JPH08501222A

JPH08501222A - 改良された核酸定量方法

Info

Publication number: JPH08501222A
Application number: JP7503836A
Authority: JP
Inventors: ベウニンゲン，マリナス・ヘラルドス・ヨハネス; キービツツ，テイム; ベウメル，トーマス・アウグステイヌス・マリア
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1996-02-13
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: ATE178946T1; CA2143857A1; DE69417863T2; CA2143857C; FI951082A; ES2131699T3; WO1995002067A1; JP3594598B2; FI951082A0; DK0662156T3; KR100312800B1; AU668659B2; AU7492894A; FI112094B; DE69417863D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、最低量の核酸増幅反応で実施し得る、改良された核酸定量方法に係わる。試料中の被分析核酸を定量するための本発明の方法は、各々が被分析核酸から区別し得るが被分析核酸と同時に増幅され得る種々の核酸構築物をそれぞれ異なる量で試料に添加するステップ；被分析核酸及び核酸構築物の両方と反応し得る増幅試薬を使用し、試料に核酸増幅処理を実施するステップ；被分析核酸及び各核酸構築物から誘導された増幅物の相対量を検出するステップ；及び前記相対量から被分析核酸の量を計算するステップを含む。各核酸構築物は異なっており、核酸構築物は相互に及び被分析核酸から区別可能であり得る。核酸構築物は、全てが同じ増幅試薬と反応し得る点で相互に及び被分析核酸と類似である。

Description

【発明の詳細な説明】改良された核酸定量方法本発明は改良された核酸定量方法に係わる。核酸の定量は種々の研究及び診断分野において極めて重要である。また核酸の定量は遺伝子調節を理解する上で重要なツールであると共に、治療効果をモニターするのに使用することもできる。例えばヒト血液または他の体液のごとき試料中に存在する特定の核酸配列の量は、例えば所定のウイルスに感染した人の疾患状態や所定の医薬による治療効能に関する貴重な情報を与え得る。核酸を量的増幅する種々の方法が記載されている。国際特許出願ＷＯ９１／０２８１７号明細書には、増幅技術としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して核酸を定量する方法が記載されている。この方法は、試料中に存在する未知量のターゲット核酸の増幅に使用される同じプライマーと反応し得る標準核酸セグメントを試料に添加することを含む。増幅後、２種のＰＣＲ産物の量をそれぞれ測定し、もとの試料中のターゲットセグメントの量を、標準曲線に対して外挿することにより定量する。標準曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応において生成された標準セグメントの量を、増幅前に存在した核酸の可変既知量に対してプロットすることにより生成される。被分析核酸と同時に増幅され得る他の配列を、被分析核酸を含む試料に加えることがBecker及びHahlbrock（Nucleic Acids Research, Vol.17, Number 22, 19 89 ）に記載されている。Becker及びHahlbrockによって記載されている方法は、被分析核酸と１ヌクレオチドだけ異なる核酸配列（点突然変異）を含む種々の既知量の内部標準を、未知量の被分析核酸を含む既知容量の試料フラクションに加え、被分析核酸と共にＰＣＲによって同時増幅するという核酸の定量方法である。即ち、全ＲＮＡの同一部分が、段階的に減らされた既知量の内部標準ＲＮＡによって「スパイク(spike)」される。内部標準配列中に１塩基の変更を導入することによって特異的制限部位を生成し、適当な制限酵素を用いて突然変異配列を切断してから、増幅された核酸を含む試料を電気泳動ゲルにかける。突然変異配列（の一部）及び被分析核酸を表わすゲル中のバンドを比較することにより、核酸を定量する。