KR100880516B1 - 체액에서 핵산의 직접 검출법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기초 연구, 임상 연구에서의 사용 및 임상적 검출 검정의 개발을 위한 핵산 검출 검정의 개선 및 적정화를 위한 방법 및 절차를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 다중 증폭 반응에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 디자인하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 다중 증폭 반응을 적정화하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 결합된 표적 및 신호 발생 검정 방법을 제공한다.

PCR, 인베이더 검정, 핵산, 검출법

Description

체액에서 핵산의 직접 검출법{Direct Nucleic Acid Detection in Bodily Fluids}

본 발명은 특히 정제되지 않은 체액(예로서, 혈액)에서 소량의 핵산을 빠르고 민감하게 검출하기 위하여 신호 증폭반응을 혼합 표적증폭반응과 결합하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 다중 증폭반응을 최적화하는 방법을 제공한다. 본 반응은 또한 인베이더 검정(INVADER assay)과 병합한 높은 다중 PCR(폴리머라아제중합연쇄반응)을 수행하는 방법을 제공한다. 게다가 본 발명은 조작이나 반응물의 추가 없이 단회반응용기(vessel)(예로서, 혈액과 같이 정제되지 않은 체액을 사용하여)에서 인베이더 검정(INVADER assay)과 함께 다중 PCR을 수행하는 방법을 제공한다.

사람 게놈(genome)의 핵산 시퀀싱의 완성으로, 지노믹스 연구에 대한 빠르고, 신뢰적이고, 경제적이고, 사용자에 친숙한 테스트에 대한 요구와 관련 약물의 디자인에 대한 노력들이 크게 증가하였다. 수많은 연구 기관들이 유전자와 유전자 발현 그리고 유전자 표현형 사이의 관계를 규명하기 위하여 가능한 유전적 서열 정 보를 활발하게 밝혀내고 있다(예로서 질병의 상태, 대사반응, 등). 이 분석법들은 개체 및 개체군에서 유전자 돌연변이와 유전학적 및 유전자 발현 이형접합성의 효과를 특징화 하려는 시도를 포함한다.

핵산추출과 증폭의 발전은, 유전물질을 얻을 수 있는 생물학적 시료의 종류를 크게 확장시켰다. 특히, 폴리머라아제 연쇄중합반응(PCR)은 고정된 조직시료, 고고학 표본 및 단일 디지트(digit)에서 다양한 종류의 많은 세포로부터 충분한 DNA의 양을 확보하는 것을 가능하게 하였다. 유사하게, 많은 양의 SNP 지노타이핑(genotyping) 프로젝트는 생물학적 표본으로부터 획득하기 쉽지않을 만한 게놈 DNA의 양을 요구한다. 문제에 대한 하나의 접근으로서, 이 발명은 PCR에 기본적인 표적 증폭에 의존한다.

PCR이 소량의 핵산을 분석가능하게 하는 동안, 이것의 많은 세팅 및 많은 종류의 문제에서 실질응용이 문제로 남는다. 소량의 표적핵산이 반응에 의해 쉽게 증폭되기 때문에, PCR 응용은 (이전)분석에서 (다음)분석으로 오염이 이월되기 매우 쉽다. 이 취약점은 종종 증폭의 조작 후 수많은 유입량을 최소화하는 특정 수단 또는 유입량의 상대적 구성의 확립이 필요하다.

일부에서, 반응 용기의 개폐 없이 실시간으로 반응을 모니터링 하는 것이 가능한 특수화된 기구가 사용된다.

그리고 나서, 소량의 증폭된 서열로부터 신호생성을 극대화하여 표적증폭을 위해 필요한 것을 제한하는 방법이 필요하다.

이하, 도는 본 발명의 일부이며 본 발명의 일부 양태나 양상을 좀 더 설명하기 위하여 포함된다. 발명은 여기에 있는 특이한 양태의 설명과 함께 하나 또는 그 이상의 도에 대한 참조로서 이해될 수 있다.

도 1 은 인베이더 검정의 한 양태를 도식화 한 것이다.

1차 반응에서, 표적 물질(빗금친 사각형)은 프로브(열린 사각형)와 표적 특이적인 부분과 5' 플랩 (채워진 사각형)으로 구성된 1차 프로브와 오버랩-플랩 구조를 형성한다. 오버랩 플랩은 구조-특이적인 5' 뉴클리에이즈에 의해 잘려진다. 오버랩-플랩의 절단 리젼는 1차 프로브의 표적-특이적인 리젼의 5' 말단 뉴클레오타이드 뒤에 존재하는 곳에 화살표로 나타내었다.

SNP 동정을 위해서, 프로브 사이의 오버랩은 다형성 자리(X)의 반대편에 위치시켰다. 만약 X 뉴클레오타이드가 1차 프로브에 상보적이지 않다면, 어떤 특이적인 절단도 일어나지 않는다. 2차 반응에서, 절단된 5' 플랩은 염색제(D) 및 퀀처(quencher(Q))로 표지된 FRET 카세트(회색선)와 오버랩-플랩 구조를 형성한다.

5' 뉴클레이즈(핵산분해효소)에 의한 FRET 카세트의 절단은 언퀀쳐드 염색제를 방출시킨다. 반원 화살표는 신호증폭을 위해 필수적인 올리고뉴클레오타이드 턴오버과정를 나타낸다. 유사한 캐스캐이드(나타내지 않음)가 이중(biplex) 인베이더 검정에서 양자택일의 SNP의 검출을 위해서 사용되곤 했다.

도 2는 PCR 5에 대한 PCR 주기 횟수 n에서 로그함수 증폭 인자 IgF 에 의존적임을 보여주는 그래프인다.

도 3A는 PCR 1(●), PCR 2(○), PCR 4(■), PCR 5(□)에 대한 lgF에서 프라이머 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 3B 는 도 3A에서 보여준 데이터를 사용하여 ln (2-F ^0.05 )와 c 사이의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 4는 시료 7에서 기술한 반응에서 8개 지노믹 DNA 시료의 전체 펨(FAM) 및 레드 인베이더 검정의 신호의 산발적인 점들을 보여준다.

도 5는 시료 7에서 기술된 반응에서 PCR 표적의 길이의 구조로서 성공적인 인베이더 검정를 위한 대립유전자당 정상화된 전체 붉은색의 프로레신 신호을 보여준다

도 6은 시료 7에서 기술된 반응에서 8개의 DNA 시료에 대한 전체 펨신호와 레드신호의 산발적인 점을 보여준다.

도 7은 시료 8의 방법에 의한 혼합표적과 신호 증폭 반응의 결과를 그래프로 디스 플레이하여 보여준다.

도 8은 다중복합 PCR에서 사용할 수 있는 프라이머 세트를 생산하기 위하여 수행한 단계별 아우트라인의 흐름도를 보여준다.

도 9는 시료 8의 방법에 의한 혼합다중복합표적과 신호 증폭 반응의 결과를 디스플레이한 그래프를 보여준다.

도 10은 시료 7에서 기술된 4중(tetraplx) 인베이더(INVADER) 검정의 결과를 디스플레이한 그래프를 보여준다.

도 11A 내지 11G는 미세유체 카드에서 다중 PCR로 증폭된 표적 DNA의 인베이더 분석법 검출의 결과를 디스플레이한 그래프를 보여준다.

도 12A 내지 12G는 미세유체 카드에서 혼합 다중 PCR 및 인베이더 분석법 신호 증폭반응의 결과를 디스플레이한 그래프를 보여준다.

발명의 요약

본 발명은 기초연구, 임상연구에서 사용하고, 임상검출 검정의 발전을 위한 핵산 검출법의 개발 및 최적화를 위한 방법과 절차를 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기를 포함하는 방법을 제공한다; a) 최소한 Y 표적서열에 대한 정보를 제공하는 방법을 포함하며, 여기에서 각각의 표적 서열은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋프린트 리젼의 바로 상위에 인접한 5' 리젼, iii) 풋프린트 리젼의 하위에 인접한 3' 리젼를 포함하고, b) 프라이머 세트가 생성되도록 표적서열정보를 처리하는 것을 포함하며, 여기에서 프라이머 세트는 최소한 Y 표적서열의 정방향 및 역방향 프라이머 서열 각각을 포함하며, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머 각각은 5'-N[x]-N[x-1]- .....-N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 표시되는 핵산서열을 포함하며, 상기 N은 뉴클레오타이드 염기를 나타내고, x는 최소 6이고, N[1]은 뉴클레오타이드 A 또는 C 이고, 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'에 대해서도 상보적이지 않다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기를 포함하는 방법을 제공한다: a)최소한 Y 표적서열에 대한 정보를 제공하는 방법을 포함하며, 여기에서 각각의 표적 서열은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋프린트 리젼의 상위에 인접한 5' 리젼, iii) 풋프린트 리젼의 하위에 인접한 3' 리젼를 포함하고, b) 프라이머 세트가 생성되도록 표적서열정보를 처리하는 것을 포함하며, 여기에서 프라이머 세트는 최소한 Y 표적서열의 정방향 및 역방향 프라이머 서열 각각을 포함하며, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머 각각은 5'-N[x]-N[x-1]- .....-N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 표시되는 핵산서열을 포함하며, 상기 N은 뉴클레오타이드 염기를 나타내고, x는 최소 6이고, N[1]은 뉴클레오타이드 G 또는 T 이고, 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'와도 상 보적이지 않다.

구체적인 양태에서, 방법은 ; a) 최소한 Y 표적서열에 대한 정보를 제공하는데, 여기에서 각각의 표적 서열은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋프린트 리젼의 상위에 인접한 5' 리젼, iii) 풋프린트 리젼의 하위에 인접한 3' 리젼를 포함하고, b) 프라이머 세트가 생성되도록 표적서열정보를 처리하는 것을 포함하며, 여기에서 프라이머 세트는 i) Y 표적서열의 각각에 대한 5' 리젼의 최소한 일부분에 대해 동일한 정방향 프라이머 서열 및 ii) 최소한 Y 표적서열의 각각에 대한 3' 리젼의 상보적인 서열에 대한 최소한의 부분에 대해 동일한 역방향 프라이머 서열을 포함하며, 여기에서 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 서열은 5'-N[x]-N[x-1]- .....-N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 표시되는 핵산서열을 포함하며, 상기 N은 뉴클레오타이드 염기를 나타내고, x는 최소 6이고, N[1]은 뉴클레오타이드 A 또는 C 이고, 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'와도 상보적이지 않다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 최소한 Y 표적서열에 대한 정보를 제공하는데, 여기에서 각각의 표적 서열은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋프린트 리젼의 상위에 인접한 5' 리젼, iii) 풋프린트 리젼의 바로 하위에 인접한 3' 리젼를 포함하고, b) 프라이머 세트가 생성되는 표적서열정보를 처리하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기에서 프라이머 세트는 i) Y 표적서열의 각각에 대한 5' 리젼의 최소한 일부분에 대해 동일한 정방향 프라이머 서열 및 ii) 최소한 Y 표적서열의 각각에 대한 3' 리젼의 상보적인 서열에 대한 최소한의 부분에 대해 동일한 역방향 프라이머 서열을 포함하며, 여기에서 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 서열은 5'-N[x]-N[x-1]- .....-N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 표시되는 핵산서열을 포함하며, 상기 N은 뉴클레오타이드 염기를 나타내고, x는 최소 6이고, N[1]은 뉴클레오타이드 T 또는 G 이고, 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머의 어떤 곳의 N[2]-N[l]-3'와도 상보적이지 않다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 a) 최소한 Y 표적 서열에 대한 표적 서열정보를 제공하며, 여기에서 각각의 표적서열은 단일염기다형성(SNP)를 포함하고, b) 하나 또는 그 이상의 검정 프로브는 각각의 표적서열이 있는 풋프린트 리젼과 같은 단일염기다형성(SNP)를 검출하기 위하여 결합할 수 있는, 각각의 표적서열이 있는 위치를 결정하며, c) 프라이머 세트가 생성되는 것과 같은 표적서열정보를 처리하는 것을 포함하는데 , 여기에서 프라이머 세트는 i) 정방향 프라이머 서열은 각 Y 표적 서열에 대해 5' 리젼의 최소한의 부분이 동일하며 ii) 역방향 프라이머 서열은 각각의 최소한의 Y 표적 서열에 대한 3' 리젼에 인접한 표적서열과의 상보적인 서열의 최소한의 부분이 동일하며, 여기에서 정방향 및 역방향 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]w-3' 로 표시되는 핵산서열을 포함하고, 상기 N은 뉴클레오타이드 염기를 나타내고, x는 최소 6 이고, N[1]은 뉴클레오타이드 A 또는 C 이고, 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트의 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'와 상보적이지 않다.

일부 하나의 양태로서, 본 발명은 하기의 내용을 포함한다: a) 최소한 Y 표 적 서열에 대한 표적 서열정보를 제공하며, 여기에서 각각의 표적서열은 단일염기다형성(SNP)를 포함하고, b) 하나 또는 그 이상의 검정 프로브는 각각의 표적서열이 있는 풋프린트 리젼과 같은 단일염기다형성(SNP)를 검출하기 위하여 결합할 수 있는, 각각의 표적서열이 있는 위치를 결정하며, c) 프라이머 세트가 생성되는 것과 같은 표적서열정보를 처리하는 것을 포함하는데 , 여기에서 프라이머 세트는 i) 정방향 프라이머 서열은 각 Y 표적 서열에 대해 5' 리젼의 최소한의 부분이 동일하며 ii) 역방향 프라이머 서열은 각각의 최소한의 Y 표적 서열에 대한 3' 리젼에 인접한 표적서열과의 상보적인 서열의 최소한의 부분이 동일하며, 여기에서 정방향 및 역방향 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3' 로 표시되는 핵산서열을 포함하고, 상기 N은 뉴클레오타이드 염기를 나타내고, x는 최소 6 이고, N[1]은 뉴클레오타이드 G또는 T 이고, 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트의 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3'와도 상보적이지 않다.

하나의 양태로서, 프라이머 세트는 최소한 Y 앰플리콘을 증폭하는 다중 PCR 반응을 수행하기 위해 구성되었고, 여기에서 각 앰플리콘은 정방향 및 역방향 프라이머의 위치에 의해 정의된다. 다른 하나의 양태로서, 프라이머 세트는 디지털 또는 프린트된 서열정보이다. 또 다른 하나의 양태로서, 프라이머 세트는 물리적인 프라이머 올리고뉴클레오타이드로 생성된다.

하나의 양태로서, 각각의 정방향 및 역방향 프라이머의 N[3]-N[2]-N[l]-3'는 프라이머 세트에서 어떤 정방향 및 역방향 프라이머의 N[3]-N[2]-N[l]-3'와도 상보적이지 않다. 다른 하나의 양태로서, 그 과정은 5' 리젼의 대부분의 3'의 A 또는 C로 각각의 정방향 프라이머에 대해 최초의 N[l]을 선택하는 것을 포함한다. 일부의 양태로서, 그 과정은 5' 리젼의 대부분 3'의 G 또는 T로 각각의 정방향 프라이머에 대해 최초의 N[l]을 선택하는 것을 포함한다. 일부의 양태에서, 그 과정은 5' 리젼에서 대부분 3'의 A 또는 C로서 다음의 각각의 정방향 프라이머에 대해 최초로 [l]을 선택하는 것을 포함하며, 여기에서, 상기 과정은 또한, 각 정방향 프라이머의 N[2]-N[1]-3' 가 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[1]-3' 과도 상보적이지 않는다는 요구를 가지지 않는, 정방향 프라이머 서열을 위한 5' 리젼에서 다음 대부분의 3'의 A 또는 C의 정방향 프라이머 서열에 대해 N[1]을 교체하는 것을 포함한다.

다른 하나의 양태로서, 그 과정은 3' 리젼의 상보성에서 대부분의 3'의 A 또는 C 로서 역방향 프라이머의 각각에 대해 최초로 N[1]을 선택하는 것을 포함한다. 일부의 양태로서, 그 과정은 3' 리젼의 상보성에서 대부분의 3'의 G 또는 T로서 역방향 프라이머의 각각에 대해 최초의 N[1]을 선택하는 것을 포함한다. 또 다른 하나의 양태로, 그 과정은 3' 리젼의 대부분의 3'의 A 또는 C 다음으로서 역방향 프라이머의 각각에 대해 최초의 N[1]을 선택하는 것을 포함하며, 여기에서 그 과정은, 역방향 프라이머 서열은 각각 역방향 프라이머의 N[2]-N[1]-3'가 프라이머 세트의 어떤 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[1]-3'에 대해 상보적이지 않는다는 요구를 실패한, 역방향 프라이머 서열을 위한 3' 리젼에서 다음 대부분의 3'의 A 또는 C 의 역방향 프라이머 서열에 대해 N[1]을 교체하는 것을 포함한다.

하나의 구체적인 양태로서, 풋프린트 리젼은 단일염기다형성을 포함한다. 일 부하나의 양태로서, 풋프린트 리젼은 돌연변이를 포함한다. 일부 하나의 양태로서, 각 표적서열의 풋프린트 리젼은 단일염기다형성을 검출하기 위하여 하나 또는 그 이상의 검정의 프로브와 결합하는 표적서열의 부분을 포함한다. 하나의 양태로, 풋프린트 리젼은 프로브가 결합할 리젼이다. 다른 하나의 양태로, 풋프린트는 다른끝의 추가적인 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부의 양태에서, 그 과정은 분석 성분 서열과 80% 이하의 유사성이 있는 각각의 정방향 및 역방향 프라이머에 대하여 N[5]-N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3‘을 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 양태로서, 분석 성분은 FRET 프로브 서열이다. 하나의 양태로서, 표적 서열은 길이로, 약 300 내지 500 염기쌍이거나, 또는 200 내지 600 쌍이다. 하나의 양태로서, Y는 2 내지 500 사이, 또는 2 내지 10,000 사이의 정수이다.

임의의 양태에서, 그 과정은, 정방향 및 역방향 프라이머 각가이 약 50 ℃의 녹는점 온도를 가진(예로서, 50℃, 또는 최소 50℃및 최대 55℃) 표적서열에 대한 정방향 및 역방향으로 x를 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 양태로, 프라이머의 녹는점 온도(표적 서열과 결합할 때)는 최소 50℃이나, 선택된 검색법의 적정반응 온도와 최소 10℃ 이상 다르다.

일부의 양태로, 정방향 및 역방향 프라이머 쌍의 적정온도는 프라이머 세트에 대해 결정된다. 다른 양태로서, 그 과정은 전자동화 된다. 또 다른 양태로서 그 과정은 프로세서와 함께 전자동화 된다.

다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 프라이머 세트와 최소한 하나의 다른 성분(예로서, 분해제), 폴리머라아제, 인베이더 올리고 뉴클레오타이드)을 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 프라이머(들) 및 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 제공한다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 하기의 방법을 제공한다; a) i) a 서열 데이터를 받기위해 배열된 사용자 인터페이스(interface), ii) 다중 PCR 프라이머 응용 소프트웨어가 저장된 컴퓨터 시스템을 제공하며, b) 사용자 인터페이스에서 컴퓨터 시스템으로 서열 데이터를 전달하는 것으로, 여기에서 서열 데이터는 적어도 Y 표적서열을 위한 표적 서열 정보이며, 여기에서 각각의 표적 서열은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋 프린트 리젼의 바로 상위의 5'리젼, 및 iii) 풋프린트 리젼에 인접한 하위의 3'리젼이고, c) 프라이머 세트를 생성하기 위한 다중 PCR 프라이머 쌍 응용 소프트웨어를 가진 표적서열정보를 처리하는 것를 포함하며, 여기에서 프라이머 세트는 i)각각의 Y 표적 서열을 위한 풋프린트 리젼에 인접한 표적 서열의 최소한의 부분과 동일한 정방향 프라이머 및 ii) 최소한의 Y 표적 서열 각각에 대하여 3‘의 풋 프린트 리젼에 인접한 서열에 상보적인 최소 한 부분에 대해 동일한 역방향 프라이머 서열이며, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머 서열은 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 표기되는 핵산서열을 포함하며, 여기에서 N은 뉴클레오타이드 염기를, x는 최소한 6 이며, N[1]은 뉴클레오타이드 A 또는 C, 및 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 N[2]-N[l]-3’이 프라이머 세트의 모든 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3’에 대해 상보적이지 않다.

일부 하나의 양태로서, 본 발명은 하기의 방법을 제공한다; a) i) 서열 데이터를 받기 위해 구성된 사용자 인터페이스(interface), ii) 다중 PCR 프라이머 응용 소프트웨어가 저장된 컴퓨터 시스템을 제공하며, b) 사용자 인터페이스에서 컴퓨터 시스템으로 서열 데이터를 전달하는 것을 제공하는데, 여기에서 서열 데이터는 적어도 Y 표적서열을 위한 표적 서열 정보이며, 여기에서 각각의 표적 서열은 i) 풋 프린트리젼, ii) 풋프린트 리젼에 바로 인접한 상위의 5'리젼, 및 iii) 풋 프린트 리젼에 바로 인접한 하위의 3'리젼이고, c) 프라이머 세트를 생성하기 위한 다중 PCR 프라이머 쌍 응용 소프트웨어를 가진 표적서열정보를 처리를 포함하며, 여기에서 프라이머 세트는 i)각각의 Y 표적 서열을 위한 풋 프린트 리젼에 인접한 표적 서열의 최소한 일부분이 동일한 정방향 프라이머, 및 ii) 최소한의 Y 표적 서열 각각에 대하여 5‘의 풋프린트 리젼에 인접한 서열에 상보적인 최소한 부분에 대해 동일한 역방향 프라이머 서열이며, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머 서열은 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'\로 표기되는 핵산서열을 포함하며, 여기에서 N은 뉴클레오타이드 염기를, x는 최소한 6이며, N[1]은 뉴클레오타이드 A 또는 C, 및 정방향 및 역방향 프라이머의 각각의 N[2]-N[l]-3’은 프라이머 세트의 모든 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3’와도 상보적이지 않다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기를 포함하는 시스템을 제공한다; a) 사용자 인터페이스(interface)로부터 데이터를 받기 위하여 구성된 컴퓨터 시스템으로, 여기에서 사용자 인터페이스는 서열 데이터를 받기 위해 구성된 것이고, 여기에서 서열데이터는 최소한 Y 표적 서열에 대한 표적 서열정보를 포함하며, 여기에서 표적 서열 각각은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋프린트 리젼의 바로 인접한 상위의 5‘ 리젼 iii) 풋프린트 리젼의 바로 인접한 하위의 3’을 포함하며, b) 다중 PCR 프라이머 쌍 응용 소프트웨어는 사용자 인터페이스에 실시가능하게 연결되어있으며, 여기에서 다중 PCR 프라이머 응용 소프트웨어는 프라이머 세트를 생산할 표적서열정보를 처리하기 위해 구성되어지며, 여기에서 프라이머 세트는 i) Y 표적 서열의 각각에 대해 풋프린트 리젼의 5‘에 바로 인접한 표적서열의 최소한 일부분과 동일한 정방향 프라이머, ii) 최소한 Y 서열의 각각에 대해 풋 프린트 리젼의 3‘에 바로 인접한 표적서열의 최소한 일부분과 동일한 역방향 프라이머이며, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머 서열은 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 표기되는 핵산서열을 포함하며, 여기에서 N은 뉴클레오타이드 염기를, x는 최소한 6 이고, N[1]은 뉴클레오타이드 A 또는 C 이고, 정방향 및 역방향 프라이머의 각각의 N[2]-N[l]-3은 프라이머 세트의 모든 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3’에 대해 상보적이지 않으며, c) 다중 PCR 프라이머 쌍 응용 소프트웨어가 저장된 컴퓨터 시스템을 포함하며, 여기에서 컴퓨터 시스템은 컴퓨터 저장장치와 컴퓨터 프로세서를 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 하기를 포함하는 시스템을 제공한다; a) 사용자 인터페이스(interface)로부터 데이터를 받기 위하여 구성된 컴퓨터 시스템으로, 여기에서 사용자 인터페이스는 서열 데이터를 받기 위해 구성된 것이고, 여기에서 서열데이터는 최소한 Y 표적 서열에 대한 표적 서열정보를 포함하며, 여기에서 표적 서열 각각은 i) 풋프린트 리젼, ii) 풋프린트 리젼에 바로 인접한 상위의 5' 리젼 iii) 풋프린트 리젼에 바로 인접한 하위의 3’을 포함하며, b) 다중 PCR 프라이머 쌍 응용 소프트웨어는 사용자 인터페이스에 실시간 가능하게 연결되어있으며, 여기에서 다중 PCR 프라이머 응용 소프트웨어는 프라이머 세트를 생산할 표적서열정보를 처리하기 위해 구성되어지며, 여기에서 프라이머 세트는 i) Y 표적 서열의 각각에 대해 풋프린트 리젼의 5‘에 바로 인접한 표적서열의 최소 일부분과 동일한 정방향 프라이머, 및 ii) 최소한 Y 서열의 각각에 대해 풋 프린트 리젼의 3‘에 바로 인접한 표적서열의 최소한 한부분과 동일한 역방향 프라이머이고, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머 서열은 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3' 로 표기되는 핵산서열을 포함하며, 여기에서 N은 뉴클레오타이드 염기이고, x는 최소한 6 이고, N[1]은 뉴클레오타이드 G 또는 T 이고, 그리고 정방향 및 역방향 프라이머의 각각의 N[2]-N[l]-3’은 프라이머 세트의 모든 정방향 및 역방향 프라이머의 N[2]-N[l]-3’과도 상보적이지 않으며, c) 다중 PCR 프라이머 쌍 응용 소프트웨어가 저장된 컴퓨터 시스템을 포함하며, 여기에서 컴퓨터 시스템은 컴퓨터 저장장치와 컴퓨터 프로세서를 포함한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 단회 반응 용기에서 표적 처리 및 신호증폭반응을 위한 방법을 제공한다. 바람직한 하나의 양태로, 표적 증폭반응은 PCR 반응이다. 일부 가장 바람직한 양태로서, 신호증폭반응은 인베이더 (침습성 절단(invasive cleavage)) 검정 이다. 다른 하나의 양태로서, 혼합된 표적 및 신호증폭반응의 시약은 반응 시작 전에 추가된다. 일부의 양태로, 표적 증폭 반응은 20 주기 후에 종결되어진다. 일부 바람직한 양태로, 표적 증폭반응은 15 주기 후 에 종결된다. 일부 가장 바람직한 양태로, 표적 증폭반응은 11주기 후에 종결된다. 일부의 양태로, 일부 조성은 남은 검정 조성의 추가에 앞서 미리 분배되어 진다. 바람직한 양태로, 미리 나누어진 시약은 반응용기에서 건조된다. 가장 바람직한 양태로, 미리 분배된 시약은 하나 또는 그 이상의 인베이더 검정 시약을 포함한다. 일부의 양태로, 반응 용기는 미세유체(microfluidic card) 카드를 포함한다. 바람직한 양태로, 반응용기는 원심의 또는 구심의 분배, 또는 용액반응 및 반응 조성의 조작을 포함한다.

전혀 다른 양태로서, 본 발명은 예로서, 단회 반응 또는 반응 용기에서 중복염색의 다중 FRET 인베이더 검정를 처리하는 방법 및 조성을 제공한다. 일부의 바람직한 양태로서, 다중 FRET 검정은 합성된 표적으로 수행한다. 또 다른 일부의 바람직한 양태로서, 다중 FRET 에쎄이는 핵산 절편 표적, 예로서 PCR 앰프리콘으로 수행한다. 일부 가장 바람직한 양태로서, 다중 FRET 검정은 게놈 DNA 표적으로 수행한다. 전혀 다른 바람직한 양태로, 다중 FRET 검정은 RNA 표적으로 수행한다. 일부 가장 바람직한 양태로, 다중 FRET 검정은 4중 반응이다.

일부의 양태에서, 하나 또는 그 이상의 인베이더 검정 반응은 미리 분배된(즉, 재측정 또는 재분배 없는 처리과정 단계에서 사용자를 위하여 미리 측정된) 포맷으로 제공될 수 있다. 일부의 양태로서, 선택된 인베이더 검정 시약조성은 함께 혼합하여 미리 분배된다. 바람직한 양태로서, 미리 분배된 검정 시약조성은 반응용기에 미리 분배되어 제공된다(반응튜브 또는 웰, 예로서 마이크로타이터 플레이트를 포함하나 이로 제한하지 않는다). 가장 바람직한 양태로, 미리 분배된 인 베이더 검정 시약 조성은 반응용기에 건조 침강된다(탈수되거나 또는 냉동 건조된다).

일부 하나의 양태로서, 인베이더 검정 시약은 키트로 제공된다. 여기에서 사용한 용어, 키트는 전달 물질을 위한 어떤 전달시스템을 말한다. 반응 검정와 관련하여, 전달 시스템은 한 장소에서 다른 장소로 저장, 수송 또는 반응 시약(올리고뉴클레오타이드, 효소 등 적당한 컨테이너 내에) 및/또는 지지물질(예로서, 완충 용액, 검정를 수행하기위한 기구 등)의 전달을 위해 요구되는 시스템을 포함한다. 예를 들면, 키트는 하나 또는 그 이상의 적절한 반응시약이 포함된 봉입물(예로서, 박스) 및/또는 지지하는 시약을 포함한다. 여기에서 사용된 용어, 분리된 키트(fragmented kit)는, 전체 키트 조성의 구성물이 각각 포함된 둘 또는 그 이상으로 나누어진 컨테이너를 포함하는 전달 시스템을 말한다. 그 컨테이너는 수취인에게 함께 또는 따로 전달될 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 컨테이너가 사용자를 위한 검정의 효소를 포함하고, 두 번째 컨테이너는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 용어, "분리된 키트(fragmented kit)"는 미 연방 식약청(the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) 제 520항 e에 지배를 받는 ASR's(분석에 특이한 시약(Analyte specific reagents)을 포함하는 포함 키트에 해당 되나, 이로 제한하지 않는다. 확실히, 모든 전달 시스템은 전체 키트의 구성성분을 각각 포함하는, 둘 또는 그 이상의 분리된 컨테이너는 “분리된 키트”라는 용어에 포함된다. 반대로, "혼합 키트(combined kit)"는 하나의 컨테이너에 반응 검정의 모든 구성물을 포함하는(예로서, 한 박스안에 각 조성물 각각이 모아진) 전달 시스템을 말한다. 용어, ”키트”는 분리된 및 혼합된 키트 모두를 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 실습을 위해 필요한 하나 또는 그 이상의 인베이더 검정 시약 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 인베이더 검정를 실행하는데 필수적인 효소 및/또는 반응조성을 저장할 또는 전달할 키트를 제공한다. 그 키트는 검정를 위한 어떤 및 모든 필요 조성 또는 바람직한 조성; 시약, 완충용액, 대조시약(예로서, 조직 시료, 양성 또는 음성 대조 표적 올리고뉴클레오타이드 등), 고체 지지대, 라벨, 글 또는 그림으로 된 설명서 및 생산 정보, 인히비터(inhibitors) 표지 및/또는 검출 시약, 시약을 위한 환경 조절 패키지(예로서, 얼음, 데시케이트 등) 등을 포함하나, 이로 제한하지 않는다. 일부 하나의 양태로, 키트는 필요한 구성의 세부품목을 제공한다. 여기에서 이것은 사용자가 남은 구성 성분을 제공할 것이라고 기대된다.

일부 양태에서, 키트는 둘 이상의 별도의 컨테이너를 포함하며, 여기에서 각 컨테이너는 전달될 성분의 일부를 담지한다. 예를 들어, 첫 번째 컨테이너(예로서, 박스)는 효소(예로서, 가장 적당한 저장 완충용액 및 컨테이너에 (보관된) 특이한 절단 효소)를 포함하며, 두 번째 박스는 올리고뉴클레오타이드(예로서, 인베이더 올리고뉴클레오타이드, 프로브 올리고뉴클레오타이드, 대조 표적 올리고뉴클레오타이드, 등)을 포함할 수 있다.

용어 정의

본 발명의 이해를 쉽게하기 위하여, 용어 및 구를 다음과 같이 정의하였다:

상기에서 사용된 용어, "SNP" , "SNPs" 또는 "단일염기다형성" 은 개체(예로서, 사람)의 게놈에서 특정 위치에서 단일 염기 변화를 말한다. "SNPs" 는 유전자를 코딩하는 부분이 아닌 게놈의 부분에 존재할 수 있다. 다른 하나의 양태로, "SNP" 는 유전자의 코딩 부분에 존재할 수 있다. 이 경우에, "SNP"는 RNA 또는 그와 관련된 단백질의 구조와 기능을 변화시킬수 있다.

상기에서 사용된 용어, "대립유전자(allele)" 는 주어진 서열의 다양한 형태 (예로서 SNP를 하나 또는 그 이상을 포함하는 유전자를 포함하나, 이로 제한하지는 않는다)를 말한다. 수많은 유전자가 개체(population)에서 다중 대립유전자의 형태를 나타낸다. 유전자의 두 가지 다른 대립유전자를 가지는 배수의 생물(이형접합체)은 동일한 대립유전자의 두 가지 카피를 가지므로, 그 유전자에 대해서 이형접합(헤테로)이라 말한다.

상기에서 사용된 용어, "결합체(linkage)"는 크로모좀에서 둘 이상의 근접한 마커(예로서, 유전자)의 근접성을 말한다.

상기에서 사용된 용어, "대립유전자 발생빈도"는 주어진 개체(예로서, 특이적인 성, 종 또는 인종집단)에서 대립유전자(예로서, SNP를 포함하는 서열)가 일어날 발생빈도를 말한다. 어떤 개체는 다른 개체들보다 그 개체의 구성원의 높은 퍼센트 내에서 주어진 대립유전자를 포함할지도 모른다. 예로서, BRCAl라 불리는 유방암 유전자의 특이 돌연변이가 일반적인 유대인 인종의 경우, 1% 내에 존재함을 발견하였다. 대조적으로, 일반적인 미국 인종 내의 개체의 경우, BRCAl의 일부 돌연변이가 0.1 내지 0.6 % 내에 추정되고 있다. BRCAl 유전자 중 하나 및 BRCA2 라 불리는 유방암 유전자 중 다른 하나인 두 가지 추가적인 돌연변이는 아시케나지(Ashkenazi) 유대인 인종에서 아주 널리 퍼져있고, 이 세 돌연변이 중 하나는 전체적으로 2.3 %까지의 위험률을 가져온다.

상기에서 사용된 용어, "인실리코(in silico) 분석법" 은 컴퓨터 프로세스와 컴퓨터 메모리를 사용하여 수행된 분석법을 말한다. 예로서, "인실리코 SNP 분석법"은 컴퓨터의 처리장치와 저장장치를 사용하여 SNP 데이터를 분석한 것을 말한다.

상기에서 사용된 용어, "유전자형(genotype)"은 생물체에서 활동하는 유전자의 구성(예로서, 유전자적 좌표에서 수행된 특이 대립유전자의 관점에서)을 말한다. 유전자형의 발현은 생물체의 생리적 표현 및 특성-"유전자형"에 대해 발생한다.

상기에서 사용된 용어, "유전자좌(locus)" 는 크로모좀에서 유전자의 위치 또는 다른 특징적인 서열의 위치를 말한다.

상기에서 사용된 용어, "질환(disease)" 또는 "질환 상태(disease stat)"는 정상적인 또는 평균적인 종류로서 간주 되는 조건의 편차를 말하며, 그 종류(예, 설사, 메스꺼움, 열, 통증 및 염증반응 등)의 주된 각각에 대해 불리하지 않은 조건하에서 영향을 받은 각각에 대한 손실이다.

상기에서 사용된 용어인, 의료적인 과정에 대해 언급된 "치료"는 추정되는, 예견되는, 또는 현존하는 질환의 상태 또는 질환 상태의 손실 또는 예상되는 손실의 결과로서 영향받은 개인에 대해 취해지는 단계 또는 작용을 말한다. 상기 치료 는 질환상태의 예견에서 또는 질환 상태 혹은 질환 상태로 의심되는 데에 대한 반응에 제공될지도 모르며, 예방, 개량, 완화 또는 치료과정이 포함되나, 이로 제한하지 않는다. 용어 "요법(therapy)"은 치료의 특별한 과정을 말한다.

용어 "유전자(gene)"는 폴리펩타이드, RNA(예로서, rRNA, tRNA, 등), 또는 전구체를 생산하기 위하여 필요한 코딩서열로 구성되어 있는 핵산서열(예로서, DNA)을 말한다. 폴리펩타이드, RNA, 또는 전구체는 전체 길이의 암호화하는 서열이나, 전체길이나 단편에 남아있는 바람직한 활성 또는 기능적 성질(예로서, 리간드 결합, 신호전달 등)을 가지는 코딩서열의 일부분에 의해 암호화 할 수 있다. 상기 유전자는 구조적인 유전자의 암호화 부분 및 전체길이의 rnRNA의 길이에 대한 유전자에서와 같이 양 말단에 약 1 kb의 길이에 대하여 암호화 부분에 인접한 5' 및 3' 말단서열 모두를 포함한다. 암호화 부분의 5'에 위치하고, mRNA 에 존재하는 서열은 5' 비번역 서열이라 말하고, 암호화 부분의 3' 쪽에 위치하거나 암호화 부분의 하위에 있고, mRNA 에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열이라 말한다. 용어 "유전자(gene)"는 유전자의 cDNA 및 게놈형태를 포함한다. 게놈 형태 또는 유전자의 클론은 "인트론" 또는 "간섭부분" 또는 "간섭서열"로 언급되는 비암호화 서열에 의해 간섭받는 암호화부분을 포함한다. 인트론은 유전자가 이형접합의 핵 RNA(hnRNA)로 전사될 때 포함되는 단편이다; 인트론은 인핸서와 같은 조절 단편을 가질 수도 있다. 인트론은 핵 또는 초기 전사체로부터 제거되거나 "스플라이싱 제거" 될 수도 있다; 그러므로, 인트론은 일반적으로 메신저 RNA(rnRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역하는 동안 초기 폴리펩타이드의 서열을 지정하거나 아미노산을 명령하는 기능을 한다. 유전자의 전사부분에서 다양성 (예로서, 돌연변이, SNPS, 인트론, 결손)은 생성된 RNA들(예로서, hnRNA들, mRNA들, rRNA들, tRNA들)의 부분에서 반영되고, 일반적으로 검출 되어질 수 있다.

"아미노산 서열(amino acid sequence)"은 당연히 단백질로 형성될 아미노산 서열을 말한다. 폴리펩타이드 또는 단백질과 같이 아미노산 서열 및 그 유사어는 열거된 단백질 분자와 연계된 완전한, 본성의 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열에 제한하는 의미는 아니다.

인트론을 포함하는 것 이외에, 유전자의 게놈 형태는 또한 RNA 전사체에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단에 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 이 서열들은 "플랭킹" 서열 또는 부위 (이 플랭킹 서열은 mRNA 전사체의 비번역 서열의 5' 또는 3'에 존재한다)를 말한다. 플랭킹 리젼는 유전자의 전사에 영향을 주는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절서열을 포함할 수 있다. 3' 프랭킹 부위는 전사의 종결, 전사 후 절단 및 폴리아데닐레이션을 지시하는 서열을 포함할 수 있다.

용어 "야생형(wild-type)"은 유전자 또는 유전자 산물이 자연적으로 발생하는 원천으로부터 분리되어 질 때의 특성을 갖는 유전자 또는 유전자 산물을 말한다. 야생형 유전자는 개체에서 가장 빈번하게 관찰되고, 따라서, 유전자의 "정상(normal)" 또는 "야생형(wild-type)" 형태는 임의로 설계된다. 반면, 용어 "변형된(modified)", "돌연변이(mutant)" 또는 "변종(variant)"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하였을 때 서열 그리고/또는 기능적인 성질(예로서, 변형된 특징)에서 변성이 나타나는 유전자와 유전자 생성물을 말한다. 자연적으로 발생되 는 돌연변이가 분리되어 질 수 있음을 언급하였으며; 이는 야생형 유전자 및 유전자 산물과 비교하였을 때 특성이 변성되어진 사실에 의해 정의되어진다.

상기에서 언급한 용어, "핵산물질 암호화(nucleic acid molecular encoding)","DNA 서열 암호화" 및 "DNA 암호화" 는 데옥시리보 핵산의 가닥을 따라 데옥시리보뉴클레오타이드의 서열을 명령하는 것을 말한다. 이 데옥시리보뉴클레오타이드의 순서는 폴리펩타이드(단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 이 경우에, 따라서 DNA 서열은 아미노산 서열을 암호화 한다.

