ES2614819T3 - Ensayo de segmentación en tiempo real - Google Patents

Abstract

Un método de análisis de muestras, que comprende: someter una mezcla de reacción que comprende: reactivos de PCR para amplificar una diana de ácido nucleico, y reactivos de segmentación flap para llevar a cabo un ensayo de segmentación flap en dicha diana de ácido nucleico, a las siguientes condiciones de termociclación: una primera serie de 5-15 ciclos de: i. una primera temperatura de al menos 90 ºC; ii. una segunda temperatura de 60 ºC a 75 ºC; iii. una tercera temperatura de 65 ºC a 75 ºC; seguida por: una segunda serie de 20-50 ciclos de: i. una cuarta temperatura de al menos 90 ºC; ii. una quinta temperatura que es al menos 10 ºC más baja que dicha segunda temperatura; iii. una sexta temperatura de 65 ºC a 75 ºC; no añadiéndose ningún reactivo adicional a dicha reacción entre dicha primera y dicha segunda serie de ciclos y midiéndose la segmentación de una sonda flap en cada ciclo de dicha segunda serie de ciclos, y comprendiendo dicho método la medición de la segmentación de dicha sonda flap mientras la mezcla de reacción está a dicha quinta temperatura.

Description

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DESCRIPCION

Ensayo de segmentacion en tiempo real Antecedentes

Diversas mutaciones puntuales en el genoma humano tienen una relacion directa con una enfermedad. Por ejemplo, se ha comprobado que diversas mutaciones de KRAS germinales estan asociadas con el smdrome de Noonan (Schubbert et al. Nat. Genet. 2006 38: 331-6) y el smdrome cardio-facio-cutaneo (Niihori et al. Nat. Genet. 2006 38: 294-6). Asimismo se encuentran tasas altas de mutaciones de KRAS somaticas en leucemias, cancer colorrectal (Burmer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989 86: 2403-7), cancer pancreatico (Almoguera et al. Cell 1988 53: 549-54) y cancer de pulmon (Tam et al. Clin. Cancer Res. 2006 12: 1647-53). Muchas mutaciones puntuales en el genoma humano no tienen ninguna asociacion causativa aparente con una enfermedad.

Es posible utilizar metodos para la deteccion de mutaciones puntuales, por ejemplo para proporcionar un diagnostico de enfermedades asociadas con las mutaciones puntuales.

Compendio

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion se proporciona un metodo de analisis de muestras tal como se especifica en la reivindicacion 1.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 ilustra esquematicamente algunos de los principios generales de un ensayo flap.

La figura 2 muestra resultados de un ensayo realizado mediante termociclacion en una etapa. Deteccion y cuantificacion de la mutacion G35T de KRAS en presencia de la secuencia de tipo silvestre en niveles, tal como se indica. Las curvas cineticas muestran que todas las relaciones entre mutante y tipo silvestre diferentes de 1:10 y 1:100 son indistinguibles.

La figura 3 muestra resultados de un ensayo realizado mediante termociclacion en dos etapas. Deteccion y cuantificacion de la mutacion G35T de KRAS en presencia de la secuencia de tipo silvestre en niveles, tal como se indica. Las curvas cineticas muestran la resolucion de relaciones de 1:10 a 1:10.0000.

Definiciones

El termino "muestra", como se emplea en esta memoria, se refiere a un material o mezcla de materiales, normalmente, aunque no necesariamente, en forma lfquida, que contiene uno o mas analitos de interes.

El termino "nucleotido" tiene la finalidad de incluir aquellos restos que no solo contienen las bases de purina y pirimidina conocidas, sino tambien otras bases heterodclicas que han sido modificadas. Dichas modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, ribosas alquiladas u otros heterociclos. Ademas, el termino "nucleotido" incluye aquellos restos que contienen marcaciones de hapteno o fluorescentes y pueden contener no solo azucares de ribosa y desoxirribosa convencionales, sino tambien otros azucares. Los nucleosidos o nucleotidos modificados tambien incluyen modificaciones en el resto de azucar, por ejemplo, en donde uno o mas de los grupos hidroxilo estan sustituidos por atomos halogenos o grupos alifaticos, estan funcionalizados como eteres, aminas o similares.

Las expresiones "acido nucleico" y "polinucleotido" se emplean en esta memoria indistintamente para describir un polfmero de cualquier longitud, por ejemplo mayor que aproximadamente 2 bases, mayor que aproximadamente 10 bases, mayor que aproximadamente 100 bases, mayor que aproximadamente 500 bases, mayor que 1000 bases, hasta aproximadamente 10.000 o mas bases, compuesto por nucleotidos, por ejemplo desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, y que se puede producir de forma enzimatica o sintetica (por ejemplo, PNA tal como se describe en la patente de EE.UU. n° 5,948,902 y las referencias citadas en la misma) y se puede hibridar con acidos nucleicos de origen natural de una forma espedfica de secuencia analoga a la de dos acidos nucleicos de origen natural, por ejemplo puede participar en interacciones de apareamiento de bases de Watson-Crick. Los nucleotidos de origen natural incluyen guanina, citosina, adenina y timina (G, C, A y T, respectivamente).

La expresion "muestra de acido nucleico", como se emplea en esta memoria, significa una muestra que contiene acido nucleico.

La expresion "polinucleotido diana", como se emplea en esta memoria, se refiere a un polinucleotido de interes sometido a estudio. En algunas realizaciones, un polinucleotido diana contiene uno o mas sitios diana de interes sometidos a estudio.

El termino "oligonucleotido", como se emplea en esta memoria, significa un multfmero de nucleotidos monocatenario con aproximadamente 2 a 200 nucleotidos. Los oligonucleotidos pueden ser sinteticos o se pueden producir enzimaticamente, y en algunas realizaciones tienen una longitud de 10 a 50 nucleotidos. Los oligonucleotidos

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pueden contener monomeros de ribonucleotido (es decir, pueden ser oligorribonucleotidos) o monomeros de desoxirribonucleotido. Un oligonucleotido puede tener una longitud de 10 a 20, de 11 a 30, de 31 a 40, de 41 a 50, de 51 a 60, de 61 a 70, de 71 a 80, de 80 a 100, de 100 a 150 o de 150 a 200 nucleotidos, por ejemplo.

Las expresiones "estructura doble" o "con estructura duplicada", como se emplean en esta memoria, describen dos polinucleotidos complementarios cuyas bases estan apareadas, es decir, que estan hibridados entre sf

El termino "cebador", como se emplea en esta memoria, se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos complementaria a una region de un polinucleotido diana. Un cebador se une con la region complementara y se extiende, utilizando el acido nucleico diana como molde, bajo condiciones de extension de cebador. Un cebador puede tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleotidos, aunque es posible utilizar cebadores con una longitud fuera de este intervalo. Un cebador se puede extender desde su extremo 3' por la accion de una polimerasa. Un oligonucleotido que no se puede extender desde su extremo 3' por la accion de una polimerasa no es un cebador.