この方法の欠点の１つは、制限酵素による内部標準の消化が不完全であると、存在する核酸の量の判定が不正確となり得ることである。 Becker及びHahlbrockは彼らの定量方法において内部標準をマーカーとして使用し、そこで被分析物質及びマーカーの両方を非競合的に増幅している。更に、ターゲット核酸に対応する既知分子数の核酸配列を、未知量のターゲット核酸配列を含む試料に添加する核酸の定量方法は、本出願人名義の同時係属欧州特許出願公開第５２５８８２号明細書にも記載されている。欧州特許出願公開第５２５８８２号明細書に記載の方法は、既知量の明確に定義された突然変異配列を添加した、未知濃度の野生型ターゲット核酸を含む試料由来の核酸を増幅することに基づいている。ターゲット配列及び突然変異配列にハイブリダイズし得る１組のプライマーを用いて増幅を実施する。欧州特許出願公開第５２５８８２号明細書に記載の競合的増幅は、固定量の試料と連続希釈系列の突然変異配列またはこの逆の組合せを用いて実施され得る。上記方法は、明確に定義された標準配列を増幅混合物に添加することを含む。上記方法を用いて正確な信頼性のある測定値を得るためには、多数の増幅反応を実施せねばならない。試料を種々の既知量部分に分割し、それらに種々の既知量の標準核酸を添加する必要がある。また国際特許出願ＷＯ９１／０２８１７号明細書に記載の方法によれば希釈系列から標準曲線を生成する必要があるが、それはかなり労力を要すると共に、ターゲット核酸に係わる実際の増幅と標準曲線に係わる増幅とを別々に実施するが故に、存在する核酸の量の推定が不正確となり得る。正確で信頼性のあるように核酸の量を決定し得るためには多数の増幅反応を実施せねばならないことから、上述の方法はかなりの労力及び時間を要する。従って、労力及び時間がそれほどかからない核酸定量方法が必要とされている。本発明はそのような方法を提供する。本発明は、試料中の被分析核酸を定量する方法であって、 −被分析核酸から区別し得るが被分析核酸と同時に増幅され得る種々の核酸構築物をそれぞれ異なる量で試料に添加するステップ； −被分析核酸及び核酸構築物の両方と反応し得る増幅試薬を使用し、試料に核酸増幅処理を実施するステップ； −被分析核酸及び各核酸構築物から誘導された増幅物の相対量を検出するステップ；及び −前記相対量から被分析核酸の量を計算するステップを含む方法を提供する。本発明の方法によれば、種々の核酸構築物を試料に添加する。各核酸構築物は異なっており、核酸構築物は相互に及び被分析核酸から区別可能である。核酸構築物は、全てが同じ増幅試薬と反応し得る点で相互に及び被分析核酸と類似である。増幅試薬とは、特に、被分析核酸及び核酸構築物にハイブリダイズし得る１つ以上の増幅プライマーを意味する。他の増幅試薬としては、当分野において公知の種々の増幅技術に使用される必須酵素、核酸ポリメラーゼのごとき増幅処理に使用される慣用試薬が挙げられる。本発明の方法は、任意の種類の増幅処理、例えば米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び第４，６８３，２０２号明細書に記載のごとき所謂ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用し得る。別の核酸増幅方法としては欧州特許出願第０，３２９，８２２号明細書に記載のごとき「核酸配列基準増幅（ＮＡＳＢＡ）」がある。本発明の方法に使用される核酸構築物は、同じ増幅試薬と反応し得る点で被分析核酸と類似である核酸配列である。従って各核酸構築物は少なくとも、被分析核酸中にも存在し、使用した核酸増幅プライマーがアニーリングし得る配列を含むべきである。本発明の方法に使用される核酸構築物は、被分析核酸から及び相互に区別し得る。これは、核酸構築物を、使用する他の核酸構築物及び被分析核酸のいずれにも存在しない固有の区別可能な配列を各構築物が含むように構築することにより実現し得る。固有の区別可能な配列が例えば約２０ヌクレオチドを含むランダムな配列であり、構築物と被分析核酸の長さ及びヌクレオチド構成を同じに維持する核酸構築物を使用することが好ましい。検出においては、試料中に存在する被分析核酸及び核酸構築物を増幅した後、各々が核酸構築物中に存在する固有の配列の１つのみを認識し得る種々の検出プローブを使用することにより、種々の核酸構築物を別々に測定し得る。勿論、核酸構築物を固有となるよう構築する他の方法もある。