DNA 및 RNA 분자는, 모노뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 만들기 위해 모노뉴클레오타이드 펜토스(5각) 링의 5' 인산기가 이웃하는 뉴클레오타이드 링의 3' 산소기와 포스포디에스테르 결합을 통하여 한 방향으로 붙는 방식으로 반응되기 때문에, "5' 말단" 및 "3' 말단" 을 가진다. 그러므로, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리누클레오타이드의 말단은, 5' 말단, 즉 5' 인산기가 3' 산소기와 결합되어 있지 않은 것을 말하며, 3' 말단, 즉 3' 산소기가 5'인산기와 결합 되어 있지 않은 것을 말한다. 말단으로 언급되는 상기에서 언급한 용어, 핵산 서열, 심지어 큰 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 내부에도 5' 및 3' 말단을 가질 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자 모두에서, 분리된 요소는 5'의 "상위의(상위방향(upstream))" 또는 3'의 "하위의(하위방향의(downstrem))"에 해당하는 것을 말한다. 이 종결은 DNA 가닥을 따라 5'에서 3' 방식으로 전사과정이 반영된다. 프로모터와 인핸서는 암호화 리젼의 5' 또는 상위에 일반적으로 존재하면서 결합된 유전자의 전사를 명령한다. 그러나, 인핸서 는 프로모터와 암호화 리젼의 3'에 위치할 때 그 효력이 발휘된다. 전사 종결 및 폴리뉴클레오타이드 신호는 3' 또는 암호화 리젼의 하위에 있다.

상기에서 언급한 구, "유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(an oligonucleotide having a nucleotide sequence encoding a gene)" 및 "유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드(plynucleotide having a nucleotide sequence encoding a gene)"은 유전자의 암호화 부분을 포함하는 핵산 서열 또는 다른 말로, 유전자 산물을 암호화하는 핵산서열을 의미한다. 암호화 부분은 cDNA, 게놈, DNA, 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다.ㄱD게p센스 스트랜드) 또는 이중가닥의 형태로 존재할 수 있다. 인핸서/ 프로모터, 스플라이스 정션, 폴리아데닐레이션 신호 등과 같은 바람직한 조절 요소는, 만약 전사의 적절한 시작 및/또는 초기 RNA 전사체의 정확한 프로세싱을 허락하는 것이 필요하다면 유전자의 암호화 리젼의 앞쪽에 위치할 수 있다. 바꿔말하면, 본 발명에서 발현벡터에서 활용된 암호화 리젼는, 내생적인 인핸서/프로모터, 슬라이스 정션, 간섭 서열, 폴리아데닐화 신호 등 또는 내생적 및 외생적인 조절자의 혼합를 포함할 수 있다.

상기에서 언급한 용어, "상보적(complementary)" 또는 "상보성(complementarity)" 은 염기쌍 법칙에 연관된 폴리뉴클레오타이드(예로서 뉴클레오타이드 서열)를 언급할 때 사용된다. 예로서, "5'-A-G-T-3'" 서열은 "3'-T-C-A-5'" 서열과 상보적이다. 상보성은 염기쌍 법칙에 따라 핵산의 염기의 일부만이 일치되는 "부분적(particial)"일 수도 있으며, 또는 핵산의 사이가 "완전(compete)" 하거나 "전체"가 상보적일 수도 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도가 핵산 가닥 사이의 결합의 효과와 세기에서 중요한 역할을 가진다. 이는 핵산 사이의 결합에 의존적인 검출 방법 만큼이나 증폭반응에서 아주 중요하다.

용어, "상동성(homology)" 은 상보성의 정도를 말한다. 그것은 부분적인 상동성 또는 완전한 상동성(예로서, 동일성)일 수도 있다. 부분적인 상보적 서열은 최소한, 결합에서 표적 핵산까지 완전하게 상보적인 서열을 부분적으로 저해하는 것이고, 기능적인 용어 "높은 상동성" 을 이용하기 위해 언급되었다. 용어, "결합저해(inhibition of binding)"은 핵산 결합 시에 언급되는 것으로, 표적서열의 결합에 대한 상동성 서열의 경쟁에 의해 발생 되는 결합의 저해를 말한다. 표적 서열에 대한 완전한 상보적 서열의 결합 저해는 낮은 스트린젠시(stringency) 하에서 하이브리다이제이션 검정(결합 측정법; 예로서, 서던 또는 노던 블랏, 서던 하이브리다이제이션 등)를 사용하여 조사할 수 있다. 상당한 상동성(substancially homology) 서열 또는 프로브는 낮은 스트린젠시 조건 하에서 표적에 대해 완벽하며, 완전한 상동성의 결합(예로서, 하이브리다이제이션)을 저해할 것이다. 낮은 t스트린젠시 조건은 너무 비특이적인 결합을 허락하는 것이여서 말할만한 것이 아니다; 낮은 스트린젠시 조건은 다른 하나에 대한 두 서열의 결합에서 특이적인(선택적인)반응을 요구한다. 비특이적인 반응의 부재는 심지어 부분적인 상보성 정도조차도 부족한(예로서, 약 30% 동일성 이하) 두 번째 표적의 사용에 의해 검사될 수 있다.

수많은 적절한 조건이 낮은 스트린젠시의 조건 포함하려고 채택될 수 있는 기술이 잘 알려져 있다; 프로브의 길이및 특성과 같은 요소들( DNA, FWA, 염기구성) 및 표적(DNA, RNA, 염기구성요소, 용액의 존재 또는 부동성 등)의 성질 및 염의 농도와 다른 조성(예로서, 포름아마이드의 존재 또는 부재, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜)이 고려되어지고, 하이브리드화 용액은 상기에 열거된 조건과는 다르게, 그러나 등가의 낮은 스트린젠시의 조건을 생성하기 위해 다양화될 수 있다. 부가적으로, 기술은 높은 스트린젠시 조건(예로서, 결합 온도를 높이거나, 세척단계를 증가시키거나, 하이브리드화 용액 내 포름아마이드를 첨가하여 사용하는 등)하에서 하이브리드화을 촉진하는 조건이 알려져 있다.

cDNA 또는 게놈의 클론과 같이 이중 가닥의 핵산 서열에 대해 언급할 때, 용어 "높은 상동성"은 상기에 기술한 것처럼 낮은 스트린젠시의 조건하에서 이중가닥의 핵산서열의 중 하나 또는 두 가닥 모두에 대해 결합할 수 있는 프로브에 대해 언급한 것이다.

유전자는 1차 RNA 전사체의 각기 다른 스플라이싱에 의해서 생성되는 다중 RNA 종을 생산할 수도 있다. 같은 유전자의 스플라스 변종인 cDNA들은 동일하거나 또는 완벽하게 상동성을 갖는 서열리젼(모든 cDNA 동일한 엑손 또는 엑손 부분의 존재 표시) 및 완전하게 비동일한 리젼(예로서, cDNA 1에서 엑손 A로 표시된 부분은 cDNA 2에서는 엑손 B로)를 포함한다. 왜냐하면 두 cDNA가 두 cDNA에서 발견되는 서열을 포함하는 완전한 유전자 또는 유전자의 부분으로부터 유래한 프로브에 대해 모두 결합 가능한 동일한 서열의 리젼를 포함한다; 두 스플라이스 변종은 그의 프로브 및 각각 서로에 대해 상당한 상동성을 지닌다.

단일 가닥 핵산 서열에 대한 언급에서, 용어 " 상당한 상동성(substantially homologous)"은 프로브가 상기 기술한 것과 같이 낮은 스트린젠시 조건하에서 단일 가닥 핵산 서열의 상보적인 부분에 결합하는 것을 말한다.

상기에서 사용한 용어,"하이브리드화(또는 결합, hybrydization)"은 핵산의 상보적인 쌍을 언급할 때 사용될 수 있다. 하이브리드화 및 하이브리드화 세기(핵산 사이의 결합 세기)는 핵산, (포함된) 스트린젠시 조건, (형성된) 하이브리드의 Tm 값(녹는점 온도) 및 핵산 사이의 GC 비율 사이의 상보적인 정도인 일부 요인들에 의해 적절하게 결합 된다.

본 발명에서 언급된 용어, "Tm"은 녹는점 온도(또는 녹는점)를 말한다. 녹는 점은 이중 가닥의 핵산분자의 집단이 단일 가닥으로 해체되는 온도이다.

핵산의 Tm 계산 방정식은 공지 기술에서 잘 알려져 있다. 기본적인 참조로서, Tm의 간단한 추정치는 핵산이 1 M NaCl 수용액에 있을 때, 등식 Tm = 81.5 + 0.41(% G 3- C)로 계산할 수 있다 (Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985] 참조). 다른 참고 문헌에는는 Tm의 계산을 위한 설명으로 서열 특징뿐만 아니라 구조적 특징을 가진 정교한 컴퓨테이션을 포함한다.

상기에서 사용된 용어, "스트린젠시(stringency)"는 핵산 결합의 시행 시에 온도, 이온 세기, 유기용매와 같은 다른 화합물의 존재 등의 조건에 대한 언급 시에 사용된 이 분야에 숙련된 사람은 "스트린젠시(stringency)" 조건이 기술한 것처럼 각각의 또는 협력에 의해서 다양한 파라메터에 의해 변형될 수 있음을 인식할 수 있다. "높은 스트린젠시(high stringency)" 조건에서, 핵산 염기쌍은 상보적인 염기서열(예로서, 높은 스트린젠시 조건하의 하이브리다이제이션은 약 85-100%, 바람직하게는 약 70-100% 의 동질성을 가질 수 있다)의 높은 빈도를 가진 핵산 단편 사이에서만 일어난다. "배지 스트린젠시(stringency) 조건에서", 핵산 염기쌍은 핵산과 상보적인 염기서열(예로서, "배지 스트린젠시" 조건하에서 하이브리다이제이션은 약 50-70% 의 동질성 내에 발생할 수 있음)의 중간 빈도 수 사이에 발생할 것이다. 따라서, "약하고" 또는 "낮은" 스트린젠시는 종종 상보적인 서열의 빈도가 일반적으로 적은, 유전적으로 다양한 생물로부터 유래된 핵산에 요구된다.

"높은 스트린젠시 조건(high stringency condition)"은 핵산 하이브리드화의 언급 시 사용되어 지는 것으로, 약 500 뉴클레오타이드 길이의 프로브를 필요로 할 때, 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ H₂0 및 1.85 g/l EDTA, NaOH로 pH 7.4로 조정), 0.5% SDS, 5X 덴하르트 용액 및 0.1X SSPE, 1 .O% SDS 용액으로 42℃에서 세척한 변성된 연어 정자 DNA 100 ug/ml로 구성된 용액에서, 42℃에서 등가의 결합 또는 하이브리드화 조건을 포함한다.

"배지 스트린젠시 조건(medium stringency condition)"은 핵산 하이브리다이제이션의 언급 시 사용되어지는 것으로, 약 500 뉴클레오타이드 길이의 프로브를 필요 시, 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ H₂0 및 1.85 g/l EDTA, NaOH로 pH 7.4로 조정), 0.5% SDS, 5X 덴하르트 용액 및 0.1X SSPE, 1 .O% SDS 용액으로 42℃에서 세척한 변성된 연어 정자 DNA 100 ug/ml로 구성된 용액에서, 42℃에서 등가의 결합 또는 하이브리드화 조건을 포함한다.

"낮은 스트린젠시 조건(low stringency condition)"은 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ H₂0 및 1.85 g/l EDTA, NaOH로 pH 7.4로 조정), 0.1% SDS, 5X 덴하르트 용액[50X 덴하르트는 5 g 피콜(Ficoll) (타입 400, 파마시아), 5 g BSA (Fraction V; 시그마)를 500ml에 녹인 것임] 및 0.1X SSPE, 0.1% SDS 용액으로 42 C에서 세척한 변성된 연어 정자 DNA 100 ug/ml로 구성된 용액에서, 42 ℃에서 등가의 결합 또는 하이브리드화 조건을 포함한다.

하기의 용어는 둘 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드: "참조서열(reference sequence)", "서열 동질화(sequence identity)", "서열 동질화 백분률(percentage of sequence indentity)" 및 "상당한 동질화(substantial)" 사이에 관계를 서술하려고 사용된 것이다. "참조서열(reference sequence)"은 서열 비교에 대한 기초로서 사용된 한정된 서열로; 참조서열은 큰 서열(전체 길이의 cDNA서열의 단편은 서열 목록에 주어짐)의 단편이거나, 또는 완전한 유전자 서열을 구성할 수 있다. 일반적으로, 참고 서열은 최고 20 뉴클레오타이드 길이, 종종은 최소 25 뉴클레오타이드 길이, 다소 빈번하게는 최소 50 뉴클레오타이드 길이이다. 두 개의 폴리펩타이드는 각각 (1) 두 폴리펩타이드 사이에 유사한 서열(예로서, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분)을 구성하고, (2)두 폴리펩타이드 사이에 일치하지 않는 서열을 구성할 수 있으며, 둘의 (또는 그 이상의) 폴리펩타이드사이에 서열 비교는 전형적으로, 동질화 및 비교 국부 리젼의 서열 유사성에 대한 "비교 창(comparison window)"을 통하여 두 개의 폴리펩타이드의 서열 비교에 의해 수행된다. 여기에서 사용된 "비교창(comparison window)"은 최소 20개의 인접한 뉴클레오타이드 자리의 개념적 단편을 말하는 것으로, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 서열은 최소 20개의 인접한 뉴클레오타이드 참고서열과 비교할 수 있으며, 비교창에서 폴리뉴클레오타이드 서열은 두 서열의 최적 배열에서 참고 서열(추가나 결손을 포함하지 않는)에 대해서 20% 및 그 이하의 추가 및 결손(갭)을 포함할 수 있다. 비교창 나열을 위한 서열의 최적 배열은 스미스와 워터만의 로컬 상동성 알고리즘에 의해 [Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2: 482 (1981)], 니들만과 운세의 상동 정렬 알고리즘에 의해[Needleman and Wunsch, J. Mol . 25 Biol . 48:443 (1970)], 피어슨과 립만의 유사 방법의 검색에 의해[Pearson and Lipma., Proc . Natl . Acad . Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)], 이 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA, in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터 이용에 의해, 또는 조사에 의해 실시될 수 있고, 그리고 다양한 방법에 의해 생성된 최상의 정렬(비교창 이상 높은 퍼센트의 유사성에서 결과)이 선택되었다. 용어, "서열 동질화(sequence identity)"는 두 개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 동일함(뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 염기)을 의미한다. 용어 "서열 동질화 퍼센트(percentage of sequence identity)"는 비교창 이상의 두 개의 적정 서열 정렬에 의해 계산된다. 핵산 염기(예, A, T, C, G, U, 또는 I)는 일치된 위치에 대한 수에서, 일치된 포지션의 서열 모두에서 발생되고, 비교 창에서 포지션의 총 합(창 크기)으로 일치된 위치를 나누고, 서열 동질화의 퍼센트의 수에 100을 곱한다.

폴리뉴클레오타이드를 적용함에 있어, 용어 "실질적 동질성(substantial identity)"은 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타내는데, 여기에서 폴리뉴클레오타이드는 최소 20개, 종종 최소 25 내지 50 개의 뉴클레오타이드 자리의 비교창 상위에 참고 서열에 대한 비교로서, 최소 85%의 서열 동질성, 바람직하게는 최소 90 내지 95 %, 더욱 바람직하게는 최소 99%의 서열 동질성을 가지는 서열을 포함하고, 여기에서 서열 동질성의 퍼센트는, 비교창 상위의 참고서열의 총 20 % 또는 그 이하의 결손 또는 추가를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 비교서열의 비교에 의해 계산된다. 참고서열은 큰 서열의 부분, 예로서 전체길이의 서열의 스플라이스 변종일 수 있다

폴리펩타이드의 응용으로서, 용어 "실질적 동질성(substantial identity)"은 두 개의 펩타이드 서열를 의미하는 것으로, 갭 질량을 이용하여, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의한 것처럼, 적절한 정렬이 최소 80 %, 바람직하게는 90 %, 더욱 바람직하게는 최소 95 % 또는 그 이상(예로서 99% 서열 동질성)의 서열 동질성으로 나뉜다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적인 핵산 치환과는 다르다. 보존 핵산 치환은 유사한 곁가지를 가진 잔기의 교체를 말한다. 예로서, 지방족 곁가지를 가진 아미노산 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신; 지방족 수산기 곁가지를 가진 아미노산 그룹은 세린, 트레오닌; 아마이드를 포함하는 곁가지를 가진 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민; 방향족 곁가지를 가진 아미노산 그룹은 페닌알라닌, 티로신, 트립토판; 염 곁가지를 가진 아미노산 그룹 은 라이신, 아르기닌, 히스티딘; 황을 포함하는 곁가지를 가진 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 우선적인 보존 아미노산 치환 그룹은 발린-루이신-이소루이신, 페닌알라닌-이소루이신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다.

"증폭(amplification)"은 주형 특이성을 포함하는 핵산 복제의 특수한 경우이다. 이것은 비-특이적 주형 복제(예로서, 주형 의존적이나, 특이한 주형에 의존적이지 않는 복제)와는 대조적이다. 주형 특이성은 여기서 복제(적절한 폴리뉴클레오타이드 서열의 합성)의 정확성 및 뉴클레오타이드(리보 또는 데옥시리보)의 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 "표적(target)" 특이성의 관점에서 자주 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 분류 되어진 의미에서의 "표적(target)"이다. 증폭 기술은 이 분류를 위해 기본적으로 디자인되어왔다.

주형 특이성은 효소를 사용하는 대부분의 증폭 기술에서 수행되었다. 증폭 효소는 그들이 사용된 조건하에서, 핵산의 이종혼합물에서 핵산의 특이적인 서열만 처리할 수 있는 효소이다. 예를 들어, Q 복제효소(replicase)의 경우에, MDV-1 RNA 는 복제효소에 대한 특이적인 주형이다(D.L. Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]). 다른 핵산은 이 증폭효소에 의해 복제될 수 없다. 유사하게, T7 RNA 폴리머라아제의 경우에는, 이 증폭효소는 자신의 프로모터들에 대해 강력한 특이성을 갖는다(M. Chamberlin et aZ., Nature 228:227 [1970]). T4 DNA 라이게이즈의 경우에, 효소는 두 개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질과 주형 사이에 불일치가 존재하면, 올리고뉴클레오타 이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 라이게이션 하지 않는다(D.Y. Wu and R. B. Wallace, Genomics 4560[1989]). 마지막으로, 높은 온도에서도 작동하는 장점을 가진, Taq 및 Pfu 폴리머라아제는 프라이머에 의해 제한되고 한정된 서열에 대해 높은 특이성을 나타낸다; 높은 온도는, 표적 서열과 프라이머 하이브리드화를 하게하고 비-표적 서열과 하이브리드화 하게 하지 않는 열역학 조건에 대한 결과이다(H.A. 25 Erlich (ed.), PCR Teelznology, Stockton Press [1989]).

여기에 사용된, "증폭 가능한 핵산(amplification nucleic acid)"는 어떤 증폭 반응에 의해 증폭될 수 있는 핵산에 대한 참고로 사용되었다. "증폭 가능한 핵산일반적으로 포함할 수 있음을 예기한다.

여기에서 용어, "시료 주형(sample template)"은 "표적(target;하기에 정의)"의 존재하에서 분석된 시료로부터 유래된 핵산을 말한다. 대조적으로, "배경 주형(background template)"은 시료에서 존재하거나 또는 존재하지 않는, 시료 주형보다 다른 핵산에 대한 참조에서 사용되어왔다. 배경 주형은 대부분 종종 부주의하다. 이것은 시료와는 상관없이 정제 되어진 잔재의 결과이거나, 또는 핵산 오염물의 존재에 기인한 것일 수도 있다. 예로서, 생물체로부터 핵산검출은, 검출된 것 이외 다른 것이 테스트 시료에서 배경으로서 존재할 수 있다.

여기에서 사용되어진 용어, "프라이머(primer)"는 올리고뉴클레오타이드를 말하는데, 정제된 제한효소 분해에 의해 자연적으로 형성되거나, 합성하여 생산되는 것으로, 핵산 가닥에 대한 상보성이 있는 프라이머 신장 산물 합성이 유도되는 조건에서 합성시작점으로 활동한다(예로서, 뉴클레오타이드 및 DNA 폴리머라아제 와 같은 유도제 존재 하 및 적합한 온도 및 pH에서). 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일가닥이나, 이중가닥으로 교체될 수도 있다. 만약 이중가닥이라면, 프라이머는 신장 산물을 준비하기 전에 이 가닥을 분리하기 위해 1차 처리되었다. 바람직하게, 프라이머는 올리고데옥시뉴클레오타이드이다. 프라이머는 유도제의 존재하에서 신장 산물의 합성을 준비하기 위해 충분한 길이여야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 기원 및 사용방법을 포함하는 많은 요소들에 의해 의존될 것이다.

여기에서 사용된 용어, “프로브(probe)” 또는 “ 하이브리드화 된 프로브(hybridization probe)”는 올리고뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드 서열)를 말하는 것으로, 정제된 제한효소 분해에서와 같이 자연적으로 발생하거나, 합성적으로, 재조합적으로, 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는 것으로, 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 최소 부분에 결합할 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 서열의 검출, 정의 및 분리에 유용하다. 일부 바람직한 양태로서, 본 발명에 사용된 프로브는 형광성, 방사성, 및 발광성 시스템을 포함하나, 효소(예로서, ELISA; enzyme-based histochemical assays)에 한정되지 않는, 다른 검출 시스템에서 검출할 수 있도록 "리포트 분자"로 표지될수 있다. 본 발명은 특별한 검출 시스템 또는 라벨에 제한되지 않는다.

여기에서 사용된 용어 "표적(target)"은 검출 또는 특징화 되는 핵산 서열 또는 구조를 말한다.

여기에서 사용된 용어 "폴리머라아제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)"은 뮬리스(K.B. Mullis)의 방법을 말하는 것으로(U.S. 특허번호 4,683, 195, 4,683, 202, 및 4,965,188 참조), 클로닝이나 정제 없이 게놈 DNA 혼합물에서 표적 서열의 단편의 농도를 증가시키는 방법을 기술한 것이다. 표적 서열을 증폭시키기 위한 이 과정은, DNA 폴리머라아제의 존재하에서 정확한 순서의 온도 주기에 따라서, 바람직한 표적 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 대한 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 대량 첨가로 구성된다. 두 개의 프라이머는 이중 가닥의 표적서열의 각각의 가닥에 대해 상보적이다. 효과적인 증폭을 위해서, 혼합물을 변성시키고, 프라이머를 표적 분자내의 상보적인 서열에 결합(annealling)시켰다. 결합시킨 후, 프라이머는 상보적인 가닥의 새로운 쌍을 형성하기 위하여, 폴리머라아제로 신장시켰다. 변성, 프라이머 결합, 폴리머라아제 신장의 과정은, 원하는 표적 서열의 증폭 단편의 농도를 얻기 위해, 수회 반복될 수 있다(즉, 변성, 결합 및 폴리머라아제 신장으로 된 구성을 한 “주기(cycle)"라고 하고, 무수히 많은 주기가 될 수 있다). 원하는 표적 서열의 증폭 단편의 길이는 각각의 관련한 프라이머가 결합하는 관련 위치에 의해 결정되어지고 , 그러므로, 이 길이는 조절할 수 있는 파라메터이다. 그 과정의 반복되는 양상을 가진 장점으로, 그 방법은 "폴리머라제 연쇄 반응"(이후로 "PCR")이라 한다. 혼합물에서, 표적 서열의 바람직한 증폭 단편이 지배적인 서열이 되기 때문에(농도에 대하여), 이들을 “PCR 증폭된(PCR amplified)”이라 말한다.

PCR과 함께, 게놈 DNA에서 몇몇 다른 방법적 측면에서 검출 가능한 수준으로, 특이 표적 서열의 단회 복제 증폭이 가능하다(예로서, 표지된 프로브와의 결 합; 아비딘-효소 컨주게이트 검출에 의한 바이오틸 프라이머 결합; 증폭된 단편에서 dCTP 또는 dATP 인 32P로 표지된 데옥시리보핵산 3-인산의 결합). 게놈 DNA에 추가하여, 일부 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적당한 세트의 프라이머 분자로 증폭될 수 있다. 특히, PCR 자체 과정에 의해 생성된 증폭단편은 그 자체로, 다음 PCR 증폭을 위한 충분한 주형이 된다.

여기에서 사용된 용어, " PCR 산물(PCR product)", “ PCR 단편(PCR fragment)” 및 “증폭 산물(amplification product)”은 변성, 결합, 신장의 PCR 의 와전한 단계인, 둘 또는 그 이상의 주기에서 이후의 혼합 결과물을 말한다. 이 용어들은 하나 또는 그 이상의 표적 서열에 대한 하나 또는 그 이상의 단편이 증폭되는 경우를 포함한다.

여기에서 사용된 용어, "증폭 시약(amplification reagent)"은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외한 증폭에 필요한 시약(데옥시리보핵산 3-인산, 완충용액 등)들을 말한다. 일반적으로, 증폭 시약들과 함께 다른 시약 구성성분은 반응용기(시험관, 마이크로 웰 등)내에 두는 것을 포함한다.

여기에서 사용된 용어, “반응용기(reaction vessel)”는 반응을 실시할 수 있는 시스템을 말하는 것으로, 시험관, 웰, 마이크로웰(예로서, 96-웰, 384-웰, 1536-웰 분석 용기와 같은 마이크로-분석 용기), 모세관, 광학 섬유와 같은 섬유말단, 유동 칩(fluidic chips)과 같은 미세유체(microfluidic devices), 카트리지 및 카드(예로서, 미국특허 제 6,126,899호, 분덴베르그 등, 미국특허 제 6,627,159호,제 6,720,187호 및 제 6,734,401호, 베드인그람 등, 미국특허 제 6, 319,469호 및 제 6,709,869호 미안 등, 미국특허 제 5,587,128 호 및 제 6,660,517호 와일딩 등을 포함하나, 이로 제한하지 않는다) 또는 일부 표면의 검사 자리(유리, 플라스틱 ;또는 실리콘 표면, 비드, 마이크로 칩; 또는 겔이나 덴드리머 같은 비-고형 표면를 포함하나, 이로 제한하지 않는다)를 포함하나 이로 제한하지 않는다.

여기에서 사용된 용어, “재조합 DNA 분자(recombinant DNA molecule)”는 분자생물학적 기술에 의해 DNA 단편이 함께 연결되어 구성된 DNA 분자에 대해 말한다.

여기에서 사용된 용어, “안티센스(antisense)”는 RNA 서열에 대한 참조(reference)로서 사용된 것으로, RNA 서열은 특이한 RNA 서열 (예로서, mRNA)에 대해 상보적이다. 용어 “안티센스 가닥(antisense strand)”은 핵산 서열에 대한 참조에서 사용된 것으로, "센스(sense)" 가닥에 대해 상보적이다. 기호(-)(즉, 음성)은 안티센스 가닥에 대한 참조로 때때로 쓰이며, 기호 (+)은 때때로 센스(즉 양성)가닥에 대한 참조로 쓰이다.

핵산에 관련하여 쓰일 때 용어 "분리된(isolated)"은,“분리된 올리고뉴클레오타이드” 또는 “분리된 폴리뉴클레오타이드”로서, 일반적으로 그 자연적 유래와 관련하여 적어도 하나의 오염된 핵산으로부터 정의되고 분리된 핵산 서열을 말한다. 대조적으로, 비-분리된 핵산은 그들이 자연에서 존재하는 상태로 발견되어지는 DNA 및 RNA와 같은 핵산이다. 예로서, 일정한 DNA 서열(예, 유전자)은 숙주세포 크로모좀의 이웃하는 유전자 앞쪽에서 발견되어지는 것으로 다량의 단백질을 암호하는 수많은 다른 mRNA의 혼합물로서 세포에서 발견되는 특이적인 단백질을 암호 화하는 특이적인 mRNA 서열과 같은 RNA 서열이다. 그러나, 분리된 핵산은 폴리펩타이드를 암호화하는 것으로, 예를 들면 세포의 핵산과 같이, 일반적으로 폴리펩타이드를 발현하는 것을 포함하는데, 자연상의 세포의 핵산과는 다른 크로모좀 좌에 있는 핵산이든, 또는 다른 경우에, 자연 상에서 존재하는 것보다 다른 핵산 서열에 의한 측면에 위치했다. 분리된 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 분리된 핵산, 올리고 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 단백질을 발현하기 위해 사용되어질 때 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 적어도 센스 또는 암호화 가닥에 존재할 수 있으나(즉, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥일 수 있음), 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함할 수도 있다(즉, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 일 수 있음).

뉴클레오타이드 서열("주어진 뉴클레오타이드 서열의 부분"에서와 같이)에 쓰일 때, 여기에서 사용된 용어,“부분(portion)”은 그 서열의 단편을 말한다. 단편은 전체 뉴클레오타이드 서열에서 하나의 뉴클레오타이드를 뺀, 4개의 뉴클레오타이드로부터의 크기 범위일 수 있다(예로서, 10개의 뉴클레오타이드 11, ... 20...).

여기에서 언급한 용어, “정제된(purified)” 또는 “정제하기 위한(to purified)”은 시료로부터 오염물의 제거를 말한다. 여기에서 사용된 용어 “정제된”은 자연 환경으로부터 제거된 분자(예로서, 핵산 또는 아미노산 서열)로, ‘단리되거나’ 또는 ‘분리된 것’을 말한다. “단리된 핵산 서열”은 그러므로, 정 제된 핵산 서열이다. ”실질적으로 정제된“ 분자는 자연적으로 연관된 다른 조성성분으로부터 최소 60% 프리이고, 바람직하게는 최고 75% 프리이고, 더 바람직하게는 최소 90% 프리이다.

용어 ”재조합 단백질(recombinant protein)“ 또는 ”재조합 폴리펩타이드(recombinant polypeptide)“는 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자를 말한다.

용어, “야생 단백질(native protein)“은 벡터 서열에 의해 암호화된 아미노산 잔기를 포함하지 않는 단백질을 지시할 때 사용되는 것으로; 야생 단백질은 야생에서 발생하는 단백질에서 발견되는 아미노산만을 포함한다. 야생 단백질은 재조합에 의해 생산 되어질 수도 있고, 또는 자연적으로 발생하는 유래로부터 분리될 수도 있다.

여기에서 사용한 용어, 단백질에 대한“부분(portion)”("주어진 단백질 부분”으로서") 의 참조 시에 그 단백질의 단편을 말한다. 단편들은 4개의 연속적인 아미노산 잔기에서부터 전체 아미노산 서열에서 아미노산 하나를 뺀, 범위의 크기일 수도 있다.

용어 “ 서던 블랏(Southern blot)”은 DNAfmf 겔에서 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 등의 고형 지지대에 옮겨서 크기에 따라 DNA를 분류하는 DNA를 분석하ms 것을 말한다. 그리고 나서, 고정된 DNA는 사용된 프로브에 대하여 DNA 특이적인 상보성을 검출하기 위하여 표지된 프로브와 반응시켰다. DNA는 전기영동 전에 제한효소로 자를 수도 있다. 전기영동 다음에, DNA는 고형지지대로 옮기기 전에 또 는 그동안 부분적으로 탈푸린화, 변성화시킬 수도 있다. 서던 블랏은 분자생물학자의 기본적인 기술이다(J. Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 뉴욕, pp 9.31-9.58 [1989]).

용어 “웨스턴 블랏(Western blot)”은 니트로셀룰로오즈 또는 막과 같은 지지대에 고정화시킨 단백질(또는 폴리펩타이드) 분석을 말한다. 단백질은 이를 분리하기 위하여 아크릴아마이드 겔에서 전개시키고, 겔에서 나이트로셀룰로오즈 또는 나일론막과 같은 고형지지대로 단백질을 옮긴다. 그런 후, 고정된 단백질은 관심 있는 항원에 대한 반응성이 있는 항체에 노출시킨다. 항체의 결합은 표지된 항체의 사용을 포함하여, 다양한 방법에 의해 검출할 수 있다.

용어 “조사 성분(test compound)”은 바람직한 활성(예로서, 질병, 질환, 병(disease, illness, sickness) 또는 신체기능 이상에 대한 치료능력 및 방어능력, 또는 시료의 생리학적 또는 세포의 상태를 변성)에 대한 분석법(약물 스크리닝 분석법)에서 조사되는 화학적 성질, 약성, 약물 등을 말한다. 조사성분은 치료성분으로 잘 알려져 있거나 잠재적인 것 모두를 포함한다. 조사성분은 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 심사하여 치료적인 성분으로 결정될 수 있다. “알려진 치료성분(known therapeutic compound)”은 치료 또는 방어와 같은 효과적임을 나타내는(예로서, 동물실험 또는 인간에 처리한 선행경험) 치료적인 성분을 말한다.

여기에서 사용된 용어, “시료(sample)”는 가장 넓은 의미로 사용된다. 사람의 크로모좀 또는 사람의 크로모좀과 관련된 서열을 포함한다고 추정되는 시료는 세포, 세포로부터 분리된 크로모좀(예로서, 중기 크로모좀의 스프레 드(spread)), 게놈 DNA(용액상 또는 서던 블랏 분석에서처럼 고형지지대에 결합되어있는), RNA(용액상에 또는 노던 블랏 분석에서처럼 고형지지대에 결합 되어 있는), cDNA(용액상에 또는 고형지지대에 결합 되어 있는) 등을 포함한다. 단백질을 함유한다고 추정되는 시료는, 세포, 조직의 일부분, 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하는 추출물 등을 포함할 수 있다. 시료는 조직절편, 혈액, 혈액 분획(예로서, 혈청, 혈장, 혈구), 침, 뇌척수액, 늑막액, 젖, 림프액, 침, 정액, 소변, 대변, 분비액, 융모 시료(CVS), 자궁 스왑(swap; 면봉 등으로 닦아낸 시료물), 구강 스왑을 포함할 수 있으나, 이로 제한하지는 않는다.

여기에서 사용된 용어, "표지(또는 라벨)" 검출할 수 있는(우선적으로 정량할 수 있는) 효과를 제공하기 위하여 사용되어질 수 있는 일부 원자 혹은 분자를 말하는 것으로, 핵산이나 단백질에 붙일 수 있다. 표지는 염색제; ³²P와 같은 방사성 표지; 바이오틴과 같은 결합성분; 디곡시제닌과 같은 햅탠; 발광성분, 인광성분 또는 형광성분; 형광염색제 단독 또는 형광 공명 에너지 전도체(fluorescence resonance energy transfer (FRET))에 의한 발산 스펙트럼을 억제하거나 이동시킬 수 있는 성분과 혼합한 염색제를 포함하나, 이로 제한하지 않는다. 표지는 형광성, 방사성, 색깔계측, 중력계측, X-레이 회절 또는 흡수, 자석성, 효소적 활성 등을 제공할 수도 있다. 표지는 전하(양성 또는 음성전하)를 띤 성분일 수도 있고, 아니면, 자연성 전하일 수도 있다. 표지는 표지를 포함하는 서열이 검출가능하기만 하면, 핵산이나 단백질서열을 포함하거나 구성될 수 있다.

여기에서 사용된 용어, “신호(signal)”는 표지 또는 분석 반응에 의해 발생되거나 제공되어 질 수도 있는 일부 검출 가능한 효과를 말한다.

여기에서 사용된 용어, “검출기(detector)“는 시스템 또는 시스템의 구성을 말하는데, 예로서, 기기(예로서, 카메라, 형광측정기, 전하결합소자(charge-coupled device(CCD)), 신틸레이션 계수기 등) 또는 반응 중간체( X-레이 또는 카메라 필름, pH 지시자 등)이고, 반응중간체는 신호나 효과의 존재시 시스템의 다른 구성으로 또는 사용자에게 전달할 수 있는 것이다. 검출기는 광도측정기 또는 분광 광도 측정기가 될 수 있으며, 이는 자외선, 가시광선 또는 적외선을 검출할 수 있으며, 형광발광 또는 화학발광; 방사선 검출기;핵자기공명분광기(nuclear magnetic resonance spectroscopy),질량분석기(mass spectrometry)또는 서페이스 인핸스드 라만 스펙트로메트리(surface enhanced Raman spectrometry); 겔 또는 모세관 전기영동이나 겔 익스클루젼 크로마토그래피(gel exclusion chromatography); 또는 당업자에 잘 알려진 다른 검출방법 또는 이의 혼합 방법이 포함된다.

여기에서 사용된 용어, "배포 시스템(distribution system)"은 하나에서 다른 하나 또는 한 위치에서 다른 위치로 물질을 전도 가능한 및/또는 전달 가능한 시스템을 말한다. 예로서, 제조업자 또는 분배자로부터 사용자로 검출패널을 전달하기위한 분배 시스템은 포장부, 우편물 방, 우편물 전달시스템을 포함하나, 이로 제한하지 않는다. 바꾸어서, 배포시스템은 하나 또는 그 이상의 배달 비히클 및 관련된 배달 퍼스넬, 디스플레이 가닥 및 배포센터를 포함할 수 있으나, 이로 제한하지 않는다. 본 발명의 한 양태에서, 예로서 흥미있는 부분(검출패널 제조)은 비용 없 이 또는 보조을 받는 비용 또는 절감된 비용으로, 사용자들에서 검출 패널을 전달하기 위해서 배포시스템을 활용한다.

여기에서 사용 되어진 용어, “절감된 비용(at reduced cost)”은 수취인(예로서, 사용자)에게 절감된 직접비용으로 물건이나 서비스를 전달하는 것을 말한다. 하나의 양태로서, “절감된 비용에서(at reduced cost)”는 수취인에 비용 없이 상품이나 서비스를 전달하는 것을 말한다.

여기에서 사용된 용어 “보조금을 받는 비용으로(at a subsidized cost)”는 최소한 수취인의 비용의 일부가 연기 또는 다른 파트에 의해 지불되어, 물건이나 서비스를 전달받는 것을 말한다.

여기에서 사용된 용어, “비용 없이(at no cost)”는 수취인에게 직접적인 재정적 지출없이 물건이나 서비스를 전달하는 것을 말한다. 예를 들면, 제조업자 또는 배포업자에 의해 사용자(예로서, 연구 과학자)에게 검출패널을 비용 없이 제공하면, 사용자는 테스트에 대해 직접적으로 지불하지 않는다.

여기에서 사용된 용어 “검출(detection)”은 시료에서 양적으로 또는 질적으로 분석물(예로서, DNA, RNA 또는 단백질)을 확인하는 것을 말한다. 여기에서 사용된 용어 "검출법(detection assay)"은 시료에서 분석된 핵산을 검출하기 위한 목적으로 수행된 키트, 검사 또는 과정을 말한다. 검출법은 표적 분석의 존재하에서 수행되었을 때 검출 가능한 신호 또는 효과를 유츌하고, 하이브리다이제이션(결합)의 과정, 핵산 절단(예로서, 엑소-, 엔도뉴클레이즈), 핵산 증폭, 뉴클레오타이드 서열, 프라이머 신장 또는 핵산 라이게이션을 병합하는 분석을 포함하나, 이로 제 한하지 않는다.

여기서 사용된 용어, “기능적 검출 올리고뉴클레오타이드(functional detection oligonucleotide)”는 검출법(detection assay)의 구성성분으로 사용되는 것으로, 여기에서 검출법은, 기능적 검출 올리고뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드 구성성분을 제공할 때, 의도된 표적 핵산의 성공적인 검출이 가능한(즉, 검출 가능한 신호를 생산하는)것을 말한다. 이것은 비-기능적 검출 올리고뉴클레오타이드에 대조적인데, 비-기능적 검출 올리고뉴클레오타이드는, 검출방법에서 올리고뉴클레오타이드 조성으로 제공될 때, 특정한 표적 핵산을 위한 검출방법에서 검출 신호를 생산하는 것이 부족하다. 올리고뉴클레오타이드가 기능적 올리고뉴클레오타이드인지를 결정짓는 것은 검출법을 이용하여 특이한 표적 핵산이 존재할 때 검출방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 시험하여 실험적으로 수행할 수 있다.

여기에서 사용된 용어, “ 다른 목적물로부터 유래된(derived from a different subject)”은, 다른 목적물로부터 유래된 시료나 핵산과 같이, 다수의 다른 개체로부터 유래된 시료를 말한다. 예를 들면, 첫 번째 사람의 게놈 DNA가 포함된 핼액시료 및 두 번째 사람의 게놈 DNA가 포함된 혈액 시료는 다른 목적물로부터 유래된 혈액 시료 및 게놈 DNA로 고려되어 진다. 다른 목적물로부터 유래된 5가지의 표적 핵산을 포함하는 시료는 적어도 다섯 명의 다른 사람으로부터 얻은 다섯 시료를 포함하는 시료이다. 그러나, 시료는 그 개인으로부터 다수의 시료를 포함할 수도 있다.