El termino "extender", como se emplea en esta memoria, se refiere a cualquier adicion de uno o mas nucleotidos al final de un acido nucleico, por ejemplo mediante ligacion de un oligonucleotido o mediante el uso de una polimerasa.

El termino "amplificar", como se emplea en esta memoria, se refiere a generar una o mas copias de un acido nucleico diana utilizando el acido nucleico diana como molde.

El termino "desnaturalizar", como se emplea en esta memoria, se refiere a la separacion de un acido nucleico de estructura doble en dos cadenas simples.

Los terminos "determinar", "medir", "evaluar", "valorar", "ensayar", "detectar" y "analizar" se emplean en esta memoria indistintamente para hacer referencia a cualquier forma de medicion, e incluyen la determinacion de si un elemento esta presente o no. Estos terminos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. La valoracion puede ser relativa o absoluta. "Valorar la presencia de" incluye determinar la cantidad de algo presente, asf como determinar si ese algo esta presente o ausente.

El termino "utilizar" tiene su significado convencional y, como tal, significa emplear, por ejemplo, poner en servicio, un metodo o una composicion para lograr un objetivo.

El termino "Tm", como se emplea en esta memoria, se refiere a la temperatura de fusion de una estructura doble de oligonucleotidos a la que la mitad de la estructura doble permanece hibridada y la otra mitad de la estructura doble se disocia en cadenas simples. La Tm de una estructura doble de oligonucleotidos se puede determinar experimentalmente o predecir utilizando la siguiente formula Tm = 81,5 + 16,6(log-i0[Na+]) + 0,41 (fraccion G+C) - (60/N), donde N es la longitud de cadena y [Na+] es menor de 1 M. Vease Sambrook y Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y., ch. 10). Tambien existen otras formulas para predecir la Tm de estructuras dobles de oligonucleotidos y una formula puede ser mas o menos apropiada para una condicion o un conjunto de condiciones dados.

La expresion "con Tm armonizadas", como se emplea en esta memoria, se refiere a multiples estructuras dobles de acidos nucleicos que presentan Tm que estan dentro de un intervalo definido, por ejemplo, en un margen de 5 °C o 10 °C entre sf

La expresion "mezcla de reaccion", como se emplea en esta memoria, se refiere a una mezcla de reactivos que pueden reaccionar entre sf para producir un producto en condiciones externas apropiadas durante un penodo de tiempo. Una mezcla de reaccion puede contener reactivos de PCR y reactivos de segmentacion flap, por ejemplo, cuyas formulas son conocidas independientemente en la tecnica.

El termino "mezcla", como se emplea en esta memoria, se refiere a una combinacion de elementos que estan entremezclados sin ningun orden particular. Una mezcla es heterogenea y no se puede separar espacialmente en sus diferentes constituyentes. Algunos ejemplos de mezclas de elementos incluyen una serie de elementos diferentes que estan disueltos en la misma solucion acuosa, o una serie de elementos diferentes unidos a un soporte solido de forma aleatoria o sin ningun orden particular, no diferenciandose espacialmente los diversos elementos. Una mezcla no es consignable. Para ilustrar esto con un ejemplo, un conjunto ordenado de polinucleotidos unidos a superficie y separados espacialmente, como es conocido comunmente en la tecnica, no es una mezcla de polinucleotidos unidos a superficie, ya que las especies de polinucleotidos unidos a superficie se diferencian espacialmente y el conjunto ordenado es consignable.

La expresion "reactivos de PCR", como se emplea en esta memoria, se refiere a todos los reactivos que son necesarios para realizar una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en un molde. Como es conocido en la tecnica, los reactivos de PCR incluyen esencialmente un primer cebador, un segundo cebador, una polimerasa termoestable y nucleotidos. Dependiendo de la polimerasa utilizada, tambien puede estar presentes iones (por ejemplo Mg2+). Opcionalmente, los reactivos de pCr pueden contener un molde a partir del cual se puede amplificar una secuencia diana.

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La expresion "ensayo flap", como se emplea en esta memoria, se refiere a un ensayo en el que un oligonucleotido flap se segmenta de un modo dependiente de solapamiento mediante una endonucleasa flap para liberar un flap que despues es detectado. Los principios de los ensayos flap son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en Lyamichev et al. (Nat. Biotechnol. 1999 17:292-296), Ryan et al. (Mol. Diagn. 1999 4:135-44) y Allawi et al. (J Clin Microbiol. 2006 44: 3443-3447). Para una mayor claridad, mas abajo se describen algunos reactivos empleados en un ensayo flap. La Figura 1 ilustra los principios de un ensayo flap. En el ensayo flap mostrado en la figura 1, un oligonucleotido invasivo 2 y un oligonucleotido flap 4 se hibridan en la diana 6 para producir un primer complejo 8 que contiene un solapamiento de nucleotidos en la posicion 10. El primer complejo 8 es un sustrato para endonucleasa flap. La endonucleasa flap 12 segmenta el oligonucleotido flap 4 para liberar un flap 14 que se hibrida con un casete FRET 16 que contiene un extintor "Q" y un fluoroforo extinguido "R" cercano que esta extinguido por el extintor Q. La hibridacion del flap 14 con el casete FRET 16 conduce a un segundo complejo 18 que contiene un solapamiento de nucleotidos en la posicion 20. El segundo complejo tambien es un sustrato para endonucleasa flap. La segmentacion del casete FRET 16 mediante endonucleasa flap 12 conduce a la liberacion del fluoroforo 22, que produce una senal fluorescente. Estos componentes se describen con mayor detalle mas abajo.

La expresion "oligonucleotido invasivo", como se emplea en esta memoria, se refiere a un oligonucleotido que es complementario a una region en un acido nucleico diana. El nucleotido del extremo 3' del oligonucleotido invasivo se puede aparear o no con la base de un nucleotido en la diana (que puede ser, por ejemplo, el sitio de un SNP o una mutacion).

La expresion "oligonucleotido flap", como se emplea en esta memoria, se refiere a un oligonucleotido que contiene una region flap y una region que es complementaria a una region en el acido nucleico diana. Las regiones complementarias diana en el oligonucleotido invasivo y el oligonucleotido flap se solapan en un solo nucleotido. Como es conocido, si tanto el nucleotido del extremo 3' del nucleotido invasivo como el nucleotido que se solapa con este nucleotido en el oligonucleotido flap se aparean con la base de un nucleotido en el acido nucleico diana, se forma una estructura particular. Esta estructura es un sustrato para una enzima, definida mas abajo como una endonucleasa flap, que segmenta el flap de la region complementaria diana del oligonucleotido flap. Si el nucleotido del extremo 3' del oligonucleotido invasivo no se aparea con la base de un nucleotido en el acido nucleico diana, o si el nucleotido de solapamiento en el oligonucleotido flap no se aparea con la base de un nucleotido en el acido nucleico diana, el complejo no es un sustrato para la enzima y se produce muy poca o ninguna segmentacion.

