ヘルペスウイルスに導入される。非がん性細胞とは、がん細胞ではない細胞をいう。当業者であれば、非がん性細胞であるか否かを適切に判断できる。非がん性細胞での目的ポリペプチドの産生、及びそれに対する免疫応答が誘導されるか否かは、A/Jマウス、DBA/2マウス、BALB/cマウスなどのHSV-1に感受性の高い実験動物を用いて評価することができる。
[新型コロナワクチンとしての利用]
 一態様では、外来ポリペプチドは、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)由来のものである。より詳細には、外来ポリペプチドは、SARS-CoV-2由来の野生型のleader配列、spike全長、spikeのコンフォメーション安定化のためのダブルプロリン(PP)変異を含む。このようなポリペプチドは、例えば下記(i)~(iii)のいずれか一のポリペプチドである:
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、配列番号1の986、及び987番目に相当するアミノ酸が、順にP、及びPであるアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド;
(iii)配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号1の986、及び987番目に相当するアミノ酸が、順にP、及びPであるアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド。
 別の好ましい態様の一つでは、外来ポリペプチドは、SARS-CoV-2由来の野生型のleader配列、spike全長、spikeのコンフォメーション安定化のためのダブルプロリン(PP)変異、さらに宿主細胞のプロテアーゼであるfurinによって認識・切断されるアミノ酸配列RRAR(配列番号8)からなる部位(furin cleavage site)の欠失を含む。このようなポリペプチドは、例えば下記(iv)~(vi)のいずれか一のポリペプチドである:
(iv)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(v)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、配列番号2の683、685、986、及び987番目に相当するアミノ酸が順に、A、A、P、及びPであるアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド;
(vi)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号2の683、685、986、及び987番目に相当するアミノ酸が順に、A、A、P、及びPであるアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド。
 なお、本発明及び本実施態様に関し、ある酵素によって認識・切断されるアミノ酸配列の欠失とは、そのアミノ酸配列の全部又は一部を欠失させるか、一部のアミノ酸の置換、修飾、不要な配列の挿入等を通じて、その酵素によって認識・切断されなくなることをいう。
 別の好ましい態様の一つでは、外来ポリペプチドは、SARS-CoV-2由来であって変異を含むleader配列、spikeの細胞外領域(ECD)のみ、PP変異、furin cleavage siteの欠失、C末端に三量体化ドメインを含む。このようなポリペプチドは、例えば下記(vii)~(ix)のいずれか一のポリペプチドである:
(vii)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(viii)配列番号3に記載のアミノ酸配列のアミノ酸配列において、配列番号1の1~20番アミノ酸からなる領域、及び1219~1256番アミノ酸からなる領域を除いた部分(すなわち、21~1218番アミノ酸からなる部分)において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド;
(ix)配列番号3に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、1~20番アミノ酸からなる領域、及び1219~1256番アミノ酸からなる領域を除いた部分(すなわち、21~1218番アミノ酸からなる部分)において免疫応答を誘導することができるポリペプチド。
 別の好ましい態様の一つでは、外来ポリペプチドは、SARS-CoV-2由来の、野生型leader配列、spikeのサブユニット1(S1)を含み、C末端にヒトIgGのFc領域を含む。このようなポリペプチドは、例えば下記(x)~(xii)のいずれか一のポリペプチドである:
(x)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(xi)配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド;
(xii)配列番号4に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、免疫応答を誘導することができるポリペプチド。
 本実施形態において、アミノ酸は、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸、非天然アミノ酸であってもよい。一態様において、本実施形態のアミノ酸は、好ましくは天然アミノ酸である。
 なお、本発明及び本実施態様に関する説明において、アミノ酸又はアミノ酸残基については、特に記載した場合を除き、Aはアラニン、Cはシステイン、Dはアスパラギン酸、Eはグルタミン酸、Fはフェニルアラニン、Gはグリシン、Hはヒスチジン、Iはイソロイシン、Kはリシン、Lはロイシン、Mはメチオニン、Nはアスパラギン、Pはプロリン、Qはグルタミン、Rはアルギニン、Sはセリン、Tはトレオニン、Uはセレノシステイン、Vはバリン、Wはトリプトファン、Yはチロシンを表す。