여기에서 사용된 용어, “함께 처리(treating together)”는, 실험이나 방법에 대한 참조로 사용될 때, 동시에 또는 순차적으로 처리하는 것을 말하는 것으로, 여기에서 실험의 결과가 함께(즉, 같은 시간 동안에) 생산되거나, 수집되거나, 분석e된다. 예를 들면, 멀티 웰의 분리된 웰 또는 마이크로어레이의 다른 부분에 존재하는 각기 다른 표적 서열의 대부분은 한 검색법에서 함께 처리되어지는데, 이 검색법에서 검색반응은 동시에 또는 순차적으로 시료에서 수행되고, 이 방법으로 수집된 정보는 함께 분석된다.

여기에서 사용된 용어 “분석 정보(assay data)” 및 “테스트 결과 값(test result data)”은, 분석(예로서, 유전자, SNP 또는 RNA의 검출 또는 정량하기 위한)을 수행하여 수집된 정보를 말한다. 테스트 결과 값은 일부 형태 즉, 원래 값 또는 분석된 값일 수도 있다(예로서, 다른 과정에 의해 미리 분석된). 수집된 값은 게다가 처리되거나 분석되지 않은 것으로, 여기에서는 “원래의(또는 가공하지 않은)(raw)” 분석 값으로 언급되는 데(예로서, 질량분석기, HPLC 또는 모세관 분리 기기(capillary separation device)로부터 칩의 스팟이나 반응 용기로부터 형광 신호로 신호의 측정에 대한 상응하는 수 또는 피크 높이나 면적으로서 피크 측정에 상응하는 수), 앞선 단계이나 분석(계산에 의해 표준화되거나 비교되거나 다르게 처리된)을 통해서 처리된 분석 값은 “분석된 값(analyzed assay data)” 또는 “도출된 값(output assay data)"으로서 언급된다.

여기에서 사용된 용어, “데이터베이스(database)”는 검색에 용이하도록 정렬된 정보(예로서, 데이터, 값)의 수집, 예를 들면, 컴퓨터 저장장치에 저장된 것을 말한다. “게놈 정보 데이터베이스(genomic information database)”은 게놈 정보를 포함하는 데이터베이스를 말하는 것으로, 다형성 정보(즉 유전적 다형성과 연관된 정보), 게놈 정보(즉 게놈의 정보), 연결정보(다른 핵산 서열(예로서, 크로모좀)과 관련된 핵산 서열의 물리적 자리에 연관된 정보) 및 질병과 관련된 정보(즉, 목적물(subject)의 존재와 관련이 있는 정보 또는 목적물(subject)의 물리적 특색(예로서, 목적물의 한 대립유전자)에 대한 질병에 대한 감수성, 예로서, 목적물의 한 대립유전자를 포함하나, 이로 제한하지 않는다. "데이터베이스 정보"는 데이터베이스로 보내어지거나, 데이터베이스에 저장, 처리되거나, 데이터베이스로부터 검색된 정보를 말한다. “ 서열 데이터베이스 정보(seguence database information)”는 핵산 서열과 관련된 데이터베이스 정보를 말한다. 여기에서 사용된 용어, “구별된 서열 데이터베이스(distinct sequence databases)”는 서로 다른 정보를 가지고 있는 둘 또는 그 이상의 데이터베이스를 말한다. 예를 들면, dbSNP 및 GenBank 데이터 베이스는 각각의 정보를 포함하는 정보가 서로에서 발견되지 않기 때문에 서열 데이터베이스가 구별되어진다.

여기에서 발견된 용어, “프로세서(processor)” 및 “중앙 프로세싱 유니트(central processing unit)" 또는 ”CPU"는 서로 바꾸어 사용할 수 있는 것으로, 컴퓨터 메모리로부터 프로그램을 읽을 수 있는 장치(예로서, ROM 또는 다른 컴퓨터 메모리) 및 프로그램에 따르는 스텝의 한 세트를 수행할 수 있는 장치에 대해 말한다.

여기에서 사용된 용어 “컴퓨터 메모리(computer memory)” 및 “ 컴퓨터 메모 리 장치(computer memory device)”는 컴퓨터 프로세서에 의해 읽을 수 있는 저장매체를 말한다. 컴퓨터 메모리의 예로서, RAM, ROM, 컴퓨터 침, 디지털을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.

여기에서 사용된 용어, “컴퓨터의 읽을 수 있는 매체(computer readable medium)"는 정보(예로서, 데이터, 값 및 명령)를 저장하기 위한 장치나 시스템을 말한다.

컴퓨터의 읽을 수 있는 매체의 예로서, 비디오 디스크(DVD), 컴팩트 디스크(CD), 하드디스크 장치(HDD), 마그네틱 테잎 및 네트워크 이상의 유동 매체를 위한 서버를 포함하나, 이로 제한하지 않는다.

여기에서 사용된 용어, “하이퍼링크(hyperlink)"는 한 문서에서 다른 문서로, 또는 한 문서의 부분(구성)에서 다른 문서의 부분으로 링크(navigational link)되는 것을 말한다. 일반적으로, 하이퍼링크는 마우스를 이용하여 클릭하여 선택하여 관련된 문서나 문서의 부분으로 점프할 수 있게 하이라이트된 단어나 구로 표시되어있다.

여기에서 사용된 용어, “하이퍼텍스트 시스템”은 컴퓨터에 기초한 정보 시스템을 말하는 것으로, 이 시스템에서 문서(및 가능한 데이터의 다른 형태)는 사용자가 항해할 수 있는 “웹”형태와 하이퍼링크를 통하여 함께 링크되어있다.

여기에서 사용된 용어, “인터넷”은 표준 프로토콜을 이용한 네트워크의 일반적인 수집을 말한다. 예를 들면, 인터넷은 서로 연결된(공공으로 및/또는 개인으로)네트워크 집합을 포함하며, 이 네크워크는 표준 프로토콜(TCP/IP, HTTP, 및 FTP와 같 은)의 세트에 의해 글로벌 및 광역의 네트워크의 형태로 함께 링크되어있다. 이 용어가 현재 일반적으로 인터넷으로 언급되어지는 동안, 미래에는 현재의 표준 프로토콜 대한 변화되고 추가되거나 또는 다른 매체(예, 텔레비전 라디오 등)와의 병합에 의해 다양화될 것이다. 이 용어는 또한 사적인 인트라넷(예로서, 법인조직)과 같은 비-공적인 네트워크를 포함할 수 있다.

여기에서 사용된 용어, “월드 와이드 웹(World Wide Web)" 또는 "웹(web)"은 일반적으로 (i) 인터 링크된 광역의 집합체로, 인터넷을 경유하여 에세스할수 있는 사용자가 볼 수 있는 하이퍼 텍스트 문서(일반적으로, 웹 문서 또는 웹 페이지라 불리는) 및 (ii) 표준화된 인터넷 프로토콜을 이용하여 문서와 같은 사용자 에세스를 제공하는 클라이언트(수신 쪽의 하드웨어[소프트웨어] 및 서버 소프트웨어 구성을 모두 말한다. 현재, 웹 문서가 위치하고 요청하기 위한 어플리케이션(applications)에 대한 초기 표준 프로토콜은 HTTP이고, 엡페이지는 HTML을 이용하여 암호화 된다. 그러나, 용어 ”웹(web)“ 및 ”월드 와이드 웹(World Wide Web)"은 미래에 HTML 및 HTTP 대신에(또는 추가하여) 사용될 수 있는 마크업 언어 및 전달 프로토콜이 포함 되어질 수 있다.

여기에서 사용된 용어, “웹사이트(web site)"는 월드와이드웹의 표준 프로토콜을 사용하여 네트워크상의 정보내용을 다루는 컴퓨터 시스템을 말한다. 전형적으로, 웹 사이트는 특별한 인터넷 도메인 네임(domain name)에 상응하며, 특별한 오가나이제이션(조직, 기구;organization)과 연관된 내용을 포함한다. 여기에서 사용된 용어는 일반적으로 네트워크상의 정보내용을 다루는 하드웨어/소프트웨어 및 (ii) the "back end" hardware/software components, 비-표준화 또는 특수한 구성 즉, 웹사이트 사용자을 위한 서비스를 수행하기 위한 서버구성과 상호작용하는 것을 포함하는 ”백 앤드(back end;비 수치적인 처리, 특히 데이터베이스의 조작을 전문으로 하는 시스템에서 호스트 컴퓨터의 작업을 도와주기 위해 설치하는 독립된 데이터베이스 전용 처리)“ 하드웨어/소프트웨어의 둘 모두를 포함할 수 있다.

여기에서 사용된 용어, “HTML"은 하이퍼텍스트 마크업 언어(HyperText Markup Language)을 말하는 것으로, 이는 문서내의 정보내용에 대한 첨부된 프리젠테이션 및 연결된 속성의 표준 암호화 컨벤션(convention) 및 암호의 세트이다. HTML은 SGML 즉 표준 규격화된 마크업언어(the Standard Generalized Markup Language)에 기초를 둔다. 문서를 저술하는 단계 동안, HTML 암호(codes; "태그”로서 언급되는)는 문서의 정보내용내로 삽입된다. 웹문서(또는 HTML 문서)가 웹 서버에서 브라우저(browser)로 순차적으로 전달될때, 암호는 브라우저에 의해 번역되며, 문서를 구문해석하고 디스플레이하기위해 사용된다. 추가적으로, 웹 브라우저가 문서를 디스플레이하는 특수화 방법에서, HTML 태그는 다른 웹문서(일반적으로, 하이퍼 링크로 언급됨)에 대한 링크를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

여기에서 사용된 용어, “XML"은 익스텐서블 마크업 언어(Extensible Markup Language)를 말하는데, 응용 프로파일은 HTML처럼, SGML에 기초를 둔다. XML은 하기의 점에서 HTML과는 다르다: 정보제공자는 자기 의지로 새로운 태그를 정의할 수 있고 이름을 추정할 수 있다; 문서 구조는 복잡한 레벨을 포함할 수 있다; 어떤 XML 문서는 구조적 밸리데이션(validation)을 수행하기위해 필요한 응용으로 사용 자를 위한 그래머(grammer)의 추가적인 설명을 포함할 수 있다. XML 문서는 엔타이티(entity)라 불리는 저장 단위로 구성되어지는데, 이것은 파스(구문 해석된; parse) 또는 비-파스된 값을 모두 포함한다. 구문 해석된 데이터는 캐릭터, 일부엣 캐릭터 데이터를 형성하는 몇몇 마크업을 형성하는 몇몇으로 구성된다. 마크업은 문서의 저장 레이아웃 및 논리적 구조의 설명을 암호화한다. XML은, 논리적인 구조에서 구속을 한정하고 미리 한정된 저장 유니트의 사용을 지원하기 위하여, 저장 레이아웃 및 논리적인 구조에서 구속하기 위한 메카니즘을 제공한다. XML 프로세스라고 불리는 소프트웨어 모듈은 XML 문서를 읽고 그들의 내용과 구조에 대한 에세스를 제공하기위해 사용된다.

여기에서 사용된 용어, “HTTP"는 하이퍼텍스트 전달 프로토콜(HyperText Transport Protocol)를 말하는데, 이는 브라우저와 웹 서버사이의 정보(HTML 문서와 같이, 및 그러한 문서를 위한 클라이언트 요구)의 교환을 위해 사용된 표준화된 월드 와이드 웹 클라이언트-서버 프로토콜(World VVide Web client-server protocol)이다.

HTTP는 수많은 다른 타입의 메시지 즉, 다른 종류의 서버 액션을 요구하기 위해 클라이언트에서부터 서버로 보낼 수 있는 메시지를 포함한다. 예를 들면, "GET" 메시지는 포맷 GET를 가지는 것으로, 문서를 리턴(return)하는 서버나 특수화된 URL에 존재하는 파일을 발생시킨다.

여기에서 사용된 용어, “URL"은 유니폼 리소스 로케이터(Uniform Resource Locator)를 말하는데, 이는 인터넷에서 파일이나 다른 리소스(resource)의 위치를 완전히 특수화시키는 유일한 주소이다. URL의 일반적인 포맷은 ”protocol://machine address:port/path/filename“이다. 포트(port) 세목은 선택적이며, 그리고, 만약 사용자에 의해 아무것도 기입되질 않는다면, 서버가 프로토콜로서 명기될지라도, 브라우저는 표준 포트를 이행하지 않는다. 예를 들면, 만약 HTTP가 프로토콜로 명기되었다면, 브라우저는 HTTP 디폴트 포트(default port) 80을 사용할 것이다.

여기에서 사용된 용어, "푸쉬 테크놀로지(PUSH technology)"는 네트워크상에서 사용자에게 데이터를 보내기 위해 사용되어지는 정보 보급 정보체계(information dissemination technology)를 말한다. 월드 와이드 웹(World Wide Web; “풀 테크놀로지(pull technology)”)과는 대조적으로, 클라이언트 브라우저는 월드 와이드 웹에 이를 보내기 전에 웹 페이지를 요구할 것이나, 푸쉬 프로토콜은 사용자 컴퓨터에 자동적으로 정보내용을 보내는데, 전형적으로 사용자에 의해 미리 한정된 정보에 기초를 둔다.

여기에서 사용된 용어, “커뮤니케이션 네트워크(communication network)“는 정보를 허락하는 한 위치에서 다른 위치로 전달되어지는 모든 네트워크를 말한다. 예를 들어, 한 컴퓨터에서 한 컴퓨터에서 다른 컴퓨터로 정보를 전달시키기 위해 정보네트워크는 전기의, 광학의, 위성 전파 등을 이용 정보를 전달하는 모든 공공의 또는 개인의 네트워크를 포함한다. 직접적으로 또는 간접적으로 한곳에서 다른 곳으로 정보를 전달할 수 있는 통신 네트워크의 부분인 두 가지 또는 그 이상의 장치는 서로 ”전자통신에서“ 되는 것으로 생각된다. 다수의 컴퓨터로 구성된 컴퓨 터 네트워크는 특수한 태스크(컴퓨터로 처리되는 일의 최소 단위)(”하위점(sub-nodes))를 수행하는 하나 또는 그 이상의 하위 컴퓨터에 정보를 처리하는 중앙컴퓨터(”중심점(central node)“)을 가질 수도 있다. 일부 네트워크는 서로 ”다른 지리적인 위치“에 있는 컴퓨터를 포함하는데, 컴퓨터가 다른 자연적 위치(즉, 자연적으로 같은 컴퓨터가 아닌, 예를 들면 다른 나라, 주, 도시, 방 등에 존재하는)에 위치함을 의미한다.

여기에서 사용된 용어, “검출법 조성(detection assay component)"은 검출법을 수행할 수 있는 시스템의 구성을 말한다. 검출법 조성은 하이브리다이제이션 프로브, 완충용액, 기타 등등을 포함하나, 이로 제한하지 않는다.

여기에서 사용된 용어, “표적검출을 위하여 구성된 검출법(a detection assays configured for target detection)”은 표적 핵산을 사용하여 수행될 때 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 분석 조성의 집합을 말한다. 예를 들어, 검출법은 경험적으로 특이한 단일염기다형성을 검출하기 위하여 설명되어온 것으로, 표적검출을 위하여 구성된 검출법으로 고려된다.

여기에서 사용된 어구, “특유의 검출법(unique detection assay)”은 생리식염수 검출 패널에 존재하는 다른 검출법과 관련하여 검출법 조성의 상이한 집합을 가진 검출법에 대해서 말한다. 특유의 분석법(unique assay)은 필수적으로 같은 검출 패널에서 그 밖에 다른 분석법보다 상이한 표적(예로서, SUP)을 검출하는 것이 아니라 주어진 표적을 검출하기 위해 사용된 조성의 집합에서 최소한 하나의 차이점을 가진다(예로서, 특유의 검출법은 같은 검출 패널에서 다른 분석에서보다 길이가 짧거나 긴 프로브 서열을 사용할 수도 있다.

여기서 사용된 용어, “후보(candidate)”는 특유의 상태나 성질을 가진다고 추정되는 분석물질 또는 분석대상물, 예로 핵산을 말한다. “후보서열 (candidate sequence)"은 특유의 서열을 포함한다고 추정되는 핵산에 대해서 말하며, 그리고 "후보 올리고뉴클레오타이드(candidate oligonucleotide)"가 특유의 서열을 포함하는 것과 같은 성격을 가지거나, 표적핵산에 대한 혼성결합 또는 분석법에서 수행 능력을 가진다고 추정되는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. ”후보 검출법(candidate detection assay)"은 유효한 검출법이 된다고 추정되는 검출법에 대해서 말한다.

여기에서 사용된 용어, “검출 패널(detection panel)"은 표적 서열을 위하여 구성된 최소한 두 개의 특유의 후보 검출법을 포함하는 기질 또는 장치를 말한다.

여기에서 사용된 용어, “유효한 검출법(valid detection assay)"은 표적과 표현형(예로서 의학조건)의 검출 사이의 연관성을 정확하게 예견하는 것으로 보이는 유효한 검출법의 예로서, 표적이 검출될 때, 당시에 표현형이 의학적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 99.9% 정확히 예견되는 검출법을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 다른 유효검출법의 예로서, 분석대상에 특이적인 시약(Analyte-Specific Reagents (즉, FDA 규율에 의해 정의된)) 또는 실험실의 진단방법(in- Vitro Diagnostics (FDA에 의해 승인됨))으로 거래되어지는 검출법을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.

여기에서 사용된 용어, “키트(kit)"는 재료를 배달하기 위한 모든 배달시스 템을 말한다. 반응법의 내용에서, 배달시스템은 반응 시약(예로서, 적당한 용기 내의 올리고뉴클레오타이드, 효소 등) 및/또는 서포팅 재료(완충용액, 분석을 수행하기 위하여 씌여진 설명서 등)의 저장, 수송 또는 배달을 허락하는 시스템을 포함한다. 예를들면, 키트는 하나 또는 그 이상의 적절한 반응시약 및/또한 서포팅 재료를 포함하는 봉입물(예로서, 박스)를 포함한다. 여기에서 사용된 용어, ”분리된 키트(fragmented kit)"는 총 키트의 세부항목을 각각 포함하는 두 개 또는 그 이상의 분리된 용기를 포함하는 배달 시스템을 말한다. 용기는 함께 또는 각각, 의도된 용기로 배달될 수도 있다. 예를 들어, 첫 번째 용기는 분석법에 사용하기 위한 효소를 포함할 수 있고, 그리고, 두 번째 용기는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 용어 “분리된 키트(fragmented kit)"는 미국 식약청(the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)의 520항에 따라 규제되는 분석대상에 특이적인 시약(Analyte-Specific Reagents)을 포함하는 키트로 구성되나, 이로 제한되지 않는다. 정말로, 둘 또는 그 이상으로 분리된, 각각 총 키트 조성의 세부항목을 포함하는 용기로 구성된 모든 배달시스템은, 분리된 키트(fragmented kit)"라는 용어에 포함된다. 대조적으로, ”혼합된 키트(combined kit)"는 단일 용기(예를 들면, 바람직한 조성의 단일 상자 각 덮개에)에 반응분석법의 조성 모두를 포함하는 배달시스템을 말한다.

여기에서 사용된 용어, “정보(information)"는 사실 또는 자료의 모든 집합을 말한다. 인터넷을 포함하나 제한되지는 않는, 컴퓨터시스템을 사용하여 저장되거나 처리된 정보에 대한 참조에서, 용어는 모든 형식(format; 에로서, 아날로그, 디지털, 시각상의)에서 저장된 모든 데이터를 말한다. 여기에서 사용된 용어, ”목적물에 관련된 정보(information related to a subject)"은 목적물(예로서, 인간, 식물, 동물)에 속하는 사실 또는 데이터를 말한다. 용어 “게놈정보(genomic information)"는 게놈을 포함하는 정보를 말하며, 핵산, 서열, 유전자, 대립유전자 빈도수, RNA 발현수준, 단백질 발현, 표현형에 관련된 유전형 등을 포함하나, 이로 제한되진 않는다. "대립유전자 빈도 정보(Allele frequency information)"는 대립유전자 빈도를 포함하는 사실 또는 데이터를 말하며, 대립유전자 정의, 대립유전자와 목적물(예사람)의 특징 사이의 통계적 상관관계, 개인적 또는 집단내의 대립유전자의 존재 또는 부재, 하나 또는 그 이상의 특유의 특성을 가진 개인에서 존재하는 대립유전자의 가능성 백분율 등을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 여기서 사용된 용어, ”분석 유효 정보(assay validation information)"는 시험 결과에 대한 데이터의 결과(예로서, 컴퓨터의 처리)로부터 게놈정보 및/또는 대립유전자 빈도 정보를 말한다. 예를 들어, 분석 유효 정보는 유효한 검출법으로서 특유의 후보 검출법을 정의하기 위하여 사용되어 질 수 있다.

분자진단의 목표는, 가능한 최소의 노동량과 단계로 가능한 짧은 시간에 분석의 정확하고 민감한 검출을 성취하기 위함이었다. 성취된 하나의 방법은 시료에서 단일 반응용기 또는 용액에서 다중의 검출을 허락하는 분석의 다중 검출이다. 그러나, 다수의 다중 반응을 포함하는 현존 진단법이 여전히, 반응 처리에 대한 시간, 복잡성, 비용이 추가된 시료준비 단계를 포함하는 많은 단계를 요구한다. 하나의 양태로서, 본 발명은 정제되지 않거나 처리되지 않은 생물시료(예, 혈액)에서 직접적으로 처리 가능한, 제공된 분석법에 대한 용액을 제공한다.

진단반응의 기능, 정확성 및 농도에 방해할 수 있는 야생 시료의 수많은 생물학적 요소들의 존재 때문에 생물시료의 직접 검출(예, 혈액, 침, 소변 등)은 어려웠다. 예를 들어, 많은 핵산 분석 검출 기술은, 특수염 및 산도(pH)에 민감하거나, 단백질 분해나 야생요소들에 의한 저해에 목적이 있는 효소 또는 다른 시약을 사용한다. 본 발명은 정제되지 않은 체액에서 핵산 검출 서열을 직접 검출하기 위하여, 인베이더 분석법의 PCR 또는 관련 기술과 혼합 또는 단독으로 사용하기 위한 시스템과 방법을 제공한다. 실시예 12 이하는 이러한 시료를 제공한다. 이러한 방법은 개별적인 반응으로서 사용될 수도 있고 또는 다중 반응으로서 사용될 수도 있다. 많은 여러 양태는 이하에 세밀히 기술하였다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 만약 표적핵산이 존재한다면, 그러한 표적핵산이 검출되는 조건하에서, 정제되지 않은 체액을 검출 분석 시약에 노출하는 단계를 포함하는, 정제되지 않은(또는 부분 정제된) 체액으로부터 하나 또는 그 이상의 핵산을 검출하는 시스템, 구성, 키트 및 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 방법은 단일반응단계에서 수행된다. 예를 들어, 시료가 시약에 한번 노출이 되면, 검출 단계 전에 추가적인 시약을 추가할 필요는 없다. 따라서, 그 방법은 추가적인 사람이나 다른 간섭의 필요없이 반응용기(예로서, 닫혀진 반응용기)에서 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 그 방법은 PCR과 함께 또는 PCR 없이, 침습성의(invasive) 절단 반응을 포함한다. 신호증폭, 감수성 및 침습성의 절단반응에 사용하는 신호를 측정하려는 능력 때문에, PCR이 사용될 때 제한된 주기 수만 사용되었다(예로서, 20, 15, 12, 10, 또는 그 이하). 이러한 방법에서 처리 또는 지원를 위한 키트는 이 방법에서 하나 또는 그 이상의 유용한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면 하나의 양태로서, 키트는 정제되지 않은 체액에서 표적 핵산의 검출 가능한 증폭을 가능케하는 폴리머라아제(중합효소), 5‘ 뉴클라아제(예로서, FEN-1 엔도뉴클라아제) 및 완충용액을 포함한다.

다중반응( Multiplex reactions )

다중반응은 1988년(Chamberlain, et al. Nucleic Acids Res., 16:11141 (1988))에 소개된 이후로, 다중 PCR이 단일 반응에서 다중 유전자좌를 증폭시키는 일반적인 방법이 되었다. 이 접근은 수많은 연구뿐 아니라 임상, 응용에서 활용되고 있다. 그 중에서 특히 다중 PCR은 바이러스 진단학((Elnifro 등의 Clinical Microbiology Reviews, 13: 559 (2000)), 친자확인 (Hidding 및 Schmitt의 Forensic Sci. Int., 113: 47 (2000); Bauer 등의 Int. J. LegalMed. 116: 39 (2002)), (장기 등의)이식 전의 유전학 진단 (Ouhibi 등의 Curr Womens Health Rep. 1: 138 (2001)), 환경 및 음식시료에서 미생물학 분석 (Rudi 등의 Int J Food Microbiology, 78: 171 (2002)) 및 수의학 (Zarlenga 및 Higgins의 Vet Parasitol. 101: 21 (2001))에서 활용되어 왔다. 가장 최근, 전체 게놈 수준에 대한 유전학, 특히 단일염기다형성 또는 SNP를 위한 분석의 발전은, 높은 다중 PCR능의 필요성을 만들어왔다. 상대적인 게놈-와이드 어소시에이션 ( genome- wide association) 및 후보유전자 연구는 개인당 100,000 내지 500,000 SNPs 의 유전자형에 대한 연구능력을 요구한다 (Kwok, Molecular Medicine Today, 5: 538-5435 (1999); Kwok, Pharmacogenomics, 1: 231 (2000); Risch 및 Merikangas, Science, 273: 1516 (1996)). 더구나, 암호화 또는 조절 리젼의 SNPs는 중요한 방식으로 유전자 기능을 변화시킨다(Cargill et al. Nature Genetics, 22: 231 (1999); Halushka et al., Nature Genetics, i 22: 239 (l999)), making these SNPs useful diagnostic tools in personalized medicine (Hagnann, Science, 285: 21 (1999); Cargill et al. Nature Genetics, 22: 231 (1999); Halushka et al., Nature Genetics, 22: 239 (1999)). 마찬가지로, SNPs 세트의 의학적 어소시에이션(association) 을 증명하는 것은 이미 그들의 잠재적인 임상 관련성에 대해 정의 되었는데, 이는 진단 펠렛의 일부분이 수 천가지의 마커로 수천 명의 개인을 동시에 검사를 할 것이기 때문이다.

그것의 넓은 분야의 요청 및 활용 대신에, 몇몇 요소들은 다중 PCR 증폭을 복잡하게 한다. 그들 사이에 가장 주요점은 다른 것보다 긴 길이로 증폭되는 일부좌의 PCR 또는 증폭 경향의 현상이다. 증폭 경향의 두 가지 클래스가 설명되었다. 하나는, PCR 드래프트를 언급하는 것으로, 반응의 초기 시기 동안 프루나 어닐링(어닐링 과정 중 결합하는 가닥이 가지 치는 듯한)과 같은 단계에서 확률적인 편차에 대해 일컫는 것으로(Polz 및 Cavanaugh, Applied and Environmental Microbiology, 64: 3724 {1998)), 재생산 할 수 없고, 표적분자의 아주 작은 양이 증폭되어질 때 가장 일반적일 수도 있다(Walsh et al., PCR Methods and Applications, 1: 241 (1992)). 다른 하나는 PCR 선정에 대해 언급한 것으로, 프라이머 특성, 앰플리콘 길이, GC양 및 다른 게놈의 특성(폴즈(Polz), 수프라(supra))에 기초한 일부 유전자좌의 우선적인 증폭을 말한다.

PCR 반응이 다중화될 때, 길이(extent)에 영향을 주는 다른 요소는 최고단계(플래투 단계)에 다다르게 하는 PCR 반응의 타고난 성향이다. 이 최고 단계는 후기 PCR 주기에서 보이지며, 슈도-리니어( pseudo-linear) 축척에 대한 기하급수적인 증가와, 그런 후에 결국에 증가가 멈추는 것으로부터, 앰플리콘 생산이 이동되는 것을 반영한다. 이 효과는 DNA 폴리머라아제와 그들의 이중 가닥의 생산물 사이의 비특이적인 상호작용에 기인한 것으로 보인다. 최고단계에서 효소에 대한 생산의 몰 비율은, 생산물 대 효소 비율은 약 30:1 이며, 심지어 효소의 다른 양이 이 반응에 포함되었을 때도 몇몇 DNA 폴리머라아제에 대해 전형적으로 일치한다. 따라서 이 효과는, 그렇게 수많은 다른 좌가 증폭된, PCR 반응에 의해 생산될 수 있는 이중 가닥의 생산물의 총량을 제한하며, 겔 전기영동, 프라이머 신장, 등에 의한 순차적인 분석에 바람직한, 각 앰플리콘의 총량에 대해 균형을 유지하여야 한다. 이것과 다른 고려사항 때문에, 비록 50개의 유전자 좌를 포함하는 다중의 PCR이 보고되었으나(Lindblad-Toh 등, Nature Genet. 4: 381 (2000)), 다중화는 전형적으로 10가지(별개의) 생산물보다 더 적게 제한된다. 그러나, 단일 게놈 DNA 시료로부터 100,000 내지 450,000 SNPs 만큼이나 많이 분석할 필요가 있기 때문에, PCR 반응의 다중능을 신장하는 값에 대한 명백하게 필요하다.

본 발명은 예로서 다중 PCR 증폭과 인베이더 검정를 혼합하는, 상당한 다중화 PCR 반응에 대한 방법을 제공한다. 인베이더 검정은 다중반응에서 아주 많은 수의 표적이 검출되는 것을 가능하게 하는 검출 단계와 신호 증폭을 제공한다. 바람직하게, 수백에서 수천, 수십만의 표적이 다중 반응에서 검출될 수 있다.

인베이더 검정에 의한 직접 유전자형은 검출용기에 따라 전형적으로 SNP당 5 내지 100 ng의 인간 게놈 DNA를 사용한다. 소수의 검정를 위하여, 반응은 표적의 증폭 전-과정 없이 직접적으로 게놈 DNA로 수행할 수 있으나, 100,000 인베이더 검정 이상이 개발되고 심지어 수많은 게놈-와이드 관련 연구(genome- wide association studies)를 위한 기대로, 다량의 DNA 시료가 제한적인 요소가 될 수 있다.

인베이더 검정가 신호로부터 10⁶ 내지 10⁷ 배의 증폭을 제공하기 때문에, 인베이더 검정와 혼합한 다중 PCR은 전형적인 PCR과 비교할 때 제한된 표적증폭에서만 사용된다. 그 결과로서, 이와 같이 더욱 광범위한 다중화를 제공하기 때문에, 표적에 대한 낮은 증폭수준은 혼합물의 개별적 반응 사이의 영향을 완화시켜 주고 그 생산물의 축척에 의한 PCR의 저해를 감소시킨다. 게다가, 이것은 낮은 증폭수준이 표적의 교차오염을 감소시키고 PCR에 의한 돌연변이 수를 감소시킨다고 생각된다.

다른 유전자좌의 불규칙한 증폭은 다중화된 PCR의 개발에서 가장 큰 도전 중의 하나이다. 두 유전자좌 사이의 증폭 요소의 차이점은, 빨리- 증폭하는 유전자좌로 부터의 신호가 검정의 포화수준이상인 동안, 천천히-증폭하는 유전자좌에 대한 인베이더 검정에 의해 생산된 신호가 검정의 검출 한계 이하인 상황의 결과일 것이다. 이 문제는 몇몇 방법에서 설명 되어질 수 있다. 하나의 양태로서, 인베이더 반응은 그러한 검출의 역학적 범위를 유의하게 신장하기 때문에 다른 시각, 예로서 실시간으로 읽을 수 있다. 하나의 다른 양태로서, 다중 PCR은 더욱 유사한 수준의 증폭에 도달하기 위한 다른 종류의 유전자좌를 허락하는 조건하에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 농도는 한정될 수 있으며, 그것 때문에 더욱 획일화된 수준의 증폭에 도달하기 위한 각각의 유전자좌를 허락할 수 있다. 또 다른 양태로서, PCR 프라이머의 농도는 다른 유전자좌의 증폭 요인의 균형화를 위해 조정할 수 있다.

본 발명은 단일 반응에서 수백에서 수천 생산물을 포함하는 높은 다중 PCR의 디자인과 특성을 제공한다. 예를 들면, 백 개의(hundred-plex) PCR에 의한 표적에 대한 전-증폭은, 검정당 0.1 ng 이하로 인베이더-베이스드 SNP 유전자형(INVADER-based SNP genotyping)을 위해 요구되는 인간 게놈 DNA의 양을 감소시킨다. 높은 다중 PCR 적정화의 특성 및 프라이머 디자인을 위한 컴퓨터 프로그램은 하기에 설명되어있다.

높은 다중 PCR의 방법을 추가적으로 제공하기 위하여, 본 발명은 앞으로, 순차적인 조작이나 시약의 추가 없이 시작반응이 셋업 되어있는 단회 반응 용기에서 표적처리 및 신호증폭반응의 방법을 제공한다.

이러한 혼합된 반응은 매우 짧은 반응 시간에 제한된 표적량으로 정량분석을 하기 위한 적합한 방법이다.

이하의 논의는 일부 우선적인 실예에 대한 양태의 설명을 제공하며, 본 발명의 범위를 제한하는 경향이 있다.

I. 다중 PCR 프라이머 디자인( Multiplex PCR Primer Design )

인베이더 검정은 100 내지 10 ng 만큼 작은 게놈 DNA를 가지고, 표적에 필요한 전-증폭과정 없이, 단일 염기 다형성의 검출을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 수십만의 SNP를 포함하는 전체 게놈 관련의 연구를 위한 발전과 잠재력을 가진 50,000 이상의 인베이더 검정에서, DNA 시료의 양은 라지 스케일(large scale) 분석에 대해 제한요인이 된다. 표적 증폭 없이 인간의 게놈 DNA(hgDNA)에서 인베이더 검정의 감수성에 기인하여, multiplex PCR 인베이더 검정와 짝을 이룬 다중 PCR은, 전통적인 겔 검출방법을 위해 광범위한 증폭(10⁹-10¹²)을 요구하는 전형적인 다중 PCR 반응에 대한 비교로서, 단지 제한된 표적 증폭(10³-10⁴)만을 요구한다. 인베이더 검출을 위해 사용된 표적 증폭의 낮은 수준은, 표적 축적의 일반적인 결과로서 증폭이 방해되는 것을 피함으로서 더욱 광범위한 다중화를 제공한다. 본 발명은 다중 PCR을 위한 프라이머 세트를 생산의 선별 기준 및 방법을 제공한다(예로서, 그것은 인베이더 검정와 같이 검출 방법와 짝을 이룰 수 있다). 하나의 양태로서, 본 발명의 소프트웨어 응용은 PCR 프라이머 선별에 자동화되었고, 따라서 거기에서 디자인된 프라이머를 가지고 높은 다중 PCR이 가능하다. 실시예 2에서 보이는 것처럼, SNP 검출을 위한 플랫폼으로서, 인베이더의 의학적으로 관련된 패널을 사용하여, 본 발명의 방법, 소프트웨어 및 선별기준을 단회 PCR 반응으로부터 101개 중에 94개의 앰플리콘(~ 93%)의 유전자형을 정확히 가능하게 하였다. 일반적인 PCR 반응은 주형으로서 10 ng의 hgDNA만 썼으며, 그에 반하여 인베이더 검정에서는 150 pg 이하의 hgDNA를 썼다.

인베이더 검정은 다른 온도를 사용하여, 한 가지 포맷의 같은 반응에서, 두 개의 다른 대립유전자의 연속적인 검출이 가능하다. 대립유전자 판별은 프로브의 “구조 특이적인” 절단으로 일어나며, 주어진 다형성에 상응하는 5' 플랩(flap)을 방출한다. 두 번째 반응에서 방출된 5‘ 플랩은 적당한 FRET 카세트의 절단에 의해 신호의 생성이 매개되어진다.

본 발명의 소프트웨어 응용의 한 양태에서 사용된 인베이더 메디컬리 어소시에이션(Medically Associated Panel) 패널에서, 분석을 위한 유효한 서열의 101 프라이머 세트에 대한 프라이머 쌍(정방향 및 역 방향 프라이머) 중의 하나의 생성은 시료의 단회 기재(entry)의 인풋 파일(input file)을 포함한다( 예로서, SNP를 포함하는 단일 표적서열을 위한 표적 서열 정보는 본 발명의 방법과 소프트웨어로 처리된다.) 표적 서열 정보는 서드 웨이브 테크놀리지스츠 쉽(Third Wave Technologiests SHIP#) 번호, 숏 네임 아이덴티파이어(short name identifier), 및 SNP 위치가 덧붙여서 표시된 서열을 포함한다.

같은 기재(entry)의 아웃풋 파일(output file)(예로서, 본 발명의 시스템, 방법 및 소프트웨어에서 처리된 표적 서열을 보여줌)은 풋프린트 리젼의 서열(SNP 사이트의 측면에 중요하게 씌여진 부분, 표적 서열에서 SNP를 검출하기위한 표적 서열에 대해 인베이더 검정 프로브가 결합하는 부분을 보여준다), 정방향 및 역방향 프라이머 서열(굵은 표시) 및 프라이머에 관련된 Tms(녹은점 온도)을 포함한다.

하나의 양태로서, 다중의 PCR이 가능하게 프라이머 세트를 만드는 프라이머의 선별은 자동화된 패션으로 수행된다(예로서, 소프트웨어 응용에 의함). 다중의 PCR의 자동화된 프라이머 선별은 도 8의 흐름도에 보여지는 디자인된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 완수 될 수 있다.

다중 PCR은 주로 프라이머-이중화가 형성되는 결과에 의해, 가짜 생산물의 앰플리콘 및 선택된 증폭의 편중된 증폭을 피하기 위한 광범위한 적정화를 요구한다. 이 문제를 피하기 위해, 본 발명은 다중 PCR을 위해 구성된 프라이머 세트를 생산하기 위한 선택기준을 제공하는 소프트웨어 응용 및 방법, 및 검출방법(인베이더 검출법)에서 순차적인 사용을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명의 방법과 소프트웨어 응용은 사용자 정의된 서열 및 상응하는 SNP 위치에서 시작한다. 일부의 한 양태로, 방법 및/또는 소프트웨어 응용은 각 서열의 표적 서열(인베이더 검출을 위해 요구되는 최소 앰플리콘)내에 풋프린트 리젼을 결정한다. 풋프린트 리젼은 사용자가 한정한 밖으로 뻗어나가는 추가적인 염기뫄 마찬가지로, 검정 프로브가 결합하는 리젼를 포함한다(예로서, 추가염기는 검정 결합하는 각각의 면을 포함한다). 다음으로, 프라이머는 풋프린터 리젼로부터 바깥쪽으로 디자인되었고 몇몇의 기준에 대하여 평가되었는데, 현재 다중화 세트에서 미리 디자인된 프라이머-이량체 형성을 위한 잠재성을 포함한다. 이 과정은 현재의 다중의 세트에서 모든 서열에 대한 프라이머가 디자인 되어질 때까지, 동일한 세트의 서열에서 다수의 반복을 통하여 계속 될 수 있다.

프라이머가 디자인되면, 주형으로 10 ng의 hgDNA만 사용하여 표준 조건하에서 다중 PCR이 수행될 수 있다. 95℃에서 10분 동안 방치한 후에, 50ul의 Taq (2.5 유니트(units))를 추가한 후, 50 회의 주기로 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 인베이더 맵 플레이트(3ul/웰)에서 직접 희석되고 로딩 될 수 있다. 추가적으로 3ul의 15mM MgCl₂ 는 인베이더 맵 플레이트의 각 반응에 첨가되고, 그리고 6ul 의 미네랄 오일로 덮었다. 플레이트는 95℃에서 5분 동안 변성시키고, 63℃에서 40분 동안 반응시켰다. FAM 및 RED 형광성은 사이토플로어(Cytofluor) 4000 형광 플레이트 리더(fluorescent plate reader)에서 측정하고, 각 앰플리콘에 대해서 “폴드 오버 제로(Fold Over Zero(FOZ)) 값을 계산하였다. 각 SNP로부터의 결과는 표에 '패스(pass)"는 연두색, "미스-콜(mis-call)" 은 분홍, "노-콜(no-call)"은 흰색으로 표기하였다(실시예 2 참조).