La expresion "endonucleasa flap", o "FEN" para abreviar, como se emplea en esta memoria, se refiere a una clase de enzimas nucleoltticas que actuan como endonucleasas espedficas de estructura en estructuras de DNA con una estructura doble que contiene una parte sobresaliente monocatenaria en el extremo 5', o flap, en una de las cadenas que esta desplazada por otra cadena de acido nucleico, es decir, que hay nucleotidos de solapamiento en la union entre el DNA monocatenario y el DNA bicatenario. Las FEN catalizan la segmentacion hidrolftica del enlace fosfodiester en la union del DNA monocatenario y el DNA bicatenario, liberando la parte sobresaliente, o el flap. Las endonucleasas flap han sido analizadas por Ceska y Savers (Trends Biochem. Sci. 1998 23:331-336) y Liu et al. (Annu. Rev. Biochem. 2004 73: 589-615). Las FEN pueden consistir en enzimas individuales, enzimas multisubunidad, o pueden existir como una actividad de otra enzima o complejo protemico, por ejemplo una DNA polimerasa. Una endonucleasa flap puede ser termoestable.

La expresion "flap segmentado", como se emplea en esta memoria, se refiere a un oligonucleotido monocatenario que consiste en un producto de segmentacion de un ensayo flap.

La expresion "casete FRET", como se emplea en esta memoria, se refiere a un oligonucleotido en horquilla que contiene un resto de fluoroforo y un resto de extintor cercano que extingue el fluoroforo. La hibridacion de un flap segmentado con un casete FRET produce un sustrato secundario para la endonucleasa flap. Una vez formado este sustrato, la base que contiene fluoroforo en el extremo 5' se segmenta del casete, generando de este modo una senal de fluorescencia.

La expresion "reactivos de ensayo flap", como se emplea en esta memoria, se refiere a todos los reactivos necesarios para realizar un ensayo flap sobre un sustrato. Como es conocido en la tecnica, los ensayos flap incluyen un oligonucleotido invasivo, un oligonucleotido flap, una endonucleasa flap y un casete FRET, tal como se describe mas arriba. Los reactivos de ensayo flap pueden contener opcionalmente una diana a la que se unen el oligonucleotido invasivo y el oligonucleotido flap.

Descripcion de ejemplos de realizacion

Antes de describir la presente invencion con mayor detalle, se ha de entender que esta invencion no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que, evidentemente, estas pueden variar. Tambien se ha de entender que la terminologfa empleada en esta memoria tiene el objetivo de describir unicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invencion solo estara limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la decima de la unidad del lfmite inferior a no ser que el contexto indique claramente lo contrario, entre el lfmite superior y el lfmite inferior de

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dicho intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo indicado, esta incluido dentro de la presente invencion. Los Kmites superiores e inferiores de estos intervalos menores pueden estar incluidos independientemente en los intervalos menores y tambien estan incluidos dentro de la invencion, sujetos a cualquier lfmite espedficamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o los dos lfmites, la invencion tambien incluye intervalos que excluyen cualquiera de estos dos lfmites incluidos, o ambos.

A no ser que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos empleados en esta memoria tienen el mismo significado entendido comunmente por una persona con competencias normales en el ambito tecnico al que pertenece esta invencion. Aunque en la practica o las pruebas de la presente invencion se pueden utilizar metodos y materiales similares o equivalentes a los aqu descritos, a continuacion se describen los metodos y materiales preferentes.

La mencion de cualquier publicacion se refiere a su divulgacion antes de la fecha de presentacion y no ha de ser interpretada como un reconocimiento de que la presente invencion no tiene derecho a antedatar dicha publicacion en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes a las fechas de publicacion reales, que pueden tener que ser confirmadas independientemente.

Se ha de senalar que las formas singulares "un", "una", "el" y "la", como se emplean en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, incluyen referencias en plural a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. Tambien se ha de senalar que las reivindicaciones pueden estar redactadas de modo que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta previsto que esta afirmacion sirva como base de antecedente para el uso de terminologfa exclusiva como "solamente", "unicamente" y similares con respecto a la relacion de elementos de reivindicacion, o el uso de una limitacion "negativa".

Como sera evidente para los expertos en la tecnica despues de leer esta descripcion, cualquier metodo descrito se puede llevar a cabo en el orden indicado o en cualquier otro orden que sea logicamente posible.

En la presente memoria se describe un metodo de ensayo de PCR en tiempo real basado en segmentacion. En terminos generales, en el metodo de ensayo, una mezcla de reaccion que comprende a) reactivos de PCR para amplificar una diana de acido nucleico, y b) reactivos de segmentacion flap para realizar un ensayo de segmentacion flap en la diana de acido nucleico amplificada, se somete a dos series de condiciones de termociclacion. En algunos casos no se anade ningun reactivo adicional a la reaccion entre la primera y la segunda serie de ciclos, y en cada ciclo de la segunda serie de ciclos se mide la segmentacion de una sonda flap. En la descripcion posterior del metodo, en primer lugar se describira la mezcla de reactivos utilizada en el metodo y despues se describiran las condiciones de termociclacion empleadas en el metodo.

En la siguiente descripcion, los expertos en la tecnica entenderan que en los metodos se podna utilizar cualquiera de una serie de polimerasas y endonucleasas flap, incluyendo, de forma no exclusiva, las aisladas de organismos procariontes, eucariontes o arqueas termoestables o hipertermoestables. Los expertos en la tecnica tambien entenderan que las enzimas utilizadas en el metodo, por ejemplo polimerasa y endonucleasa flap, no solo incluyen enzimas de origen natural, sino tambien enzimas recombinantes que incluyen fragmentos enzimaticamente activos, productos de segmentacion y variantes de enzimas de tipo silvestre.

Mezcla de reaccion

Como se indica mas arriba, la mezcla de reaccion utilizada en el metodo contiene al menos reactivos de PCR para amplificar una diana de acido nucleico y reactivos de segmentacion flap para realizar un ensayo de segmentacion flap en el acido nucleico amplificado. Por lo tanto, la mezcla de reaccion empleada en el metodo puede contener un par de cebadores y un tampon de reaccion (que puede estar tamponado en pH y puede incluir sal, por ejemplo MgCl2, y otros componentes necesarios para la PCR), nucleotidos, por ejemplo dGTP, dATP, dTTP y dCTP y una DNA polimerasa termoestable, asf como un oligonucleotido flap, una endonucleasa flap y un casete FRET, tal como se definen mas arriba. Dependiendo del modo de realizacion del ensayo (es decir, dependiendo de si se utiliza uno de los cebadores de PCR como un oligonucleotido invasivo en el ensayo flap), la mezcla de reaccion puede contener adicionalmente un oligonucleotido invasivo que es diferente a los cebadores de PCR. La mezcla de reaccion puede contener ademas una diana de acido nucleico.