[塩基配列又はアミノ酸配列の同一性について]
 本発明及び本実施態様に関し、ポリペプチド、タンパク質又はアミノ酸配列について「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1~250個、1~200個、1~150個、1~100個、1~50個、1~40個、1~30個、1~20個、1~15個、1~9個又は1~4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチド又はタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
 本発明及び本実施態様に関し、塩基配列(ヌクレオチド配列ということもある。)又はアミノ酸配列について「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列又はアミノ酸配列においても、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したヌクレオチド又はアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性=(一致した位置の数/位置の全数)×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるNBLAST及びXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列又はアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム(例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。同一性の計算には遺伝子情報処理ソフトウェア GENETIX(登録商標)(株式会社ゼネティックス)を用いてもよい。なお、同一性%を求める対象配列が、末端にタグ配列等の、比較する配列には存在しない付加配列を有する場合には、その付加配列部分は同一性%の計算には含めない。
 本発明及び本実施態様に関し、塩基配列又はアミノ酸配列について、同一性が高いというときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも50%、例えば60%以上、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97.5%以上さらに好ましくは99%以上の配列同一性を。
 本発明及び本実施態様で用いるポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、DNA、遺伝子は、当業者であれば周知の方法で製造することができる。
[医薬組成物]
 本実施形態は、上述の本実施形態のベクターとして用いるウイルスを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、非がん性細胞で外来ポリペプチドを産生するために用いられてもよく、好ましくは投与された対象において外来ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するために、より好ましくは投与された対象において外来ポリペプチドに対する抗体を産生させるため、細胞性免疫を誘導するために用いることができる。
 含有される領域にコードされている外来ポリペプチドが感染症の原因となる病原体由来である場合、本実施態様の医薬組成物は、その病原体による感染症の処置のため、好ましくは感染症の予防のためのワクチンとして用いることができる。
 感染症には、ウイルス感染症(例えば、新型コロナウイルス感染症、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群 (AIDS)、成人T細胞性白血病、エボラ出血熱、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群 (SARS)、進行性多巣性白質脳症、水痘、帯状疱疹、手足口病、デング熱、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎(ポリオ)、麻疹 、咽頭結膜熱(プール熱)、マールブルグ出血熱、ハンタウイルス腎出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱)、細菌感染症、リケッチア感染症、寄生性感染症、プリオン病が含まれる。
 含有される領域にコードされている外来ポリペプチドががんの原因となる病原体由来である場合、本実施態様の医薬組成物は、特定のがんの予防のためのワクチンとして用いることができる。適用できるがんには、肝臓がん、子宮頸がん、陰茎がん、外陰部がん、膣がん、肛門がん、口腔がん、咽頭がん、胃がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、成人T細胞白血病リンパ腫が含まれる。
 含有される領域にコードされている外来ポリペプチドががん抗原由来である場合、本実施態様の医薬組成物は、特定のがんの処置のため、好ましくは、予防のためのワクチンとして、治療のためのワクチンとして、また再発予防のためのワクチンとして、用いることができる。適用が期待できるがんとして、下記が挙げられるが、これらに限定されない。