하나의 양태로서, 많은 PCR 반응은 약 1 내지 약 10의 반응이다. 다른 하나의 양태로서, 많은 PCR 반응은 약 10회 내지 약 50회의 반응이다. 또 다른 하나의 양태로서, 많은 PCR 반응은 약 50회 내지 약 100회의 반응이다. 추가적인 양태로서, 많은 PCR 반응은 약 100회 내지 약 1000회의 반응이다. 여전히 다른 양태로서, 많은 PCR 반응은 약 1000회 이상의 반응이다.

본 발명은 또한 다중 PCR 반응을 최적화하기 위한 방법을 제공한다(프라이머 세트가 생성되면, 각 프라이머 또는 프라이머 쌍의 농도는 최적화 되었다). 예를 들어, 한번 프라이머 세트가 만들어지고 동일한 몰 농도로 다중 PCR에서 사용되어지면, 프라이머는 적정 프라이머 농도가 다중 프라이머 세트가 잘 수행되게 결정되어 개별적으로 평가되어진다.

다중 PCR 반응은, 표준적이고 단일 PCR 반응(한 곳에서 PCR 반응이 일어남)과 비교로서, 핵산정보를 얻는 효과적이고 낮은 비용으로, 과학적, 연구적, 임상적 및 생물공학 산업에서 인정되어왔다. 반응 용기(튜브 또는 멀티-웰 플레이트의 웰)당 단일 증폭반응만 수행하는 대신에 수많은 증폭 반응이 단일 반응 용기에서 수행되었다.

표적당 비용은, 검정 셋업 및 데이터 분석에서 줄여진 기술의 시간 및 상당한 시약의 절약(특히 효소 비용)에 의해 이론상으로 낮아진다. 다중 접근의 다른 이점은 훨씬 낮은 표적 시료가 요구된다는 것이다. 수십만 단일염기다형성을 포함하는 전체 게놈관련 연구에서, 표적이나 테스트 시료의 양은 라지 스케일 분석(large scale analysis)을 위해 제한되어지는데, 단일 반응을 수행하는 개념으로서, 예를들어 100개의 결과를 얻기 위해 하나의 액체시료를 사용하는 것과 100개의 액체시료를 사용하는 것과의 대결은 매력적인 옵션이다.

성공적인 다중 PCR 반응을 위하여 프라이머를 디자인하는 것은, 프라이머간의 비정상적인 상호관계의 결말이 검토될 수 있다. 프라이머 이량체의 형성은, 심지어 길이에서 몇몇 염기만 있는, 표적 서열에 대한 두 프라이머의 정확한 결합을 저해할 수도 있다. 더군다나, 만약 이량체가 프라이머의 3‘ 말단 가까이에 형성되면, 3’ 말단이 프라이밍 이벤트(프라이머가 주형을 인식하고 결합할 때 중요한 부분으로 인식됨)를 위해 요구되어지기 때문에 증폭이 없거나 아주 낮은 수준의 증폭이 일어날 것이다. 명확하게는, 다중 반응에 활용된 상당한 프라이머가, 더 비정상적인 프라이머 상호관계 형성이 가능하다. 본 발명의 방법, 시스템 및 응용은, 높은 다중 PCR에 적합한 세트를 만들므로서 프라이머의 라지 세트에서 프라이머 이량체를 방해하도록 돕는다.

수많은 위치에서 프라이머가 디자인되었을 때(예를 들어 다중 PCR반응에서는 100개의 위치에서), 프라이머쌍을 디자인한 명령이, 반응의 위해 양립할수 있는 프라이머쌍의 전체 수에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 만약 프라이머 첫 번째 세트가 A/T가 많은 표적리젼에 대해서 디자인되었다면, 이 프라이머 세트는 A/T가 많게 된다. 만약 두 번째 표적리젼 또한 A/T가 많은 리젼에서 선택되었다면, 두 번째 세트를 위한 프라이머 디자인은 프라이머 이량체와 같은 적절한 상호작용에 의해 양립할 수 있다. 그러나 만약 두 번째 선택된 표적리젼가 A/T가 많은 리젼가 아니라면, 첫 번째 A/T가 많은 프라이머 세트와 상호작용하지 않게 디자인되어질 수 있다. 입력된 표적 서열의 모든 주어진 세트를 위하여, 본 발명은 프라이머 세트를 디자인하는 명령은 무작위로 한다(도 8 참조). 더군다나, 일부 양태어서는, 본 발명은, 모든 주어진 다중 반응을 위한 많은 양립 가능한 프라이머 세트를 최대화하기위한, 대다수 다르고, 무작위적인 명령에서, 표적서열의 입력 세트를 재명령한다.

본 발명은 다중 디자인에서 표적에 대한 프라이머 세트를 위한 수많은 양립 가능한 프라이머를 최대화하는 동안, 3‘ 상호작용을 최소화하기위한 프라이머 기준을 제공한다. 프라이머는 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3' 로 나타낼 수 있으며, N[1]는 A 또는 C( 다른 양태로서, N[1]는 G 또는 T)이다. N[2]-N[l]인 각각의 정방향 및 역방향 프라이머는 어떤 다른 올리고뉴클레오타이드의 N[2]-N[l]와도 상보적일 수 없다. 다른 하나의 양태로, N[3]-N[2]-N[l]는 어떤 다른 올리고뉴클레오타아드의 N[3]-N[2]-N[l]와도 상보적일 수 없다. 바람직한 양태로, 만약 이 기준이 주어진 N[l]에서 만나지 않는다면, 정방향 프라이머를 위한 5’ 방향의 다음 염기 또는 역방향 프라이머를 위한 3‘ 방향의 다음 염기가 N[l]자리로 평가될 수 도 있다. 표적에 무작위적 것과 관련하여, 모든 기준이 표적서열의 모든, 또는 아주 많은 부분( 표적서열의 95%가 이 기준에 딱 맞는 프라이머 세트로 만들어진 프라이머쌍을 가질 수 있다)과 만날 때까지, 이 과정은 반복되어진다.

다중 프라이머 디자인에서 극복해야할 또 다른 도전(challenge)은, 실제로 요구되는 뉴클레오타이드 서열, 서열 길이 및 올리고뉴클레오타이드 녹는점 온도(melting temperature (Tm))의 제약 사이의 균형이다. 중요하게도, 다중 프라이머 세트의 프라이머는 완충용액, 염 및 온도의 동일한 반응조건하에서 기능을 할 수 있기 때문에, 관련 리젼에 GC 또는 AT가 많은 리젼가 있다고 할지라도, 충분히 유사한 Tm 값을 가지는 것이 필요하다. 본 발명은 최소 및 최대 Tm값과 최소 및 최대 길이에 일치하는 프라이머 디자인을 가능하게 한다. 예를 들어, 각각 프라이머 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]w-3' 의 식에서, x는 프라이머가 미리 결정된 녹는점 온도를 가지도록 선택된다(예로서, 프라이머가 약 50℃의 녹는점 온도를 가 가질때 까지, 프라이머에 염기를 포함시킨다).

종종 PCR 반응 생산물은 결합방식으로 검출하는 방법 또는 예로서 인베이더 검정와 같은, 다른 핵산 검출 값을 위한 표적 물질로 사용된다. 증폭 프라이머 사이에 적절한 상호작용에 대한 두 번째 반응을 가능하게 하기 위해 프라이머 위치를 정하는 것이 고려되어야 할 것이고, 두 번째 반응 올리고뉴클레오타이드는 정확한 결과와 값을 위해 최소화되어야 할 것이다. 선택기준은 다중 프라이머 세트를 위해 디자인된 프라이머가 검출법의 올리고뉴클레오타이드와 반응하지 않는 프라이머가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 이중의 인베이더 검정의 FRET 올리고뉴클레오타이드와 반응하는 프라이머를 방해하기 위하여, 일부 유사 기준이 사용되었다. 특히, 만약 세트에서 각각의 프라이머가 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'로 정의 되었다면, N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3‘는 FRET 또는 인베이더 올리고뉴클레오타이드와 95% 이하의 유사성을 가진 것이 선택된다. 다른 양태로서, N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3‘는 FRET 또는 인베이더 올리고뉴클레오타이드와 80% 이하의 유사성을 가진 프라이머로 선택된다. 다른 하나의 양태로서, N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3‘는 FRET 또는 인베이더 올리고뉴클레오타이드와 70% 이하의 유사성을 가진 프라이머로 선택된다.

프라이머 세트를 개발하기 위해 본 발명에서 기준이 사용되는 동안, 일부 프라이머쌍은 모든 정해진 기준(에러로서 거절될 수 있는)과 일치하지 않을 수 있다. 예를 들면, 100개의 표적 세트에서 30개가 디자인되고 모든 리스트된 기준과 일치하나, 세트 31는 실패한다. 본 발명의 방법에서, 세트 31이 실패되어 플래깅(flagging)할 수 수 있고 그 방법은 100개의 표적 리스트를 통하여 계속 될 수 있으며, 기준과 일치하지 않은 세트는 다시금 플래깅)(flaggng)할 수 있다(도 8참조). 한번 100개의 표적이 프라이머 디자인에서 기회를 갖는다면, 그 방법은 실패된 세트의 수를 기록하고, 디자인 과정을 무작위로 명령하고 반복하는데서 100개의 표적을 재명령 할 것이다(도 8 참조). 변경 후에, 대부분 넘겨진(passed) 프라이머 쌍을 가진 세트(실패된 세트의 최소한의 수)는 다중 PCR 반응을 위해 선택된다(도 8 참조).

도 8은 본 발명의 방법과 소프트웨어 응용의 한 양태의 기본 흐름도를 보여준다. 바람직한 양태로서, 도 8에서 기술된 과정은 사용자의 용이함을 위하여 소프트웨어 응용으로 편입시켰다(또한 그 방법이 도 8의 가이드로서 수동으로 조작하여 사용할 수 도 있다).

표적 서열 및/또는 프라이머쌍은 도 8에서 보여지듯이 시스템 내에 삽입시켰다. 첫 번째 박스 세트는 다이머 테스트 엔트리(DimerTest entries)(, 사용자가 사용하기를 원하는 프라이머 쌍 또는 프라이머들, 그러나 아직 프라이머 이량체나 야간의 반응성은 테스트되지 않음) 프라이머 쌍과 마찬가지로, 다른 서열이 프라이머 세트 풀(pool)(예로서, PDPass, 이 서열은 서로 프라이머 이량체를 형성하거나 FRET 서열에 대한 반응성을 가지는 것 없이 이미 처리되거나 보여지는 서열)내로 즉시 넘겨지는 동안, 표적서열이 어떻게 풋프린트를 결정짓는(도 8B 참조) 서열 목록으로 첨가되는지를 보여준다(도 8B). 다른 말로, 박스의 시작 세트는 "앤드 오브 인풋(end of input)"을 지시하고, 나중에 적절히 처리된 서열을 정렬한다,

도 8에서 "A"로 시작하는, 프라이머 풀은 새로운 진행을 시작하기 위하여, 기본적으로 지워지거나 또는 “비워진다”. 표적 서열은 “B"로 보내어 처리되고, 다이머테스트 쌍(DimerTest pairs)은 ”C"로 보내어져 처리된다. 표적서열은 사용자 또는 소프트웨어 응용이 표적서열을 위한 풋프린트 리젼을 결정하는 곳인 “B"로 보내어진다(예로서, 검정 프로브는 표적서열에서 돌연변이(예로서, SOP)를 검출하기 위하여 결합할 수 있는 곳). 이 리젼를 완전하게 포함하여 디자인된 그러한 프라이머의 리젼(사용자가, 결합리젼가 지나서 추가적인 염기가 첨가되어진 것을 한정함으로서 신장될 수 있는)를 디자인하는 것이 중요하다. 도 8에서, 인베이더 크리에이터(INVADER CREATOR) 소프트웨어 응용은 표적 리젼와 결합할 인베이더 올리고뉴클레오타이드와 하위방향의 프로브를 디자인하기 위해 사용되었다(비록 모든 종류의 시스템이 프로브 디자인에서 사용자가 흥미 있어 하는 모든 종류의 프로브를 생산하기 위해 사용될 수 있지만, 따라서 표적서열을 위한 풋프린트 리젼을 결정하는 것이다). 따라서 핵심 풋프린트 리젼은 표적에서 두 개의 검정 프로브의 위치에 의해 정의되어진다.

다음으로, 시스템은 풋프린트의 5‘ 끝 쪽에서부터 시작하고, 첫 번째 염기에 도달할 때 까지 또는 첫 번째 A 또는 C (또는 G 또는 T)에 도달할 때 까지 5“ 방향으로 이동한다. 정방향 프라이머의 서열을 정의하기위한 시작점으로서 두는 것이다(즉, 이것은 처음의 N[1] 자리). 이 처음의 N[1]자리로부터, 정방향 프라이머를 위한 프라이머의 서열은 표적 리젼에서 만나는 염기와 동일하다. 예를 들면, 만약 프라이머의 디폴트 크기가 12개의 염기로 이루어져 있다면, 시스템은 N[1]으로 선택된 염기에서 시작하고 표적 서열에서 찾은 다음 11개의 염기를 추가한다. 그리고 나서 12-머 프라이머는 녹는점 온도가 테스트(예로서, 인베이더 크리에이터를 사용하여)되고, 추가적인 염기는 프라이머 서열이 사용자에 의해서 최소 및 최대 녹는점 온도로서 디자인된 녹는점 온도를 가질 때까지(예로서, 약 50 ℃이나 55 ℃ 이상은 아닌) 표적서열에서 추가 된다. 예를 들면, 시스템은 5'-N[x]-N[x-1]- ..... -N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3' 형식을 제공하고 x는 처음에 12이다. 그리고는, 시스템은 미리 정해놓은 녹는 점 온도가 될 때 까지 x를 높은 숫자(예로서, 긴 서열)로 맞춘다. 하나의 양태로서, 최대 프라이머 크기는 디자인된 프라이머의 길이를 제한하는 상위 제한으로 두기 위한 디폴트(초기설정) 파라메터(parameter; 매개변수)로 사용된다. 일부 양태로서, 최재 프라이머의 크기는 약 30 염기(예로서, 29 염기, 30 염기, 31 염기)이다. 다른 양태로서, 디폴트 셋팅(예로서, 최소 및 최대 프라이머 크기, 최소 및 최대 녹는점 온도) 은 표준 테이타베이스 조작 기술을 사용하여 변형되어질 수 있다.

도 8에서 다음 박스는, 지금까지 디자인된 프라이머가 프라이머 이량체 및/또는 (풀(pool)에서 이미 다른 서열과)플랫 반응성을 일으키는지를 결정하기위해 사용되어진다. 이결정을 위해 사용된 기준은 위에 성명되어있다. 만약 프라이머가 이 단계를 넘어간다면,정방향 프라이머는 프라이머 풀(pool)에 추가된다. 그러나. 만약 정방향 프라이머가 도 8에서 보여준 이 기준을 실패하면, 시작점은 5‘ 방향(다음 A 또는 C, 또는 다음 G 또는 T)으로 한 뉴클레오타이드가 옮겨간다(N[1]이 옮겨진다). 시스템은 처음에, 성공적인 프라이머를 만들기 위해서, 표적 서열에서 충분한 위치을 허락하는 확실한 쉬프팅(이동하는)을 하기위해서 체크(조사)한다. 만약 ’예스‘라면, 시스템 경로는 뒤로 가서 이 프라이머의 녹는점 온도를 체크한다. 그러나 만약 어떤 서열도 디자인 할 수 없다면, 표적 서열은 에러로 표시된다(이 표적으로부터 어떤 정방향 프라이머도 만들어 질수 없다고 표시된다).

동일한 과정은 도 8에서도 볼수 있듯이 역방향 프라이머를 디자인할때도 반복된다. 만약 역방향 프라이머가 성공적으로 만들어진다면, 프라이머 쌍 EH는 프라이머들은 프라이머 풀(pool)에 입력되고, 시스템은 다시 “B"로 돌아가거나(예로서, 더 이상의 표적 서열을 처리하기 위해서라면), 다이머테스트 쌍(DimerTest pair)을 테스트 하기위해서 "C"로 간다.

도 8의 "C"의 시작(starting)은, 프라이머(들)로 입력되는 프라이머 쌍이 어떻게 시스템에 의해 처리되는지를 보여준다. 도 8에서 보여지듯이, 만약 다이머테스트 쌍이 없다면, 시스템은 "D"로 간다. 그러나, 다이머테스트 쌍이 있다면, 상기에서 설명한 프라이머 이량체 및/또는 FRET 반응성을 테스트한다. 만약 다이머테스트 쌍이 이 기준을 통과하지 못한다면, 그들은 에러로 표시된다. 만약 다이머테스트 쌍이 이 기준을 통과한다면, 프라이머 세트 풀(pool)에 추가되고, 그리고 나서 만약 더 이상이 다이머테스트쌍을 테스트할 것이 있으면 시스템은 "C"로 돌아가고, 만약 더 이상의 테스트가 없다면 "D"로 간다.

도 8의 "D"에서의 시작(starting)은, 생성된 프라이머 풀(pool)이 평가 되어진다. 이 섹션의 첫 번째 단계는 서열의 특유의 무작위적 조합에 의해 생성된 에러(실패)의 수를 조사하기 위한 것이다. 만약 에러가 없다, 이 세트는 사용자에게 출력되어지는 가장 좋은 세트이다. 만약에 제로 에러(zero errors) 이상이라면, 시스템은 에러를 가장 최소화 시킨 결과를 유출했던 다른 사전의 실행과 이 실행을 비교한다. 만약 현재의 실행이 에러가 거의 없다마ㅕㄴ, 이것은 현재에 가장 좋은 세트로 디자인 된 것이다. 이 시점에서, 시스템은 동일한서열의 다른 무작위적인 세트와 의 실행을 시작하기 위해 "A"로 돌아갈 수 있고, 또한 미리 세트된 실행의 최대수치(예로서, 5 실행)가 이 실행에 도달할 수 있다(예로서, 이것은 5번째 실행이었고, 실행의 최대수는 세트 5 였다). 만약 최대치가 도달되었으면, 가장 좋은 세트는 가장좋은 세트로 출력되었다. 프라이머의 가장 좋은 세트는 다중 PCR 반응이 수행되는 것과 같이 올리고뉴클레오타이드의 물리적 세트로 생성되기 위해 사용되었다.

다중 PCR 반응을 수행시키기 위한 다른 챌린지는, 표준 다중 반응에 결과되는 동일하지 않는 앰플리콘 농도이다. 앰플리콘으로 표적화된 다른 유전자좌는, 다른 앰플리콘 생산물의 각각의 광대하게 다른 농도를 산출하는 증폭반응에서 각각 다르게 행동할 수 있다. 본 발명은, 첫 번째 검출법의 리드(read)(예로서, 인베이더 검정 리드)에 관계하는 프라이머 농도를 최적화하기 위해 사용되어질 수 있는, 그리고 다른 앰플리콘의 실제적으로 동일한 농도에 가깝게 프라이머 농도를 균형화하는, 방법, 시스템, 소프트웨어 응용, 컴퓨터 시스템 및 컴퓨터 데이터 저장매체를 제공한다.

다양한 프라이머 쌍을 위한 농도는 실험적으로 결정될 수 있다. 하나의 양태로서, 첫 번째 실행은 동일한 몰 농도의 모든 프라이머와 처리된다.

그리고 나서 처리 시간이 정해진다. 처리시간에 기초하여, 각 앰플리콘을 위한 관련 증폭 요인이 결정된다. 그리고 나서 통일된 정확한 방정식에 기초하여, 프라이머 농도가 되는 추정 값은 동일한 시점에 더욱 가깝게 신호를 갖도록 얻는다. 이 검출법은 다른 크기(384 웰 플레이트)의 어레이(array)에서 실시할 수 있다.

검출법에 대한 발명과 검출법 어레이의 혼합이 상당히 효과적인 과정을 제공하는 것으로 평가된다. 본 발명에 의해 생성된 프라이머(들)와 프라이머 쌍의 균형화된 혼합물을 사용하기 때문에, 싱글 포인트 리드(single point read)는 평균적인 사용자가 다른 표적의 어레이를 가로질러 높은 감수성과 특수성을 요구하는 공정테스트에서 큰 효과를 얻을 수 있음으로 해서 수행되어질 수 있다.

단회 반응 용기에서 프라이머 쌍 농도를 최적화하는 것은, 사용자가 단회 반응 용기 및 한 단계에서 대다수 또는 다양한 표적 증폭을 위한 증폭을 처리하도록 허락한다. 그리고 나서, 한 단계 과정의 산출은 예를 들면 수백의 검정를 위한 테스트 결과 데이타를 성공적으로 얻기 위해서 사용되어진다. 예를 들면, 384웰 플레이트에서 각각의 웰은 여기에서 다른 검출법을 사용할 수도 있다. 한 단계 다중 PCR 반응의 결과는 게놈 DNA의 증폭된 384개의 다른 표적을 가지며, 각 플레이트를 위한 384개의 테스트 결과를 제공한다. 각 웰은 심지어 가장 큰 효과를 얻어질 수 있는 대다수의 검정를 실행하는 곳이다.

그러므로, 본 발명은 각 PCR 산물의 공정한 증폭이 이루어지기 위한 파라메터로서 높은 다중 PCR에서 각각의 프라이머 세트의 농도의 사용을 제공한다. 모든 PCR은 프라이머 어닐링(annealing)과 프라이머 신장 단계를 포함한다. 표준 PCR 조건하에서, 프라이머 신장 단계의 최적의 시간이 증폭된 산물의 길이에 의존하고 어닐링 단계를 더 길게 하는 동안, 1 uM의 높은 프라이머 농도는 프라이머 어닐링의 빠른 반응속도(kinetics)를 보증한다. 프라이머 농도의 감소에 의해, 어닐링 반응속도는 제한된 단계가 될 수 있고, 프라이머 증폭 요인은 프라이머 농도, 프라이머의 결합률 및 어닐링 시간에 크게 의존 받을 수 있다.

프라이머 P와 표적 T의 결합은 다음 식에 의해 나타낼 수 있다:

여기서, k _a 는 프라이머 어닐링의 결합률 상수이다. 우리는 어닐링이 프라이머 녹는점이하의 온도에서 일어나고 역반응은 무시될 수 있다고 추정하였다.

프라이머 과량의 조건하에서 이 반응속도에 대한 용액은 이하으 ltlr으로 잘 알려져 있다:

여기서, [ PT ]는 프라이머와 결합하는 표적 분자의 농도이며, T ₀ 는 최초의 표적 농동, c는 최초의 프라이머 농도 및 t는 프라이머 어닐링 시간이다.

프라이머와 결합하는 각 표적 분자가 완전한 크기의 PCR 생산물을 생산하기 위해 복제되었다고 가정하면, 한 PCR 주기의 표적 증폭 요인은

이다.

n 주기 후의 총 PCR 증폭요인은

에 의해 주어진다.

수학식 4에 따르며, 프라이머 어닐링 반응속도가 PCR의 속도 제한된 단계인 조건하에서, 증폭요인은 프라이머 농도에 강하게 의존적이다. 따라서, 개별적인 결합률 양, 프라이머 연장 단계 또는 모든 다른 요인에 의해 기인될 수 있는, 편향된 유전자 좌의 증폭은 다중 PCR에서 각 프라이머 세트를 위한 프라이머 농도를 조정함으로서 바로 잡을 수 있다. 조정된 프라이머 농도는 또한 미리-증폭된 유전자좌의 PCR분석을 위해 사용된 인베이더 검정의 편향된 수행을 바로잡는데 사용될 수 있다. 이 기본 원리를 사용하여, 본 발명은 증폭 효율과 프라이머 농도 간의 직선 관계를 설명하였고, 이 방정식은 실시예 1에서 10개의 다른 앰플리콘의 동일한 증폭의 결과로, 다른 앰플리콘의 프라이머 농도를 균형화하기 위하여 사용되었다. 이 기술은 다중 프라이머 쌍의 모든 크기 세트에 사용될 수 있다.

Ⅱ. 검출 검정(assay) 디자인

다음 부분은 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 검출 검정를 설명한다. 예를 들어, 수많은 서로 다른 검정들이 목적 핵산 서열에 대한 풋프린트를 결정하는 것에 사용될 수 있고 이후 다중(multiplex) PCR의 출력에 적용되는 검출 검정(또는 다중 PCR 반응과 동시에 작동될 수 있는 검출 검정)로서 사용될 수도 있다.

하나 또는 그 이상의 위치에 있는 목적 핵산 서열을 결정하는데 유용한 검출 기술의 광범위한 변화가 있다. 예를 들어, SNP의 존재 유무를 검출하는데 유용한 수많은 기술들이 있다. 이러한 기술들의 다수는 목적물에 하이브리드화 하기 위해 올리고뉴클레오타이드의 이용을 요구한다. 사용된 검정에 따라, 올리고뉴클레오타이드가 절단되고, 신장되고, 결합되고, 분리되고, 또는 변형되고, 이러한 검정에서 그것의 동태는 목적 핵산의 서열을 특정화하는 수단으로서 측정된다. 이러한 기술들의 상당수는 하기의 Ⅳ에서 자세히 설명된다.

본 발명은 검출 검정(detection assay)에서의 사용을 위한 올리고뉴클레오타이드의 디자인을 위한 시스템 및 수단을 제공한다. 특히, 본 발명은 검출 검정를 위한 목적하는 반응 조건(예를 들어, 온도, 완충용액 조건 등) 하에서 목적 핵산들의 적절한 리젼(예를 들어, 이차 구조를 포함하지 않는 목적 핵산 리젼)에 성공적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드들의 디자인을 위한 시스템 및 수단을 제공한다. 당해 시스템 및 수단은 또한 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 반응 조건하 에서의 검출 검정에서 모든 기능을 가지는 수많은 서로 다른 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 목적 핵산의 서로 다른 부분에 결합하거나 또는 둘 또는 그 이상의 서로 다른 목적 핵산에 결합하는 올리고뉴클레오타이드)의 디자인을 고려한다. 이러한 시스템 및 수단은 또한 실험적인 반응 조건하에서 작동하는 조절 시료들을 디자인하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 시스템 및 수단들은 어떠한 특정의 검출 검정에 한정되지 않는 반면, 다음의 명세서는 SNP를 검출하기 위해 인베이더 검정(Third Wave Technologies, Madison WI; 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,846,717, 5,985,557, 5,994,069 및 6,001,567, PCT 국제공개문헌 WO 97/27214 및 WO 98/42873 및 de Arruda et al., Expert. Rev. Mol. Diagn. 2(5), 487-496(2002), 이고 이들 모두는 당해 문헌 전체에서 참고하여 반영되었다)와 함께 사용될 때의 발명을 설명한다. 인베이더 검정은 본 발명의 시스템 및 수단과 함께 사용될 때, 검출 패널(detection panel), ASR 및 임상적 진단학에서의 사용하기에 유용한 정도의 사용상 용이성 및 민감도를 제공한다. 당해 분야의 숙련자는 여기에 예시적인 실시예의 구체적이고 일반적인 특징들이 다른 검출 검정에도 일반적으로 적용 가능한 것을 알 수 있을 것이다.

A. 인베이더 검정

인베이더 검정은 목적 핵산의 존재에 의존하고, 분명한 절단 산물을 배출하기 위한 핵산 절단 구조를 절단시키는 핵산 절단 구조를 형성하기 위한 수단을 제 공한다. 5'-뉴클레아제 활성은, 예를 들어, 목적물-의존적인 절단 구조를 절단시키는데 사용되고, 결과적인 절단 구조들은 시료의 특정 목적 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드의 두 가닥 모두 중복되는 침입성의 절단 구조를 형성하는 것 같은 목적 핵산에 결합될 때, 하기에서 설명하는 바와 같이, 침입성의 절단이 일어날 수 있다. 절단제(예를 들어, 5'-뉴클레아제) 및 상위(上位-upstream) 올리고뉴클레오타이드간의 상호작용을 통해, 절단제는 독특한 단편이 생산되는 것과 같은 방법으로 내부 위치에서 하위(下位-downstream) 올리고뉴클레오타이드를 절단하게 될 수 있다.

일부 양태에서, 인베이더 검정은 목적 핵산들이, 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 프로브들의 절단(물)과 함께하는 하이브리드화의 다수의 주기 동안 온도 주기(즉, 목적 핵산 가닥들의 주기적인 변성을 위해) 또는 핵산 합성(즉, 목적 또는 프로브 핵산 가닥들의 폴리머라이제이션-기초의 치환을 위한)을 사용할 필요 없이, 재사용되거나 재순환되는 검출 검정들을 제공한다. 절단 반응이, 프로브가 계속적으로 목적 가닥 상에서 대체되는 조건 하에서 일어날 때(예를 들어, 프로브-프로브 대체를 통해, 프로브/목적물 결합 유무 사이의 균형을 통해, 또는 이들 메카니즘을 포함하는 조합을 통해(Reynaldo, et al., J. Mol. Biol. 97:511-520[2000]), 다양한 프로브들이 다양한 절단 및 다양한 절단 산물의 생성이 이루어지게 하면서 동일한 목적물에 하이브리드 될 수 있다.

B. 인베이더 검정을 위한 올리고뉴클레오타이드의 디자인

올리고뉴클레오타이드가 SNP를 검출하기 위한 인베이더 검정에 사용되기 위해 고안된 일부 양태로, 관련 서열은 인베이더 크리에이터(INVADERCREATOR) 프로그램(Third Wave Technologies, Madison, WI)에 입력된다. 상기에서 설명한 바와 같이, 서열들은 어떤 수의 유래로부터의 분석을 위해, 직접적으로 인메이더크리에이터인베이더 검정 결합된 표적에 이미 결합된 형광표지그룹으로부터 발광된 빛으로 하이브리다이제이션 데이타를 수집하였다. 표적과 완벽하게 어울리는 프로브는 잘결합되지 않는 것에 비교하여 일반적으로 더 강력한 시그널을 나타낸다. 어레이 상에서 각각의 프로브의 서열와 위치는 알려져 있기 때문에 상호보완적으로 프로브 어레이에 도포된 표적 핵산의 동일성이 결정될 수 있다.

일부 양태에서는, 인베이더 검정은 BLAST(National Institute of Health website에서 이용가능한)에의 연결을 포함하고, mfold(Zucker, Science, 244:48[1989])를 포함하는 소프트웨어 프로그램인 RNAstructure(Mathews et al., RNA 5:1458[1999])에 연결될 수 있는, 시큐어 사이트 억세스(sequre site acess)를허용하는 웹 기반의 프로그램이다. RNAstructure는 가능성이 있는 단일 및 2분자 복합체 형성을 위해 INVADERCREATOR에 의해 생성된 제안된 올리고뉴클레오타이드 디자인들을 시험한다. 인베이더크리에이터는 개방된 데이터베이스 접속성(open database connectivity - ODBC)에 순응하고 export/integration을 위한 오라클 데이터베이스를 사용한다. 인베이더크리에이터 시스템은 대부분의 게놈 센터들이 UNIX-기반이기 때문에 UNIX 시스템과 함께 잘 작동되기 위해 오라클을 가지고 구성 되었다.

일부 양태에서, 인베이더크리에이터 분석은 대규모 일괄작업(batch job)의 분석을 다룰 수 있기 위해 분리된 서버(예를 들어 SUN 서버) 상에서 제공된다. 예를 들어 고객은 하나의 이메일에 2000 SNP 서열까지 제출할 수 있다. 상기 서버는 인베이더크리에이터 소프트 웨어의 서열 묶음을 통과시키고, 개시될 때 상기 프로그램은 검출 어세이 올리고뉴클레오타이드 셋을 디자인한다. 일부 양태에서, 프로브 셋 디자인은 서열 수령 24시간 내에 사용자에게로 되돌려진다.

각각의 인베이더 검정은 일차 반응을 위한 최소한 두 목적 서열-특유의, 레이블 되어있지 않은 올리고뉴클레오타이드를 포함한다 : 상위 인베이더 올리고뉴클레오타이드 및 하위 프로브 올리고뉴클레오타이드. 프로브는 자유롭게 목적 가닥과 붙거나 떨어지며, 단지 잘려지지 않은 프로브가 중첩된 인베이더 올리고뉴클레오타이드 옆에 하이브리드될 때만 절단이 일어나도록 디자인 되는 반면, 인베이더 뉴클레오타이드는 일반적으로 반응 온도에서 안정하게 결합되도록 디자인된다. 일부 양태에서, 프로브는 목적물에 상보적이지 않은 5' 플랩 또는 "팔"을 포함하고, 이러한 플랩은 절단이 일어날때 프로브에서부터 방출된다. 일부 양태에서, 방출된 플랩은 2차 반응에서 인베이더 올리고뉴클레오타이드로서 관여한다.

다음의 논의는 어떻게 인베이더크리에이터 프로그램을 위한 유저 인터페이스가 구성될 수도 있는지에 대한 하나의 예를 제공한다.

사용자가 예를 들어, 컴퓨터의 테스크탑 디스플레이(예를 들어, 윈도우즈 데스크탑)상의 아이콘을 클릭하는 것에 의해 작업 스크린을 연다. 사용자는 어세이가 디자인되기 위한 목적 서열과 관련된 정보를 입력한다. 일부 양태에서, 사용자는 목적 서열을 입력한다. 또 다른 양태에서, 사용자는 데이터베이스로부터 서열의 검색을 일으키는 암호(code) 또는 숫자를 입력한다. 또 다른 양태에서, 사용자의 이름, 목적 서열과 관련된 식별 번호 및/또는 주문 번호와 같은 부가적인 정보가 제공될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 사용자는 목적 핵산이 DNA 또는 RNA임을 표시한다(예를 들어 체크 박스 또는 드롭 다운 메뉴를 통해). 다른 바람직한 양태에서, 사용자는 디자인이 모노플렉스(즉, 반응마다 하나의 목적 서열 또는 대립 유전자) 인지, 멀티플렉스(즉, 반응마다 다수의 목적 서열들 또는 대립 유전자들) 검출에 대한 것인지를 표시한다. 필수적인 선택과 기재를 완료할 때 사용자는 분석 프로세스를 시작한다. 하나의 양태에서, 사용자는 계속하기 위해 "디자인하기" 단추를 클릭한다.

일부 양태에서, 상기 소프트웨어는 진행 전에 분야 기재를 확인한다. 일부 양태에서, 상기 소프트웨어는 어떠한 분야들이 정보의 적절한 형태의 정보를 기재함으로써 완성되는 것을 검증한다. 다른 양태에서, 상기 소프트웨어는 입력 서열이 선택된 요구사항(예를 들어 최소 또는 최대 길이, DNA 또는 RNA 크기)들을 충족하는 것을 검증한다. 만약 어떤 분야에서 기재사항이 타당하다고 판단되지 않으면, 에러 메시지 또는 대화창이 나타날 수도 있다. 바람직한 양태에서, 에러 메시지는 어떤 분야가 불완전하고/거나 부정확하다는 것을 나타낸다. 일단 서열 기재가 확인되면, 상기 소프트 웨어는 어세이 디자인과 함께 진행된다.

일부 양태에서, 상기 정보는 기재사항 필드가 디자인의 어떤 유형이 창조될 것인지 특정하기 위해 제공된다. 바람직한 양태에서, 목적 서열 및 멀티플렉스 체크 박스는 창조할 디자인의 유형을 특정한다. 디자인 선택 사양은 SNP 어세이, 멀리플렉스된 SNP 어세이(예를 들어, 서로 다른 대립 유전자들에 대한 프로브 셋이 단일 반응에서 결합되도록 하는), 다중 SNP 검정(예를 들어 입력 서열이, 어떤 프로브 셋이 디자인될 다수 위치의 변형 가능한), 및 다중 프로브 암 검정(multiple probe arm assay)를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

일부 양태에서, 인베이더크리에이터 소프트웨어는 웹 주문 입력(Web Order Entry(WebOE)) 프로세스(즉, 인트라/인터넷 브라우저 인터페이스를 통한)에 의하여 시작되고, 이러한 파라미터들은 메뉴 또는 체크 박스를 통해 입력하는 것보다, <param> 태그 애플릿을 통해 WebOE 로부터 이동된다.

멀티플 SNP 디자인의 경우, 사용자는 함께 실행하는 둘 또는 그 이상의 디자인을 선택한다. 일부 양태에서, 이러한 선택은 새로운 스크린 뷰(예를 들어, 멀티플 SNP 디자인 선택 뷰(view))를 연다. 일부 양태에서, 상기 소프트웨어는 목적 서열에서의 각각의 유전자 자리(locus)에 대한 디자인을 창조하고, 각각을 채점(기록?)하고, 이러한 스크린 뷰에서 사용자에게 그들을 나타낸다. 사용자는 이후에 같이 실행할 어떠한 두 디자인들을 선택할 수 있다. 일부 양태에서, 사용자는 첫번째 및 두번째 디자인(예를 들어 메뉴 또는 단추를 통해)을 선택할 수 있고 계속하기 위해 "디자인하기" 단추를 클릭한다.

미리-선택된 반응온도에서 최적으로 실행될 프로브 서열을 선택하기 위해, 검출된 SNP의 융점(Tm)이 최근접-이웃 모델 및 DNA 듀플렉스 형성(DNA duplex formation - Allawi and Santalucia, Biochemistry, 36:10581[1997])에 대한 공개된 파라미터를 사용하여 계산한다. 목적 가닥이 RNA인 양태에서, RNA/DNA 헤테로듀플렉스 형성(RNA/DNA heteroduplex formation)에 적절한 파라미터들이 사용될 수도 있다. 어세이의 염 농도가 종종 최근접-이웃 파라미터가 얻어진(1M NaCl 및 이가(二價) 금속이 없는) 용액 조건과 다르고, 효소의 존재 및 농도가 최적 반응 온도에 영향을 미치기 때문에, 조정은, 반응을 실행하기 위한 최적 온도를 결정하기 위한 계산된 Tm에 맞추어 만들어진다. 이러한 요소를 보충하는 한 방법은 융점 계산 내에서 염 농도를 제공하는 수치(value)를 다양화하는 것이다. 이러한 조정은 '염 보정'이라 부른다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "염 보정"은 상기 듀플렉스(duplex)에 영향을 미치는 비(非)-염 파라미터 또는 조건의 핵산 듀플렉스를 위한 Tm 계산에 미치는 영향을 반영하는 목적으로 염 농도를 제공하는 수치에서 만들어지는 변화를 말한다. 가닥 농도를 제공하는 수치들의 변화는 또한 이러한 계산의 결과에 영향을 미칠 것이다. 0.5M NaCl 수치(SantaLucia, Proc Natl Acad Sci U S A, 95:1460[1998]) 및 프로브 약 1mM 및 목적물 1fM의 가닥 농도를 사용하여, 계산한 프로브-목적물의 융점에 사용되기 위한 알고리즘이 최적의 인베이더 어세이 반응 온도를 예측하는 것에의 사용에 적용된다. 30 프로브들의 셋을 위해, 이러한 수단에 의해 계산된 최적 어세이 온도 및 실험적으로 결정된 온도의 평균 편차는 약 1.5℃이다.

주어진 SNP에의 하위 프로브의 길이는 반응을 수행하기 위해 선택된 온도에 의해 정의된다(예를 들어 63℃). 목적 DNA 상의 다양한 위치(의도된 절단 자리의 프로브 뉴클레오타이드 5'와 짝을 이루는 목적 염기)에서부터 시작하고, 3' 말단 상에서 부가되는 반복 공정은, 프로브의 목적물-결합 부위의 길이가 원하는 반응 온도에 어울리는 계산된 최적 반응 온도(효소 효과를 보상한 염 보정을 더한 Tm)가 도달될 때까지 매번 하나의 염기쌍만큼 증가 되는 것에 의해 사용된다. 프로브의 비-상보적인 팔(arm)은 바람직하게는 이차 반응이 동일한 온도에서 순환하는 것을 허용하도록 선택된다. 전체 프로브 올리고뉴클레오타이드는 반응에 방해가 될 수 있는 이량체 복합체들 또는 이차 구조들의 가능한 형성을 위해 mfold(Zucker, Science, 244:48[1989]) 또는 Oligo 5.0(Rychlik and Rhoads, Nucleic Acids Res, 17:8543[1989])와 같은 프로그램들을 사용하여 스크린된다. 동일한 원리들이 또한 인베이터 올리고뉴클레오타이드 디자인을 위해 따라오게 된다. 간단히, 목적 DNA상의 N위치로부터 시작되는 인베이더 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단은 실험하고자 하는 샘플에 포함되어 있다고 생각되는(의심되는?) 어느 대립 유전자와도 상보적이 아닌 뉴클레오타이드를 가지도록 디자인되었다. 상기 미스매치(mismatch)는 절단에 부정적인 영향을 미치지 않고, 그것은 아마도 두 프로브들 사이의 동축 안정화 효과(coaxial stabilization effect)를 최소화하는 것에 의해 프로브 순환을 향상할 수 있다. 잔기 N-1에서부터 시작하는 목적 DNA에 상보적인 추가적인 잔기들은 이후, 인베이터 올리고뉴클레오타이드-목적물 하이브리드의 안정성이 프로브의 그것을 초과할 때 -일반적으로 15 내지 20℃- 까지 5' 방향으로 부가된다. 어세이 디자인의 한 양태는 모든 프로브 서열이 동일한 최적 온도에서 일어나는 일차 및 이차 반응이 이루어지기 위해 선택될 수도 있는 것이고, 당해 반응 단계는 동시에 일어 날 수 있다. 다른 양태에서, 프로브는 서로 다른 온도에서 작동하기 위해 디자인될 수도 있으며, 이러한 반응 단계는 그들의 온도 최적조건에서 동시에 일어나지 않는다.