Las identidades y concentraciones exactas de los reactivos presentes en la mezcla de reaccion pueden ser similares o iguales a las empleadas independientemente en los ensayos de PCR y de segmentacion flap, excepto que la mezcla de reaccion contiene Mg2+ en una concentracion mayor que la empleada en mezclas de reaccion de PCR convencionales (que contienen Mg2+ en una concentracion entre aproximadamente 1,8 mM y 3 mM). En algunas realizaciones, la mezcla de reaccion descrita en la presente memoria contiene Mg2+ en una concentracion dentro del intervalo de 4 mM a 10 mM, por ejemplo de 6 mM a 9 mM. Los ejemplos de tampones de reaccion y DNA polimerasas que pueden ser empleados en la mezcla de reaccion en cuestion incluyen los descritos en diversas publicaciones (por ejemplo Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons 1995 y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.). Es posible comprar tampones de reaccion y DNA polimerasas adecuados para PCR de diversos proveedores, por ejemplo Invitrogen (Carlsbad, Calif.), Qiagen (Valencia, Calif.) y Stratagene (La Jolla, Calif.). Los ejemplos de

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polimerasas incluyen Taq, Pfu, Pwo, UlTma y Vent, aunque en algunas realizaciones se pueden emplear muchas otras polimerasas. La informacion proporcionada con la polimerasa incluye orientacion sobre los componentes de reaccion adecuados para ser utilizados con una polimerasa y sobre las condiciones adecuadas para su uso. El diseno de cebadores esta descrito en diversas publicaciones, por ejemplo Diffenbach y Dveksler (PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 1995); R. Rapley, (The Nucleic Acid Protocols Handbook (2000), Humana Press, Totowa, N.J.); Schena y Kwok et al., Nucl. Acid Res. 1990 18:999-1005). Tambien existen programas informaticos comercialmente disponibles para el diseno de cebadores y sondas, incluyendo, de forma no exclusiva, Primer Detective (ClonTech, Palo Alto, Calif.), Lasergene, (DNASTAr, Inc., Madison, Wis.); y Oligo software (National Biosciences, Inc., Plymouth, Minn.) e iOligo (Caesar Software, Portsmouth, N.H.).

En Lyamichev et al. (Nat. Biotechnol. 1999 17:292-296), Ryan et al. (Mol. Diagn. 1999 4:135-44) y Allawi et al. (J Clin Microbiol. 2006 44: 3443-3447) se pueden encontrar ejemplos de reactivos de ensayo de segmentacion flap. Las condiciones apropiadas para reacciones de endonucleasa flap son conocidas o se pueden determinar facilmente utilizando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Kaiser et al., J. Biol. Chem. 274:21387-94, 1999). Los ejemplos de endonucleasas flap que pueden ser utilizadas en el metodo incluyen, de forma no exclusiva, DNA polimerasa I de Thermus aquaticus, DNA polimerasa I de Thermus thermophilus, FEN-1 de mairnfero, FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus, fEN-1 de Methanococcus jannaschii, FEN-1 de Pyrococcus furiosus, FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum, FEN-1 de Thermus thermophilus, CLEAVASE™ (Third Wave, Inc., Madison, Wis.), RTH1 de S. cerevisiae, RAD27 de S. cerevisiae, rad2 de Schizosaccharomyces pombe, 5'-3' exonucleasa de bacteriofago T5, FEN-1 de Pyroccus horikoshii, exonucleasa 1 humana, 5'-3' exonucleasa de timo de ternero, incluyendo homologos de los mismos en eubacterias, eucariontes y arqueas, como miembros de la familia de clase II de enzimas espedficas de estructura, asf como mutantes enzimaticamente activos o variantes de los mismos. Es posible encontrar descripciones de enzimas de segmentacion, entre otros lugares, en Lyamichev et al., Science 260:778-83, 1993; Eis et al., Nat. Biotechnol. 19:673-76, 2001; Shen et al., Trends in Bio. Sci. 23:171-73, 1998; Kaiser et al. J. Biol. Chem. 274:21387-94, 1999; Ma et al., J. Biol. Chem. 275:24693-700, 2000; Allawi et al., J. Mol. Biol. 328:537-54, 2003; Sharma et al., J. Biol. Chem. 278:23487-96, 2003; y Feng et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11:450-56, 2004.

En realizaciones particulares, la mezcla de reaccion puede contener reactivos para ensayar multiples (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o mas) secuencias diana diferentes en paralelo. En estos casos, la mezcla de reaccion puede contener multiples pares de cebadores de PCR, multiples oligonucleotidos flap diferentes con diferentes flaps, y multiples casetes FRET diferentes para detectar los diferentes flaps una vez que estos han sido segmentados. En una realizacion, los oligonucleotidos de una mezcla pueden tener flaps comunes pero diferentes secuencias de union para permitir, por ejemplo, que un grupo de mutaciones segmente un casete FRET comun y emita una senal cuando un fluoroforo individual es indicativo de la presencia de una mutacion. En esta realizacion, una vez identificada la presencia de una mutacion, se puede determinar que mutacion esta presente en la muestra. Opcionalmente, la reaccion puede incluir multiples oligonucleotidos invasivos si uno de los cebadores de PCR no se utiliza como un oligonucleotido invasivo. Al segmentar los casetes FRET se pueden observar multiples senales fluorescentes distinguibles. El fluoroforo se puede seleccionar, por ejemplo, entre 6-carboxifluorescema (FAM), que tiene longitudes de onda de excitacion y emision de 485 nm y 520 nm, respectivamente; Redmond Red, que tiene longitudes de onda de excitacion y emision de 578 nm y 650 nm, respectivamente; Yakima Yellow, que tiene longitudes de onda de excitacion y emision de 532 nm y 569 nm, respectivamente; y Quasor670, que tiene longitudes de onda de excitacion y emision de 644 nm y 670 nm, respectivamente, aunque se podnan emplear muchos otros. En algunos casos, al menos uno de los pares de cebadores de PCR, oligonucleotidos flap y casetes FRET puede estar destinado a la deteccion de un control interno.