 脳腫瘍、神経膠腫(グリオーマ)、眼腫瘍、神経芽腫、網膜芽細胞腫、中枢神経系原発悪性リンパ腫、髄膜腫下垂体腺腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫、眼球内腫瘍、網膜芽細胞腫、脈絡膜悪性黒色腫、眼内悪性リンパ腫、眼付属器の腫瘍、眼瞼腫瘍、涙腺癌、眼付属器リンパ腫、眼窩肉腫、結膜腫瘍、視神経腫瘍、神経膠腫、口腔癌、舌癌、咽頭癌、甲状腺癌、聴器癌、腺様嚢胞癌、嗅神経芽細胞腫、頭頸部の肉腫、肺癌、乳癌、胸腺腫、胸腺癌、悪性胸膜中皮腫、体幹の肉腫、心臓の肉腫、肺神経内分泌腫瘍、胸部のSMARCA4欠損腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌(結腸癌・直腸癌)、小腸癌(十二指腸癌・空腸癌・回腸癌)、GIST(消化管間質腫瘍)、膵・消化管神経内分泌腫瘍、肛門癌、消化管神経内分泌腫瘍、肝細胞癌、胆道癌(胆管癌[肝内胆管癌を含む]・胆のう癌・十二指腸乳頭部癌)、膵臓癌、膵・消化管神経内分泌腫瘍、肝腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、腎細胞癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、尿膜管癌、腎腫瘍、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、(子宮内膜癌)、子宮肉腫、卵巣癌・卵管癌、腟癌、外陰癌、悪性黒色腫(皮膚)、基底細胞癌、有棘細胞癌、皮膚のリンパ腫、軟部肉腫〈成人〉、デスモイド腫瘍、骨肉腫〈小児〉、ユーイング肉腫〈小児〉、軟部肉腫〈小児〉、横紋筋肉腫〈小児〉、肉腫(サルコーマ)の分類、未分化/分類不能肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、粘液線維肉腫、未分化多形肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、滑膜肉腫、類上皮肉腫、胞巣状軟部肉腫、明細胞肉腫(淡明細胞肉腫)、骨外性ユーイング肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病/リンパ芽球性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、B細胞リンパ腫、T/NK細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚のリンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、成人T細胞白血病リンパ腫、多発性骨髄腫、急性前骨髄球性白血病、濾胞性リンパ腫、MALTリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫、原発不明癌、遺伝性腫瘍・家族性腫瘍、神経内分泌癌、胚細胞腫瘍、パラガングリオーマ、胚細胞腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、神経内分泌腫瘍。
 本発明及び本実施態様に関し、疾患又は状態に関連して処置というときは、特に記載した場合を除き、予防、発症リスクの低減、治療、進行の抑制、再発の予防を含む。
 本実施形態の医薬組成物は、有効成分であるウイルスを有効量含む。本発明及び本実施態様に関し、有効量とは、対象に投与されたときに対象における非がん性細胞において、目的のポリペプチドが産生される量、対象において外来ポリペプチドに対する免疫応答が誘導される量、対象において外来ポリペプチドに対する抗体が産生される量の少なくとも一つを意味する。具体的な投与量は、症状の程度、投与対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、製剤の性質、プロモーターの強度等により、当業者が適宜決定することができる。
 本実施形態の医薬組成物は、例えば、約10~約1012プラーク形成単位(pfu)、好ましくは約10~約1010pfu、さらに好ましくは約10~約5×10pfuを、注射によりそれぞれ1回又は数回に分けて投与することができる。本実施形態の医薬組成物の投与回数は、対象患者及び対象疾患に応じて適宜設定することができる。例えば、最初の1回を投与し、その2~5週間後に2回目を投与することができる。また必要に応じ、その後1~8ヶ月ごとに、3回目以降、必要な回数を繰り返し投与することができる。
 本実施形態の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、例えば、静脈内、動脈内、脳室内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、皮下、皮内、表皮内、筋肉内、粘膜表面(例えば、眼、鼻腔内、肺、口腔、腸、直腸、膣、尿路表面)内に投与され得る。医薬組成物が感染症の予防のためのワクチンである場合、好ましくは、皮下又は筋肉内注射により投与される。医薬組成物ががんの予防のためのワクチンである場合、皮下又は筋肉内注射により投与され得る。また医薬組成物ががんの治療のためのものである場合、がんに直接投与(腫瘍内投与)され得る。腫瘍内投与により、より少ない投与量で高い効果が期待できる。
 本実施態様の医薬組成物は、公知の製剤化方法によって製剤化することができる。例えば、アジュバントや任意の担体を含んでいてもよく、アジュバントや担体を添加せずに無菌生理食塩水又は無菌緩衝生理食塩水のような生理学的に許容される溶液で単に希釈したものでもよい。長期保存に適した凍結製剤、乾燥製剤、凍結乾燥製剤等としてもよい。
 本実施形態の医薬組成物は、医薬として許容される添加剤を含んでいてもよい。添加剤の例として、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤などが挙げられる。
 皮下又は筋肉内注射剤の形態である場合、医薬組成物は、例えば1バイアル(5mL)中に、有効成分のほか、L-ヒスチジン6mg、L-ヒスチジン塩酸塩水和物2mg、塩化ナトリウム10mg、塩化マグネシウム1mg、エデト酸ナトリウム水和物0.2mg、精製白糖375mg、無水エタノール20mg、ポリソルベート805mgを含む製剤とすることができる。
 本実施形態の医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本実施形態の医薬組成物は、他の療法と組み合わせて用いることができる。