일부 양태에서, 상기 소프트웨어는 사용자에게 다음을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 양상의 변화시킬 기회를 제공한다. : 프로브, 목적물 및 인베이터 올리고뉴클레오타이드 온도 최적조건 및 농도; 차단 그룹(기?); 프로브 팔(arm); 염색제, 캡핑 그룹 및 다른 부가물; 프로브 및 목적물들의 각각의 염기들(예를 들어, 목적물 및/또는 프로브들의 말단으로부터 염기를 부가하거나 삭제하거나, 또는 인베이더 및/또는 프로브 및/또는 목적 뉴클레오타이드에서 내부 염기들을 변화시키는 것). 일부 양태에서, 변화는 메뉴로부터 선택하는 것으로 만들어진다. 또 다른 양태에서, 변화는 텍스트 또는 박스들로부터 시작된다. 바람직한 양태에서, 이러한 선택사항은 새로운 스크린을 연다(예를 들어, 디자이너 워크시트 뷰).

일부 양태에서, 상기 소프트웨어는 어세이 디자인들의 질(예를 들어 실행 가능성)을 나타내기 위한 채점 시스템을 제공한다. 하나의 양태에서, 채점 시스템은 점수의 시작 득점(예를 들어 100점)을 포함하며, 상기 시작 득점은 이론상의 디자인을 나타내고, 어세이 실행에 부정적인 영향을 가진다고 알려져 있거나 의심되는 디자인 특징들은 벌점을 받는다. 벌점은 서열들보다 어세이 파라미터들에 따라 달라지며, 이러한 것에는 디자인이 의도한 어세이의 유형(예를 들어, 모노플렉스, 멀티플렉스) 및 어세이 반응이 실행될 온도 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 다음의 예는 실험에 의해 정의되는 정보에 기초한 인베이더 어세이의 일부 양태들 과 함께, 사용을 위한 실례가 되는 채점 기준을 제공한다. 벌점을 초래할 수도 있는 디자인 특징들의 예는 다음의 [괄호 안에 표시되는 벌점, 첫번째 숫자가 더 낮은 온도 어세이(예를 들어, 62 내지 64℃), 두번째 숫자는 더 높은 온도 어세이(예를 들어, 65 내지 66℃)]가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:

1. [100:100] 인베이터 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단이 프로브 팔을 닮았다:

ARM 서열: 만약 인베이더가 다음으로 끝나면 받는 벌점:

Arm 1: CGCGCCGAGG (SEQ ID NO: 11) 5'...GAGGX 또는 5'...GAGGXX

Arm 2: ATGACGTGGCAGAC (SEQ ID NO: 12) 5'...CAGACX 또는 5'...CAGACXX

Arm 3: ACGGACGCGGAG (SEQ ID NO: 13) 5'...GGAGX 또는 5'...GGAGXX

Arm 4: TCCGCGCGTCC (SEQ ID NO: 14) 5'...GTCCX 또는 5'...GTCCXX

2. [70:70] 프로브가 다형성(polymorphism)을 포함하는 5-염기 스트레치(즉, 한줄에 같은 염기가 5개)를 가진다;

3. [60:60] 프로브가 다형성에 인접하는 5-염기 스트레치를 가진다;

4. [50:50] 프로브가 다형성으로부터 한 염기 떨어져 있는 5-염기 스트레치를 가진다;

5. [40:40] 프로브가 다형성으로부터 두 염기 떨어져 있는 5-염기 스트레치를 가진다;

6. [50:50] 프로브의 5-염기 스트레치가 G들이다 - 추가 벌점;

7. [100:100] 프로브가 어디에든 6-염기 스트레치를 가진다;

8. [90:90] 둘 또는 세 염기 서열이 최소한 네 번 반복된다;

9. [100:100] 프로브에서 변성 염기가 나타난다;

10. [60:90] 프로브 하이브리드 영역이 짧다(65 내지 67℃ 디자인에 대해 13 염기 또는 그 이하; 62 내지 64℃ 디자인에 대해 12 염기 또는 그 이하);

11. [40:90] 프로브 하이브리드 영역이 길다(65 내지 67℃ 디자인에 대해 29 염기 또는 그 이하; 62 내지 64℃ 디자인에 대해 28 염기 또는 그 이하);

12. [5:5] 프로브 하이브리드 영역 길이-염기마다 추가 벌점;

13. [80:80] 프로브 암 뒤에 첫번째 3 염기에서 불충분한 식별력을 가진 Ins/Del 디자인;

14. [100:100] 프로브 목적 Tm인 7.5℃ 내에 존재하는 계산된 인베이더 올리고뉴클레오타이드 Tm(70.5℃ 이하의 인베이더 올리고뉴클레오타이드를 가진 65 내지 67℃ 디자인, 69.5℃ 이하의 인베이더 올리고뉴클레오타이드를 가진 62 내지 64℃ 디자인);

15. [20:20] 2.0℃ 이상 까지 다른 계산된 프로브들의 Tm들;

16. [100:100] 프로브가 그의 목적물 Tm보다 2℃ 더 낮은 계산된 Tm을 가진다;

17. [10:10] 다른 가닥들의 그것보다 8 염기가 긴 가닥의 목적물;

18. [30:30] 인베이더 올리고뉴클레오타이드가 어디든 6-염기 스트레치를 가진다 - 최초 벌점;

19. [70:70] 인베이더 올리고뉴클레오타이드의 6-염기 스트레치가 G들이다 - 추가 벌점;

20. [15:15] 프로브 하이브리드 영역이 14, 15 또는 24 내지 28 염기 길이(65 내지 67℃) 또는 13, 14 또는 26, 27 베이스 길이(62 내지 64℃)이다;

21. [15:15] 프로브가 다형성을 포함하는, G들의 4-염기 스트레치를 가진다;

특히 바람직한 양태에서, 디자인들에서의 올리고뉴클레오타이드 각각에 대한 온도들은 변화가 생기는 경우 재계산되고 점수도 재계산된다. 일부 양태에서는 점수 설명들이 "설명" 단추를 클릭함으로써 보여질 수 있다. 일부 양태에서는, BLAST 검색 선택사양이 제공된다. 바람직한 양태에서는 BLAST 검색은 "BLAST 디자인" 버튼을 클릭함으로써 완료된다. 일부 양태에서는, 이러한 행동은 BLAST 프로세스를 설명하는 대화 박스를 나오게 할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 BLAST 검색 결과들은 디자이너 워크시트 상에서 두드러진 디자인으로서 표시된다.

일부 양태에서, 사용자는 "수락함" 버튼을 클릭함으로써 디자인을 수락할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 프로그램은 사용재의 개입 없이 디자인을 승인할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 프로그램은 다음 프로세스 단계로 승인된 디자인을 보낸다(예를 들어, 제조로; 파일 또는 데이터베이스로). 일부 양태에서, 상기 프로그램은 최종 디자인의 재검토를 허용하고 디자인에 부착될 수 있는 노트들을 허용하는 스크린 뷰를 제공한다. 바람직한 양태에서, 사용자는 디자이너 워크시트로 돌아갈 수 있거나(예를 들어, "돌아감" 버튼을 클릭함으로써), 디자인을 저장할 수 있다(예를 들어, "저장" 버튼을 클릭함으로써).

일부 양태에서, 상기 프로그램은 인쇄(예를 들어, 문서 전용 뷰) 또는 다른 보내기(? 예를 들어, 출력 뷰)를 위해 최적화된 디자인의 스크린 뷰를 만들어낼 수 있는 선택사양을 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 출력 뷰는 특히 인쇄를 위해, 또는 다른 장치로 보내는 것(예를 들어, 복사 또는 다른 또 다른 장치에 보냄으로써)이 적당하다. 특히 바람직한 양태에서, 상기 출력 뷰는 별개의 창에서 열린다.

본 발명은 인베이더크리에이터 소프트웨어의 사용에 한정되지 않는다. 결국, 다양한 소프트웨어가 기대되고, 상업적으로 이용가능하며, 이러한 프로그램으로 GCG Wisconsin Package(Genetics computer Group, Madison, WI) 및 Vector NTI(Infomax, Rockville, Maryland)가 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 검출 어세이들이 본 발명에서 사용될 수도 있다.

1. 직접적 시퀀싱 어세이(direct sequencing assays)

본 발명의 일부 양태에서, 다양한 서열들이 직접적 시퀀싱 어세이를 사용하여 검출된다. 이러한 어세이들에서, DNA 샘플들은 첫번째로 어떤(임의의?) 적당한 수단을 사용하여 기질로부터 분리된다. 일부 양태에서, 관심이 있는 영역은 적당한 벡터안으로 클론되고, 숙주 세포(예를 들어, 박테리아)에서의 배양으로 증폭된다. 다른 양태에서, 관심이 있는 영역에서의 DNA(관심이 있는 SNP 또는 변이를 포함하는 영역)는 어떤 적당한 수단을 사용하여 시퀀싱되고, 이러한 수단에는 방사선 마커 뉴클레오타이드를 사용하는 수작업의 시퀀싱 또는 자동화된 시퀀싱 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 시퀀싱의 결과들은 어떤 적당한 수단을 사용하여 표시된다. 서열은 검사되고 주어진 SNP 또는 변이의 존재 유무가 결정된다.

2. PCR 어세이

본 발명의 일부 양태에서, 다양한 서열들은 PCR-기초의 어세이를 사용하여 검출된다. 일부 양태에서, 상기 PCR 어세이는 단지 변이체 또는 야생형 대립 유전자(예를 들어, 다형성 또는 변이의 영역)에만 하이브리드하는 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함한다. 프라이머들의 셋(set) 양쪽 모두가 DNA 샘플을 증폭하기 위해 사용된다. 만약 단지 변이 프라이머만이 PCR 생산물로 귀착되면, 그 때 환자는 변이 대립 유전자를 가진다. 만약 단지 야생형 프라이머만이 PCR 생산물로 귀착되면, 그때 환자는 야생형 대립 유전자를 가진다.

3. 단편 길이 다형성 어세이(Fragment length polymorphism assays)

본 발명의 일부 양태에서, 다양한 서열들은 단편 길이 다형성 어세이를 사용하여 검출된다. 단편 길이 다형성 어세이에서, 일련의 위치에서의 DNA를 절단함에 기초하는 특유한 DNA 밴딩(banding) 양식이 효소를 사용하여(예를 들어, 제한 효소 또는 CLEAVASEⅠ[Third Wave Technologies, Madison, WI] 효소) 생산된다. SNP 또는 변이를 포함하는 샘플에서부터 나온 DNA 절편들은 야생형에 비해 다른 밴딩 유형을 가질 것이다.

a. RFLP 어세이

본 발명의 일부 양태에서, 다양한 서열들이 제한 절편 길이 다형성 어세이(RFLP)를사용하여 검출된다. 관심이 있는 영역은 첫번째로 PCR을 사용하여 분리된다. 상기 PCR 생산물들은 이후 주어진 다형성에 대한 특유한 길이 절편을 얻는다고 알려진 제한 효소를 사용하여 절단된다. 제한-효소 처리된(digested) PCR 생산물들은 일반적으로 겔 전기영동을 사용하여 분리되고, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색에 의해 나타내질 수 있다. 절편들의 길이는 분자량 마커와 야생형 및 변이 대조군들로부터 생산된 절편들과 비교된다.

b. CFLP 어세이

다른 양태에서, 다양한 서열들은 CLEAVASE 절편 길이 다형성 어세이(CFLP; Third Wave Technologies, Madison, WI; 예를 들어, US Patent Nos. 5,843,654; 5,843,669; 5,719,208; 및 5,888,780 참조; 이들 각각은 참고 문헌에 포함된다)를 사용하여 검출된다. 이 어세이는, DNA 단일 가닥들이 그들 자체로 폴딩될 때, DNA 분자의 정확한 서열에 대해 매우 독특한(individual) 더욱 정돈된(order) 구조를 취한다는 관찰에 기초한다. 이러한 이차 구조들은, 단일 가닥으로 된 영역들이 이중 가닥으로 된 DNA 헤어핀들과 함께 병렬되는 것과 같은 부분적으로 중복된 DNA 영역을 포함한다. CLEAVASE Ⅰ 효소는, 이러한 단일 가닥으로 되거나 이중 가닥으로 된 영역들 사이의 교차점들을 인식하고 절단하는, 구조-특이적이고 열에 안정한 뉴클레아제이다.

관심이 있는 영역이 우선 예를 들어 PCR을 사용하여 분리된다. 바람직한 양태에서, 하나 또는 양쪽 가닥 모두가 레이블된다. 그후, DNA 가닥들이 가열함으로 써 분리된다. 다음으로, 반응물들은 내부 가닥 구조를 형성하는 것을 가능케 하기 위해 냉각된다. 상기 PCR 생산물들은 이후 주어진 SNP 또는 변이에 대하여 특유한 일련의 절편들을 생산하기 위해 CLEAVASE Ⅰ 효소를 사용하여 처리된다. 상기 CLEAVASE 효소 처리된 PCR 생산물들은 분리되고 검출되며(예를 들어, 변성 겔 전기영동에 의한) 가시(可視)화된다(예를 들어, 오토라디오그래피, 형광 영상 또는 염색에 의한). 절편들의 길이는 분자량 마커와 야생형 및 변이 대조군들로부터 생산된 절편들과 비교된다.

4. 하이브리드화 어세이(Hybridization assays)

본 발명의 바람직한 양태에서, 다양한 서열들이 하이브리드화 어세이에 의해 검출된다. 하이브리드화 어세이에서, 주어진 SNP 또는 변이의 존재 유무는 상보적인 DNA 분자들(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프로브)에 하이브리드 하는 샘플로부터 나온 DNA의 능력에 기초하여 결정된다. 하이브리드화 및 검출을 위한 다양한 기술을 사용하는 다양한 하이브리드화 어세이가 가능하다. 어세이들의 선택에 대한 설명은 하기에서 제공된다.

a. 하이브리드화의 직접적인 검출

일부 양태에서, 관심이 있는 서열(예를 들어, SNP 또는 변이)에 대한 프로브의 하이브리드화는 결합된 프로브를 보이게함으로써 직접적으로 검출된다(예를 들어, 노던 또는 서던 어세이; Ausabel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY[1991]). 이러한 어세이들에서, 게놈 DNA(서던) 또는 RNA(노던)이 기질로부터 분리된다. 상기 DNA 또는 RNA는 이후 분리되고(예를 들어 아가로즈 젤 상에서) 멤브레인으로 이동된다. 레이블된(예를 들어 라디오뉴클레오타이드와 병합하는 것에 의해) 프로브 또는 검출된 SNP 또는 변이를 위한 특정한 프로브들이 어떤 조건 또는 낮은, 중간의, 높은 엄격한 조건 하에서 멤브레인과 접촉하는 것을 허용한다. 결합되지 않은 프로브는 제거되고, 결합의 존재는 레이블된 프로브를 보여주는 것에 의하여 검출된다.

b. "DNA 칩" 어세이를 이용한 하이브리드화의 검출

본 발명의 일부 양태에서, 다양한 서열들이 DNA 칩 하이브리드화 어세이를 사용하여 검출된다. 이 어세이에서, 일련의 올리고뉴클레오타이드 프로브들은 고체 지지체에 부착된다. 올리고뉴클레오타이드 프로브들은 주어진 SNP 또는 변이에 특유하도록 디자인된다. 관심 있는 DNA 샘플은 DNA 칩에 접촉되고, 하이브리드화가 검출된다.

일부 양태에서, 상기 DNA 칩 어세이는 GeneChip 어세이이다(Affymetrix, Santa Clara, CA; 예를 들어, US Patent Nos. 6,045,996; 5,925,525; 및 5,858,659 참조; 이들 각각은 참고 문헌에 포함된다). 상기 GeneChip 기술은 "칩"에 부착되는 올리고뉴클레오타이드 프로브들의 소형화되고, 고농도인 어레이(정렬? array)들을 사용한다. 프로브 어레이들은 Affymetrix의 광-유도된 화학적 합성 프로세스에 의해 제조되고, 이들은 반도체 산업에서 적용되는 포토리토그래픽(photolithographic) 제작 기술을 가지고 고체상 화학적 합성에 결합한 것이다. 특정 화학적 합성 단계들에 이어, 칩 노출 위치를 정하기 위한 일련의 포토리토그 래픽 마스크들을 사용하여, 상기 프로세스는 어레이에서 미리 결정된 위치에의 각각으 프로브와 함께 올리고뉴클레오타이드들의 고농도 어레이를 구축한다. 다양한 프로브 어레이들은 큰 유리 웨이퍼 상에서 동시에 합성된다. 상기 웨이퍼들은 이후 주사위 모양으로 절단되고, 각각의 프로브 어레이들은 사출-성형된 플라스틱 카트리지들에서 봉입(packaged)되고, 이러한 플라스틱 카트리지들은 환경으로부터 프로브 어레이들을 보호하고 하이브리드화를 위한 챔버 역할을 한다.

분석할 핵산을 단리하고 PCR로 증폭하여 형광표지그룹으로 표지화하였다. 그런 다음, 표지된 DNA를 유체학적 스테이션을 이용하는 어레이와 함께 항온처리하였다. 상기 어레이를 스캐너에 삽입하고 하이브리다이제이션 패턴을 측정하였다.프로브 어레이에 결합된 타겟에 이미 결합된 형광표지그룹으로부터 발광된 빛으로 하이브리다이제이션 데이타를 수집하였다. 타겟과 완벽하게 어울리는 프로브는 잘결합되지 않는 것에 비교하여 일반적으로 더 강력한 시그널을 나타낸다. 어레이 상에서 각각의 프로브의 시퀀스와 위치는 알려져 있기 때문에 상호보완적으로 프로브 어레이에 도포된 타겟 핵산의 동일성이 결정될 수 있다.

다른 양태에서는 전기적으로 포획된 프로브를 포함하는 DNA 마이크로칩(Nanogen, 미국 캘리포니아 샌디에고)이 이용되었다(미국 특허 제6,017,696호; 제6,068,818호; 및 제6,051,380호). 마이크로일렉트로닉스(microelectronics)를 이용하여 Nanogen 기술은 그의 반도체 마이크로 칩 상에 설계된 시험 리젼에 대해 그리고 이것으로부터 하전된 분자가 활발하게 움직이고 집중되게 할 수 있다. 주어진 SNP 또는 돌연변이에 대해 독특한 DNA 포획 프로브는 마이크로칩 상에 특이 리젼에 전기적으로 위치하거나 또는 "어드레스(address)"된다. DNA는 강한 음전하를 가지기 때문에 양전하 영역에 전기적으로 이동할 수 있다.

먼저, 마이크로칩 상의 시험 리젼 또는 시험 리젼의 한 줄은 양전하로 전기적으로 활성화된다. 다음으로 DNA 프로브를 함유하는 용액이 마이크로칩 상에 주입된다. 음전하를 띠는 프로브는 신속하게 양전하를 띠는 리젼로 이동하여, 여기에서 이들이 집중하여 마이크로칩 상의 리젼에서 화학적으로 결합된다. 그런 다음, 이 마이크로칩을 세척하고 상이한 DNA 프로브의 다른 용액을 특이적으로 결합된 DNA 프로브 어레이가 완결될 때까지 추가한다.

시험 샘플(예를 들면, 목적하는 PCR 증폭된 유전자)에서 DNA 포획 프로브 중 상보성 DNA와 하이브리드화되는 것을 측정하는 방법으로 표적 DNA 분자의 존재에 대해 시험 샘플을 분석한다. 전하는 마이크로칩 상의 1 이상의 시험 리젼에 표적 분자를 이동시키고 모으는데 이용된다. 각각의 시험 리젼에 샘플 DNA의 전기적 집중은 상보적 포획 프로브와 샘플 DNA의 신속한 하이브리드화를 촉진한다(하이브리다이제이션은 수 분내에 일어날 수 있다). 결합되지 않았거나 비특이적으로 결합된 DNA를 각 리젼에서 제거하기 위해 이 리젼의 양극성 또는 전하를 음성으로 전환하여 결합되지 않았거나 비특이적으로 결합된 DNA가 포획 프로브에서 떨어져 용액으로 되돌아 오게 한다. 레이저에 기초한 형광 스캐너가 결합을 검출하는데 사용된다.

또 다른 양태에서, 표면 장력의 차이에 의해 플랫 표면(칩) 상에서의 유동액의 응집에 기초한 어레이 기술(ProtoGene, Palo Alto, CA)이 이용된다(예를 들면, 미국 특허 제6,001,311호, 제5,985,551호 및 제5,474,796호 참조). Protogene의 기술은 화학적 코팅에 의해 부과되어 있는 표면 장력의 차이에 의해 유동액이 플랫 표면에서 분리될 수 있다는 사실에 기초한다. 일단 이렇게 분리되면, 올리고뉴클리오타이드 프로브는 시약의 잉크젯 프린팅에 의해 칩 상에서 직접 합성된다. 표면 장력으로 규정되는 반응 리젼를 가지는 어레이는 4개의 DNA 표준 염기 각각에 대해 하나씩인 한 세트의 4개 압전 노즐 하에서 X/Y 번역 단계에서 장치된다. 번역 단계는 어레이의 각 줄에 따라 이동하며 적절한 시약이 각각의 반응 리젼에 전달된다. 예를 들면, A 아미다이트(amidite)는 아미다이트 A가 합성 단계 등에서 결합되어질 리젼에만 전달된다. 일반적인 시약과 세정제는 전체 표면을 담가서 전달한 다음 스피닝하여 제거한다.

SNP에 특이적인 DNA 프로브 또는 목적하는 돌연변이를 Protogene의 기술을 이용하여 칩에 첨부한다. 이 칩을 목적하는 PCR로 증폭된 유전자와 접촉시킨다. 하이브리드화를 실시한 후, 결합되지 않은 DNA를 제거하고 하이브리드화는 적당한 방법(예를 들면, 결합된 형광 그룹의 형광 탈소광(de-quenching))을 이용하여 검출한다.

또 다른 양태에 있어서는 다형성(polymorphism)의 검출을 위해 "비드 어레이(bead array)"를 사용한다 (Illumine, San Diego, CA; PCT 공개 제WO 99/67641호 및 제WO 00/39587호). 일루미나(Illumina)는 광섬유 다발과 어레이에 자기 집합하는 비드를 결합하는 비드 어레이(BEAD ARRAY) 기술을 이용한다. 각각의 광섬유 다발은 다발의 직경에 따라 수천 내지 수백만 개의 개개의 섬유를 포함한다. 비드는 주어진 SNP 또는 돌연변이의 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드로 코팅된다. 비드의 배치들을 합하여 어레이에 특이적인 풀을 만든다. 이 에세이를 수행하기 위하여 비드 어레이(BEAD ARRAY)를 준비된 주요 시료(DNA 등)와 접촉시킨다. 적당한 방법으로 하이브리드화를 확인하였다.

c. 하이브리드화의 효소적 검출방법

본 발명의 양태에 있어서, 특이 구조의 효소 분해방법으로 하이브리다이제이션을 검출하였다(INVADER 에세이, Third Wave Technologies; 미국 특허 제 5,846,717호, 제6,090,543호, 제6,001,567호, 제5,985,557호 및 제5,994,069호). INVADER 에세이는 중복되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리다이제이션에 의해 생성된 복합체를 분해하는 구조 특이적 효소에 의해 특이적인 DNA와 RNA 서열를 검출한다. 상승된 온도와 프로브들 중 하나의 과량으로 인해 다수의 프로브는 온도 순환 없이 존재하는 각각의 표적서열로 분해될 수 있다. 이렇게 분해된 프로브들은 2차 표지된 프로브의 분해를 유발한다. 2차 프로브 올리고뉴클레오티드는 제2 염료 또는 다른 소광 잔기에 의해 소광되는 형광 염료로 5'-말단이 표지화될 수 있다. 분해되는 동안, 탈소광된 염료로 표지된 생성물은 표준 형광 플레이트 리더 또는 반응과정 동안 형광 데이터를 수집하도록 구성된 장치(즉, "real-time" 형광 검출기, ABI 7700 서열 검출 시스템(Sequence Detection System), Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 검출될 수 있다.

인베이더 검증은 증폭되지 않은 게놈 DNA에서 특이적인 돌연변이와 SNP를 검출한다. 게놈 DNA에서 SNP를 검출하는데 사용되는 검증법의 양태에 있어서, 2개의 올리고뉴클레오티드(SNP/돌연변이 또는 야생형 서열에 대해 특이적인 1차 프로브, 및 인베이더 올리고뉴클레오티드)는 게놈 DNA에 직렬로 혼성결합하여 오버래핑 구조를 형성한다. 구조 특이적 뉴클레아제 효소는 이 오버래핑 구조를 인식하여 1차 프로브를 분해한다. 2차 반응에서, 분해된 1차 프로브는 형광물질로 표지된 2차 프로브와 결합하여 효소에 의해 분해되는 다른 중복된 구조를 생성한다. 1차 및 2차 반응은 동일한 용기에서 동시에 진행할 수 있다. 상기한 바와 같이, 2차 프로브의 분해는 형광물질 검출기를 이용하여 검출된다. 시험 시료의 신호는 종래의 양성 및 음성 대조군과 비교된다.

다른 양태에 있어서, 결합된 프로브의 하이브리드화 TaqMan 검증(PE Biosystems, Foster City, CA; 미국 특허 제5,962,233호 및 제5,538,848호 참조)를 이용하여 검출된다. 이 검증은 PCR 반응 중에 실시된다. TaqMan 검증은 AMPLITAQ DNA 폴리머라제 등과 같은 DNA 폴리머라제의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. 주어진 대립형질(allele) 또는 돌연변이에 특이적인 프로브는 PCR 반응에 포함된다. 이 프로브는 5'-리포터 염료(예를 들면, 형광 염료)와 3'-소광(quencher) 염료를 가진 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. PCR에서 프로브가 그의 표적에 결합되면 AMPLITAQ 폴리머라제의 5'-3' 뉴클레올리틱 활성은 리포터와 소광 염료 사이의 프로브를 분해한다. 소광 염료에서 리포터 염료를 분리하므로써 형광이 증가된다. 신호는 각각의 PCR 주기에 따라 축적되고 형광측정계를 이용하여 관찰된다.

또한, 다른 양태에 있어서, 다형성은 SNP-IT 프라이머 신장 검증(Orchid Biosciences, Princeton, NJ; 미국 특허 제5,952,174호 및 제5,919,626호 참조)를 이용하여 검출된다. 이 에세이에서 SNP는 특이적으로 합성된 DNA 프라이머와 SNP 추정 위치에서 하나의 염기에 의해 DNA 사슬을 선택적으로 연장하는 DNA 폴리머라제를 이용하여 확인된다. 목적하는 영역의 DNA는 증폭된 후 분해된다. 그런 다음, 폴리머라제 반응은 미세유체(microfluidics)이라 불리우는 미니어쳐 시스템을 이용하여 실시한다. 표지물을 SNP 또는 돌연변이 위치에 있을 것으로 추정되는 뉴클레오티드에 첨가하여 검출한다. DNA와 표지물의 결합은 적당한 방법을 이용하여 검출할 수 있다(예를 들면, 뉴클레오티드가 비오틴 표지물을 함유하는 경우, 비오틴에 대해 특이적인 형광물질로 표지된 항체에 의해 검출된다).

Ⅲ. 서열 입력 및 사용자 인터페이스(User Interfaces)

서열은 여러가지 공급원으로부터 분석을 위해 입력될 수 있다. 다양한 양태에서, 서열 정보를 컴퓨터에 입력한다. 이 컴퓨터가 인 실리코(in silico) 분석에서 실시되는 것과 동일한 컴퓨터 시스템일 필요는 없다. 일부 바람직한 양태에 있어서, 후보가 되는 표적 서열은 커뮤니케이션 네트워크(예를 들면, 지역 네트워크, 인터넷 또는 인트라넷)에 링크된 컴퓨터에 입력될 수 있다. 이와 같은 양태에서, 커뮤니케이션 네트워크에 접근할 수 있는 세계의 어느 지역에 있는 사용자도 그들의 지역에서 후보 서열을 입력할 수 있다. 일부 양태에서, 사용자 인터페이스는 인 실리코(in silico) 분석(예를 들면, 후보 표적 서열의 서열)에 의해 요구되는 정보에 대한 엔트리 영역을 포함하는 커뮤니케이션 네트워크(예를 들면, World Wide Web에 기초한 사용자 인터페이스)에 대해 사용자에게 제공된다. 웹에 기초한 사용자 인터페이스의 사용은 몇 가지 이점이 있다. 예를 들면, 입력 위저드를 제공하므로써 사용자 인터페이스는 사용자가 정확한 포맷에서 필요량의 정보를 입력하게 할 수 있다. 일부 양태에서, 사용자 인터페이스는 표적 서열에 대한 서열 정보가 최소 길이(예를 들면, 20 이상, 50 이상, 100 이상의 뉴클레오티드)이고 단일 포맷(예를 들면, PASTA)인 것을 요구한다. 다른 양태에서, 이 정보는 어떠한 포맷에서도 입력될 수 있고, 본 발명의 시스템과 방법은 적당한 분석 형태로 입력 정보를 편집하거나 변경한다. 예를 들면, 입력 표적 서열이 너무 짧으면, 본 발명의 시스템과 방법은 짧은 서열에 대한 일반 데이터베이스를 조사하고, 독특한 서열가 확인되면 하나 또는 두 개의 입력 표적 서열의 말단에 뉴클레오티드를 첨가하여 짧은 서열를 적당하게 긴 서열로 전환한다. 마찬가지로 서열 정보가 바람직하지 않은 포맷에 입력되었거나 외래의 비서열의 특성을 포함한다면, 추가의 인 실리코 분석 전에 표준 포맷(예를 들면, PASTA)을 수정할 수 있다. 또한, 사용자 인터페이스는 이에 제한되는 것은 아니나 사용자의 이름과 주소를 포함하는 사용자에 대한 정보를 수집할 수 있다. 일부 양태에서 표적 서열 입력은 사용자 확인 코드와 연관된다.

일부 양태에서, 서열은 검증 디자인 소프트웨어(인베이더크리에이터 소프트웨어 등)에서 직접 입력된다.

바람직한 양태에서, 각각의 서열은 ID 번호가 주어진다. 이 ID 번호는 이중 분석을 피하기 위해 분석되는 표적 서열에 링크된다. 예를 들면, 인 실리코 분석이 입력 서열에 해당하는 표적 서열을 이미 분석되었다고 결정하면, 유저에게 알려 지고 인 실리코 분석에서 비켜가기(by-passing)와 이전에 얻어진 결과를 단순하게 접수하는 것에 대한 선택이 주어진다.

웹-명령(Web-ordering) 시스템과 방법

검출 검정법를 명령하고자 하는 사용자, 검출 에세이를 설계하고자 하는 유저 또는 본 발명의 데이터베이스 또는 다른 정보에 접근하고자 하는 유저는 전자 커뮤니케이션 시스템(인터넷 등)을 이용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 오더링과 정보 시스템은 어떠한 유저도 이 정보에 접근할 수 있도록 하는 일반 네트워크에 연결되어 있다. 일부 양태에서는 개인 전자 커뮤니케이션 네트워크가 제공된다. 예를 들면, 구매자 또는 사용자가 반복 구매자(예를 들면, 유통업자 또는 대규모 진단 실험실)라면, 구매자의 컴퓨터 시스템과 본 발명 시스템의 컴퓨터 시스템 사이에 풀타임 전용 개별 컨넥션이 제공될 수 있다. 이 시스템은 사람의 상호작용을 최소화하도록 배치될 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 재고 컨트롤 소프트웨어는 구매자의 보유량에서 검출 에세이의 수와 종류를 모니터하는데 사용된다. 구매자가 적정한 수와 종류의 검출 검정법를 가지고 있는지를 결정하기 위해 규정된 간격으로 질문이 보내지고, 부족함이 검색되면 구매자에게 추가의 검정을 설계, 생산 및/또는 전달하는 지시를 보낸다. 일부 양태에서, 이 시스템은 또한 판매업자의 재고량을 모니터하고, 바람직한 양태에서는 생산 용량과 시기를 관리하는 생산시스템으로 통합된다.

일부 양태에서, 사용자에게 친숙한 인터페이스가 검출 검정의 선택과 주문을 촉진하기 위해 제공된다. 시판되고 있는 수많은 검출 검정 및/또는 사용자가 정보를 얻고자하는 다형성으로 인하여 사용자에게 친숙한 인터페이스는 옵션의 복합 세트에 의해 네비게이션을 가능하게 한다. 예를 들면, 일부 양태에서, 일련의 축적된 데이터베이스는 사용자를 목적하는 생성물로 이끄는데 사용된다. 일부 양태에서 제1 층은 유기체의 모든 염색체의 디스플레이를 제공한다. 사용자는 그 염색체 또는 관심있는 염색체를 선택한다. 염색체의 선택은 염색체 상의 밴딩 영역을 표시하는, 그 염색체의 더 상세한 지도를 제공한다. 목적하는 밴드를 선택하면 유전자 위치를 나타내는 지도에 이르게 된다. 상세한 하나 이상의 추가 층이 다형성의 염기 위치, 유전자 이름, 게놈 데이터베이스 ID 태그, 주해, 구매가능한 선재하는 개발된 검출 검증을 가진 염색체 영역, 디자인과 생산 등에 사용가능하지만 선재 개발된 에세이가 없는 영역을 제공한다. 영역, 다형성 또는 검출 에세이를 선택하는 것은 사용자가 검출 에세이 디자인 및/또는 주문 명령을 개시하기 위한 정보가 수집되어 있는 주문명령 인터페이스를 제공한다. 일부 양태에서는 유전자 이름, 서열 범위, 다형성 또는 기타 질문이 사용자가 정보의 적절한 층에 보다 직접 접근하게 하는 검색 엔진이 제공된다.

일부 양태에서, 주문, 디자인 및 생산 시스템은 디자인이 필요한지, 검출 검정 내의 구성요소에 기초한 상품의 가격, 특정 고객을 위한 특별한 디스카운트, 대량 구매에 대한 디스카운트, 재주문에 대한 디스카운트, 특허권 또는 제 3자에 대한 계약 지불 의무가 있는 제품의 가격 인상 및 용도에 따른 가격 선택 등과 같은 1 이상의 팩터에 의해 검출 에세이의 가격이 결정되는 금융 시스템과 통합된다. 예를 들면, 검출 에세이가 연구 용도 보다 임상 진단에 사용되거나 확인되는 경우, 가격은 증가된다. 일부 양태에서, 임상 제품에 대한 가격 인상은 자동적으로 일어난다. 예를 들면, 일부 양태에서 본 발명의 시스템은 FDA, 일반 공개 또는, 어떤 제품이 임상 진단이나 ASR 용도에 대해 확인되었는지를 결정하는 다른 데이터베이스에 링크된다.

다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태와 구현예를 예시하고 입증하기 위해 제공된 것으로, 다음 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

하기 실시예에서는 다음과 같은 약자들이 사용되었다 : N (normal); M (molar); mM (millimolar); μM (micromolar); mol (moles); mmol (millimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles), pmol (picomoles), g (grams); mg (milligrams); μg (micrograms); ng (nanograms); 1 or L (liters); ml (milliliters); μl (microliters); cm (centimeters); mm (millimeters); μm (micrometers); nm (nanometers); DS (dextran sulfate); C (degrees Centigrade); 및 Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

실시예 1

10-PLEX (MANUAL)의 설계 : 인베이더(INVADER) 검정 시험

이하의 실시예에는 다중 증폭 반응에 대한 증폭 프라이머의 매뉴얼 설계와 인베이더(INVADER) 검정에 의한 앰플리콘(amplicon)의 후속 검출을 기재하였다.

10개 표적 서열는 TWT 인-하우스 올리고뉴클레오티드 주문 입력 데이터베이스에서 입수할 수 있는 예비 인가된 SNP 함유 서열 세트에서 선택된다. 각각의 표적은 인베이더(INVADER) 검정가 이전에 설계되어 있었던 단일 뉴클레오티드 다형성(SOP)을 포함한다. INVADER 에세이 올리고뉴클레오티드는 인베이더 크리에이터(INVADER CREATOR) 소프트웨어 (Third Wave Technologies, Inc. Madison, WI)에 의해 설계되었으며, 따라서 이 실시예에서 풋프린트(footprint) 영역은 인베이더(INVADER) "풋프린트"로서 정의되거나, 또는 목적하는 염기, 이 경우에는 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출에 최적으로 위치되는 인베이더(INVADER)와 프로브 올리고뉴클레오티드에 의해 커버되는 염기로서 정의된다. 10개 표적 서열 각각의 약 200 뉴클레오티드를 서열의 중앙에 있는 SNP 염기를 이용하여 증폭 프라이머 설계 분석방법으로 분석하였다.

50 내지 60 ℃의 프로브 융점 Tm에 대한 범위에서와 같이, 최대 및 최소 프로브 길이(각각 30 뉴클레오티드와 12 뉴클레오티드 결핍)의 기준을 규정하였다. 이 실시예에서는, 미리 선택된 반응 온도에서 최적으로 수행될 프로브 서열를 선택하기 위해 가장 근접한 이웃 모델과 DNA 이중가닥 생성용으로 공개된 파라미터를 이용하여 올리고뉴클레오티드의 녹는점 온도(Tm)를 계산하였다((Allawi and SantaLucia, Biochemistry, 36:10581 [1997]). 검정의 염 농도는 가장 근접한 이웃 파라미터가 얻어지는 용액 조건 보다 대체로 상이하고(1M NaCl과 2가 금속이 없 는) 효소의 존재와 농도가 최적 반응 온도에 영향을 미치기 때문에 반응을 수행하기 위한 최적의 온도를 결정하기 위해 계산된 Tm으로 조절되어야만 한다. 이러한 요소들을 보상하는 한 가지 방법은 융점 계산 내에서 염 농도에 대해 주어진 값을 변화시키는 것이다. 이러한 조정을 '염 보정(salt correction)'이라 하였다. "염 보정"이란 비염(non-salt) 파라미터의 핵산 듀플렉스 또는 상기 듀플렉스에 영향을 미치는 조건에 대한 Tm 계산 상의 효과를 반영할 목적으로 염 농도에 제공되는 값에서 만들어지는 변화를 말한다. 가닥 농도에 제공된 값의 변화는 또한 이러한 계산 결과에 영향을 미친다. 280 nM NaCl(SantaLucia, Proc Natl Acad Sci U S A, 95:1460 [1998]) 값과, 약 10 pM의 프로브와 1fM 표적의 가닥 농도를 이용하여 프로브-표적 녹는점 온도를 계산하는데 사용되는 알고리즘을 최적의 프라이머 디자인 서열 예측에 사용하기 위해 적용하였다.

다음으로, 풋프린트 영역에 인접한 서열을 상부와 하부 모두 스캔하고, 최초의 A 또는 C는 N[1]이 A이거나 또는 C이어야 하는, 프라이머에 대해 5'-N[x]-N[x-l]-.....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'으로 표시되도록 디자인 스타트를 위해 선택되었다. 주어진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 N[2]-N[1]은 다른 올리고뉴클레오티드의 N[2]-N[1]에 상보적이지 않아야 하고 N[3]-N[2]-N[1]은 다른 올리고뉴클레오티드의 N[3]-N[2]-N[1]에 상보적이지 않아야 하는 규칙을 이용하여 프라이머는 상보적으로 회피되었다. 이러한 기준이 주어진 N[1]에서 만족되지 않으면, 정방향 프라이머에 대한 5' 방향의 다음 염기 또는 역방향 프라이머에 대한 3' 방향의 다음 염기가 N[1] 리젼에서 평가될 것이다. 매뉴얼 분석의 경우에 A/C가 많은 영역은 3' 말단의 상보성을 최소화하기 위해 표적되었다.