Evidentemente, los diversos oligonucleotidos utilizados en el metodo estan disenados para que no interfieran entre sf. Por ejemplo, en realizaciones particulares, el oligonucleotido flap puede estar rematado en su extremo 3', con lo que se evita su extension. Igualmente, en algunas realizaciones, el oligonucleotido invasivo tambien puede estar rematado en su extremo 3' si no se utiliza como uno de los cebadores de PCR. En realizaciones particulares, si el oligonucleotido invasivo no se utiliza como uno de los cebadores de PCR, el oligonucleotido invasivo puede estar presente en una concentracion dentro del intervalo de 5% a 50%, por ejemplo de 10% a 40%, de la concentracion de los cebadores de PCR. Ademas, en ciertos casos, las Tm de la parte de flap y las regiones complementarias diana del oligonucleotido flap pueden ser independientemente al menos 10 °C mas bajas (por ejemplo 10-20 °C mas bajas) que las Tm de los cebadores de PCR, lo que conduce a a) una menor hibridacion del oligonucleotido flap en el acido nucleico diana a temperaturas mayores (60 °C a 75 °C) y b) una menor hibridacion de cualquier flap segmentado con el casete FRET a temperaturas mayores (60 °C a 75 °C). La quinta temperatura menor es favorable para la hibridacion de los oligonucleotidos utilizados en el ensayo flap, y para la actividad de la endonucleasa flap.

En una reaccion multiple, los cebadores pueden estar disenados de modo que tengan propiedades termodinamicas similares, por ejemplo Tm, contenido de G/C y estabilidad de horquilla similares, y en algunas realizaciones todos pueden tener una longitud similar, por ejemplo de 18 a 30 nt, por ejemplo de 20 a 25 nt de longitud. Los otros reactivos utilizados en la mezcla de reaccion tambien pueden tener Tm armonizadas.

La mezcla de ensayo puede estar presente en un recipiente, incluyendo, de forma no exclusiva, un tubo; una placa de multiples pocillos, como una placa de 96 pocillos, de 384 pocillos o de 1536 pocillos; y un dispositivo microfluidico. En algunas realizaciones, en el mismo recipiente de reaccion se llevan a cabo varias reacciones

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multiples. Dependiendo del modo de realizacion de la reaccion, la mezcla de reaccion puede tener un volumen de 5 |j| a 200 jl, por ejemplo de 10 jl a 100 jl, aunque tambien estan previstos volumenes fuera de este intervalo.

En algunas realizaciones, una mezcla de reaccion en cuestion puede contener ademas una muestra de acido nucleico. En realizaciones particulares, la muestra puede contener DNA genomico o una version amplificada de este (por ejemplo, DNA genomico amplificado utilizando por ejemplo los metodos de Lage et al., Genome Res. 2003 13: 294-307 o la solicitud de patente publicada US20040241658). En algunos ejemplos de realizacion, la muestra genomica puede contener DNA genomico de una celula de mairnfero, como una celula humana, de raton, rata o mono. La muestra se puede preparar a partir de celulas cultivadas o de celulas de una muestra clmica, por ejemplo una biopsia, un raspado o un lavado de tejido, o de celulas de una muestra forense (es decir, celulas de una muestra recogida en la escena de un crimen). En realizaciones particulares, la muestra genomica puede proceder de una muestra fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE).

En realizaciones particulares, la muestra de acido nucleico se puede obtener a partir de una muestra biologica, como celulas, tejidos, fluidos corporales y heces. Los fluidos corporales de interes incluyen, de forma no exclusiva, sangre, suero, plasma, saliva, modo, flema, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido pleural, lagrimas, lfquido de conducto mamario, linfa, esputo, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido sinovial, orina, lfquido amniotico y semen. En realizaciones particulares se puede obtener una muestra de un individuo, por ejemplo un humano, y esta se puede procesar antes de su uso en el ensayo en cuestion. Por ejemplo, el acido nucleico se puede extraer de la muestra antes de su uso, para lo cual ya se conocen metodos.

Por ejemplo, se puede extraer DNA de heces mediante cualquier cantidad de metodos diferentes, incluyendo los descritos, por ejemplo, en Coll et al. (J. of Clinical Microbiology 1989 27: 2245-2248), Sidransky et al. (Science 1992 256: 102-105), Villa (Gastroenterology 1996 110: 1346-1353) y Nollau (BioTechniques 1996 20: 784-788), y en las patentes EE.Uu. n° 5463782, 7005266, 6303304 y 5741650. Los equipos de extraccion de DNA comerciales para la extraccion de DNA de heces incluyen QIAamp stool mini kit (QIAGEN, Hilden, Alemania), Instagene Matrix (Bio-Rad, Hercules, Calif.), y RapidPrep Micro Genomic DNA isolation kit (Pharmacia Biotech Inc Piscataway, N.J.), entre otros.

Metodo de analisis de muestras

Al llevar a cabo el metodo en cuestion, la mezcla de reaccion se somete a las siguientes condiciones de termociclacion: una primera serie de 5 a 15 (por ejemplo de 8 a 12) ciclos de: i. una primera temperatura de al menos 90 °C; ii. una segunda temperatura en el intervalo de 60 °C a 75 °C (por ejemplo 65 °C a 75 °C); iii. una tercera temperatura en el intervalo de 65 °C a 75 °C; seguida por: una segunda serie de 20-50 ciclos de: i. una cuarta temperatura de al menos 90 °C; ii. una quinta temperatura que es al menos 10 °C mas baja que la segunda temperatura (por ejemplo en el intervalo de 50 °C a 55 °C); y iii. una sexta temperatura en el intervalo de 65 °C a 75 °C. Durante la termociclacion no se anade ningun reactivo adicional a la mezcla de reaccion, por ejemplo entre la primera y la segunda serie de ciclos. En realizaciones particulares, la polimerasa termoestable no se inactiva entre la primera y la segunda serie de condiciones, permitiendo de este modo la amplificacion de la diana durante cada ciclo de la segunda serie de ciclos. En realizaciones particulares, la segunda y la tercera temperatura son la misma temperatura, de modo que se aplican condiciones de termociclacion "en dos etapas". Cada uno de los ciclos puede tener independientemente una duracion en el intervalo de 10 segundos a 3 minutos, aunque se emplean perfectamente duraciones fuera de este intervalo.

En cada ciclo de la segunda serie de ciclos, mientras la reaccion se encuentra a la quinta temperatura se puede medir una senal generada por segmentacion de la sonda flap para obtener una medicion en tiempo real de la cantidad de acido nucleico diana en la muestra (refiriendose la expresion "en tiempo real" a una medicion que se realiza mientras la reaccion avanza y se acumulan productos). La medicion se puede expresar como una cantidad absoluta de copias o como una cantidad relativa cuando esta normalizada con respecto a un acido nucleico de control en la muestra.

Sin establecer una vinculacion con ninguna teona espedfica, se cree que las mayores temperaturas de reaccion en la primera serie de ciclos pueden permitir que el par de cebadores de PCR amplifique eficientemente el acido nucleico diana sin ninguna interferencia significativa por parte de cualquiera de los reactivos de ensayo flap o sus productos de reaccion. La temperatura de reaccion menor utilizada en la segunda serie de ciclos (es decir, la quinta temperatura) no es optima para la polimerasa utilizada para la PCR, pero permite que el oligonucleotido flap se hibride eficientemente con el acido nucleico diana y esta mas cerca de la temperatura optima de la endonucleasa flap. La temperatura de reaccion menor utilizada en la segunda serie de ciclos tambien facilita la hibridacion posterior del flap segmentado con el casete FRET. De este modo, a una temperatura menor, el acido nucleico diana puede ser detectado sin ninguna interferencia significativa por parte de los reactivos de PCR.