 異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語(技術用語及び科学用語を含む。)は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
[T-Cov2 4種類の作製]
 以下の実験で用いたウイルスにより産生されるポリペプチドの構造を図1-1に示す。Aは、T-Cov2SPPウイルス作製のためのものであり、SARS-CoV-2由来の野生型のleader配列、spike全長、spikeのコンフォメーション安定化のためのダブルプロリン(PP)変異を含む。Bは、T-Cov2SPPウイルス作製のためのものであり、Aにおいて、さらに宿主細胞のプロテアーゼであるfurinによって認識・切断されるアミノ酸配列RRAR(配列番号8)からなる部位(furin cleavage site)の欠失を含む。Cは、T-Cov2STHウイルス作製のためのものであり、mu-phosphatase leader配列、spikeの細胞外領域(ECD)のみ、PP変異、furin cleavage siteの欠失、C末端に三量体化ドメインを含む。Dは、T-Cov2S1Fcウイルス作製のためのものであり、野生型leader配列、spikeのサブユニット1(S1)を含み、C末端にヒトIgGのFc領域を含む。
 A~Dのポリペプチドのアミノ酸配列を、配列表の配列番号1~4及び図13に示す。配列の特徴を下記に示す。
 A (配列番号1): spike protein(GenBank: QHD43416.1), PP(K986P, V987P)変異
 B (配列番号2): spike protein(GenBank: QHD43416.1), Furin(R683A R685A), PP(K986P, V987P)変異
 C (配列番号3): spike protein(GenBank: QHD43416.1), Furin(R683A R685A), PP(K986P, V987P)変異。mu-phosphatase signal peptide(1..20), C-terminal; GGGSG-YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(foldon trimerization motif, 1219..1249)+G-HHHHHH (hexa-histidine tag, 1250..1256)
 D (配列番号4): Spike S1(1..685) (GenBank: QIC53204.1, Met1..Arg685), Fc region of human IgG1(686..917) (GenBank: CAR58103.1, Glu98..Lys329)  
 実施例で用いたウイルスの構造を図1-2に示す。ウイルスは、TRL、IRLに存在する2つのγ34.5に欠失、ULに存在するICP6にLacZ遺伝子を挿入することによる不活化、USに存在するα47とそれに重複するUS11プロモーター領域に欠失、を有するG47Δを基本骨格とした。ウイルスの作製には上述のT-BACシステムを用いた。
 詳細には、ウイルスは、G47Δを基本骨格におけるICP6遺伝子の欠失部位に、LacZとSV40のpolyA(SV40 pA)及び逆向きのサイトメガロウイルスプロモーター(PCMV)とその下流にA~Dの4種類から選択されるいずれか1つ(図1-2中ではSARS-CoV-2 Spikeと表記)とBGHのpolyA(BGH pA)を挿入して作製した。なお、IPC6遺伝子の欠失部位に外来遺伝子を挿入せず、LacZとPCMVのみが挿入されたウイルスT-01を、コントロールとして使用した。
 実験で用いたLacZ-融合型T-Cov2 spike(A)遺伝子挿入部位及びその前後の塩基配列を、配列表の配列番号5、及び図14に示す。配列の特徴を下記に示す。
 点線(配列番号5のLocation 1..226)はUL39遺伝子プロモーターを含むと報告されているUL39遺伝子コード領域上流の配列、下線(Location 227..1544)はUL39遺伝子のアミノ酸コード領域(GU734771.1の塩基番号 ~87656)、波線以降(Location 1545以降)は挿入配列で、波線は遺伝子組み換えに操作に伴い生じた配列(注1:loxP配列を含む)、破線はlacZ遺伝子のアミノ酸コード領域、続く下線はプラズミドベクター由来の配列(注2:pcDNA6-E/Uni-lacZ由来のlacZの3’側の配列)、点線もプラズミドベクター由来の配列(注2:pVP22/myc-His2由来のSV40 polyA及びBGH polyAの周辺配列)、TGAはICP6-lacZ融合蛋白の終始コドン、二重波線はpVP22/myc-His2由来のSV40 polyA配列、二点鎖線はpVP22/myc-His2由来のBGH polyAの相補配列、点線はプラズミドベクター由来の配列(pVP22/myc-His2由来のSV40 polyA及びBGH polyAの周辺配列)、続く下線はT-Cov2 spike タンパク質(A)のアミノ酸コード領域の相補配列(二重線TCAは終始コドンの相補配列、二重線のCATは開始コドンの相補配列)(TCAからCATまで、Location 5349..9170)、二重線はCMVプロモーターの相補配列、前後の波線は使用したプラスミド由来の配列(MCS)、二点鎖線はpVP22/myc-His2のCMVプロモーター配列に隣接する配列、破線は遺伝子組み換えに操作に伴い生じた配列(pLLZF2→pLLZMF2作製過程で含まれたMCSを含む合成オリゴマー配列)、波線は遺伝子組み換えに使用したアダプター配列及びFRT配列の相補配列、点線以降(GU734771.1の塩基番号88551~)は894bpの欠失部分(GU734771.1の塩基番号87657~88550)の下流のICP6 3’側の配列。大腸菌β-ガラクトシダーゼはICP6のN末端との融合タンパク質として発現される。なお、本配列がGU734771.1と異なる部分(9か所)を□で示す。