실시예에 있어서, 인베이더(INVADER) 검정 다중 증폭 반응을 따라 실시되었다. 그러므로, 2차 인베이더(INVADER) 반응 올리고뉴클레오티드(FRET 올리고뉴클레오티드 서열) 섹션은 또한 프라이머 디자인을 위한 기준으로 결합되었다: 여기에서 증폭 프라이머 서열는 FRET 올리고뉴클레오티드의 특이 영역에 대해 80% 이하의 동종성을 나타내어야 한다.

모든 프라이머는 표준 올리고뉴클레오티드 화학에 따라 합성되었고, (표준 방법)으로 탈염되었으며, 260 nm에서 흡광도에 의해 정량되었고 50 μM 농도 용액으로 희석되었다.

다중 PCR은 다음 조건 하에서 같은 몰의 프라이머(0.Ol μM/프라이머)를 이용하는 10-플렉스 PCR에 의해 실시되었다: lOO mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Tris pH 8.0, 200 uM dNTPs, 2.5U Taq DNA 폴리머라제, 및 50 ㎕ 반응 용액 중의 10 ng of 사람 게놈 DNA (hgDNA) 템플레이트. 이 반응을 (94 ℃/30 초, 50 ℃/44 초)를 30회 동안 항온처리하였다. 항온처리 후에 다중 PCR 반응 용액을 물로 1:10의 비율로 희석하고 인베이더(INVADER) 검정 FRET 검출 플레이트, 96 웰 게놈 2-플렉스, 100 ng CLEAVASE VIII 효소를 이용하여 인베이더 분석을 실시하였고, 인베이더 검정은는 다음과 같이 15 ㎕ 반응물로 결합되었다 : PCR 반응의 1:10 희석용액 1 ㎕, PPI 혼합물 3 ㎕, 22.5 mM MgCl₂ 5 ul, dH20 6 ㎕를 CHILLOUT 리퀴드 왁스 15 ㎕로 커버하였다. 샘플은 95 C에서 5 분 동안 항온처리에 의해 인베이더 바이플렉 스에서 분해하고 63 C에서 항온처리한 다음 형광물질을 다양한 시점에서 사이토플루 4000으로 측정하였다.

유전자형 콜(call)을 정확하게 제조하는 다음 기준 (FOZ_FAM+FOZ_RED-2 > 0.6)을 이용하여, 10개의 인베이더 검정 콜 중 2개 만을 63C에서 10분 항온처리한 후 만들 수 있으며, 10 콜 중의 5 만을 63C(60 분)에서 추가로 50분 항온처리하여 만들 수 있다. 60 분 시점에서, 검출가능한 FOZ 값 사이의 편차는 가장 강력한 시그널(41646, FAM_FOZ+RED_FOZ-2=54.2, 리더의 역학적 범위를 많이 벗어난)과 가장 약한 시그널(67356, FAM_FOZ+RED_FOZ-2=0.2) 간에 100배를 넘는다. 100 ng의 사람 게놈 DNA(같은 몰량의 각 표적을 입수할 수 있는)에 대해 직접적으로 동일한 INVADER 에세이를 이용하여 모든 판독은 리더의 역학적 범위에서 만들어질 수 있었고 FOZ 값의 편차는 이 검정의 가장 강력한 것(53530, FAM_FOZ+RED_FOZ-2=3.1)과 가장 약한 것(53530, FAM_FOZ+RED_FOZ-2=0.43) 사이에 약 7 배였다. 이것은 같은 멀티플렉스 PCR 반응에서 상이한 앰플리콘 간에 보여지는 FOZ 값의 극적인 불일치가 인베이더 검정에 기인하는 가변성이 아니라 편향된 증폭의 작용이라는 것을 의미한다. 이러한 조건 하에서 상이한 인베이더 검정에 의해 생성된 FOZ 값은 서로 직접 비교할 수 있고 증폭 효율의 지표로서 신빙성 있게 이용될 수 있다.

FOZ 값을 이용하여 주어진 앰플리콘의 증폭 팩터의 평가

주어진 앰플리콘의 증폭 팩터 (F)를 평가하기 위해 인베이더 검정의 FOZ 값은 앰플리콘 다량을 평가하는데 사용될 수 있다. 주어진 시간(FOZm)에 미지 농도 의 앰플리콘 FOZ는 제시간에(FOZ ₂₄₀, 240 min) 규정된 포인트에서 기지 량의 표적(예를 들면, 게놈 DNA 100 ng = 단일 유전자 30,000 카피)의 FOZ에 직접 비교될 수 있고 미지 앰플리콘의 카피 수를 계산하는데 사용될 수 있다. 수학식 1에서 FOZm은 주어진 시간(m) 동안 INVADER 에세이에서 항온처리된 미지 농도의 표적의 RED_FOZ과 FAM_FOZ의 합을 나타낸다. FOZ ₂₄₀은 경험적으로 결정된 RED_FOZ 값( INVADER 에세이 41646 사용)을 나타내며, 240 분에서 카피 수를 알고 있는 표적(예를 들면, hgDNA 100ng = 30,000 카피)에 대해 사용한다.

F = ((FOZm-1)*500/(FOZ ₂₄₀ - 1))*(240/m)^2

수학식 1a가 프라이머 농도와 증폭 요인 F 사이의 일련의 연관성을 결정하는데 사용되지만, 수학식 1a'는 D 값이 PCR 반응의 희석 요인인 10-플렉스 PCR(등몰 량의 프라이머와 프라이머의 최적 농도 모두를 가지는)에 대한 증폭 팩터 F의 계산에 이용된다. 50 ㎕ 멀티플렉스 PCR 반응의 1:3 희석의 경우에 D=0.3333이다.

F = ((FOZm-2)*500/(FOZ ₂₄₀ - 1)*D)*(240/m)^2

수학식 1a와 1a'은 10-플렉스 멀티플렉스 PCR의 기술에서 사용되지만, 이 식의 보다 정확한 적용은 107-플렉스 PCR에서 프라이머 농도를 최적화하는데 사용된 다. 이 경우, FOZ₂₄₀은 표적으로 hgDNA (FOZ ₂₄₀=3.42)를 사용하는 전체 인베이더 맵플레이트에 대한 FAM_FOZ₂₄₀+RED_FOZ₂₄₀의 평균값이며, 희석 팩터 D는 0.125로 세팅된다.

F = ((FOZm-2)*500/(FOZ ₂₄₀ - 2)*D)*(240/m)^2

보다 정확한 증폭 팩터 F의 평가를 위해서 FOZ 값은 판독이 제공되는 장치의 역학적 범위 내에 있어야 하는 것에 주목하여야 한다. 이 연구에서 사용되는 Cytofluor 4000의 경우에, 역학적 범위는 약 1.5 내지 12 FOZ이다.

섹션 3. 증폭 팩터와 프라이머 농도 간의 상관관계

프라이머 농도와 증폭 요인 (F) 간의 상관관계를 결정하기 위하여 4개의 상이한 유니플렉스 PCR 반응을 프라이머 1117-70-17 및 1117-70-18을 이용하여 0.01 uM, 0.012 uM, 0.014 uM, 0.020 uM의 농도 각각에서 실시하였다. 각 4개의 PCR 반응을 다음 조건 하에서 실시하였다: 100 mM KCl, 3 mM MgCl, 1O mM Tris pH 8.0, 템플레이트로서 10 ng의 hgDNA를 사용하는 200 uM dNTP. (94C/30 초, 50C/20 초)에서 항온처리를 30회 실시하였다. PCR에 이어서, 반응물을 물로 1:10으로 희석하고 INVADER Assay FRET 검출 플레이트, 96 웰 게놈 바이플렉스, 100 ng CLEAVASE VIII 효소를 이용하는 표준 조건 하에서 실시하였다. 15 ㎕의 반응용액 각각은 다 음과 같이 제조되었다 : 1:10의 희석된 PCR 반응액 1 ㎕, PPI mix SNP#47932 3 ㎕, 22.5 mM MgC1₂ 5 ㎕, 물 6 ㎕, CHILLOUT 액체 왁스 15 ㎕. 전체 플레이트를 96C에서 5 분 동안 항온처리한 다음 63C에서 60 분 동안 항온처리하고 이 지점에서 Cytofluor 4000 형광 플레이트 리더 상에서 단일 리드를 취하였다. 각각 4개의 상이한 프라이머 농도 (0.01 uM, 0.012 uM, 0.014 uM, 0.020 uM)에 대하여 60분에서 FOZ_FAM과 FOZ_RED의 합이 FOZm이고, m=60이며 FOZ ₂₄₀=l.7인 수학식 1a를 이용하여 증폭 팩터 F를 계산하였다. 증폭 요인의 로그 Log(F)에 대해 각 반응의 프라이머 농도 플로팅에서는 강력한 상관관계가 나타났다. 이러한 데이터 포인트를 이용하여 증폭 팩터와 프라이머 농도 간의 선형 상관관계를 나타내는 식을 수학식 2에 기재하였다.

Y = 1.684X + 2.6837

수학식 2를 이용하여 주어진 앰플리콘의 증폭 팩터 Log(F) = Y는 기지 농도의 프라이머 (X)를 이용하여 예측가능한 방법으로 조작될 수 있다. 역방법으로, 멀티플렉스 PCR에서 등몰의 프라이머 농도 조건 하에서 관찰된 증폭 경향은 증폭 팩터 (F)에 기초한 "명백한(apparent)" 프라이머 농도 (X)로서 측정될 수 있다. 멀티플렉스 PCR에 있어서, 상이한 앰플리콘 중에서 "명백한" 프라이머 농도의 값은 상이한 위치의 증폭을 균일화하는데 필요한 각 앰플리콘의 프라이머 량을 측정하는데 사용될 수 있다:

X = (Y - 2.6837)/1.68

섹션 4 균형화된 멀티플렉스 혼합물로부터 명백한 프라이머 농도의 계산

상기한 섹션에 기재한 바와 같이, 프라이머 농도는 주어진 앰플리콘의 증폭 팩터에 직접 영향을 줄 수 있다. 동일한 몰농도의 프라이머양의 조건하에서, FOZm 리딩은 수학식 2를 사용하여 각 앰플리콘의 "정확한(apparent)" 프라이머 농도를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 주어진 증폭 요인의 log(F) 및 X의 용해애 대한 수학식 2에서 Y 값을 교체하는 것은, 주어진 "정확한" 프라이머 농도가 다중 PCR에서 주어진 앰플리콘의 적절하게 충분한 데에 기초된다. 다중 반응에서 모든 프라이머의 "정확한" 프라이머 농도(동일한 몰 농도로 제공된)를 계산하기위한 수학식 2를 이용하는 것은, 각기 다른데에 대한 일반화된 프라이머 세트의 의미로 제공한다. "최적화된" 다중 프라이머 혼합물 R에 추가될 수 있는 각기 다른 프라이머에 대한 적절한 양을 끌어내기 위하여, 가장 강한 앰플리콘 값이 1 이고, 남아있는 앰플리콘은 1 보다 같거나 큰 값의, 최대 정확한 프라이머 농도(Xmax)는 각각의 "정확한" 프라이머 농도로 나눌 수 있다

[수학식 3]

R[n] =Xmax/X[n]

적절한 농도의 임의의 프라이머 값으로서 R[n] 값을 사용하는 것은, R[n]의 값이 주어진 다중화 반응에서 각각의 프라이머에 대한 워킹 농도를 제공하기 위한 일정한 프라이머 농도에 의해 다중화 된다. 실시예에서 보여지듯이, SNP 검정 41646에 상응하는 앰플리콘 은 1의 R[n] 값을 가진다. 가장 낮은 프라이머 농도가 1 또는 0.001uM로 정해진 R[n]의 41646인, 모든 R[n] 값은 0.01uM(동일한 몰 농도의 다중 PCR 반응에서 오리지날 시작 프라이머 농도)로 곱해진다. 남은 프라이머 세트는 또는 비례하여 증가된다. 최적화된 프라이머 혼합물의 다중 PCR의 결과는 이하에 기술되어있다.

섹션 5. 다중 PCR에서 최적화된 프라이머 농축물(concentration)을 사용하여, 10개의 인베이더 검정(Invader assay) 중 FOZ에 편차(variation)를 크게 감소시킨다.

다중 PCR을 부피에 기초한 다양한 프라이머의 양(X[최대] 는 SNP41646, 1x = 0.01uM/프라이머)에 대해 10 배 증폭 반응을 사용하여 수행했다. 다중 PCR을 동일한 몰농도(equimolar)의 프라이머 혼합물과 함께 사용된 조건과 동일한 조건 아래에서 수행했다 ; 50ul에 반응에서 100mM KCl, 3mM MgCl, 10mM Tris pH 8.0, 200uM dNTP, 2.5U taq, 및 hg DNA 주형 10ng. 반응을 30사이클 동안 수행하였다(94C/30초, 50C/44초). 반응(incubation) 후에, 다중 PCR 반응물을 물을 사용하여 1:10으로 희석한 후, 인베이더 검정을 수행하였다. 인베이더 검정 FRET 검출 플레이트(96 웰 유전자 2-플렉스(biplex), 100ng CLEAVSE Ⅷ 효소)를 사용하여, 반응물을 다음과 같은 15ul 반응물로 구성하였다.; PCR 반응의 1: 10 희석액 1ul, 적절한 PPI 혼 합물 3ul, 22.5mM의 MgCl₂ 5ul, dH₂O 6ul, CHILL OUT 15ul을 추가로 각 웰에 더한 후에 95℃ 에서 5분동안 반응시켰다. 플레이트를 63℃에서 반응시킨 후, 사이토플루오 4000(유세포분석기)으로 10 분 동안 형광을 측정하였다.

게놈형 콜(call)을 정확히 만들기 위한 다음 기준에 따라, (FOZ_FAM + FOZ_RED-2 > 0.6), 10 인베이더 콜(call)의 10개(100%) 모두를 63 ℃에서 10분간 반응시킨 후에 하였다. 나아가 FAM + RED-2(전체적인 신호 발생의 표지자로 이것은 직접적으로 증폭 인자(식 2 참조)와 관련이 있다)는 가장 낮은 신호(67325, FAM + REM -2 = 0.7)와 가장 높은 신호(47892, FAM + RED-2=4.3)사이에 7 배 보다 적게 차이가 났다.

실시예 2

소프트웨어를 사용한 101-중(PLEX) PCR의 고안

TWT 올리고를 명령하는 엔트리 데이터베이스를 사용하여, 각 서열(e.g.NNNNNNN[N_(wt)/N_(mt)]NNNNNNNN)에 대하여 SNP 위치가 나타난, 괄호로 주석이 달린 SNP를 사용하여, 길이가 200 뉴클레오티드(nucleotide)보다 적은, 144개의 서열을 얻었다. 관심있는 SNP에 인접한 서열 데이타를 확장하기 위해서, 블라스트(BLAST) 분석을 사용하여 서열을 대략 길이로 1kB(SNP의 각 옆에 접해있는 500nt)정도로 확장하였다. 144의 시작 서열 중에서, 16개는 블라스트(BLAST)에 의해 확장될 수 없어서, 대략 1kB 길이로 확장된 128개 서열의 최종 세트를 얻었 다. 이 확장된 서열은 다음의 각 서열의 정보와 함께 엑셀 포맷으로 사용자에게 제공되었다; (1) TWT 수, (2) 숏 네임 아이덴티파이어(short Name Identifier) 및 (3) 서열. 엑셀 파일은 콤마디리미티드 포맷(comma delimited fomat)으로 변환되고, 프라이머 디자인너 인베이더 크리에이터( Designer INVADER CREATOR) vol.3.3 소프트웨어(이 프로그램의 버전은 프라이머의 FRET 반응성에 대해 스크린(screen)하지 않으며, 또한 사용자가 프라이머의 최대 길이를 특정할 수도 없게 한다.)를 위한 입력파일로 사용되었다. 인베이더 크리에이터 프라이머 디자이너(INVDER CREATOR Primer Designer) vol 1.3.3.은 60℃ 로 설정된 Tm_low만 제외하고는 디폴트(default) 조건( e.g. 최소 프라이머 크기 12, 최대 30)에서 운영되었다. 출력 파일은 128개의 프라이머 세트(256 프라이머)를 포함하였고, 그것 중의 4개는 과도하게 긴 프라이머 서열(SNP #47854, 47889, 54874, 67369)로 인해 버려지고, 124개의 프라이머 세트(248프라이머)만이 합성에 이용되기 위해 남겨졌다. 남아있는 프라이머는 200nmol 스케일(scale)에서 표준화된 과정을 사용하여 합성되고, 탈 염에 의해 정제되었다. 합성 실패 후에, 107 개의 프라이머 세트가 동일 몰 농도의(equimolar)의 107-중 프라이머 혼합물(214 프라이머)의 집합체로 이용가능하게 하였다. 증폭에 이용가능한 107개의 프라이머 세트 중에서, 오직 101개가 증폭 인자를 결정하기 위한 인베이더 맵(INVADER MAP) 플레이트 위에 존재하였다.

다중 PCR는 다음과 같은 조건하에서 동일 몰 농도(equimolar)의 101-중 프라이머(0.025uM/프라이머)를 사용하여 수행하였다; 50ul 반응에서 100mM KCl, 3mM MgCl, 10mM Tris pH 8.0, 200uM dNTP 및 10ng의 인간 유전자 DNA(hg DNA) 주형. 10분 동안 95℃ 에서 변성(denaturation)시킨 후에, Taq 2.5 유니트(unit)를 더한 후에, 94C/30초, 50C/44초에서 50 주기(cycle)로 반응시켰다. 반응 후에, 다중 PCR 반응물을 물로 1:24로 희석하고, 인베이더 맵(INVADER MAP) 검출 플레이트를 이용하여 인베이더 검정법을 수행하였다. 각 인베이더 맵 검정법은 다음과 같은 6ul의 반응액에서 수행된다; 3 ul의 PCR 반응물을 물로 1: 24 희석한 용액(D = 0.125와 같은 총 희석 1: 8 ), 6ul의 칠아웃(CHILLOUT)으로 표지된 15mM MgCl₂ 3ul. 샘플을 인베이더 플레이트에서 95℃ 에서 5분 동안 반응시켜 변성시킨 후, 63℃ 에서 반응시키고, 다양한 시점에서 160분에 걸쳐 사이토프루(Cytofluor) 4000(348 웰 판독기)을 사용하여 형광을 측정하였다. 10분, 20분, 40분, 80분, 120분에 계산된 FOZ 값의 분석은 정확한 콜(call)(동일 DNA 시료의 유전자 call과 비교할 때)이 인베이더 맵플랫폼으로 분석한 101 앰플리콘 중에서 94개가 만들어졌다는 것을 보여준다. 이것은 인베이더 크리에이터 프라이머 디자이너(INVADER CREATOR Primer Designer) 소프트웨어가 다중 PCR에서 대단하게 기능하는 프라이머 세트를 만들어 낼 수 있다는 증거를 제공한다.

160분의 시간 과정 동안 얻어진 FOZ 값을 사용하는데 있어서, 증폭 인자 F 와 R[n]을 101개의 앰플리콘 각각에 대해 계산했다. R[nmax]은 1.6으로 설정하는데, 이것은 낮은 엔드 교정(Low end correction)이 160분에 충분한 FOZ 신호를 제공하는데 실패한 앰플리콘에 대해 만들어졌음에도 불구하고, R[n]에 대해 12개의 임의의 값을 부여한 것이다. 10분에 앰플리콘의 FOZm 값이 판독된 앰플리콘에 대한 높은 엔드 교정(High end correction)은 1 이라는 R[n] 값이 임의적으로 부여된다. 101-중의 최적화된 프라이머 농도는 0.025uM 프라이머(다양한 프라이머의 농도에 대해서는 도 1을 보라)에 상응하는 농도를 가진 1의 R[n]을 가지고 10-중의 예와 식 1b에서 말한 기본적인 원칙을 사용하여 계산한다. 다중 PCR은 다음과 같은 조건하에 수행하였다; 50ul 반응액에서 100mM KCl, 3mM MgCl, 10mM 트리스 pH 8.0, 200uM dNTP, 및 10ng의 인간 지놈믹 DNA(hg DNA) 주형. 10분 동안 95℃ 에서 변성시킨 후에, Taq 2.5 유니트를 추가한 후, 94C/30초, 50C/44초에서 50 주기로 반응을 수행하였다. 반응 후에, 다중 PCR 반응액은 물로 1: 24로 희석되고, 인베이더 맵(INVADER MAP) 분석 플레이트를 사용한 인베이더(INVAER) 분석법을 행하였다. 각 인베이더 맵(INVADER MAP)법은 다음과 같은 6ul의 반응물에서 행한다; PCR 반응물의 1 : 24 희석액 3ul(D = 0.125과 동일한 총 희석), 6ul의 CHILLOUT로 표지된 15mM MgCl₂ 3ul. 시료는 인베이더 맵 플레이트에서 95℃에서 5분 동안의 반응에 의해 변성된 후, 63℃ 에서 반응이 수행되고 160분 동안 다양한 시점에서 Cytofluor 4000(384 웰)를 이용하여 형광을 측정하였다. FOZ 값의 분석을 10분, 20분 그리고 40분에 행하고 게놈 DNA에 대해 직접적으로 작성한 콜(call)과 비교하였다. 비교는 동일한 몰의 프라이머 농도의 101-중 프라이머로 10분 동안에 만들어진 콜(call)과 최적화된 프라이머 농도로 10분 동안 만들어진 콜(call) 사이에서 수행하였다. 동일한 몰 농도의 프라이머 농도 하에서, 다중 PCR은 10분동안에 오직 50개의 정확한 콜(call)을 만들고, 최적화된 프라이머 농도하에서는 다중 PCR은 21개(42%)의 새로운 콜(call)을 얻었고, 71개의 정확한 콜(call)을 만들어낸다. 비록 모든 101개의 콜(call)이 10분의 시점에 만들어질 수는 없지만, 94개의 콜(call)이 40분 시점에 만들어질 수 있으며, 이것은 다수의 앰플리콘의 증폭 효율이 향상될 수 있다는 것을 나타낸다. 단일 단계의 최적화만 필요로 하는 10-중 최적화와는 다르게, 최적화의 다중 단계는 모든 유전좌자(loci)의 증폭과 균형을 맞추기 위해서 더 복잡한 다중 단계를 요구할 수도 있다.

실시예3

PCR의 증폭 요인(amplification factor)을 결정하기 위한 인베이더 검정의 사용

인베이더(INVADER) 법은 PCR 반응 동안 증폭 과정을 모니터하기 위하여 즉, 반응에서 특별한 앰플리콘의 증폭 효율을 반영하는 증폭 요인 F를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 특히 인베이더 검정은 정량된 참조(reference) DNA로부터 생긴 표준 곡선의 참조(reference)에 의해 PCR 반응의 어떤 시점에 존재하는 분자의 수를 결정하기 위해서 사용될 수도 있다. 증폭 요인 F는 최초 목표 농도에 대한 증폭 후에 PCR 산물의 농도의 비율로써 측정될 수 있다. 이 예는 증폭 요인의 측정에 있어 프라이머 농도의 다양화의 효과를 입증하였다.

PCR 반응은 다양한 수의 주기에 대해 5 주기씩 증가하면서, 즉 5, 10, 15, 20, 25, 30 주기로 행하였다. 그래서 반응의 과정이 축적된 PCR 산물을 측정하기 위하여 인베이더 검정을 사용하여 평가될 수 있었다. 측정이 선형 범위에서 가능하도록 반응은, 목표 양이 인베이더 검정이 포화 되지 않은 것을 확실히 하기 위하여 연속적으로 희석되었다. 인베이더 검정 표준 곡선은 알려진 양의 앰플리콘을 포함하는 일련의 희석물들을 사용하여 만들었다. 이 표준 곡선은 나타난 주기 수에 PCR 반응에서 증폭된 DNA 조각의 수를 외삽하는데 사용되었다. 증폭 전에 존재한 수에 대한 주어진 수의 PCR 주기 후의 분자의 수의 비율은 각 PCR 반응의 증폭 요인 F를 유도하는데 사용될 수 있다.

PCR 반응

PCR 반응은 동일한 몰 농도의 프라이머(e.g. 0.02μM 또는 0.1μM 프라이머,최종 농도)를 사용하여 준비되었다. 각 프라이머 농도에서 반응은 검사될 각 증폭 단계 즉, 5, 10, 15, 20, 25, 30 주기의 PCR에서 삼중으로 시행되었다. 6개의 표준 PCR 반응 (각각 2 프라이머 농도에서 삼중으로)을 하기에 충분한 하나의 매스터 믹스와 2 대조군 X 6번의 테스트(5, 10, 15, 20, 25 또는 30 주기의 PCR)와 평균을 내기 위한 추가 반응에 충분한 것.

PCR 산물의 연속적인 희석

인베이더 검정 반응에서 표적으로 더해지는 물질의 양이 PERSEPTIVE BIOSYSTEMS CYTOFLUOR 4000 실시간 분석의 역동 범위를 초과하지 않게 하기 위해서, PCR 반응 산물을 인베이더 검정에 첨가하기 전에 희석하였다. 각 반응에서 처 음 20배 희석액이 만들어지고, 이어서 5배의 연속적 희석이 행해졌다.

표준을 만들기 위해, 다른 주기의 수의 시험에 사용된 동일한 프라이머 세트를 가지고 발생시킨 증폭 산물을 표준 방법을 사용하는 변성되지 않은 표준 폴리아크릴아마이드 겔로부터 분리하고 PICOGREEN 법을 사용하여 정량하였다. 200pM의 유효한 스톡(stock)이 만들 후, 이 농도 표준의 연속적 희석이 30ng/㎕에서 tRNA를 포함하는 증류수에서 만들어져서 0.5, 1, 2.5, 6.25, 15.62, 39, 100fM의 최종적 앨플리콘의 농도로 일련의 물질이 만들어졌다.

인베이더 검정 반응

각 PCR 반응물의 적절한 희석와 목표 대조군이 없는 것이 삼배수(triplate)로 만든 후, 표준적이고 단회의 인베이더 검정으로 검사하였다. 인베이더 검정을 위하여 하나의 기본 혼합물을 이하와 같이 합해서 만들었다; 6가지의 PCR 주기 X 24개의 각각의 검사수[( 삼중의 희석액의 1 검사 X 2 프라이머 조성 X 3 PCR 복제) = 18 + 6개의 (표적 없는) 대조군]. 게다가 표준 연속물에는 정량된 앰플리콘 표준의 7가지의 희석물이 있었고 1개의 표적 없는 대조군이 있었다. 표준 연속물은 추가적인 32 인베이더 검정에 대해 각각 주 플레이트상의 복제에서 분석되었다. 인베이더 검정의 총 개수는 6 X 24 + 32 = 176이었다. 기본적인 혼합은 32개의 반응에 대하여 포함하였다. 인베이더 검정의 기본 혼합은 다음의 표준 요소를 포함하였다 ; 192웰에 16 웰을 더한 혼합물에 대해 FRET 완충용액/ Cleavase ⅩⅠ/PPI 혼합.

다음의 올리로뉴클레오티드는 PPI 혼합물에 포함된다.

분석 2(GAAGCGGCGCCGGTTACCACCA) (SEQ ID NO: 15)를 위한 0.25μM 인베이더

분석 2(CGCGCCGAGGTGGTTGAGCAATTCCAA) (SEQ ID NO: 16)를 위한 2.5μM의 A 프루브

분석 2(ATGACGTGGCAGACCGGTTGAGCAATTCCA) (SEQ ID NO: 17)를 위한 2.5μM의 G 프루브

모든 웰을 15㎕의 미네랄 오일로 덮고, 95℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그리고 발생된 신호의 수준에 의존하여 63℃에 20, 40, 80 또는 160분의 다양한 간격으로 판독하였다. 반응 플레이트는 사이토플루 시리즈(CytoFluor Series) 4000 Fluorescence Multi-Well Reader로 판독되었다. 사용된 셋팅은 F 염색 분석에 대해 485/20nm 흥분/밴드간격과 530/25nm 방사/밴드간격, 그리고 R 염료 분석에 대해 560/20nm 흥분/밴드간격과 620/40nm 방사/밴드간격을 가졌다. Instrument gain이 각 염료에 대해 설치되고 따라서 No Target Blank가 100-200 Absolute Flourescence Units(AFUs)사이에서 생산되었다.

결과:

삼중의 인베이더 검정의 결과가 증폭 요인의 log10 의 값(y 축)과 그래프가 사이클의 수 (x 축)의 함수로 그려졌을 때, PCR 산물 농도는 인베이더 검정으로부터 표준 곡선에 대해 외삽함으로써 평가되었다. 복제 법으로부터 얻어진 데이타는 평균을 내지 않고 대신에 그림에서 다중의 겹쳐진 점으로 표현되었다.

이 결과는 PCR 반응이 테스트된 사이클의 범위에 대해 지수배라는 것을 나타낸다. 다른 프라이머 농도의 사용은 다른 기울기를 초래해서 더 높은 프라이머의 농도(0.1μM)를 사용해서 행해진 PCR 분석의 인베이더 검정으로부터 생성된 기울기는 더 낮은 농도(0.02μM)를 사용한 것보다 더 경사가 심하다. 게다가, 0.1μM을 사용하여 얻어진 기울기는 예상된 완전히 2 배(0.301)에 접근한다. 각 프라이머 농도에서의 PCR 반응의 증폭 요인이 기울기로부터 얻어졌다:

0.1μM 프라이머의 경우, 기울기 = 0.286;증폭 요인:1.93

0.02μM 프라이머의 경우, 기울기 = 0.218;증폭 요인:1.65

선은 원점(origin)으로 연결되지 않고 0 과 5 사이클 사이를 X-축을 자르는 것으로 보이며, 이는 아마도 인간 지노믹 DNA의 시작 농도를 추정할 때의 에러인 것으로 생각된다.

그러므로, 이 데이타는 프라이머 농도가 PCR 반응동안 증폭의 정도에 영향을 준다는 것을 보여준다. 이 데이타는 또한 인베이더 검정이 PCR 반응 전 과정에서 증폭을 보니터하는데 효과적인 도구라는 것을 보여준다.

실시예4

증폭 요소의 프라이머 농도에 대한 의존성

이 실시예는 증폭 요인 F와 프라이머 농도 c사이의 상관관계를 보여준다. 이 실험에서 F는 4개의 서로 다른 농도의 단일 중합 PCR 반응에서 증폭된 각 6 SNP들로부터의 2 대립 유전자에 대해 결정되어지고, 그러므로 6개의 프라이머 쌍 X 2 지 노믹 시료 X 4 프라이머 농도 = 48 PCR 반응.

실시예 3에서 PCR 주기 횟수의 결과를 두 개의 프라이머 농도의 단일 증폭 지역에서 시험 한 반면에, 이번 실시 예에서는 모든 테스트 PCR 반응을 20 주기로 수행하였다. 그러나 프라이머 농도의 다양화의 결과는 4개의 다른 농도 수준에서 연구되었다 : 0.01μM, 0.025μM, 0.05μM, 0,1μM. 게다가, 이 실험은 다른 게놈부위의 증폭에서의 차이를 연구하기 위해서 (a) 다른 게놈 부위가 다르게 증폭되는지 여부(즉 PCR 편향성) 그리고 (b)다른 게놈 부위의 증폭이 프라이머 농도에 얼마나 의존하는지를 조사하였다.

실시예 3에 나타나 것처럼, F는 정제되고 정량된 참조 앰플리콘 준비의 희석 계열을 사용한 각 자리에 대하여 표준 곡선을 발생시킴으로써 얻어졌다. 이 경우에, 12개의 다른 참조 앰플리콘이 발생하였다: 프라이머 쌍에 의해 증폭된 6개의 다른 지노믹 지역에 포함된 SNP의 각 대립유전자 중 하나. 각 참조 앰플리콘의 농도를 인베이더 검정으로 시험하였다. 그리고 앰플리콘 농도에 대한 형광 카운터의 표준 곡선이 만들어졌다. PCR 반응을 또한 지노믹 DNA 시료에서 하고, 산물이 희석되고, 그리고 나서 인베이더 검정으로 표준곡선과 비교함으로써 분자의 수의 관점에서 증폭의 양을 결정하기 위해 테스트를 하였다.

a. 정량화된 참조 앰플리콘을 사용한 표준곡선의 발생

전체 혈액에서 얻어진 총 8개의 지노믹 DNA 시료를 24 SNP에서 그들의 유전자 타입을 결정하는 표준 비플렉스 인베이더 검정으로 총 6개의 다른 자리에서 야 생형 또는 변이체에 대한 시료 상동성을 확인하기 위해 스크린하였다.

일단 이들 자리가 확인되면, 야생형 또는 변이체의 지노믹 DNA 시료를 각 SNP를 포함하는 지노믹 지역에 접해있는 프라이머과 함께 분리된 PCR 반응으로 분석한다. 각 SNP에서, 하나의 대립유전자가 FAM 염색이고 하나가 RED 염색이라고 알려져 있다.

그리고 나서 적합한 지노믹 DNA 준비물을 표준 개개 즉 단일plex PCR 반응에서 실시예 3에서 설명한 것과 같은 PCR 참조 표준으로써 사용을 위한 증폭된 조각을 발생시키기 위하여 증폭하였다.

PCR 후에, 증폭된 DNA는 표준 방법을 사용하여 겔 분리하고 앞서서 PICOGREEN 법을 사용하여 정량하였다. 이 농도 표준의 연속적인 희석이 다음과 같이 만들어졌다 ;

각 정제된 앰플리콘을 200pM 농도의 유효한 스톡(stock)을 만들기 위해 희석한다. 그리고 나서 이들 스톡(stock)을 다음과 같이 희석하였다. 각 앰플리콘의 유효한 스톡 용액을 30ng/㎕의 tRNA를 포함하는 증류수(dH₂O)에서 1.25pM의 농도로 준비하였다. 유효한 스톡(stock)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 희석하고, 그리고 연속적으로 INVADER법에서 다음의 최종 농도를 생산하도록 희석하였다. : 1, 2.5, 6.25, 15.6, 39, 100 그리고 250fM. FAM 염료로 하는 프루브 올리고뉴클레오티드를 사용하는 인베이더 검정에서 분석될 앰플리콘에 대한 하나의 플레이트를 준비하고 RED 염료로 리포트(repoting)하는 프루브 올리고뉴클레오티드로 시험되는 것에 대한 하나의 플레이트를 준비하였다.

이런 구조에서 100㎕ 의 상등액을 MJ 리서치 96웰 플레이트에 추가하였고, 인베이더 검정을 실시하기 전에 95℃ 에서 5분 동안 변성하였다.

b. 다른 프라이머 농도에서 게놈 시료의 PCR 증폭

PCR 반응을 이전 실시예에서 설명한 4개의 다른 프라이머 농도에서 각 2개의 대립유전자에 대한 6개의 게놈부위의 각각의 증폭을 위해 총 48번의 PCR 반응을 수행하였다. 모든 PCR은 20 주기로 수행하였다. 이하의 프라이머 농도로 검사한다 : 0.01 μM, 0.025μM, 0.05μM과 0.1μM.

추가적인 23번의 반응(16번의 반응은 준비되지만 사용되지 않고 7개의 추가 반응이 준비된다.)에 더하여 모든 48번의 반응에 대한 기본 혼합은변형된 프라이머 농도만 제외하고는 표준 과정에 따라 준비하였다.

c. PCR 반응물의 희석

인베이더 검정 분석 전에 실시예 1과 2에서 설명된 것처럼 PCR 산물을 희석하는 것이 필수적이다. 각 48개의 PCR 반응물의 연속적인 희석은 각 SNP에 대한 96 웰 플레이트를 사용하여 했다. 플레이트의 왼쪽 절반은 FAM으로 리포트(reporting)하는 프루브 올리고뉴클레오티드로 테스트되는 SNP를 포함하였다; 오른쪽 절반은 RED로 리포트(report)하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 처음의 희석은 1:20이다; 이어지는 희석은 1:5에서 1:62,500이었다.

d. PCR 희석의 인베이더 검정 분석과 참조 앰플리콘

표준 biplex 인베이더 검정에서 인베이더 분석을 각 정량화된 참조 앰플리콘(각 앰플리콘에 대해 표준 곡선을 발생시키기 위해서)의 표시된 희석액 뿐만 아니라 각 PCR 산물의 모든 희석액에 대해서도 하였다.

모든 웰은 15㎕ 의 미네랄 오일을 발랐다. 시료를 5분 동안 95℃ 에서 변성을 위해 가열하고 64℃ 에서 반응시켰다. 형광측정은 40과 80분에 CytoFluor 4000형광 플레이트 판독기(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 측정하였다. 사용되는 설정은 F 염색 분석에 대해서는 485/20nm 흥분/밴드넓이와 530/25nm 방사/밴드넒이로 R 염색에 대해서는 560/20nm 흥분/밴드넓이와 620/40nm 방사/밴드넓이이다. 기기획득값은 각 염료에 대해 설정하는데 따라서 No Target Blank가 100-200 Absolute Fluorescence Unit(AFU)사이에서 생산되었다. 처리되지 않은 데이터는 방법 성과(실시간 또는 종료점 방식)를 측정하는데 사용했던 디바이스/장치에 의해 발생된 것이다.

이 결과는 비록 차이가 동일한 SNP가 표현하는 각 목표 쌍 안에서는 훨씬 작음에도 불구하고 c에 대한 lnF의 의존성이 동일한 반응 조건하에 12 PCR에 대해다른 증폭 비율을 입증한다는 것을 나타낸다. 증폭 요인은 높은 프라이머 농도에서 평평한 상태를 가지면서 강하게 낮은 프라이머 농도에 의존한다. 이런 현상은 프라이머 어닐링(annealing)의 역학적 관점에서 설명될 수 있다. 높은 프라이머 농도에서, 빠른 어닐링(annealing) 키네틱스는 프라이머가 모든 표적에 결합하고 최대한 의 증폭 속도가 달성되는 것을 확실하게 한다. 반면에 낮은 프라이머 농도에서는 프라이머 어닐링(annealing) 키네틱스는 F를 감소시키면서 속도 제한 단계가 된다.

이 분석은 ln (2 - F ^1/n)에서 프라이머 농도 대 c좌표의 함수로 증폭 요소를 구성하는 것은 기울기 -k_αt_α의 기울기를 가진 직선을 생산해야만 한다는 것을 제한한다. 다시 ln(2-F^1/n) 대 c좌표에서 데이타를 재구성하는 것은 예상된 증폭 요인보다 더 낮기 때문에 0.1μM의 프라이머 농도(F 는 10⁵ 이거나 더 크다)에서 선형성으로부터 유도된 낮은 프라이머 농도(낮은 증폭 요인)에 대한 예상된 선형 의존성을 입증한다. k_αt_α 값을 다음의 식을 사용한 PCR에 대하여 계산한다.

실시예5

192-중 PCR 반응의 인베이더 검정 분석

이 실시예는 인간 지놈에서 192의 서로 다른 유전자좌(loci)를 증폭하기 위해 고안된 매우 다중화된 PCR 반응의 산물을 분석하기 위한 인베이더 검정의 사용을 설명한다.

지노믹 DNA 추출

지노믹 DNA를 전 혈액의 5㎖의 전혈로부터 분리하고 Gentra Systems, Inc.에 의해 제조된 Autopure(Minneapoils, MN)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 500㎕의 증류수(dH₂O)에 넣었다.

프라이머 디자인

192유전좌자(loci)의 앞과 뒤의 프라이머 세트를 Primer Designer 버전 1.3.4를 사용하여 디자인하였다(도 8을 포함한 위의 Primer Designer 부분을 보라). 적합한 SNP 위치 양 옆에 있는 500개 이하의 염기를 가진, 인베이더 디자인을 위해 사용한 목표 서열을, Primer Designer을 위한 입력 파일로써 사용하기 위해 콤마 -디리미티드(comma delimited) 텍스트 파일로 전환하였다. 60℃ 로 세팅된 올리고 Tm을 제외하고는, 디폴트 파라미터(default parameter)하에서 프라이머 디자이너(Primer Designer)를 운용하였다.

프라이머 합성

올리고뉴클레오타이드 프라이머는 Polyplex(GeneMachines, San Carlos, CA)표준 과정을 사용하여 합성하였다. 양은 0.2μmole이며 NAP-10에서 오직 탈염시키고(정제는 시키지 않는다), 건조시키지는 않는다.