En algunos casos es posible detectar una fluorescencia que indica la cantidad de flap segmentado mediante un fluorometro automatico disenado para llevar a cabo PCR en tiempo real, que presenta las siguientes caractensticas: una fuente luminosa para excitar el fluoroforo del casete FRET, un sistema para calentar y enfriar mezclas de reaccion y un fluorometro para medir la fluorescencia emitida por el casete FRET. Esta combinacion de caractensticas posibilita una medicion en tiempo real del flap segmentado, lo que permite cuantificar la cantidad de

5

10

15

20

25

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35

40

45

50

55

acido nucleico diana presente en la muestra. En la tecnica se conocen fluorometros automaticos para llevar a cabo reacciones de PCR en tiempo real y estos se pueden adaptar para utilizarlos en este ensayo espedfico, por ejemplo el ICYCLER™ de Bio-Rad Laboratories (Hercules, Calif.), el Mx3000P™, el MX3005P™ y el MX4000™ de Stratagene (La Jolla, Calif.), el ABI PRISM™ 7300, 7500, 7700 y 7900 Taq Man (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), el SMARTCYCLER™, ROTORGENE 2000™ (Corbett Research, Sydney, Australia), el GENE XPERT™ System (Cepheid, Sunnyvale, Calif.) y el LIGHTCyClER™ (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, Ind ). La velocidad de incremento entre las diferentes temperatures de reaccion no es cntica y en algunas realizaciones se pueden emplear las velocidades de incremento por defecto previamente ajustadas en los termocicladores.

En algunos casos, el metodo puede incluir ademas la representacion grafica de la cantidad de segmentacion que se produce en cada uno de los ciclos de la segunda serie, proporcionando de este modo una estimacion de la abundancia de la diana de acido nucleico. La estimacion se puede calcular determinando el ciclo umbral (es decir, el ciclo en el que dicha fluorescencia aumenta por encima de un umbral predeterminado; el valor "Ct" o valor "Cp"). Esta estimacion se puede comparar con un control (que se puede ensayar en la misma mezcla de reaccion que el locus genomico de interes) para obtener una estimacion normalizada. El termociclador tambien puede incluir un programa de aplicacion para determinar el ciclo umbral para cada una de las muestras. Por ejemplo, en Luu-The et al. (Biotechniques 2005 38: 287-293) se muestra un ejemplo de un metodo para determinar el ciclo umbral.

Tambien se describe un dispositivo para llevar a cabo analisis de muestras. El dispositivo puede incluir: a) un termociclador programado para llevar a cabo el proceso arriba descrito y b) un recipiente que comprende: reactivos de PCR para amplificar una diana de acido nucleico, y reactivos de segmentacion flap para realizar un ensayo de segmentacion flap en la diana de acido nucleico.

Utilidad

El metodo descrito puede ser utilizado en diversas aplicaciones, incluyendo dichas aplicaciones por regla general aplicaciones de analisis de muestras en las que se detecta la presencia de una secuencia de acidos nucleicos diana en una muestra dada.

En particular, los metodos arriba descritos se pueden emplear para diagnosticar, para predecir una respuesta a un tratamiento o para investigar una afeccion cancerosa u otra enfermedad en mairnferos, incluyendo, de forma no exclusiva, leucemia, carcinoma de mama, cancer de prostata, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, esclerosis lateral amiotrofica, esclerosis multiple, apoplejfa, autismo, discapacidad intelectual y trastornos de desarrollo. Muchos polimorfismos de nucleotido estan asociados con estas enfermedades y son considerados como un factor para la aparicion de las mismas. El conocimiento del tipo y la localizacion del polimorfismo de nucleotido puede ayudar enormemente al diagnostico, el pronostico y el entendimiento de diversas enfermedades en mamfferos. Ademas, las condiciones de ensayo descritas en esta memoria pueden ser empleadas en otras aplicaciones de deteccion de acidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, deteccion de enfermedades infecciosas, control de la carga viral, genotipado de virus, pruebas ambientales, pruebas de alimentos, pruebas forenses, epidemiologfa y otras areas en las que se utiliza una deteccion de secuencias de acidos nucleicos espedficas.

En algunas realizaciones se puede obtener una muestra biologica de un paciente, y la muestra se puede analizar utilizando el metodo. En realizaciones particulares, el metodo se puede emplear para identificar y/o estimar la cantidad de copias mutantes de un locus genomico que se encuentran en una muestra biologica que contiene tanto copias de sipo silvestre de un locus genomico como copias mutantes del locus genomico que tienen una mutacion puntual con respecto a las copias de tipo silvestre del locus genomico. En este ejemplo, la muestra puede contener al menos 100 veces (por ejemplo al menos 1.000 veces, al menos 5.000 veces, al menos 10.000 veces, al menos 50.000 veces o al menos 100.000 veces) mas copias de tipo silvestre del locus genomico que copias mutantes de dicho locus genomico.

En estas realizaciones, el metodo se puede emplear para detectar una mutacion oncogenica (que puede consistir en una mutacion somatica), por ejemplo en PIk3cA, NRAS, KRAS, JAK2, HRAS, FGFR3, FGfR1, EGFR, CDK4, BRAF, RET, PGDFRA, KIT o ERBB2, pudiendo estar asociada dicha mutacion con cancer de mama, melanoma, cancer de rinon, cancer endometrial, cancer de ovario, cancer de pancreas, leucemia, cancer colorrectal, cancer de prostata, mesotelioma, glioma, meduloblastoma, policitemia, linfoma, sarcoma o mieloma multiple (vease, por ejemplo Chial 2008 Proto-oncogenes to oncogenes to cancer. Nature Education 1:1).

En estas realizaciones, la mezcla de reaccion puede contener un primer cebador y un segundo cebador, comprendiendo el primer cebador un nucleotido de extremo 3' que se aparea con las bases de la mutacion puntual. El primer cebador se puede emplear como el oligonucleotido invasivo en la segunda serie de ciclos o, en algunos casos, la mezcla de reaccion puede presentar un oligonucleotido invasivo independiente que tambien tiene un nucleotido de extremo 3' que se aparea con las bases de la mutacion puntual. Dado que la mutacion puntual en el locus genomico puede estar directamente asociada con cancer, por ejemplo cancer colorrectal, el metodo en cuestion puede ser empleado para diagnosticar pacientes de cancer, de forma individual o en combinacion con otras tecnicas clrnicas (por ejemplo un examen ffsico como una colonoscopia o analisis inmunohistoqmmicos) o tecnicas moleculares. Por ejemplo, los resultados obtenidos en el ensayo en cuestion se pueden combinar con otra informacion, por ejemplo informacion referente al estado de metilacion de otros locus, informacion referente al

5

10

15

20

25

30

35

40

mismo locus o a un locus diferente, informacion citogenetica, informacion referente a transposiciones, informacion de expresion genetica o informacion sobre la longitud de telomeres, para proporcionar un diagnostico general de cancer u otras enfermedades.