 G47Δが由来するHSV-1のγ34.5遺伝子及びその前後の塩基配列(TRL領域内)を、配列表の配列番号6及び図15に示す。図15では、網掛けで示す開始コドンから終止コドンまでがγ34.5遺伝子のコード領域である(配列番号6のLocation 88..834)。図15では、作製したウイルスでは欠失している部位(GU734771.1の塩基番号576~1527)を下線で示す(配列番号6のLocation 177..1128)。欠失部位以降はγ34.5遺伝子3’側の非コード領域が130bp下流に生じる終止コドン(二重下線)まで無意味なアミノ酸配列として翻訳される。
 TRLの上記配列(γ34.5遺伝子のコード領域周辺; GU734771.1の塩基番号400~1849)とIRLのγ34.5遺伝子のコード領域周辺の相補配列(GU734771.1の塩基番号124349~125798)とは完全に一致する。IRLにおけるγ34.5遺伝子欠失部位は、GU734771.1の塩基番号124671~125622(相補配列)となる。なお、本配列がGU734771.1と異なる部分はない。
 G47Δが由来するHSV-1のα47遺伝子及びその前後の塩基配列を配列表の配列番号7及び図16に示す。配列の特徴を下記に示す。
 α47遺伝子は相補鎖側にコードされている。図16では、網掛けで示す終止コドンと開始コドンの間がα47遺伝子のコード領域である(配列番号7のLocation 218..484)。図16では、作製したウイルスでは欠失している部位を下線で示す(配列番号7のLocation 230..540)。作製したウイルスでは、α47遺伝子は翻訳開始部位から欠失しており、新たなORFは生じない。この部分の配列は、令和元年5月31日承認の「融合型ヒトIL-12遺伝子及び大腸菌lacZ遺伝子を発現し、γ34.5遺伝子・UL39遺伝子・α47遺伝子を不活化された遺伝子組換えヒト単純ヘルペスウイルス1型(F株由来)(T-hIL12)」の生物多様性影響評価書(https://www.biodic.go.jp/bch/download/lmo/R1.5.31_iyaku_ap1.pdf)の、3 遺伝子組換え生物等の調製方法、(2)宿主内に移入された核酸の移入方法に記載のとおり、HSV-1 strain 17に由来し、本配列はJN555585.1の塩基番号145099~145806に相当し、欠失部分はJN555585.1の塩基番号145328~145638に相当する。なお、本配列がJN555585.1と異なる部分(1か所)を□で示す(JN555585.1においてはCCTのところ、本配列ではCT)。
[実験1]
 各外来ポリペプチドをコードするcDNAコンストラクトの発現プラスミド(pcDNA3.1+)を、HEK293T細胞にTransfectionし、48時間後の培養上清を回収し、Amicon-Ultra30Kで限外ろ過して濃縮した後、spikeタンパク質としての発現量、及びACE2結合タンパク質としての発現量を求めた。前者はSpike RBD*検出ELISA(anti-spikeRBD抗体を固相化、 anti-spikeRBD抗体で検出)で、後者はACE2結合検出ELISA(ACE2を固相化、anti-spikeRBD抗体で検出)で測定した。値は濃縮液中の濃度として算出した。(*Receptor binding domain)
 結果を下表及び図2に示す。A:Cov2SPPは、スパイクタンパク質の発現量は多いが、ACE2との結合能が低く、B:Cov2SPPFは、スパイクタンパク質の発現量は少ないが、ACE2との結合能はCよりも低かった。また、C:Cov2STHは、スパイクタンパク質の発現量は少ないが、ACE2との結合能は高く、D:Cov2S1Fcは、スパイクタンパク質の発現量は多く、ACE2との結合能は高め(Cよりは低そう)であった。
[実験2]
 各ウイルスをVero細胞にMOI 0.01で感染し、48時間後の培養上清を回収し、Amicon-Ultra30Kで限外ろ過して濃縮した後、spikeタンパク質としての発現量、及びACE2結合タンパク質としての発現量を求めた。前者はSpike RBD検出ELISA(anti-spikeRBD抗体を固相化、 anti-spikeRBD抗体で検出)で、後者はACE2結合検出ELISA(ACE2を固相化、anti-spikeRBD抗体で検出)で測定した。値は濃縮液中の濃度として算出した。
 結果を下表及び図3に示す。Aは、spikeタンパク質の発現量は多いが、ACE2との結合能が低めであり、Bは、spikeタンパク質の発現量は少なく、ACE2との結合能も低かった。Cは、spikeタンパク質の発現量は少ないが、ACE2との結合能は高く、Dは、spikeタンパク質の発現量は少ないが、ACE2との結合能は高め(Cより低いがA, Bより高い)であった。
[実験3:in vivo実験]
 各ウイルスを1x10pfuあるいは1x10pfu/100μlで準備し、6週齢のA/Jマウス(雌)の後肢前腿部に27G針にて筋肉内投与(マウス1匹当たり100μlを両脚に分けて投与(1か所50μlずつ))した。4週間(4w)後にもう一度投与した。2, 4, 6, 8週間後に経時的に血清を回収し(下表参照)、抗Cov2-spikeタンパク抗体の発現量をELISA(Cov2-spikeタンパク固相化、HRP標識抗マウスIgG抗体にて検出)にて定量した。(*Benzonaze処理ウイルス。ウイルス製造の際に、回収したウイルスをBenzonaseで酵素処理し、宿主細胞として用いたVero細胞由来のDNAとRNAを除去したもの。)
 また、8週間後には、投与部位の筋肉を採取し、ウイルスDNAの有無をリアルタイムPCRあるいは、免疫組織化学染色(IHC)にて検証した。また、投与前、投与後1日と1週間おきに8週間体重を測定した。
1) 抗Cov2spikeタンパク抗体の発現量