PCR 반응

두 개의 기본 혼합물을 만들었다. 기본 혼합물1은 1-96 유전좌자를 증폭하 기 위한 프라이머를,; 기본 혼합물 2는 97-192 자리를 증폭하기 위한 프라이머를 포함했다. 혼합물들을 표준과정에 따라 만들었고, 혼합물들은 표준 구성요소를 포함했다. 모든 프라이머는 100mM KCl과 3mM MgCl하에 최종 농도 0.025μM로 존재했다. PCR 주기 조건은 MJ PTC-100 써머사이클러(thermocycler)(MJ Research, Waltham, MA)에서 다음과 같다: 15분 동안 95℃; 30초 동안 94℃, 그 후 44초 X 50 주기동안 55℃

주기 후에, 모든 4 PCR 반응물들이 결합하였고 3㎕의 상등액을 CYBI-2000 자동화된 피펫을 스테이션(station)(CyBio AG,Jean,Germany)을 사용하여 분배했다. 이 장치는 384-웰 마이크로플레이트의 각각의 웰에 개개의 반응물을 추가하였다. 더해질 반응물들도 384-웰 깊이의 절반 플레이트(384-well deep half plate)에 놓여졌다.

인베이더 검정 반응

인베이더 검정은 CYBI-웰 2000을 사용하여 준비되었다. 지노믹 DNA 표적의 3㎕ 상등액을 적절한 웰에 첨가한다. 표적이 없는 대조군은 Te( 10mM 트리스, pH 8.0, 0.1mM EDTA) 3㎕를 포함한다. 인베이더 검정에 사용될 반응액은 표준 PPI 혼합물, 버퍼, FRET 올리고뉴클레오티드와 Cleavase Ⅷ 효소이며, CYBI 웰 2000으로 각 웰에 개별적으로 첨가되었다.

반응물의 첨가 후에, 미네랄 오일 6㎕ 을 각 웰에 바른다. 플레이트를 MJ PTC-200 DNA ENGINE 써모사이클러(MJ Research)에서 5분 동안 95℃ 로 가열하고, 반응온도 63℃로 식힌다. Safire 마이크로플레이트 판독기(Tecan, Zurich,Switaerland)를 사용하여 20분과 40분 후에 다음과 같은 설정에서 형광을 판독한다. F 염색 분석에 대해서 495/5 nm 흥분/밴드넓이와 520/5nm 방사/밴드넓이; 그리고 600/5 nm 방사/밴드넓이, 575/5 nm 흥분/밴드넓이 Z 위치, 5600μs; 플래쉬의 수, 10; 래그 타임(lag time), 0; R ,염료 분석에 대한 완성 시간(integration time) 40μs.획들물은 F 염료에 대해서는 90으로 설정하고, R염료에 대해서는 120으로 설정한다. 처리되지 않은 데이타(raw data)는 방법 성능(실시간 또는 종점 방식)을 축정하기 위해 사용된 디바이스/기구에 의해 발생된다.

192 반응중에서, 20분 후에 157개의 유전자 형 콜(call)이 만들어졌고, 40분 후에 158개가, 또는 총 82%가 만들어졌다. 검정법 중의 88의 경우, 유전자형 결과는 인베이더 분석 후의 모노plex PCR을 사용해서 전에 얻었던 데이타나 또는 지노믹 DNA의 분석으로부터 직접적으로 얻은 INVADER 결과를 사용해서 전에 얻었던 데이타와 비교를 위해 이용가능했다. 69개 결과의 경우, 어떤 확실한 유전자형 결과가 얻어지지 않았다.

이 실시예는 하나의 다중 PCR 반응에서 150유전좌자 이상을 증폭하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 이 실시예는 또한 다중 PCR 반응에서 발생한 각각의 증폭된 조각의 양이 인베이더 검정에서 표적으로 사용될 때, 분별가능한 유전자형 콜(call)을 생산하기에 충분하다는 것을 보여준다. 게다가, 비록 약간은 어떤 유전자형 콜(call)도 얻어질 수 없도록 시그날이 낮았지만 다중 PCR 법에서 발생한 많은 앰플리콘은 인베이더 검정에서 FOZ로 측정되는, 높은 신호를 주었다. 그런데도 어떤 것들은 앰플리콘이 아주 낮은 수준으로 존재하거나 전혀 존재하지 않아서 인베이더 검정에서 어떤 시그널을 만드는데 실패하였다.

실시예 6

매우 다중화된 PCR 반응의 성능을 향상시키기 위한 프라이머 농도의 최적화

다중 PCR에서 개별 반응 사이에 경쟁은 증폭 편향성(amplication bias)를 악화시키고 단일 PCR과 비교시, 증폭 요인에 전체적인 감소를 야기한다. 증폭 요인의 프라이머 농도에 대한 의존성을 PCR 편향성을 약화시키는데 사용할 수 있다. 전 실시예의 192-중 PCR에서 증폭된 다양한 유전좌자로부터 만들어진 다양한 신호 수준은, 증폭 요인에 있어서 프라이머 농도의 결과를 보여주는 실시예 3의 결과와 함께 또한 프라이머 농도를 조정해서 인베이더 검정에 사용하기에 충분한 표적을 만들수 있는 PCR 반응의 퍼센테이지를 향상시키는게 가능할 수도 있다는 것을 보여준다.

예를 들면, 다른 시료는 40분 반응 후에, 1.09 FAM과 1.22의 RED의 FOZ 결과를 나타낸 반면에, 실시예 5에서 분석된 한 특별한 시료는 인베이더 검정에서 40분 반응 후에 29.54 FAM과 66.98 RED의 FOZ 결과를 생산했는데, 이는 유전자형 콜(call)을 발생시키기에 시그널이 불충분하다는 결정을 뒷받침한다. 최초 시료의 경우 농도를 낮추고 그리고 두번째 경우 농도를 상승시키는 프라이머 농도의 조정은 두 시료의 증폭요소를 동일한 값에 더 가깝게 하는 것을 가능하게 해야만 한다. 이런 종류의 조정은 대부분 또는 모든 유전좌자를 다중 PCR 반응에서 거의 동등한 효율로 증폭시키는 것을 가능하게 하기 위하여 증폭 요소를 서로 더 충분히 근접시 키기 위해 한번 이상의 조정을 필요로 하면서, 이러한 종류의 조정이 반복적인 과정이 될 수 있음을 보여준다.

실시예 7 (다중 예)

원칙적으로, PCR 증폭은 동일한 튜브 내에서 다중 위치에서 증폭되는 다중 방식으로 수행될 수 있다. 그러나, 실제로는, 이러한 접근법은 PCR의 편차 때문에 개별적인 확장된 산물의 고도의 다양한 산물로 귀착할 수 있다. 본 실시예는 다중 반응 조건의 최적화가 최소의 증폭 편차를 낸다는 것을 설명한다. 독자적인 반응에서의 다양한 증폭률에 의해 야기되는 증폭 편차는 수많은 주기를 걸친 PCR 산물 내에서 명확한 차이를 이끌어 낸다. 본 실시예에서, PCR 표적 증폭은 반응의 모든 범위 전역에 걸쳐 분석되었고, PCR 수율에 영향을 주는 변수는 정량적 인베이더 검정을 사용하여 조사하였다. 이러한 작업으로부터, 프라이머 농도와 프라이머 결합 시간에 대한 표적 증폭 요인의 의존도를 설명하는 모델이 개발되었으며, 이는 증폭 편차의 원인이 되는 기작을 밝혀준다. 편차를 최소화하는 서로 다른 조건을 시험해보기 위해 6-중 PCR을 모델 시스템으로 사용하여, 두 가지 접근법이 확인되었다. 첫 번째는, 서로 다른 유전자 자리의 증폭 요인의 균형을 맞추기 위해 프라이머의 농도를 조절하는 것에 의존하는 것이다. 두 번째 접근은, 프라이머 농도가 모든 독립적인 반응을 위해 동일하도록 유지되었지만, 그 프라이머의 결합 시간과 증폭 주기의 수는 증폭 편차를 최소화하기 위해 최적화되었다는 것이다. 최적화된 PCR 조건은 8개 유전자 DNA 시료의 192-중 PCR 증폭을 수행하기 위해, 그리고 인베이더 검정을 사용한 유전자형화에 사용되었다.

재료 및 방법( MATERIALS AND METHODS )

재료( Materials )

화학물질과 완충용액은 Fisher Scientific로부터 구입하였다. 구조-특이적 5'뉴클레아제 Cleavase^TM1 효소(Third Wave Technologies사)는 기술한 바와 같이(5) 정제했다. 그 효소는 50% 글리세롤, 20 mM Tris HCL, pH 8, 50 mM KCL, 0.5% Nonidet P40, 100㎍/ml BSA에서 투석하고 저장했다. 달리 언급하지 않는다면, A,G,C 및 T는 데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다.

유전자 DNA 의 준비( Preparation of genomic DNA )

8개의 유전자 DNA 샘플 G1,G2,G3,G4,G5,G6,G7 및 G8은 AutoPure LS 인스트루먼트(Gentra Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 백혈구 10ml로부터 준비했다. 정제된 DNA는 10mM Tris HCL pH 8.0, 0.1 mM EDTA 를 포함하는 Te 완충용액에서 13.3ng/㎕까지 희석했다.

올리고뉴클레오타이드 합성( Oligonucleotide synthesis )

monoplex 및 6-중 PCR 반응과 함께 인베이더 검정에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 A,G,C,T,6-카르복시플루오레세인 다이(FAM)(Glen Research), 리드몬드 RED^TM 다이(RED)(Epoch Biosciences, Redmond, WA), 및 Eclipse^TM 다크 퀸처(Z)(Epoch Biosciences)를 포함하는 표준 포스포아미다이트 화학(standard phosphoramidite chemistries) 및 PerSeptive Biosystems instrument를 사용하여 합성했다. 일차 프로브 및 FRET 카세트는 Resource Q-칼럼(Amesham-Pharmacia Biotech, Newark, NJ)을 사용한 이온 교환 HPLC에 의해 정제하고, 침입하는 프로브는 NAP-10 칼럼(Amersham 17-0854-02)에 대해 탈염하여 정제했다. 192-중 PCR 검정에 사용된 일차 프로브는 C16 CPG 칼럼(Biosearch Technologies, Novato, CA, BG1-SD14-1)을 사용하여 바이오서치 테크놀러지(Biosearch Technologies)에 의해 합성하고, SuperPure Plus Purification 칼럼(Biosearch, SP-2000-96)을 사용하여 정제했다. 192-중 검정에 침입하는 프로브는 trityl-on 5'capture 정제를 사용한 Biosearch Technologies에 의해 합성하고 정제했다. PCR 프라이머는 인테그레이티드(Integrated) DNA 테크놀러지, 시카고, IL에 의해 합성했다. 올리고뉴클레오타이드 농도는 260nm(A₂₆₀)에서의 흡수와 A,C,G 및 T 각각에 대한 15,400, 7,400, 11,500 및 8,700 A₂₆₀의 흡광계수에 의해 결정했다.

다중 PCR 에 대한 프라이머 설계 ( Primer design for multiplex PCR )

컴퓨터 프로그램인 프라이머디자이너(PrimerDesigner) 소프트웨어(Third Wave Technologies; Madison, WI, 도 8과 상기의 프라이머 설계의 설명을 보라)를 개발하여 다중 PCR용 프라이머의 설계를 돕고 프라이머가 다이머를 형성할 가능성을 줄이도록 하였다. 다중형에 대한 PCR 프라이머는 전술한 프라이머 설계에 대한 설명 및 도 8과 함께 다음의 변수를 사용하여 프라이머디자이너 소프트웨어에 의해 고안되었다. 증폭될 각 유전자 위치에 대하여, 각 위치당 총 1001개 염기가 되도록 500 뉴클레오타이드가 SNP의 각 측면에 포함된다. 각 유전자 자리에 대하여, 침입성 및 일차 프로브들의 결합을 위해 요구되는 60-80개 뉴클네오타이드의 서열이 결정되고, 이 지역으로부터 바깥 쪽으로의 "walking"에 의해 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 후보 PCR 프라이머들이 확인되었다. 후보 프라이머는 다음의 규칙에 근거하여 선택했다: (1) 프라이머는 프라이머-다이머 형성을 피하기 위해 3' 말단에 A 또는 C를 가져야한다; (2) 프라이머의 Tm은 60℃(11,12)dlek; (3) 프라이머는 길이가 12 내지 30 뉴클레오타이드 사이에 있어야 한다; (4) 임의의 프라이머의 두 개 또는 세 개의 3'말단 염기는 다중 PCR 혼합물의 임의의 다른 프라이머의 두 개 또는 세 개의 3' 말단 염기에 상보적이어서는 안된다; (5) 어떤 프라이머도 어떠한 인베이더 일차 프로브의 절단된 5' 가지 서열과 80% 이상의 염기 유사도를 가져서는 안된다. 알고리즘은 무작위로 선택된 유전자 위치에 대한 처음 두 프라이머의 설계에 의해 개시되고, 풀(pool)에 더 많은 프라이머를 첨가하는 것을 반복함으로써 진행된다. 만약 하나의 유전자 자리에 대한 어떤 프라이머도 설계될 수 없다면, 알고리즘은 새롭게 무작위로 선택된 유전자 자리로부터 개시된다.

인베이더 검정 설계 ( INVADER assay design )

인베이더 검정에 대한 일차 및 침입 프로브는 다른 곳에서 기술된 바와 같은 인버이더크리에이터(INVADRCreator) 알고리즘으로 설계했다.(Lyamichev, V. and Neri, B. (2003) INVADER assay for SNP genotyping. Methods Mol Biol, 212, 229- 40, herein incorporated by reference). 인베이더 검정 1-6에 대한 프로브 염기서열은 각각 PCR1-6에 대응한다. 192-중 PCR 실험을 위한 192 인베이더 검정에 대한 염기서열은 같은 알고리즘을 사용하여 설계되었다.

인베이더 검정이 수반된 PCR 의 정량 분석 ( Quantitative analysis of PCR with the INVADER assay )

단일의 PCR들 1-6 또는 6-중 방식은 본문에 특정된 농도로 프라이머를 포함하는 50㎕ GeneAmp PCR 완충용액(PE Biosystems, Foster City, CA), 0.2 mM dNTPs, 1㎕(5U/㎕) Amplitaq DNA 폴리머라제(PE Biosystems, N808-0171), 1㎕(1.1㎍/㎕) TaqStart 항체(Clontech, catalog number 5400-2, Palo Aloto, CA) 및 인간 게놈 DNA 50 ng 내에서 또는 표적 없는 대조군으로서 3.8 ㎕ Te 완충용액 내에서 수행했다. 증발되는 것을 막기 위해 각 웰은 투명한 Chill-out(MJ Research, catalog number CHO-1411 Las Vegas, NV) 15 ㎕로 덮고, 플레이트는 금속막 밀봉(foil sesal(Beckman Coulter, catalog number BK 538619, Fullerton, CA))으로 덮었다. 주기 횟수와 각 주기에 대한 시간-온도 프로필은 본문에서 특정된다. 각각의 PCR은 95℃에서 15분 동안의 초기 시료 변성 단계와 99℃에서 10분 동안의 마지막 배양 단계를 포함한다. 각 반응은 96-웰 플레이트에서 3번 수행했다. PCR 산물은 인베이더 검정의 동적 범위 내에서 생산물의 농축을 위해 첫 번째 단계에서 연속적으로 20배 희석한 후 30㎍/ml tRNA를 포함하는 Te 완충용액으로 5-배 연속 희석했다.

희석된 PCR 산물을 가지는 인베이더 반응을 96-웰 플레이트에서 0.05μM 침 입 올리고뉴클레오타이드, 각각의 일차 프로브 0.5μM, 각 FRET 카세트 0.33μM, 5.3ng/μL Cleavase XI 효소, 12 mM MOPS(pH 7.5), 15.3mM MgCl2, 2.5% PEG 8000, 0.02% NP40, 15㎕ 미네랄 오일(Sigma)이 적층된 0.02% Tween 20을 포함하는 15μL에서 수행하였다. PCR 산물은 15μL 반응물 중 7.5μL를 구성했다. 표적 없는 대조군으로서, Te 완충용액 7.5μL를 PCR 산물 대신 사용했다. 반응은 표적을 변성시키기 위해 5분 동안 95℃에서 배양한 후, 63℃에서 20분 내지 3시간 동안 배양하였다. 반응은 플레이트를 상온으로 냉각함으로써 중지되었고, FAM 염료에 대해 485/20nm의 여기(excitation) 및 530/25nm 방사 필터를 사용하고, RED 염료에 대해 560/20nm의 여기 및 620/40 방사 필터를 사용하는 cytofluor 4000 형광 플레이트 리더(PE Biosystems) 형광신호를 검출했다. 각 PCR 복제물은 상응하는 인베이더 검정으로 세 번씩 분석하였고, 그에 따라 각 PCR 반응에 대해 9개 데이타 포인트가 수집되었다.

PCR 산물의 농도를 분석하기 위해서, PCR 산물에 상응하는 표준 농도를 사용하여 각 인베이더 검정 1-6에 대한 표준 곡선을 얻었다. 검정 1-6에 대한 PCR 표준은 DNA 샘플 G1, G2, G6 또는 G8의 PCR 증폭에 의해 준비했다. 그 증폭된 산물은 에탄올 침전에 의해 농축되고, 변성되지 않은 8% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동을 사용하여 정제되고, Picogreen dsDNA 정량 키트(Molecular Probes, Eugene, OR, catalog no. P7589)를 사용하여 정량되었다. 표준 곡선에 대한 인베이더 반응은 분석된 PCR 산물과 동일한 마이크로타이터 플레이트에서의 2번의 PCR 표준 0 내지 100fM으로 수행했다.

분석된 PCR 산물의 농도는 PCR 시료의 형광 시그널의 값에 가장 가까운 표준 곡선의 3개 데이타 지점을 사용한 선형 회귀(regression)에 의한 형광 시그널로부터 결정했다. PCR 산물 농도와 그 변이는 3중(triplicate) 인베이더 검정 측정으로부터 각각의 PCR 복제물에 대해 측정했다. 3중(triplicate) PCR에 대한 PCR 산물의 농도는 인베이더 검정 분석의 편차에 의해 증량 측정된 각 복제물에 대한 평균값을 사용하여 평가되었다. PCR에 사용된 유전자 DNA의 개시 농도는 동일한 표준 곡선을 사용한 3중(triplicate) 인베이더 검정에 의해 결정했다. 증폭 인자 F는 평가된 PCR 산물 농도에 희석 인자를 곱하고, PCR에 사용된 유전자 DNA 농도로 나눔으로써 결정되었다. 192-중 PCR 반응을 DNA 시료 G1-G8로 PCR 1-6을 17 주기로 수행하는 것에 대해 기술한 것과 같은 조건 하에서 단일 복제로 수행했는데, 이때 각 프라이머의 농도는 0.2μM, 프라이머 결합 시간은 1.5분, 프라이머 연장 시간은 2.5분 및 개시 샘플 변성 단계는 95℃에서 2.5분 동안 수행했다. 192-중 PCR 반응은 30㎍/ml tRNA(Boehringer Mannheeim, 109 525)를 포함하는 Te 완충용액에서 30-배로 희석하고, 인베이더 반응에 첨가하기 전에 95℃에서 5분 동안 가열했다. 인베이더 반응은 침입 프로브가 0.07μM, 그리고 각 일차 프로브가 0.7μM인 것 외에는 검정 1-6에서 기술한 것처럼 수행했다. 유전자 PCR 시료와 표적이 없는 PCR 대조군에 대한 FAM 및 RED 형광 시그널은 15, 30 및 60분 뒤 또는 명세서에서 특정한 것과 같이 수집했다. 순 형광 시그널은 각 192 인베이더 검정에 대한 시료 시그널로부터 표적이 없는 시그널을 공제함으로써 측정했다. 다음의 알고리즘이 지노타이핑(genotyping) 소프트웨어에 의한 분석에 적용되었다: (1) 표적 없는 대조 시그널 로 시료 시그널을 나눔으로써 각 인베이더 검정에 대한 FAM(FOZF)과 RED(FOZR) 시그널에 대한 폴드-오버-제로(Fold-over-zero) 값을 측정하였다. (2) 각 인베이더 검정에서, 비율 값 H는 (FOZF-1)/(FOZR-1)로서 결정되었다. (3) 만약 0.25<H<4이고 FOZF와 FOZR 모두가 >1.3이면 이형 접합체(HET)로 정의되었다; 만약 H>4이고 FOZF>1.6이면 시료는 동형접합체 FAM으로 정의되었다; 그리고 만약 H<0.25 이고 FOZR>1.6이면 동형접합체 RED로 정의되었다. (4) 다른 모든 경우 시료는 "확실치 않은(equivoccal)"이라고 부른다.

PCR에 영향을 주는 변수를 조사하기 위해, 반응 전반에 걸친 표적 증폭 인자 F를 결정하기 위해 정량적 인베이더 검정을 사용하는 방법이 개발되었다. 그 F 인자는 증폭된 산물과 개시 유전자 DNA의 농도 비율에 의해 결정되는 것으로, 두가지 모두 "재료와 방법(Materials and Methods)"에서 기술한 것처럼 PCR 산물의 알려진 양으로부터 얻은 표준 곡선을 사용하는 인베이더 검정으로 측정된다.

먼저, F는 PCR 순환 n의 횟수의 함수(function)로서 분석되었다. 단독 PCR5는 DNA G2를 사용하는 0.1μM의 프라이머 농도 C로 수행했고, F는 5,10,15,20,25,30 및 35(도 2)의 n 후에 결정되었다. 도 2에 나타나는 바와 같이, PCR 5는 기울기 0.296±0.0016으로 처음 25번 주기 동안의 n에 대한 lgF의 선형 기울기로 나타나고, 그것은 표적 증폭이 7부터 순차적으로 급격하다는 것을 나타낸다. 선형 의존도의 기울기로부터 결정된 단위 PCR 순환에 대한 평균 증폭 요인은 1.98±0.007로, 그것은 표적의 양이 각 순환 후에 거의 두 배가 된다는 것을 나타낸다. 도 2에서 삽입(inset)은 표적으로 사용된 DNA G2의 더 많은 양을 제외하고는 동일한 조건 아래에서 PCR5의 주기 1,2,3, 및 5에 대한 n에서 lgF의 의존도를 나타낸다. 그 의존도는 또한 0.283이라는 lgF 대( vs ) n의 기울기인 선형 함수에 의해 측정될 수도 있다. 25번의 주기 후에, PCR5는 2 X 10⁸에서 안정수준에 도달하는데, 그것은 개시 유전자 DNA 농도인 0.28fM로부터 결정되어진 표적 농도 0.06μM의 표적 농도에 상응한다. 그 안정상태는 0.1μM 농도의 PCR에서 사용된 프라이머의 결손에 의해 또는 그것 자체의 산물에 의한 PCR 억제에 의해서 설명될 수 있다. PCR5에 유사하게도, PCR2의 양적 분석은 0.295±0.004의 기울기, 그리고 3 X 10⁸에서의 안정상태로 처음 25 주기에서의 n에 대한 lgF의 선형 의존도를 보여준다(데이타는 없음). 이러한 결과는 PCR 표적 증폭 분석에 대한 정량법으로서의 인베이더 검정을 확립하고, 또한 PCR이 7 차수(order) 크기 이상, 또는 적어도 25 주기 동안 급격히 진행함을 설명한다.

F를 조절하는 수단으로서의 F에 대한 c의 효과를 조사하기 위해, 그리고 증폭 편차(Henegariu, O., et al., Biotechniques, 23, 504-11, 1997)를 줄이기 위해 정량적 인베이더 검정을 사용하여 단독 PCR 1-6를 조사하였다. 각 PCR은 0.01, 0.025, 0.04, 0.05 또는 0.1μM의 C로 20번 주기로 수행했다. c의 함수로서의 대수 F는 도 3A에 PCR 1,4, 및 5가 나타나 있다. 도 3A는 PCR 1(●), PCR 2(○), PCR 4(■), PCR 5(□)에 대한 lgF에서의 프라이머 농도 c의 영향을 보여준다. PCR 증폭은 0.01, 0.025, 0.04, 0.05, 또는 0.1 mM의 c와, PCRs 1,4, 및 5에 대해 유전자 DNA G2 및 PCR2에 대해 유전자 DNA G6 50ng을 가지는 50mL에서 수행했다. 각 PCR은 95℃에서 30초 동안의 주형 변형 단계, 55℃에서 40초 동안의 프라이머 결합 단계 및 60초 동안 72℃에서의 프라이머 연장 단계를 각 단계에서 수행하는 20주기 동안 수행하였다. 0.01 mM의 c를 가지는 PCR1에 대한 lgF 값은 신뢰성 있는 측정을 하기에는 너무 낮았다. 그 표준 오차는 3번(triplicate) PCR을 수행하고, 그리고 역시 3번의 상응하는 정량적 인베이더 검정에 의해 각 복제물을 분석함으로써 측정했다. PCR 3과 6은 PCR 5와 2와 각각 매우 유사하여, 생략한다. 동일한 반응 조건에서 수행된 PCR들 사이의 F에는 현격한 차이가 있다. 그 차이는 낮은 c에서 가장 명백하다; 그러나 그것은 lgF가 이론상 최대값 lg(2²⁰)또는 6.0에 가까워져서 c 값이 높아지면 그 차이는 덜 현격해진다. 앞 부분에서도 보여준 바와 같이, PCR은 20 주기에서 급격한 반응이 되는 것으로 생각될 수 있고, F는 F^1/n로서의 단일 PCR 순환에서 표적 증폭 인자 z를 결정하는데 사용될 수 있다.

앞에서 설명한 바와 같이, F에 대한 c의 측정된 영향은 모델에 의해 기술될 수 있는데, 그것은 보다 낮은 c에서 프라이머 결합이 PCR의 속도 제한 단계임을 나타낸다. 이러한 모델에서, 프라이머 P의 표적 T에 대한 결합은 결합율 상수 k_a를 가지는 이차 반응에 의해 기술된다:

프라이머가 표적에 비해 과량 존재하고 프라이머의 융점 아래에서 결합이 일어난다고 가정하면 역반응은 무시될 수 있으므로, 상기 반응(1)은 다음과 같이 표 현될 수 있다:

여기서, [ PT ]는 프라임된(primed) 표적의 농도이고, T₀은 이전의 PCR 주기 후의 표적 농도이고, t_a는 프라이머가 결합하는 시간이다. 두 개의 PCR 프라이머가 동일한 k_a 를 가진다고 가정하면 결합 시간 t_a는 각각의 프라임된 표적 분자의 복제를 완료하기에 충분히 긴 시간이고, z는 다음과 같이 결정되며,

n 주기 후의 F는 다음과 같이 주어질 수 있다.

식 (4)에 따르면, ln (2-F ^1/n )는 k_at_a와 동일하게 c의 선형 함수가 되어야 한다.

ln (2-F ^1/n ) vs . c좌표를 사용하여 도 3A에서 나타낸 데이터의 변형은 그 모델에 대한 강한 지지를 제공하는 각 PCRs(도 3B)에 대한 예상되는 선형 의존도를 설명한다. 도 3B에서, 직선은 각 PCRs에 맞는 최소 제곱법을 보여준다. 0.1mM의 c에서의 PCR 2와 5에 대한 데이터 지점은 높은 표준 오차 때문에 사용하지 않았다. ln(2-F ^1/n ) vs . c의 기울기는 가장 낮은 k_a로 프라이머에 의해 가장 한정되는 프라이머 결합 단계에서의 명백한 결합율 상수 k_a ^app 를 결정하는데 사용될 수 있다. 44초의 t_a를 사용한 도 3B에서 결정된 PCR 1,2,4 및 5에 대한 k_a ^app값은 각각 0.34 10⁶, 0.73 10⁶, 0.45 10⁶, 및 1.2 10⁶ s^-1M^-1이다. 이값은 유사한 완충용액 내 짧은 올리고뉴클레오타이드에서 얻은 1.5 10⁶ s^-1M^{- 1}와 2.6 10⁶ s^-1M^-1의 k_a값과 가깝다. 가장 늦은 k_a값(PCR 1)과 가장 빠른 k_a값(PCR 5) 사이에는 최소 세 배의 차이가 있는데, 그것은 그 프라이머의 결합 역학(kinetics)이 증폭 편차에 상당히 기여할 수 있음을 제시한다.

PCR 증폭의 정량 분석의 결과는 다중 PCR에서의 균형잡힌 표적 증폭에 대한 두가지 접근을 제시한다: (1) lgF vs.c에 대한 의존도를 사용하여 각각의 독립적인 c의 조정과, (2) 다음과 같이 식 (4)로부터 고정된 c에서 모든 표적에 대한 최대 증폭에 접근하기 위한 c와 t_a를 증가시킨다.

조정된 프라이머 농도 c_adj는 각 PCR 1-6(표 1)에 대해 10⁴의 예측된 F 값을 제공하는 도 3A에서 나타난 데이터로부터 결정되었다.

표 1. 조정된 프라이머 농도 조건에서의 다중 PCRs 1,2,3,4,5, 및 6에 대한 증폭 인자 lgF의 대수.

^a 다중 PCRs 1,2,3,4,5, 및 6은 각 주기마다 95℃에서 30초 동안의 주형 변형 단계와 55℃에서 40초 동안의 결합 단계 및, 72℃에서 60초 동안의 프라이머 증폭 단계를 사용하고 유전자 DNA G2 또는 G6 50ng가 있는 50μM에서 20번 수행했다.

^b 도 2로부터 PCRs 1,2,3,4,5, 및 6의 각각에 대한 c_adj를 측정하여 예상되는 lgF 값 4를 제공하였다.

^c PCR 1,3,4,5, 및 PCR 2, 6 각각에 대한 lgF_adj와 lgF_{0 .025}는 유전자 DNAs G2와 G6 각각으로 수행한 정량적 인베이더 검정 및 6-중 PCR의 FAM 시그널을 사용하여 결정되었다. 그 표준 오차는 각각에 대해 3번의 상응하는 인베이더 검정에 의해 분석된 세 번의 PCR 반응으로부터 결정되었다.

6-중 PCR 1-6은 각 PCRs에 대해 조정된 c_adj 농도 또는 0.025μM의 고정된 c_0.025에서, 표적으로는 DNAs G2 또는 G6를 사용하고 도 3에서와 동일한 조건 하에서 수행되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, c_adj 조건 하에서는, 모든 6개의 표적은 가장 빠른 것(PCR 3)과 가장 늦은 것(PCR 1) 사이에서 4.15± 0.17의 평균 lgF 값과 2.75배의 차이를 가지고서 대략 10⁴배로 증폭되었다. c_{0 .025} 조건 하에서, 다중 PCR에서 증폭된 총 산물의 양은, 3.89±0.91의 평균 lgF를 가지는 c_adj인 PCR과 유사했지만, 기술한 것처럼 가장 빠른 PCRs와 가장 늦은 PCRs(3 그리고 1, 각각) 사이의 F에는 26.3배 차이라는 현격한 증폭 편차가 있었다. PCR 1-6는 또한 6-중 방식과 동일한 조건 하에 단독 형태(uniplex format)로 c_adj 또는 c_{0 .025}에서 수행되었으며, 표1에서 보여지는 상응하는 F 값에 매우 유사한 F값을 나타내었다. 이러한 결과는 6-중 방식에서 각각의 PCR 사이에는 심각한 간섭이 없다는 것을 제시한다.

c를 조정함으로써 PCR의 균형을 맞추는 것은 증폭 편차를 최소화하기 위한 강력한 방법이다; 그러나 그것은 각 PCRs에서 c에 대한 F의 알려진 의존성을 또는 프라이머 농도의 반복적 적정화를 사용한다. 다른 접근법은 고정된 c값을 사용하지만 편차를 최소화하는 조건하에서의 PCR을 수행하는 것이다. 실험 데이터(그림 3)와 이론적인 분석(Eq.3) 모두 z는 ct_a 값이 증가함에 따라 점근성으로(asymtotically) 2에 가까워야한다는 것을 제안한다. 그래서, 다중 PCRs은 0.1μM의 고정된 c, 도 3에 나타난 조건 하에서의 최대 농도, 즉 0.2μM 및 44초 대신 90초의 프라이머 결합 단계로 수행되었다. 6-중 PCR 1-6은 표적으로 DNAs G1,G2,G6,또는 G8을 사용하여 5.1이라는 이론적으로 최대의 lgF 값을 제공하기 위해 17번 주기를 수행했다.

인베이더 검정 1-6에 의한 F의 정량 분석은 FAM 및 RED 시그널 모두(유전자 DNA의 유전자형에 대해서는 표 S3을 보라)를 사용하여 수행되었고, lgF 값은 표2에 나타나 있다.

표 2. 고정된 프라이머 농도 조건에서의 다중 PCRs 1,2,3,4,5, 및 6에 대한 증폭 인자 lgF의 대수.

^a 다중 PCRs 1,2,3,4,5, 및 6은 각 주기마다 95℃에서 30초 동안의 주형 변형 단계와 55℃에서 90초 동안의 프라이머 결합 단계 및 72℃에서 150초 동안의 프라이머 증폭 단계를 사용하고 유전자 DNA G1,G2,G6 또는 G8이 50ng가 있고, c는 0.1 또는 0.2μM인 50μM에서 17번 수행했다. 표준 편차는 세번의 PCR 반응으로부 터 결정되었는데 각 분석은 역시 3번의 인베이더 검정과 상응함으로써 결정되었다.

^b 인베이더 어세이의 형광 염료를 리포팅한다.

FAM과 REM 시그널로 얻은 평균 lgF 값의 차이는, 0.1 그리고 0.2μM PCR 조건에서의 각 t-test p값이 0.88과 0.77로, 통계적으로 상당하지는 않는데, 그것은 F의 분석이 인베이더 어세이 타입에 의존한다는 것을 제시한다. 0.2μM인 c에서의 PCRs 1-6에 대한 평균 lgF 값은 각각 4.55±0.10, 5.03±0.10, 4.96±0.10, 4.80±0.10, 5.42±0.10, 및 5.15±0.10로서, 즉 5.1이라는 기대값에 상당히 근사하다. 비록 인베이더 검정 5가 다른 검정과 비교해서 유전자 DNA 시료를 상대적으로 낮게 수행하였고, 그것이 인위적으로 더 높은 비율의 PCR 산물과 유전자 DNA 농도, 그리고 과대 평가된 lgF 값이라는 결과가 나왔다고 설명했지만, 왜 PCR 5 에서 lgF 값이 5.42로 기대치보다 통계적으로 더 높은 것인지는 명확하지 않다.

PCR 1,2,4 및 6에 대한 0.2 와 0.1μM인 c에서 얻은 평균 lgF 값의 차이는 각각 0.32, 0.13, 0.18 및 0.17이다. 그 차이는 0.0001, 0.04, 0.01 그리고 0.02 보다 적은 t-test p 값과 상응하는 것으로 상당하다. 가장 빠른 PCRs(3과 5)에 있어서 0.2와 0.1μM에서의 평균 lgF 값의 차이는 각각 0.07 및 0.08이었고, t-test p 값은 0.37과 0.47로 통계적인 차이가 없다고 추정된다. 이러한 분석은 ct_a 항의 증가는 보다 늦은 PCRs의 수행을 향상시키며, 다중 반응에서의 빠른 PCRs의 수행에는 영향을 주지 않아서 증폭 안정상태에 명백하게 접근한다는 것을 설명한다.

이 실시예의 다음 부분은 192-중 PCR의 개발인데, 그것은 인베이더 검정으로 SNP 유전자타이핑을 하기 위해 달성된(Ohnishi, et al., J Hum Genet, 46, 471-7, 2001), 100의 다중 인자를 본절적으로 두 배로 하는 것이다. 염색체 5,11,14,15,16,17 및 19를 나타내는 192 SNPs가 무작위로 선정되었고 각 SNPs에 대한 인베이더 검정이 고안되었다. 선택하는 과정 동안, 반복 구역에서 SNPs에 대한 선별은 수행되지 않았다. 따라서 몇몇 192 SNPs는 다중 유전자 자리에서 증폭되는 것 같았다. 균형잡힌 증폭을 위해 개발된 PCR 조건은 단순성 및 짧은 확장 시간으로 인해 고정된 프라이머 농도로 사용되었다. 유전자 DNA 샘플 G1-G8은 0.2μM의 고정된 c, 1.5분의 프라이머 결합 시간 및 2.5분의 프라이머 연장으로, 192-중 PCR로 17 주기로 증폭되었고, 그리고나서 "재료와 방법(Materials and Methods)"에서 기술한 것처럼 192 biplex 인베이더 검정으로 분석했다. RED와 FAM 순수 시그널은 샘플 시그널로부터 표적 조절 시그널 없는 것을 제외시켜서 얻었다. 순수 시그널로부터 유전자형을 구별하는 하나의 방법은 "재료와 방법(Materials and Methods)"에서 기술한 것처럼 각각의 어세이 동안에 보편적으로 기준이라고 부르는 것을 사용한다. 이러한 기준은 대립 유전자 중 하나로부터의 유일한 시그널을 가지는 동형 시료로 다른 것으로부터 교차-반응 시그널이 거의 없는 것, 그리고 두개의 대립 유전자에 대한 대략 같은 시그널을 나타내는 이형 시료라고 가정된다. 그러한 엄격한 기준은 종종 다른 기능적인 인베이더 어세이에서 다의성을 이끌 수 있는 것으로 불린다.

선택적으로, 각 인베이더 어세이에 대한 흩어진 점으로서 모든 8개의 DNA 샘플에 대한 FAM 과 RED 순수 시그널을 좌표에 따라 점을 그리는 것에 의해, 그리고 동형과 이형에 상응하는 집단을 외관상으로 구별하는 것으로 유전자형이 만들어진다. 만약 너무 적은 점들이 포함된다면 흩어진 점 분석은 수행할 수 없다; 이런 분석은 또한 주관적인 요소를 포함하는데, 이는 이러한 유형의 시각적 분석은 분석자의 판단에 의존하기 때문이다. 이런 작업에서, 8개의 시료는 192 인베이더 검정 대부분에 대한 시각적 판단을 하기에 충분하다고 판단되었다. 성공적인, 그리고 실패적인 분산된 점 분석 모두의 예가 도 4에 나타나 있다. 도 4는 8개의 유전자 DNA 샘플에 대한 순수 FAM 과 RED 인베이더 어세이 시그널에 대한 분산된 점을 보여준다. 196-중 PCR로 증폭된 DNA 샘플 G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7 및 G8에 대한 인베이더 어세이 순수 FAM 과 RED 시그널을 점을 찍어 나타냈다. A-C는, 어세이 7, 9 및 25인 성공적인 유전자형은 정의되는 군집을 구별하기 위해 정해진 모든 시료가 동형 FAM(○), 동형 RED(□) 또는 이형(x)으로 구별되었다. D-F는, 실패한 유전자형이다. 어세이 6(D)에서, 좌표의 기원에 가장 가까운 시료는 다른 어떤 군집에도 할당될 수 없다; 어세이 47(E)에서는, 시료는 3개의 구별되는 클러스터를 형성하지만 어떤 샘플에도 FAM 시그널은 없다; 어세이 54(F)에서는, 시료가 높은 FAM 시그널 교차-반응을 가지는 동형 RED와 비대칭 RED/FAM 비율을 가지는 이형과 서로 구별될 수 없다. RFU-상대 형광 단위.

시각 분석을 위해, 만약 하나의 시료가 특정 군집에 할당될 수 없다면 모든 샘플을 제외하는 엄격한 기준을 사용하였다. 또한 양쪽 채널 모두에서의 강한 시그널을 가지는 세트는, 인베이더 검정의 높은 교차-반응, 또는 가장 추정되는 바와 같이, PCR에 의한 다중 동형 유전자좌를 증폭하는 것으로 추정되므로, 정확한 유전 자형을 제공할 수 있는 것으로 고려되지 않았다. 이러한 기준을 사용하여, 161 또는 192 어세이의 84%에 대한 콜(calls)이 만들어졌다. 콜(calls)은 "재료와 방법"에서 기술된 유전자형 소프트웨어를 사용하여 만들어진 콜은 이들 call의 82.5%와 일치하였다.

31의 실패한 인베이더 검정은 그 실패가 낮은 PCR 증폭 요인 때문인지, 낮은 인베이더 검정 수행 때문인지, 또는 PCR에 의한 높은 동형 서열 때문인지 아닌지를 결정하기 위해 조사되었다. PCR 표적 서열은 하나 이상의 유전자 자리가 증폭된 독립적인 PCRs인지 아닌지를 결정하기 위해 BLAT를 사용하여 분석되었다. 31 어세이의 8은 보기에는 실패했는데, 이는 그것들 각각에 대해, 다양한 유전자 자리가 PCR에 의해 증폭되기 쉽고, 유전자 자리 각각이 인베이더 어세이에 의해 검출될 수 있기 때문이다. 남은 23 어세이는 아래의 하나 또는 복합적인 이유에 의해 실패한 것으로 추정된다: 좋지 않은 PCR 증폭, 올리고뉴클레오타이드 고안과 제조에 있어서의 결함, 또는 인식되지 못한 반복되는 서열은 2003년 4월의 인간 게놈 조합에 포함되지 않았다. 유전자에서의 반복 서열 때문에 실패한 8 검정을 제외시킨, 인베이더 어세이 유전자형으로 192-중 PCR의 효율은 161/184 또는 87.5%로 측정되었다.