しかしながら、好ましくは核酸構築物は、増幅が妨害されるよう突然変異すべきではない。本発明の方法では、被分析核酸と同じ効率で増幅され得る核酸構築物を使用することが好ましく、そうでないと、増幅後に試料中に存在する被分析核酸及び構築核酸の量に基づいて正確な計算を行うことが困難となる。核酸構築物は、当分野において公知の種々の方法により作製し得るポリヌクレオチドである。核酸構築物は例えば種々の組換えＤＮＡ方法によって作製し得る。例えば、被分析配列を含むプラスミドを制限酵素で消化してもとの配列を除去し、核酸合成装置において作製したかまたは異なるプラスミドからサブクローニングした新規の配列を挿入することにより、新規の配列を被分析配列中に導入し得る。核酸合成装置を使用して核酸構築物を丸ごと作製することもできる。核酸構築物は、試料に増幅処理を実施する前に、未知量の被分析核酸を含む試料に添加すべきである。既知量の種々の核酸構築物を添加する試料は、あとで試料中に存在する核酸の濃度を計算し得るよう、当然ながら所定の容量を有するべきである。試料は、核酸量を決定すべき材料を既知容量または既知量で取分けたものを含む必要がある。所定の試験液中の核酸の濃度を決定する場合には、試料は、既知量の問題の試験材料から単離した全核酸を含むべきである。核酸構築物は、問題の試験液（例えばヒト血清）に核酸単離処理を実施する前または後に添加し得る。核酸の単離方法は記載されており、当業者には公知である。本発明の方法を実施する試料を調製するのに使用し得る核酸単離方法は例えばManiatisら，Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Sprin g Harbor Laboratoryに記載されている。核酸含有試料を処理する別の方法はBoo mら，J.Clin.Microbiol.２８：４９５−５０３，１９９０に記載されている。本発明の好ましい実施態様においては、所定量の試験液から核酸を単離する前に核酸構築物を添加する。こうすると、単離処理の際に場合によっては生じ得る核酸の損失が、結果的に試料中に存在する被分析核酸及び構築核酸の両方の量に反映され得る。従って、問題のもとの試験液中に存在する被分析核酸の量は、得られた結果から直接計算し得る。核酸構築物を既知量の試験液に、試験液を核酸単離処理する前に添加した場合、核酸単離処理を実施した後に試料に単離対照核酸構築物を添加するとよい。ＩＣ（単離対照）配列を添加すると、核酸単離処理の効率を決定することができる。即ち、各試料に対して、しきい値を単離効率に調整し得る。単離対照構築物は、例えば固有の配列を含むことから被分析核酸及び他の核酸構築物とは異なるが、好ましくは同じ効率で増幅される配列であり得る。ＩＣは別の「核酸構築物」と見なし得るが、本発明の好ましい実施態様においては核酸構築物は試験液に核酸単離処理を実施する前に添加されるが、ＩＣ配列は核酸単離処理を実施した後に添加される点で異なる。試験液に核酸単離処理を実施する前に明確に定義された分子数の各核酸構築物を添加し、核酸単離処理を実施した後に明確に定義された分子数のＩＣを添加することから、単離処理効率を計算し得る。例えば１００分子の特定の核酸構築物を添加し、同じ量のＩＣ分子を添加した場合、単離効率が１００％ならば、核酸構築物とＩＣとで（増幅後に）同じシグナルがもたらされる。得られたＩＣシグナルが核酸構築物に対して得られたシグナルの２倍であるならば、核酸単離処理効率は５０％でしかなかった（もともと存在した核酸分子の半分が単離処理の際に失われたことを意味する）。これに従ってしきい値を調整し、偽陰性試験結果を得る危険性を低下し得る。１種以上の核酸構築物をそれぞれ異なる既知量で添加する。核酸構築物は、相互に一定係数（例えば係数１０）ずつ異なる一連の量で添加するのが好ましい。例えば３種の核酸構築物ＱＡ、ＱＢ及びＱＣを使用する場合、ＱＡ１０²分子、ＱＢ１０³分子及びＱＣ１０⁴分子を試料に添加し得る。試料を、各々が既知容量の１つ以上の反応アリコートに分割し、それらに核酸を種々の量範囲で添加することができる。その場合、各反応アリコートに同じ核酸構築物を添加することが好ましい。例えば２種の反応を使用する場合、「低域」反応と「高域」反応とを実施し得る。核酸構築物の範囲が重複する場合、低域反応アリコートにはＱＡ、ＱＢ及びＱＣを前述のごとき量で添加し、広域反応アリコートにはＱＡ、ＱＢ及びＱＣをそれぞれ１０⁴、１０⁵及び１０⁶分子添加し得る。