 抗Cov2spikeタンパク抗体の発現量についての結果を図4-1に示す。抗体産生量は、B>A>>C>Dの順であった。Bでは1x10pfu投与の方が効果が高く、Aでは投与後2wまでは1x10pfu投与の方が抗体産生量が多かったが、その後は1x10pfu投与の方が逆転した。A、Bともに、初回投与では2wから4wで減少傾向が見られたが、4wにおけるブースター投与により、6w, 8wと抗体産生量を顕著に増加させた。C, Dでは、5匹中1~2匹が検出される程度で、それ以外は検出限界以下であった。
 また、図4-2にマウス個々の抗体産生量の経時的変化を示す。ここでは、ELISAにおけるOD値で示す。OD3以上は測定限界越えである。A7-2は4w投与後に死亡した。A、C, Dウイルスでは個体間でのバラツキが多く、Bでは比較的安定していた。CはC7-1, 5が陽性、Dでは、D7-1、4が陽性であった。T-01で擬陽性が見られた(T7-3)。
2)8w後での筋肉内ウイルス残存量(リアルタイムPCR)
 投与部位の筋肉からゲノムDNAを調製後、ICP6/LacZ probe, primerセットを用いて、リアルタイムPCRを行い、ウイルスゲノムのコピー数を算出した。結果を図6に示す。
3)8w後での病理像(HE, IHC(HSV1, CD4, CD8)
 8w後の筋肉を採取し、HE染色ならびに、抗HSV-1抗体(緑)、抗CD8抗体(茶色)、抗CD4抗体(赤)を用いてIHCを行った。図7に、代表的な1x10pfu投与の結果を示すが、1x10pfuでもほぼ同様の結果であった。抗HSV-1抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体のすべてで染まることはなかった。
4)体重変化
 図8にマウス個々の体重の経時的変化を示す。A:T-Cov2SPPは、1x10pfu投与、1x10pfu投与ともに麻酔の影響で1匹ずつ死亡した。0, 2, 4, 6, 8wはウイルス投与あるいは採血のため、麻酔下で体重測定した。麻酔を打たない場合の方が体重が低い印象であった。観察期間中、行動・毛並みに異常はなかった。歩き方が変なマウスもいなかった。 
[実験3(補足実験):in vivo実験 抗体量は2w(~3w)までにどのような経時的変化で産生されるか]
 B:T-Cov2SPPFウイルスを、1x10pfuあるいは1x10pfu/100μlで準備し、 6週齢のA/Jマウス(雌)の後肢の前腿部に筋肉内投与(マウス1匹当たり100μlを両脚に分けて投与)した。6、12、18日後に経時的に血清を回収し、抗Cov2-spikeタンパク抗体の発現量をELISA(Cov2-spikeタンパク固相化、HRP標識抗マウスIgG抗体にて検出)にて定量した。
 結果を下表及び図9に示す。投与から6日後でも、抗Cov2spikeタンパク抗体が検出され、18日目まで経時的に増加が認められた。
[実験4:in vivo実験]
 各ウイルスを1x10pfu/100μlで準備し、6週齢あるいは19週齢のA/Jマウス(雌)の後肢の前腿部に筋肉内投与(マウス1匹当たり100μlを両脚に分けて投与)した。0,1,2,3日後に筋肉及び血清を回収し、Cov2-spikeタンパクの発現量(血中及び筋肉中)をELISAにて定量(anti-spikeRBD抗体を固相化、 HRP標識抗spikeRBD抗体で検出)し、さらにリアルタイムPCRにて筋肉中ウイルス量を定量した。ウイルスとしては、A:T-Cov2SPP、T-01及びmockを用いた。Aを用いたのは、A-Dで一番発現量が高かったためである。
1)Cov2-spikeタンパクの発現量
 結果を図10-1に示す。筋肉内では発現が認められる。若齢マウス(6週齢)の方が老齢マウス(19週齢)に比べてその発現量が高いことが分かった。投与一日目が発現のピークであり、時間経過とともにその発現量は低下する。
2)筋肉内でのウイルスDNA量の時間経過
 結果を下表及び図10-2に示す。投与直後から経時的にウイルスDNA量の減少が認められた。若齢マウス(6週齢)の方が老齢マウス(19週齢)に比べてd1(7倍),d2(1.4倍)ともに保持される量が高い傾向にあった。T-01 d1でAに比べてウイルス量が少し多めなのは、投与後確認した力価(actual titer)が高かったため。
[実験4(補足実験):in vivo実験:血中にウイルスは検出されるか]
B:T-Cov2SPPFウイルスを1x10pfuあるいは1x10pfu/100μlで準備し、 6週齢あるいは17週齢のA/Jマウス(雌)の後肢の前腿部に筋肉内投与(マウス1匹当たり100μlを両脚に分けて投与)した。1,4日後に筋肉及び全血を回収し、リアルタイムPCRにて血中及び筋肉中ウイルス量を定量した。(Bを用いたのは、一番抗体産生量が高いため)
1)血中ウイルスDNA量
 すべてのサンプルで検出されなかった。
2)筋肉内でのウイルスDNA量の時間経過
 結果を下表及び図11に示す。投与部位の筋肉中のウイルス量は、経時的に減少した。若齢マウス(6週齢)の方が老齢マウス(17週齢)に比べてd4で30倍ほど保持される量が高い傾向にあった。
[実験5:in vivo実験]
 各ウイルスを1x10pfuあるいは1x10pfu/100μlで準備し、7週齢のA/Jマウス(雌)の後肢の前腿部に筋肉内投与(マウス1匹当たり50μlを両脚に分けて投与)した。0,1,5日後に筋肉を採取し、HE染色ならびに、抗HSV-1抗体(緑)、抗CD8抗体(茶色)、抗CD4抗体(赤)を用いてIHCを行った。ウイルスとしては、A:T-Cov2SPP、T-01及びmockを用いた。
 Day1の1x10pfu投与の結果を図12に示す。1x10pfuでもほぼ同様の結果であった。Day1ではT-01, A:T-Cov2SPPともにHSV-1陽性が投与部位に沿って認められた。Day5の1x10pfu投与の結果を図13-1に、Day5の1x10pfu投与の結果を図13-2に示す。Day5では、投与部位に炎症が起きているのか、CD8, CD4陽性細胞が多く認められた。HSV-1陽性はほぼ認められなかった。
[実験6:in vivo実験]
  B:T-Cov2SPPFウイルスを1x106pfu/100μlで準備し、7~8週齢のDBA/2マウス(雌)の後肢の前腿部に筋肉内投与(マウス1匹当たり100μlを両脚に分けて投与)し、下記の測定を行った。