En una realizacion se puede tomar una muestra de un paciente en un primer lugar, por ejemplo en un establecimiento clrnico, como un hospital o la consulta de un doctor, y la muestra se puede enviar a un segundo lugar, por ejemplo un laboratorio, donde esta es procesada y se lleva a cabo el metodo arriba descrito para generar un informe. Un "informe", como se describe en la presente memoria, consiste en un documento electronico o ffsico que incluye elementos de informe que proporcionan resultados de ensayo, que pueden incluir un valor Ct o Cp o similar que indica la presencia de copias mutantes del locus genomico en la muestra. Una vez generado, el informe puede ser enviado a otro lugar (que puede ser el mismo que el primer lugar), donde puede ser interpretado por un profesional sanitario (por ejemplo un clrnico, un tecnico de laboratorio o un medico como un oncologo, cirujano o patologo) como parte de un diagnostico clrnico.

Equipos

Tambien se describen equipos para poner en practica el metodo en cuestion, tal como se describe mas arriba. Los componentes del equipo pueden estar presentes en recipientes independientes, o multiples componentes pueden estar presentes en un solo recipiente.

Ademas de los componentes arriba mencionados, el equipo tambien puede incluir instrucciones para utilizar los componentes del equipo con el fin de poner en practica los metodos en cuestion. Por regla general, las instrucciones para poner en practica los metodos en cuestion estan registradas en un soporte de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, como papel o plastico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los equipos en forma de un prospecto, en el etiquetado del recipiente del equipo o en componentes de este (es decir, asociadas con el paquete o subpaquete), etc. Las instrucciones pueden estar presentes como un archivo de datos de almacenamiento electronico presente en un soporte de almacenamiento adecuado legible por ordenador, por ejemplo CD-ROM, disquete, etc. En otros equipos, las instrucciones reales no estan presentes en el equipo, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones desde una fuente remota, por ejemplo por Internet. Un ejemplo de ello consiste en un equipo que incluye una direccion web en la que se pueden ver las instrucciones y/o desde la que se pueden descargar las instrucciones. Como en el caso de las instrucciones, estos medios para obtener las instrucciones estan registrados en un sustrato adecuado.

Ademas de las instrucciones, los equipos tambien pueden incluir una o mas muestras de control, por ejemplo analitos de control positivos o negativos para utilizarlos en las pruebas del equipo.

La mencion de cualquier publicacion se refiere a su divulgacion antes de la fecha de presentacion y no ha de ser interpretada como un reconocimiento de que la presente invencion no tiene derecho a antedatar dicha publicacion en virtud de invencion anterior.

Ejemplo 1

Ensayo G35T de KRAS

El ensayo descrito mas abajo esta disenado para detectar secuencias de acidos nucleicos que contienen la mutacion G35T de KRAS sobre un fondo de secuencias de tipo silvestre. Como referencia, mas abajo se muestran secuencias de nucleotidos parciales de los alelos de tipo silvestre y mutantes G35T de KRAS.

Secuencia parcial de region de amplificacion para KRAS, tipo silvestre (posicion 35 subrayada):

imagen1

GAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGA TCC A AC A AT AG AGGTA A ATCTTGTTTT A AT ATGC AT ATT ACTGG (SEQ ID N° :D

Secuencia parcial de region de amplificacion para KRAS, mutante G35T (posicion 35 subrayada):

ATG ACTGA AT ATA A ACTTGTGGT AGTTGG AGCTGTTGGCGT AGGC A A GAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAA I ATGA TCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGG (SEQ ID N° :Ji

5

10

15

20

25

30

35

La capacidad para detectar la mutacion T de KRAS en la posicion 35 sobre un fondo de G de tipo silvestre en la posicion 35 se analizo utilizando dos protocolos de termociclacion diferentes, uno de los cuales emplea una ciclacion de una sola etapa y el otro emplea una ciclacion en dos etapas (vease la tabla 1). En los dos protocolos, todas las diluciones presentaban aproximadamente 100.000 copias (es decir, 100.000 plasmidos bicatenarios) de la secuencia de tipo silvestre. A las 100.000 copias de tipo silvestre se les anadieron aproximadamente 10.000, 1.000, 100 y 10 copias del gen diana mutante. Como control se utilizo una muestra que contema 100.000 copias de la secuencia mutante.

La tabla 1 resume las condiciones de ciclacion para el ensayo basado en segmentacion para la termociclacion en una etapa y la termociclacion en dos etapas. La adquisicion de senales fluorescentes tiene lugar a la temperatura de 53 °C, que conduce a la reaccion de segmentacion de la sonda flap de la diana y la segmentacion del fluoroforo del casete FRET mediada por el flap liberado.

Tabla 1. Ciclacion en una etapa en comparacion con el protocolo en dos etapas (Headstart)

Etapa

Temperatura Tiempo Una etapa: numero de ciclos 2 etapas (Headstart): numero de ciclos Adquisicion de senales fluorescentes

Preincubacion (activacion enzimatica)

95 °C 2 min 1 1 Ninguna

Amplificacion (preamp. Headstart)

95 °C 20 s NINGUNO 10 Ninguna

67 °C

30 s Ninguna

70 °C

30 s Ninguna

Amplificacion

95 °C 20 s 50 45 Ninguna

53 °C

1 min. Individual

70 °C

30 s Ninguna

Enfriamiento (mantenimiento)

40 °C 30 s 1 1 Ninguna

Los cebadores par la amplificacion por PCR de la mutacion G35T de KRAS fueron 5'- CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3' (SEQ ID N°: 3) como el cebador inverso y 5-ACTTGTGGTAGT TGGAGCTCT-3' (SEQ ID N°: 4) como el cebador directo. Se ha de senalar que, en el cebador directo, la base 3'T (subrayada) corresponde a la posicion mutante 35. La penultima C en la posicion 34 tambien es un mal emparejamiento tanto con la secuencia mutante como con la secuencia de tipo silvestre, y esta disenada para aumentar la discriminacion de la base 3' contra la diana de tipo silvestre.