192-중 PCR에서의 증폭 경향을 측정하기 위해, 도 5에서 보여지는 PCR 표적 길이에 대한 8개 DNA 시료에서 수행된 성공적인 161 인베이더 검정을 위해 단위 대립 유전자당 표준화된 RED 순수 형광 시그널을 좌표에 나타냈다. 도 5는 성공적인 161 인베이더 검정을 위해 단위 대립 유전자당 표준화된 순수 RED 형광 시그널을 PCR 표적 길이의 기능으로서 나타낸다. 인베이더 반응은 각각 196-중 PCR로 증폭된 8개 DNA 시료로 60분 동안 수행되었다. 그 선은 PCR 표적 길이의 기능으로서의 순수 시그널의 선형 회귀를 나타낸다.

PCR 증폭과 인베이더 검정 수행에 있어서의 변이를 포함하는 순수 시그널에서의 상당한 변이가 있다. FAM 순수 시그널에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다. 700bp 보다 긴 PCR 표적이 성공적인 유전자형을 가능하게 하는 낮은 가능성을 가질 수 있음을 제시하는 순수 시그널과 표적 길이 사이의 약한 상관 관계가 있다.

놀랍게도, 순수 시그널에서의 고도의 다양성에도 불구하고, 유전자형은 시그널 분배에 있어서 높고 낮은 끝단 각각에서 모두 성공적으로 수행되었다. 인베이더 검정 유전자형에서 관찰된 확고함을 조사해보기 위해, 동일한 192 인베이더 반응에 대한 순수 시그널을 15, 30, 및 60분 후에 측정했다. 인베이더 검정에서의 시그널 증폭은 시간에 대한 2차 방정식(1)이기 때문에, 30분 그리고 60분 시간 지점은 4배 또는 16배로 보다 높은 표적 레벨로 각각 수행된 15분 반응과 동등할 수 있고, 따라서 낮은, 중간의, 그리고 높은 레벨의 PCR 증폭을 모델링할 것이다. 하나의 예로서, 15, 30, 그리고 60분 시간 지점에서 얻은 인베이더 어세이 110에 대한 흩어진 점들이 도 6에 나타나 있다. 도 6은 8개 DNA 시료에 대한 순수한 FAM와 RED 시그널의 흩어진 점을 보여준다. 인베이더 검정 110은 196-중 PCR로 증폭된 DNA 시료로 수행했고, 시그널은 15분(A), 30분(B) 그리고 60분(C) 뒤에 측정했다. 그 시료는 흩어진 점을 분석하여 동형 FAM(○), 동형 RED(□), 또는 이형 (x)으로 구분된다. RFU- 상대적인 형광 단위.

흩어진 점은 군집 분석에 의한 인베이더 유전자형이 강한 순수 시그널에 의해 영향 을 받지 않고 심지어 FAM 과 RED 순수 시그널이 포화상태에 다다르는 60분 반응에 대해서도 설명될 수 있음을 나타낸다. 이러한 효과의 결과로서, 더 많은 시그널이 느린 PCRs에서 만들어지기 때문에 유전자 동정을 향상시키면서 더 긴 인베이더 반응으로 더 많은 콜(calls)이 만들어질 수 있지만, 동시에 빠른 PCRs에서 보다 높은 시그널은 시료를 군집화하는데 영향을 주지 않는다.

실시예 8 : 단일 반응관에서의 PCR 증폭 및 인베이더 검정( INVADER assay ) 분석

본 실시예는 인베이더 검정(INVADER assay) 이후에 소량의 표적을 증폭하기 위한 PCR 사용 방법이 단일 반응관(single reaction vessel)임을 기술하고 있다. 특히, 본 실시예는 단일 반응 셋업(set up) 후에 조작 또는 시약 첨가의 필요없이 상기 두 반응을 실행하는 것을 기술하고 있다. 달리 정의되지 않는 한, 다음의 실시예는 검정가 DLEU 유전자(염색체 13) 및 α-액틴 유전자(염색체 1)에서 서열을 검출하기 위한 표시된 시약으로 실행되었다.

10 mM MOPS 완충액, ph 7.5

7.5 mM MgC1₂

dNTPs, 각 25 μM

게놈 DNA 10 ng

PCR 프라이머 각 200 nM

일차(primary) 프로브 0.5 μM

인베이더 올리고 0.05 μM

FRET 프로브 0.05 μM

CLEAVASE 효소 (VIII 또는 X) 100 ng

Stoffel 또는 천연 Taq DNA 폴리머라제 1 μ

DLEU 위한 PCR 프라이머:

전방 프라이머 1716-14-1 (SEQ ID NO: 1):

5'- CCCGACATTTTTACGCATGCGCAAACTCCAACC-3', Tm=73.8℃

후방 프라이머 1716-14- 2 (SEQ ID NO: 2):

5'- TACACGCACGCGCAAGAAGCAAGAGGACT-3', Tm= 74.1℃

α-액틴을 위한 PCR 프라이머:

전방 프라이머 1716-14-3 (SEQ ID NO: 3):

5'- CTGGGTTTCCAACAGGCGAAAAGGCCCT- 3', Tm= 73.4℃

후방 프라이머 1716-14-4 (SEQ ID NO: 4):

5'- GCGTGAGGGTGGAAGGAGATGCCCATGG-3', Tm= 74.7℃

프로브, 인베이더 올리고, FRET 카셋트(밑줄 친 염기는 플랩 서열(flap sequences) 을 나타낸다; 굵은 염기는 인베이더 검정(INVADER assay)에서 위치 1을 나타낸다)

α-액틴 프로브 1734-57 ACGGACGCGGAG AGGAACCCTGTGACAT-hex (SEQ ID NO: 5)

α-액틴 인베이더 올리고 1734-57 CCATCCAGGGAAGAGTGGCCTGTTT (SEQ ID NO: 6)

DLEU 프로브 CGCGCCGAGG TTCTGCGCATGTGC-hex (SEQ ID NO: 7)

DLEU EVADER 올리고 AGGGAGAGCCGTGCACCACGATGAC (SEQ ID NO: 8)

DLEU FAM FRET 23-428 Fam-TCT-Z28-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG hex (SEQ ID NO: 9)

α-액틴 RED FRET Red-TCT-Z28-TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACTCCGCGTCCGT-hex (SEQ ID NO: 10).

A. 조합된 PCR-INVADER 반응의 형상

어떤 경우에는, PCR과 INVADER 반응을 시간적으로 분리하는 것, 예로, INVADER 반응이 바람직하지 않은 조건하에서 PCR 반응을 실시하고 그 후 INVADER 반응이 진행될 수 있는 반응 조건으로 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 반응 조건을 만드는 하나의 수단은 반응에 사용되는 효소에 대한 항체, 예를 들어 Light Cycler TaqBlock antibody(Roche Applied Sciences) 등의 사용을 통해서이다. 다른 하나의 수단은 온도를 통해서이다. 본 실시예에서, PCR 프라이머는 70℃ 이상의 온도에서 어닐링하도록 디자인되었고, 반면에 INVADER ASSAY에서 사용하기 위한 프로브 올리고뉴클레오타이드는 약 63℃ 온도에서 어닐링하도록 디자인되었다. 그 결과 그 프로브는 PCT 주기의 어닐링, 신장, 변성기 중에 표적 분자와 반응할 수 없었 다. 또한, Taq DNA 폴리머라제의 스토펠(stoffel) 단편 및 천연 Taq DNA 폴리머라제 모두 증가된 온도(이 경우에는 99℃에서 10분간)에서 연장된 노출에 의해 불활성될 수 있는 반면에, CLEAVASE 효소는 상기 처리 다음에도 활성을 유지하도록 결정되었다. 특히, CLEAVASE Ⅷ는 상기 가열에 거의 안정한 것으로 보이며, 그 이후의 실험에 사용되었다.

상기에 기술된 성분들을 사용하여 전체 부피가 10㎕ 되도록 모든 시약들이 결합되어 반응이 실시되었고 광유로 오버레이 되었다. PCR은 11 내지 20 주기(95℃에서 30초; 72℃에서 30초 내지 2분)로 진행되었다. 이들 주기 반응 후에, Taq DNA 폴리머라제를 불활성하도록 혼합물들이 99℃에서 10분 동안 가열되었다. 그 후 반응 혼합물들이 63℃에서 30분 내지 3시간 동안 항온처리하였고, 그 후 INVADER 반응을 진행하였다.

B. INVADER assay 신호 생성 억제 평가

초기 결과들은 INVADER assay의 신호 생성을 제한하는 억제가 나타났음을 나타내었다. 다음의 실험들이 이 억제에 대한 다양한 반응 성분들의 가능한 공헌을 평가하기 위하여 실시되었다.

부분적인 반응들이 다양한 반응 성분들의 효과를 조사하기 위하여 조합되었다. 특히, 다양한 INVADER 반응 성분들은 초기 반응 구성(set up)에서 생략되었고, DNA 폴리머라제의 열적 불활성화 후의 반응에 첨가되었다. 다음의 표에서, "+"는 어떤 성분이 초기 반응 구성에 포함되었던 것을 나타내고; "-"는 어떤 성분이 INVADER 반응이 진행되도록 허용되는 Taq DNA 폴리머라제의 열적 변성 후에 첨가되었다는 것을 나타낸다.

FRET 혼합물들이 PCR 반응 중에 포함된 컬럼 2 및 5의 결과와 FRET 프로브가 PCR 반응이 정지되었던 후에까지 첨가되지 않는 컬럼 1, 3 내지 4 및 6의 결과 비교는 INVADER assay에서 생산된 신호가 PPI-FRET 혼합물의 존재에 의해 억제되었다는 것을 제시한다. PPI-FRET 혼합물의 각 성분이 PCR 반응 중에 생략되었던 다음의 실험(하기 참조)은 FRET 프로브가 억제되었음을 확인시킨다.

상기 표에서 세개의 오른쪽-대부분 컬럼들의 조사는 FRET 프로브가 생략되어 있는 컬럼과 비례하여 FRET 프로브 중의 어느 하나 또는 모두가 반응의 개시로부터 존재하였던("+") 반응을 위해 INVADER assay 신호 생성이 감소되었다는 것을 나타낸다.

Taq 폴리머라제의 양이 증가된 추가적인 실험은 Stoffel DNA 폴리머라제에서의 2배 증가가 INVADER assay에서 증가된 신호 생성을 초래하였음을 증명하였다. 이들 실험들에 기초하여, PCR 반응 중의 확장 시간을 증가시키는 것 뿐만 아니라 Taq DNA 폴리머라제 농도를 최적화하는 것은 이 억제의 영향을 감소시킨 것으로 증명되었다.

C. 조합된 PCR 및 INVADER assay 반응 조건의 최적화

조합된 검정에서 다양한 반응 성분의 양 및 다양한 단계의 시간을 최적화하기 위해 실험이 실시되었다. MgCl₂의 농도는 1,7mM 부터 7.5mM의 범위로 다양화하였다. dNTP 농도는 25 내지 75mM의 범위로 테스트되었다. 프라이머 농도는 0.2μM 내지 0.4μM로 다양화하였다. 천연 Taq 폴리머라제를 사용하여 획득된 실험 데이터는 아래 나타나 있다. FAM 신호 생성은 DLEU INVADER 올리고의 존재에 의존하고, INVADER 반응들 모두 61℃에서 30분간 INVADER 반응 후에 천연 Taq DNA 폴리머라제를 변성하기 위해 99℃에서 10분 후 PCR의 17 주기 다음에 INVADER 반응들 모두 신호를 생성한다는 것을 나타낸다.

D. 조합된 PCR-INVADER assay의 투여량 반응

조합된 PCR-INVADER assay에서 신호 생성을 모니터링하기 위해 게놈 DNA 표적 농도가 시작되는 범위 이상에서 실험이 실시되었다. 반응들은 다음과 같이 준비되었다.

INVADER 반응들 120분 동안 진행되도록 허용되었고, 결과들이 60분 또는 120분 후에 판독되었다. 120분 부터 판독된 결과들이 도 7에 나타나있다. 이들 결과들은 조합된 PCR-INVADER 반응이 DNA 농도 범위 이상에서 선형적이며 인간 게놈 DNA의 1.5ng의 작은 양이 검출될 정도로 충분히 민감하다는 것을 나타낸다.

E. 이중(biplex) INVADER assay 검출과 결합된 다중(multiplex) PCR

INVADER assay와 결합된 다중 PCR 반응을 분석하기 위해 추가적인 실험이 실시되었다. 20중(plex) PCR 반응이 하기와 같이 설치되었다. PCR CF 혼합물은 1μM의 농도로 하기 표에 있는 각 프라이머를 포함했다. 게놈 DNA 시료은 하기 표에 나타난 바와 같이 코리엘(Coriel)로부터 얻었다.

코리엘(Coriel) 시료은 다음과 같이(예, "C"n) 번호를 매겼다.

PCR 프라이머는 다음으로부터 선택되었다.

PCR 반응은 상기에 기술된 바대로 14 주기동안 7.5℃에서 2.5분 확장 및 95℃에서 45초 변성을 실행하였다. 혼합물들은 10분 동안 99℃에서 가열되었고, 그 후 1시간 동안 63℃에서 냉각되었다. 결과들을 도 9에 나타내었다. 그 delF508 시료은 Coriel#3이고; G85E/621+1G>T는 Coriel 21이고; 1717-1G>A는 Coriel 28이고; delF508/R117H는 Coriel 30이고; delF508/3849+10kb는 Coriel 5이고; A455E/delF508은 Coriel 8이고; R506T/delF508은 Coriel 9이다. 이들 결과들은 조합된 PCR과 INVADER assay가 다중 PCR 반응으로 실행될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 9 : 사중( tetraplex ) INVADER assay : 4-염색 시스템(4- dye system )

분석 작업처리량을 증가시키는 다른 하나의 수단은 단일 반응 또는 반응 관에서 실행되고 분석될 수 있는 INVADER 반응의 수를 증가시키는 것이다. 본 실시예는 올리고뉴클레오타이드의 4 세트가 하나의 단일 반응에 포함된 4-중(plex) INVADER assay의 실행을 기술하고 있다. 이 경우에, 그 반응은 또한 4개의 다른 표적 서열(야생형 및 두개의 다른 SNPs의 변이체 변형)을 포함했다. 네 개의 다른 좌위(loci), 세 개의 다른 좌위 및 하나의 내부 조절을 포함하면서 선택적인 배열들이 또한 숙고되었다.

다중 FRET 분석을 위한 INVADER assay를 배열하는 하나의 변수가 FRET 프로브 상의 포함물에 대한 염색제의 선택과 관련된다. 염색 및 소광제의 다양한 조합은 당해 분야에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,925,517호, 제5,691,146호 및 제6,103,476호 등 참조; 참조 문헌에 관련된 각각이 기재됨). 하나의 실시에서, CLEAVASE 효소의 절단 활성과 최소한의 간섭을 나타내는 염색-소광제 조합이 바람직하다. 그러한 염색-소광제 조합은 INVADER assay와 함께 사용될 때 더욱 최적의 전환(turnover)율을 지지할 수 있다.

염색제의 선택에 영향을 끼치는 다른 하나의 고려는 그들의 분광 특징과 관련된다. 하나의 실시에서, 예를 들어 형광 판독기에서 검출된 검정를 위해, 각 염색으로부터의 형광 신호가 그 기구에 의한 서로 다른 것으로부터 분광적으로 용해성이 있는 것이 바람직하다. 만일 분광적으로 충분하게 다르지 않다면, 하나의 염색제로부터 의 형광 방출은 다른 염색에 기여하는 신호와 간섭 또는 방해될 수 있다. 이러한 "교차 대화(cross talk)"는 감소된 검정 민감성 또는 증가된 에러율을 초래할 수 있다. 어떤 기구가 다양한 채널(예로, 광학적 필터링 및/또는 수집된 신호의 소프트웨어 조작의 사용을 통해)에서 검출된 신호의 검출을 분석할 능력을 실질적으로 가지고 있으며, 따라서 염색의 다양한 조합의 선택이 다중화된 반응을 검출하는데 사용되는 기구와 관련된다.

형광 판독기 스캔으로부터 주어진 염색의 형광 방출은 다음과 같이 염색의 농도에 비례한다.

α는 여기 및 방출 파장, 및 판독기의 증폭 셋팅을 다양화하는 상수이고, b는 백그라운드(background)이다. 만일 다양한 염색이 존재한다면, 각 염색은 다음과 같이 전체 형광에 기여한다.

또는

다양한 스캔이 만들어질 때, 각 스캔으로부터의 형광은 다음과 같이 기록될 수 있다.

숫자로 나타낸 아래에 기입한 문자들은 형광 기록(reading), 염색 계수 및 각 스캔에 대한 백그라운드 성분을 나타낸다. 일련의 방정식은 다음과 같이 행렬 형태로 쓰여질 수 있다.

또는

1차 행렬 F 요소는 형광 기록(reading)에서 공제된 백그라운드이며, A는 이차 계수 행렬이며, d는 1차 행렬로서 INVADER assay에서 방출된 각 자유 염색(free dye) 양이다. F 및 A 행렬의 요소는 각 다른 스캔에 대한 순수한 염색 및 블랭크를 사용한 어떤 종류의 눈금으로 제공됨으로써 결정될 수 있다. 따라서, d에 대한 해법이 A의 역수를 등식 (4)의 양 변에 곱하는 것에 의해 구할 수 있다.

그러한 행렬은 다음과 같이 4-중(plex) 염색으로 유도되었다. 염색-T10 올리고뉴클레오타이드, 예로, 5' 말단의 염색을 가지는 10dT 잔기를 포함하는 올리고는 "자유 염색(free dye)"의 방출 특징을 결정하는데 사용되었다. 이들 dT10의 다른 비율이 시간이 흐르면서 INVADER assay로부터 신호 생성을 모방하는 관련된 염색 및 적절한 소광제를 포함하는 FRET 프로브와 조합되었다. 전체 시료 양은 15㎕이고, 각 시료은 15㎕ 중유로 오버레이되었다. 테스트된 비율은 0% dT10/100% FRET 프로브; 25% dT10/75% FRET 프로브; 50% dT10/50% FRET 프로브; 75% dT10/25% FRET 프로브; 및 100% dT10/0% FRET 프로브이다. 테스트된 염색은 플루오레세인(fluorescein, FAM), Cal-Gold 및 Cal-Orange(Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA), 및 REDMOND RED(Synthetic Genetics)이다. 튜브들은 각 염색에 적합한 여기 및 방출 파장에서 Tecan Safire XFLUOR 4에서 판독되었다. 각 경우에, 각 염색으로부터 관찰된 형광은 dT10 올리고의 증가 비율이 선형적으로 증가되었고, 신호들이 부가되었다. 선형 회귀에서의 기울기는 다음과 같이 계수 행렬(coefficient matrix)로 삽입되어졌다.

관련된 행렬은 상기에 기술한대로 A^-1을 얻기 위해 각 값의 역수를 취하는 것에 의해 얻어졌고, 각 경우에서 자유 염색(free dye)의 퍼센트, d가 유도된다.

INVADER assays는 다음과 같이 실시되어졌다. 표준 반응이 CLEAVASE Ⅷ 효소 및 5pM (최종) 합성 표적과 함께 상기에서 기술한대로 최종 부피 15㎕로 제공되었다. 네 개의 다른 합성 표적이 본 실시예에서 사용되었다 : 야생형 및 SNPs 1과 2의 돌연변이체. 사용된 FRET 프로브는 다음과 같다.

검정은 63℃에서 항온처리되었고 형광은 20분 후에 나타난 파장에서 판독되었다. 이들 조합된 반응에 대한 결과들이 표적 분자의 다양한 조합의 검출을 나타내면서 도 10에 나타나 있다.

실시예 10

표적 검출을 위한 인베이더 검정 시약으로 미리- 로딩된 미세유체 카드

이하의 실시예는 관심있는(interrogation) DNA 시료를 위한 인베이더 검정 시약을 함유하는 미세유체 카드의 사용에 대해 기술하였다. 본 실시예에서 표적 물질은 PCR로 별도로 제조하였다. 3M 미세유체 카드는 8개의 로딩 포트(port)를 가지는데, 이들 각각은 카드를 원심분리함에 따라 48 개의 각 반응 챔버로 액체 시 약을 공급하도록 형성되어 있다. 상기 반응 챔버는 하나 또는 그 이상의 특정 대립유전자(예를 들어 아래 실시예 11에서 보이는 바와 같은)의 검출을 위해 미리 분배되어 건조된 인베이더 검정 반응 성분들을 포함한다.

다중 PCR 반응 혼합물을 하기 성분들을 사용하여 제조하였다 (나타낸 농도는 PCR 반응에서 그들의 최종 농도에 있을 때의 값이다): 유전자 DNA 2 ng/μL, 다중 PCR 프라이머 혼합물 0.2 μM, PCR 완충액 및 MgCl₂ 1X, dNTPs 0.2 mM, 및 천연 Taq 폴리머라제 0.2 U/rxn. 최종 부피는 20μL 였다. 이들 혼합물을 95℃에서 2.5 분 동안 가열한 후 95℃에서 30초 단계, 55℃에서 1.5 분 단계 및 72℃에서 2.5 분 단계를 20 회 순환시켰다. 최종적으로, 시료를 99℃에서 10 분간 배양하여 폴리머라제 활성을 없앴다.

PCR 후, 앰플리콘(amplicon)을 1:125의 dH₂O로 희석한 후, 이 시료 50μL를28mM MgCl₂ 와 4ng/μL의 농도로 CLEAVASE X 효소를 포함하는 용액 50 μL와 혼합하였다. 그 후 이 혼합물을, 전술한 실시예에서 기술한 3M CF 미세유체 카드의 8개의 개별 포트들 중 하나에 첨가하였다. 인베이더 검정을 63℃에서 20 분간 수행한 후 마이크로플레이트 형광계 상에서 검정물로부터의 형광을 측정하였다. 결과를 도 11A-11G에 나타내었다. 유전자 시료 DNA의 유전형은 각 패널의 상부에 나타내고, 시험된 돌연변이 각각은 X-축을 따라 나타내었다.

실시예 11

3M CF 미세유체 카드 상에서의 인베이더 및 PCR

하기 실시예는 관심있는 DNA 시료에 대한 인베이더 검정 시약을 함유하는 미세유체 카드의 사용에 대해 기술하였다. 이 실시예에서, 표적 물질은 단일 반응으로 증폭되고 검출되었다. 반응은 상술한 바와 같이 3M 미세유체 카드 상에서 수행되었다.

미세유체 카드의 반응 챔버는 상기 카드 상의 48 개의 상이한 인베이더 검정을 실행하여 건조시키기 위한 인베이더 검정 반응 성분들(즉, 인베이더 올리고뉴클레오티드, 프라이머성 프로브, 및 FRET 카세트들)을 포함한다. 그러한 카드를 제조하기 위하여, 2 μL의 1X PRIFF-MOPS 혼합물(10 mM MOPS 완충액 내 0.25μM의 각 프라이머성 프로브 올리고뉴클레오티드, 0.125 μM의 각 FRET 올리고뉴클레오티드, 0.025μM의 인베이더 올리고뉴클레오티드)을 상기 미세유체 카드의 웰들 내로 분배한다. 그 후 카드를 HEPA 필터를 통과한 공기가 통하는 에어 박스 내에서 건조시킨다. 공기의 온도 또는 상대 습도를 조절할 필요는 거의 없다. 조립된 미세유체 카드 내 각 반응 챔버의 용적은 약 1.7μL이며, 따라서 반응 동안 이들 성분들의 최종 농도는 1X PRIFF-MOPS 혼합물에서의 그것들의 약 1.18 배가 된다.

이들 인베이더 검정 올리고뉴클레오티드 세트에 의해 검출되는 대립유전자 변이체들은 다음과 같다:

인베이더 검정에 필요한 CLEAVASE VIII 효소와 함께, 인베이더 검정의 표적을 다중 PCR로 증폭하기 위해 필요한 모든 물질을 함유하는 마스터 혼합물을 제조하여 8개 풀로 분주하였다. 이들 8개 풀 중 7 개에는 동일한 유전자 DNA 시료를 넣고, 나머지 하나의 시료는 주형을 함유하지 않는 대조군으로 사용하였다. 이들 8 개 혼합물 각각의 100 μL 씩을 카드 상의 각 로딩 포트에 첨가하고, 카드 내 웰을 원심분리 하였다. 이들 혼합물 내 성분의 최종 농도는 다음과 같다: 7.5 mM의 MgCl₂, 6.67 ng/μL의 Cleavase VIII, 0.33 U/μL 의 천연 Taq-pol, 25μM의 dNTP 혼합물, 0.2 μM 다중 PCR 프라이머들.

합해진 PCR 및 인베이더 검정 반응물을 다음과 같이 배양하였다: 95℃에서 15초 및 72℃에서 2분 15초를 15회 순환시켰고, 그 후 99℃에서 10 분간 단회 반응시켜 천연 Taq-pol 활성을 없앤 후, 인베이더 검정 반응을 위해 60℃에서 1 시간 반응시켰다.

인베이더 검정물로부터의 형광 신호를 형광 마이크로플레이터 판독기 상에서 검출하였으며, 결과를 도 12A-12G에 나타내었다(표적 물질을 함유하지 않는 시료는 제외하였다). 각 유전자 시료 DNA의 유전형을 각 패널의 상부에 나타내었으며, 시험된 돌연변이 각각은 X-축 상에 나타내었다.

실시예 12

정제되지 않은 전체 혈액 시료 내에서의 직접 검출

본 실시예는 정제되지 않은 전체 혈액 시료 내 표적 서열을 직접 검출하는 것에 대해 기술한다. 특히, 본 실시예는 전술한 실시예에서와 유사하게, 유전자 DNA를 검출하기 위하여 단일 반응 용기 내에서의 PCR 중합 및 인베이더 검정 검출의 결합을 기술한다. 본 실시예는 그러나, 결합된 PCR-인베이더 분석의 단일 반응 용기 방법을 정제되지 않은 전체 혈액 시료에 적용함으로써, 전술한 실시예들에서 좀 더 연장된다.

총 부피 20μL 내에 PCR/인베이더 검정 반응 혼합물을 다음과 같이 준비하였다. 완충액으로서 약 4 μL의 쉬마쥬(Shimadzu) 로부터의 0.5 X AMPDIRECT-A 또는 약 pH9의 10 mM TAPS 생물학적 완충용액(3-[[tris(Hydroxymethyl)methyl]amino]propanesulfonic acid)을 사용하였다.

AMPDIRECT-A 대신 전체 혈액에 있어 직접적인 PCR 및 인베이더 검정을 위한 완충액으로서 TAPS pH9가 사용될 수 있을 것임을 발견한 것은 예상하지 못한 것이었다. 또한, 전체 혈액 내 PCR 및AMPDIRECT-A 완충액에 대한 부가의 상세한 설명은 미합중국특허공개 제 20020102660 및 20020142402 와, Nishmura 등의 Clin. lab., 2002, 48: 377-84 및 Nishimura 등의 Ann. Clin biochem., 2000, 37: 674-80, 등에 나와 있으며, 이들 모두는 모든 목적에 있어서 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 하기의 부가적인 시약들도 사용된다: 6.25 μM 의 dNTPs, 각 dNTP, 0.2 μM 의 각 PCR 프라이머, 0.3 단위의 Taq 폴리머라제(천연), 40 ng의 CLEAVASE VIII, 3 mM MgCl₂ (AMPDIRECT 완충액 내 -이 완충이 사용된다면- 임의의 MgCl₂에 더하여), 검출될 각 표적(예컨대, 표적 유전자 DNA 및 내부 대조군)에 대한 일차 프라이머 0.5 μM, 검출될 각 대립유전자에 대한 0.05 μM의 인베이더 올리고뉴클레오티드(SNP가 검출된다면, 다중 프라이머성 프로브로 사용되기 위하여), 또는 검출될 각 표적에 대한 인베이더 올리고뉴클레오티드 0.05 μM (예를 들어, 내부 대조군 표적에 대한 다양한 표적들을 정량화할 때 사용하기 위한 것), 0.25 μM의 각 FRET 프로브(표적 및 대조군 반응 위한 것), 및 총 반응 부피를 20 μL로 만들기 위한 증류수.

시험될 액성 전체 인간 혈액 시료는 먼저 소디움 시트레이트, 디포태슘 EDTA, 또는 소디움 헤파리네이트와 같은 항응집제로 처리된다. 약 0.4 μL(또는 그 이하)의 이 처리된 전체 인간 혈액은 그것을 교반하지 않으면서 반응 튜브의 바 닥에 로딩함으로써 PCR/인베이더 반응 혼합물에 첨가된다. 필요하다면, 광물성 오일을 그 위에 로딩할 수도 있다. 다음으로, 상기 시료 상에서 총 28 회 주기로 PCR을 수행한다. 예를 들어, PCR은 전체 인간 혈액에 대해 적절한, 하기의 온도 프로파일을 사용하여 수행될 수 있다: 80℃에서 15 분간 예열한 후 94℃에서 4.5 분 가열하고, 그 후 92℃에서 30 초, 연결온도(annealing temperature)에서 1분, 72℃에서 1 분, 및 72℃에서 7분 동안의 반응을 28 회 주기시켰다.

이 주기 반응 후에, 상기 혼합물을 99℃에서 10 분간 가열하여 Taq DNA 폴리머라제를 불활성화시켰다. 상기 반응 혼합물을 그 후 63℃에서 약 30 분 내지 약 3 시간 동안 배양하여 인베이더 검정 반응이 진행되도록 하였다. 인베이더 검정으로부터의 결과를 수집하였다(예로써, 상기 기술한 실시예들을 보라). 본 실시예의 결과는 전체 혈액 내에서의 유전자 DNA에 있어서의 표적 서열의 성공적인 PCR 증폭을 나타내었을 뿐만 아니라, 관심 있는 표적 서열의 성공적인 인베이더 검정 검출도 나타내었다. 이 전체 혈액으로부터 관심 있는 표적 핵산의 검출에 있어서의 성공은 완충액으로서 AMPDIRECT 또는 TAPS pH9 중 어떤 것을 사용하더라도 가능하다.

결합된 PCR 및 인베이더 검정으로 직접 DNA를 검출하는 것은 또한 와트만(WHATMAN) 사로부터의 것과 같은 혈액-스팟 카드를 사용하여 수행될 수도 있다. PCR-인베이더 반응 완충용액은, 상기와 유사하게, 다음과 같이 제조될 수 있다: 10 mM TAPS pH9 완충액, 3 mM의 MgCl₂, 0.2 μM의 각 PCR 프라이머, 6.25 μM의 각 dNTP, 0.5 μM의 검출될 각 표적(예컨대, 표적된 유전성 DNA 및 내부 대조군)에 대 한 일차 프로브, 검출될 각 대립유전자에 대한 인베이더 올리고뉴클레오티드(만약 SNP가 검출된다면, 다중 일차 프라이머와 함께 사용하기 위한 것) 0.05 μM 또는 검출될 각 표적에 대한 인베이더 올리고뉴클레오티드 0.05 μL (예를 들어, 내부 대조군 표적에 대한 다양한 표적들을 정량화할 때 사용하기 위한 것), 0.25 μM의 각 FRET 프로브(표적 및 대조군 반응을 위한 것), 0.06 μl의 Taq 폴리머라제 (천연, 5u/μl), 0.2 μl의 CLEAVASE VIII 200 ng/L, 및 최종 부피가 20μL 가 되도록 하는 증류수.

혈액으로 스팟된 와트만(WHATMAN) FTA 유전자 카드로부터 상기 혈액을 함유하는 하는 1 mm의 펀치를 취하고, 위와 동일한 직경을 갖는 하나의 대조군 펀치를 혈액을 포함하지 않는 카드 상의 위치로부터 취하였다. 이 종이 펀치들을 그 후 1 ml의 물 내에서 가끔씩 교반하면서 약 10 분간 세정하였다.

PCR 및 인베이더 검정을 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. 이 과정의 결과는 전체 혈액 내 유전성 물질로부터의 표적 서열의 성공적인 PCR 증폭 및 관심 있는 표적 서열의 성공적인 인베이더 검정 검출을 나타낸다.

상기 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허들은, 마치 여기에서 명확하게 기술된 것과 같이, 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 당해 분야의 기술자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 실시예에 관하 여 기술되었다 하더라도, 청구된 본 발명이 그와 같은 특정 실시예에 부당하게 한정되어서는 안될 것이다. 실제로, 관련된 분야의 기술자들에게 있어 자명한, 본 발명을 실시하기 위해 기술된 양태의 다양한 수정은 하기 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.

<110> LYAMICHEV, Victor LUKOWIAK, Andrew A JARVIS, Nancy ROEVEN, Robert HALL, Jeff G ALLAWI, Hatim T <120> Direct Nucleic Acid Detection in Bodily Fluids <130> IPA 9604-256 <140> 10-2006-7009540 <141> 2007-05-08 <160> 72 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 cccgacattt ttacgcatgc gcaaactcca acc 33 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 tacacgcacg cgcaagaagc aagaggact 29 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ctgggtttcc aacaggcgaa aaggccct 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gcgtgagggt ggaaggagat gcccatgg 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 acggacgcgg agaggaaccc tgtgacat 28 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 ccatccaggg aagagtggcc tgttt 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 cgcgccgagg ttctgcgcat gtgc 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 agggagagcc gtgcaccacg atgac 25 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> This residue is linked to a Z28 quencher. <400> 9 tctagccggt tttccggctg agacctcggc gcg 33 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> This residue is linked to a Z28 quencher. <400> 10 tcttcggcct tttggccgag agactccgcg tccgt 35 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 cgcgccgagg 10 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 atgacgtggc agac 14 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 acggacgcgg ag 12 <210> 14 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 tccgcgcgtc c 11 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 gaagcggcgc cggttaccac ca 22 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 cgcgccgagg tggttgagca attccaa 27 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 atgacgtggc agaccggttg agcaattcca 30 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 tggtcccact ttttattctt ttgcaga 27 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 aagtcaccaa agcagtacag cc 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 gctgtcaagc cgtgttctag ataaa 25 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 cggaaggcag cctatgtgag a 21 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 catgggccat gtgcttttca aac 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 catgggccat gtgcttttca aac 23 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 cttcttggta ctcctgtcct gaaaga 26 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 attatgggag aactggagcc ttca 24 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 gattacatta gaaggaagat gtgcctttca a 31 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 taaggcaaat catctacact agatgacca 29 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 taactgagac cttacaccgt ttctca 26 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 atgggaggaa taggtgaaga tgttagaa 28 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 tctgaatgcg tctactgtga tcca 24 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cctgcacaat gtgcacatgt acc 23 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 ggactatgga cacttcgtgc c 21 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 ggagaaggaa gagttggtat tatcctgac 29 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 gcatcaaact aattgtgaaa ttgtctgcc 29 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 gcatcaaact aattgtgaaa ttgtctgcc 29 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 gaaggtggaa atgccatatt agagaaca 28 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 gtacctatat gtcacagaag tgatccca 28 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 gattagaaaa atgttcacaa gggactcca 29 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 cagttgactt gtcatcttga tttctgga 28 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 cctcgacaat gtgcacatgt acc 23 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 acctattcac cagatttcgt agtcttttca 30 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 tgtaccagct cactacctaa tttatgaca 29 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 gagctgagca agacttaacc actaattac 29 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 gtgaacattc ctagtattag ctggcaac 28 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 ctccaaaaat accttccagc actacaaa 28 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 gaaattactg aagaagaggc tgtcatcac 29 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 ctccaaaaat accttccagc actacaaa 28 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 gactaaccga ttgaatatgg agccaaa 27 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 cttaaatgtg attcttaacc cactagcca 29 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 gaggtaaaat gcaatctatg atgggaca 28 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 taagggagtc ttttgcacaa tggaaaa 27 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 acctcaccca actaatggtc atca 24 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 tagacaggac ttcaaccctc aatca 25 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 gagtatcgca cattcactgt catacc 26 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 aaggtaacag caatgaagaa gatgacaaa 29 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 taatgacaga tacacagtga ccctcaa 27 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 gcttcaggct actgggattc ac 22 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 gtcatctttc ttcacgtgtg aattctcaa 29 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 gcttcaggct actgggattc ac 22 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 ttctggctaa gtccttttgc tcac 24 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 catttcagtt agcagcctta cctca 25 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 tcctccctga gaatgttgga tcaa 24 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 tgatggtggt atgttttcag gctaga 26 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 gttctcccct gtcccagttt taac 24 <210> 65 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 cgcgccgagg n 11 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> This residue is linked to a BHQ-1 quencher. <400> 66 tctagccggt tttccggctg agacctcggc gcg 33 <210> 67 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 acggacgcgg agn 13 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> This residue is linked to a BHQ-1 quencher. <400> 68 tctagccggt tttccggctg agactccgcg tccgt 35 <210> 69 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 aggccacgga cgn 13 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> This residue is linked to a BHQ-1 quencher. <400> 70 tctagccggt tttccggctg agacgtccgt ggcct 35 <210> 71 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 atgacgtggc agacn 15 <210> 72 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> This residue is linked to a Z28 quencher. <400> 72 tctagccggt tttccggctg agagtctgcc acgtcat 37

Claims (23)

1. 정제되지 않은 혈액을, 존재한다면 단단계 반응(a single step reaction)에서 표적 핵산이 검출되는 조건 하에서 검출 검정 시약들에 노출시키는 것을 포함하는 정제되지 않은 혈액 내 표적 핵산을 검출하는 방법으로서, 상기 검출 검정 시약은 폴리머라제, FEN(Flap endonuclease)-1 엔도뉴클리아제, 및 TAPS를 포함하는 완충액을 포함하고, 상기 단단계반응은 폴리머라제 중합 반응 및 프로브 절단 반응을 포함하는 것인 방법.
2. 삭제
3. 제1항에서, 상기 프로브 절단 반응은 침입성 절단 검정 반응(an invasive cleavage assay reaction)인 방법.
4. 삭제
5. 제3항에서, 상기 폴리머라제 중합 반응은 20회 미만의 증폭 주기(amplification cycle)를 포함하는 것인 방법.
6. 제3항에서, 상기 폴리머라제 중합 반응은 15회 미만의 증폭 주기를 포함하는 것인 방법.
7. 제3항에서, 상기 폴리머라제 중합 반응은 12 회 미만의 증폭 주기를 포함하는 것인 방법.
8. 제1항에서, 상기 표적 핵산은 포유동물의 유전자 DNA인 방법.
9. 제1항에서, 상기 표적 핵산은 병원체로부터의 것인 방법.
10. 제1항에서, 상기 표적 핵산은 식물로부터의 것인 방법.
11. 삭제
12. 제1항에서, 상기 표적 핵산은 형광으로 검출되는 것인 방법.
13. 삭제
14. 제1항에서, 상기 TAPS를 포함하는 완충액은 약 pH9인 방법.
15. 내열성 폴리머라제, 내열성(thermostable) FEN-1 엔도뉴클리아제, 및 정제되지 않은 체액 내에서 표적 핵산의 검출 가능한 증폭을 가능하게 하는 TAPS를 포함하는 완충액을 포함하는, 정제되지 않은 체액 내 표적 핵산 검출용 키트.
16. 삭제
17. 제15항에서, 상기 TAPS를 포함하는 완충액은 약 pH9인 키트.
18. 제15항에서, 증폭 프라이머를 더 포함하는 키트.
19. 제15항에서, 상기 표적 핵산의 존재 하에 침입성 절단 구조를 생성하도록 하는 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 키트.
20. a) 폴리머라제 중합 반응 및 FEN-1 엔도뉴클리아제 절단 시약을 미세유체 카드에 제공하되 상기 시약들은 표적 핵산을 증폭 및 검출할 수 있도록 구성되고; b) 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료를 원심력을 사용하여 상기 시약들에 노출시키고; 그리고 c) 표적 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 다중 검출 방법.
21. 제20항에서, 상기 노출은 폴리머라제 중합 반응 주기를 20 회 또는 그 미만 으로 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
22. 삭제
23. 제20항에서, 상기 FEN-1 엔도뉴클리아제 절단 시약은 침입성 절단 검정 시약을 포함하는 것인 방법.

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