 1) 1, 2, 3, 4週後に筋肉を回収し、リアルタイムPCRにて筋肉中ウイルス量を定量した。
 2) 1, 2, 3, 4週後に血清を回収し、抗Cov2-spikeタンパク抗体の発現量をELISA(Cov2-spikeタンパク固相化、HRP標識抗マウスIgG抗体にて検出)にて定量した。
 また、DBA/2マウスの皮下にclone M3細胞株(黒色腫)を移植して皮下腫瘍を形成した担癌マウスに対して、腫瘍内にB:T-Cov2SPPFウイルスを2x105pfu/20μlで投与し、3週後に血清を回収し、抗Cov2-spikeタンパク抗体の発現量を、上記のELISAにて定量した。
 結果を、結果を図13-1及び13-2、及び下表に示す。
 B:T-Cov2SPPFウイルスを筋肉内投与すると、筋肉内にはウイルスDNAが4週後でも痕跡程度に検出されるのみであった(図13-1、下表)。
 A/JマウスもDBA/2マウスもいずれもHSV-1に対し感受性が比較的高いマウス系であるが、マウス系が異なっても、同様にワクチン効果が得られた(図13-1左)。腫瘍内投与(IT)では、筋肉内投与(IM)の1/5量投与にも関わらず、血中抗体濃度は同じ3週で比較した場合、35倍程度と高い値を示した(図13-2右、下表)。
[参考文献等]
 実施例の項に記載した実験についてのより詳細な情報は、前掲特許文献1~4、非特許文献1~4等の公知の文献に記載の材料及び実験方法を参照することができる。
 本発明により、新たなウイルスベクターが提供される。このウイルスベクターはワクチンとして使用することができ、医薬品(再生医療等製品を含む)研究・開発、医薬品製造、医療等の産業上重要な分野において利用可能性を有する。
[配列表に掲載した配列]
SEQ ID NO:1 Spike protein(GenBank: QHD43416.1), PP(K986P, V987P) mutation
SEQ ID NO:2 Spike protein(GenBank: QHD43416.1), Furin(R683A R685A), PP(K986P, V987P) mutation
SEQ ID NO:3 Spike protein(GenBank: QHD43416.1), Furin(R683A R685A), PP(K986P, V987P), mu-phosphatase signal peptide(1..20), foldon trimerization motif(1219..1249), hexa-histidine tag(1250..1256)
SEQ ID NO:4 Spike S1(1..685) (GenBank: QIC53204.1, Met1..Arg685), Fc region of human IgG1(686..917) (GenBank: CAR58103.1, Glu98..Lys329)
SEQ ID NO:5 Sequence containing LacZ-fused T-Cov2 spike(A) gene insertion site
SEQ ID NO:6 Sequence containing γ34.5 gene deletion site (TRL region)
SEQ ID NO:7 Sequence containing α47 gene deletion site (TRL region)
SEQ ID NO:8 Furin cleavage site
 本出願は、2022年8月16日に出願された日本国特許出願・特願2022-129775号に基づく優先権を主張するものであり、その全体はここに参照として組み込まれる。

Claims (7)

  1.  外来ポリペプチドをコードする領域を含有し、以下の(a)~(c)から選択される少なくとも一つの特徴を有する、単純ヘルペスウイルスベクターを含む、外来ポリペプチドを産生してそれに対する免疫応答を誘導するための、医薬組成物。
    (a)ICP6遺伝子が欠失又は不活化されている
    (b)γ34.5遺伝子が欠失又は不活化されている
    (c)α47遺伝子が欠失又は不活化されている
  2.  単純ヘルペスウイルスベクターが、(a)~(c)のすべての特徴を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
  3.  外来ポリペプチドをコードする領域が、IPC6遺伝子が欠失又は不活化されている部位に挿入されている、請求項2に記載の医薬組成物。
  4.  外来ポリペプチドの産生を非がん性細胞で行うためのものである、請求項1から3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  5.  皮下又は筋肉内注射剤である、請求項4に記載の医薬組成物。
  6.  外来ポリペプチドが、病原体由来のタンパク質の全部又は一部を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  7.  外来ポリペプチドが、SARS-CoV-2由来のスパイクタンパク質の全部又は一部を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
     
     
PCT/JP2023/029503 2022-08-16 2023-08-15 単純ヘルペスウイルスベクターを含む医薬組成物 WO2024038857A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-129775 2022-08-16
JP2022129775 2022-08-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024038857A1 true WO2024038857A1 (ja) 2024-02-22

Family