La deteccion homogenea de la mutacion G35T de KRAS se llevo a cabo mediante el uso de una sonda flap segmentable por endonucleasa, un casete FRET segmentable y una endonucleasa flap termoestable. La secuencia de la sonda flap para la deteccion de la mutacion G35T era 5'-GACGCGGAGTTGGCGTAGGCA-373C6 (SEQ ID N°: 5), en la que la base mutante se muestra subrayada y el extremo 3' esta bloqueado con un grupo hexanodiol para inhibir la extension. La parte flap segmentada, que a continuacion se une con el casete FRET y a su vez libera el fluoroforo alejandolo de su extintor, incluye todas las bases desde el extremo 5' hasta la T espedfica de la mutacion. Los cebadores y las sondas flap fueron suministrados como artfculos fuera de catalogo por Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa).

El casete FRET utilizado era 5'-FAM/TCT/extintor/AGCCGGTTTTCCGGCT GAGACTCCGCGTCCGT-373C6 (SEQ ID N°: 6), donde FAM es fluorescema, el extintor es Eclipse® Dark Quencher, y el extremo 3' esta bloqueado con un grupo hexanodiol para inhibir la extension del cebador. El casete FRET fue suministrado por Hologic (Madison, Wisconsin).

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en placas LightCycler® 480 Multiwell 96 (Roche, Indianapolis) en MOPS 10 mM pH 7,5, con MgCh 7,5 mM, y dNTPs 250 pM (Promega, Madison, Wisconsin). La Taq polimerasa consistfa en la enzima iTaq (BioRad, Hercules, California) y la enzima de segmentacion era Cleavase 2.0 (Hologic, Madison, Wisconsin). La concentracion del cebador directo era de 50 nM, la concentracion del cebador inverso era de 500 nM, la sonda flap se utilizo en una concentracion de 500 nM, y el casete FRET se empleo en una concentracion final de 200 nM. Toda la amplificacion y deteccion se llevo a cabo en el termociclador optico LightCycler 480 (Roche, Indianapolis, Indiana).

Las figuras 2 y 3 muestran datos brutos y curvas cineticas, generadas mediante el LightCycler, para las dos condiciones de ciclacion diferentes, tal como se resumen en la tabla 1. La tabla 2 presenta los resultados, que muestran la mejona de la respuesta cuantitativa lineal del protocolo de ciclacion en 2 etapas.

La tabla 2 muestra la deteccion y cuantificacion de la mutacion G35T de KRAS en presencia de la secuencia de tipo 5 silvestre en niveles, como se indica, comparando dos protocolos de ciclacion diferentes. El punto en el que la fluorescencia de una muestra aumenta por encima de la fluorescencia de fondo se denomina "punto de cruce (Cp)" de la muestra (Manual Roche LightCycler 480, Indianapolis, Ind.), y en estos ensayos se calcula como el punto en el que la fluorescencia aumento al 18% de la fluorescencia maxima. Los niveles de Cp por encima de 40 ciclos no muestran ninguna respuesta detectable a la dosis.

10 Tabla 2. Deteccion y cuantificacion de la mutacion G35T de KRAS

Copias 35T mutantes

Copias 35G de tipo silvestre Relacion mutante:tipo silvestre Punto de cruce (Cp) en 1 etapa Punto de cruce (Cp) en 2 etapas (Headstart)

0

100.000 N/A 44,56 40,33

0

100.000 N/A 43,87 40,27

10

99.990 1:10.000 43,99 38,89

10

99.990 1:10.000 43,04 38,09

100

99.900 1:1.000 43,39 36,59

100

99.900 1:1.000 43,66 36,31

1.000

99.000 1:100 43,66 31,41

1.000

99.000 1:100 39,70 31,82

10.000

90.000 1:10 39,62 26,71

10.000

90.000 1:10 33,68 26,73

100.000

0 N/A 27,72 20,62

100.000

0 N/A 28,04 20,45

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de analisis de muestras, que comprende: someter una mezcla de reaccion que comprende:

   reactivos de PCR para amplificar una diana de acido nucleico, y

   reactivos de segmentacion flap para llevar a cabo un ensayo de segmentacion flap en dicha diana de acido nucleico,

   a las siguientes condiciones de termociclacion: una primera serie de 5-15 ciclos de:

   i. una primera temperatura de al menos 90 °C;

   ii. una segunda temperatura de 60 °C a 75 °C;

   iii. una tercera temperatura de 65 °C a 75 °C; seguida por: una segunda serie de 20-50 ciclos de:

   i. una cuarta temperatura de al menos 90 °C;

   ii. una quinta temperatura que es al menos 10 °C mas baja que dicha segunda temperatura;

   iii. una sexta temperatura de 65 °C a 75 °C;

   no anadiendose ningun reactivo adicional a dicha reaccion entre dicha primera y dicha segunda serie de ciclos y midiendose la segmentacion de una sonda flap en cada ciclo de dicha segunda serie de ciclos, y

   comprendiendo dicho metodo la medicion de la segmentacion de dicha sonda flap mientras la mezcla de reaccion esta a dicha quinta temperatura.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la segmentacion de dicha sonda flap se mide detectando la fluorescencia de dicha mezcla de reaccion durante cada uno de dichos 20-50 ciclos.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que:

   dichos reactivos de PCR comprenden: un molde de acido nucleico; un primer cebador de PCR, un segundo cebador de PCR, una polimerasa termoestable, y nucleotidos; y

   dichos reactivos de segmentacion flap comprenden: un oligonucleotido invasivo, una sonda flap, un endonucleasa flap termoestable y un casete FRET,

   teniendo dicho primer cebador de PCR y dicho oligonucleotido invasivo secuencias de nucleotidos diferentes.
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que:

   dichos reactivos de PCR comprenden: un molde de acido nucleico; un primer cebador de PCR, un segundo cebador de PCR, una polimerasa termoestable, y nucleotidos; y

   dichos reactivos de segmentacion flap comprenden: un oligonucleotido invasivo, una sonda flap, un endonucleasa flap y un casete FRET,

   teniendo dicho primer cebador de PCR y dicho oligonucleotido invasivo la misma secuencia de nucleotidos.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 4, en el que dicho primer cebador de PCR esta presente en dicha mezcla de reaccion en la misma concentracion que el segundo cebador de PCR.
6. 6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha quinta temperatura esta dentro del intervalo de 50 °C a 55 °C.
7. 7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas condiciones de termociclacion incluyen una primera serie de 8-12 ciclos.
8. 8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha mezcla de reaccion tiene un volumen de 5 pl a 50 pl y cada una de dichas primera a sexta temperaturas tiene, independientemente, una duracion de 10 segundos a 3 minutos.
9. 9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas segunda y tercera temperaturas son la misma temperatura.
10. 10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende la representacion grafica de la cantidad de segmentacion que se produce en cada uno de los ciclos de dicha segunda

    5 serie, proporcionando de este modo una estimacion de la abundancia de dicha mutacion en dicha diana de acido nucleico.
11. 11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho ensayo de segmentacion flap detecta una mutacion en dicha diana de acido nucleico.