ID=89941730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/029503 WO2024038857A1 (ja) 2022-08-16 2023-08-15 単純ヘルペスウイルスベクターを含む医薬組成物

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024038857A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004528836A (ja) * 2001-03-27 2004-09-24 メディジェン, インコーポレイテッド ウイルスベクターおよび治療法におけるそれらの使用
WO2019189643A1 (ja) * 2018-03-30 2019-10-03 国立大学法人東京大学 腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルス

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004528836A (ja) * 2001-03-27 2004-09-24 メディジェン, インコーポレイテッド ウイルスベクターおよび治療法におけるそれらの使用
WO2019189643A1 (ja) * 2018-03-30 2019-10-03 国立大学法人東京大学 腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルス

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIKAWA, TOMOHIRO: "Covid-19 in 2019: Covid-19 vaccines", DOKKYO JOURNAL OF MEDICAL SCIENCES., vol. 48, no. 3, 1 January 2021 (2021-01-01), JP , pages 303 - 313, XP009553222, ISSN: 0385-5023 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100372934B1 (ko) 형질 상보성 세포주에 의해 생성된 바이러스 결손 백신
Shen et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) for cancer treatment
JP4212897B2 (ja) ウイルスおよび治療法におけるそれらの使用
ES2276470T3 (es) Utilizacion de vectores de herpes para la terapia tumoral.
JP5926804B2 (ja) Cmv用ワクチンとしての条件付き複製サイトメガロウイルス
JPH08507784A (ja) ウイルス・ワクチン
WO2018161825A1 (zh) 一种重组单纯疱疹病毒及其用途
US5665362A (en) Viral vaccines
JPH11502222A (ja) 遺伝子供給用ベクター
JPH10501990A (ja) 複製能力のある単純ヘルペスウイルスは新生細胞の破壊を媒介する
WO2000034497A2 (en) Enhanced packaging of herpes virus amplicons and generation of recombinant virus vectors
US11944677B2 (en) Chimeric virus-like particles and uses thereof as antigen-specific redirectors of immune responses
Parker et al. Genetically engineered herpes simplex viruses that express IL-12 or GM-CSF as vaccine candidates
Chung et al. The ongoing pursuit of a prophylactic HSV vaccine
JP4044131B2 (ja) ヘルペスウイルスワクチン
JP6902195B2 (ja) 多価エンテロウイルス(Enterovirus)ワクチン組成物およびそれに関連する使用
JP7130744B2 (ja) サイトメガロウイルスの安定な製剤
González-Smith et al. Evaluation of Brucella abortus DNA vaccine by expression of Cu–Zn superoxide dismutase antigen fused to IL-2
Zhang et al. Lipidated L2 epitope repeats fused with a single-chain antibody fragment targeting human FcγRI elicited cross-neutralizing antibodies against a broad spectrum of human papillomavirus types
JPH07500972A (ja) 非放出性ヘルペスウイルス生ワクチン
WO2005103237A9 (ja) 組換え単純ヘルペスウイルスの作製方法
WO2008154867A1 (en) Material with immunogenicity
WO2024038857A1 (ja) 単純ヘルペスウイルスベクターを含む医薬組成物
Stanberry Herpes: vaccines for HSV
CN105101993A (zh) 单次高剂量的mva在新生儿和婴儿中诱导保护性免疫反应

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23854891

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1