核酸構築物の量範囲は重複してもよいし、低域と高域とでそれぞれ核酸構築物の量にギャップがあってもよい。１種以上の反応アリコートを使用することは、１種以上の増幅反応を実施する必要があることを意味するが、最少の反応で極めて広範囲の被分析物質濃度をカバーし得るので、従来の核酸定量方法と比較した作業及び時間の節約は尚も十分である。重複しない量範囲の核酸構築物を使用することの利点は、使用する構築物の数を減らし得る一方で、尚も広い範囲の濃度をカバーし得ることである。被分析物質が核酸構築物量範囲間のギャップに当たる量で存在するならば、試料または反応アリコート中に存在する核酸構築物から発したシグナル範囲と直接比較することはできない。しかしながら、被分析核酸のシグナルが低域シグナルよりは強く高域シグナルよりは弱いことから被分析核酸の量が決定され、かかるデータを用いて濃度を計算し得る。本発明の方法により種々の範囲の核酸構築物を１つ以上の反応アリコートに添加する場合、被分析核酸の濃度を決定すべき試料を種々の容量のアリコートに分け、かかるアリコートに核酸構築物を添加した後に各アリコートに核酸単離処理を適用することができる。単離処理においては各アリコートを別々に取扱うべきであるが、添加した核酸構築物が全く同じ処理を経て同じ変動を被ることで性能の変動が補正されるが故に、単離の際に起こり得る被分析核酸の損失を補正する必要はない。当然ながら、全量に核酸単離処理を実施し、それを種々の容量のアリコートに分け、そのあと所定範囲の構築物を添加してもよい。増幅反応を実施する際に起こり得る問題は、例えば同じ実験室で以前に試験した他の試料に由来する核酸分子で試料が汚染され得ることである。この結果、試験結果が偽陽性となったり、定量化の場合には、試料中に存在する核酸分子数の計算に誤りが生じる。本発明の方法で試験する試料が１０〜１００分子で汚染されていても、汚染が主に被分析物質分子からなり、試験している試料中の被分析核酸の量が１００分子未満であるならば、内部校正直線は変化しないが、被分析核酸の分子数計算には影響がある。試料中の被分析分子数が１０００分子未満の場合は、約１００〜１０００分子で汚染されると内部校正直線はわずかに影響され、試料中に存在する被分析核酸分子数の計算は妨害される。１０００分子以上による汚染は校正直線及び計算結果を変化させる。本発明の好ましい実施態様では、以前に試験した試料または他の試料に由来する核酸分子による試料の汚染を検出し得る。本発明の方法を使用して１種以上の試料を試験する場合、同じ核酸構築物を全ての試料に使用するが、各々特定の核酸構築物の量を変えれば、汚染を検出し得る。例えば３種の核酸構築物を使用する場合（Ｑａ、Ｑｂ及びＱｃ）、試料「Ａ」にはこれらの構築物をＱａ_高、Ｑｂ_中及びＱｃ_低の量で添加し、試料「Ｂ」には同じ構築物をＱａ_低、Ｑｂ_高及びＱｃ_中の量で添加し、試料「Ｃ」にはＱａ_中、Ｑｂ_低及びＱｃ_高の量で添加するなどとし得る。勿論、同じ組合せの核酸構築物を１つ以上の試料、例えば続けて１０の試料に使用してから、別の組合せに変えて使用してもよい。３種の構築物を使用する場合は、同じ組合せの核酸構築物を再び使用せねばならなくなるまでに最高６種の変形態様が可能である。４種の構築物を使用する場合は最高２４種の変形態様が可能となり得るなどとなる。種々の試料に種々の組合せの核酸構築物を使用すると、異なる組合せを使用した試料に由来する核酸材料による汚染が検出可能となる。汚染により、問題の試料における内部校正直線は変化する。校正直線の勾配は別のものとなり、正常データと比較して相関係数が小さくなり、従って汚染として区別可能である。各試料において１種の構築物をゼロレベルで使用すると（ゼロレベルで使用する構築物は試料ごとに変える）、極めて少量の汚染分子が検出され得る。ゼロ量で添加した特定の構築物が検出可能量で存在することは、この特定の試料が、別の組合せを選択した試料に由来する材料で汚染されていたことを示すことは明らかである。増幅後の核酸構築物及び被分析核酸の検出は種々の方法で実施し得る。シグナルが表わす増幅された核酸（構築物または被分析物質）の量に対応して異なる測定可能なシグナルを生成する限りは、当分野において公知の多くの検出方法を使用し得る。本発明の方法に使用し得る検出方法としては、酵素及び発光（蛍光、電気化学発光、リン光）現象、例えば金または染料ゲルのごとき固体ラベル使用の検出方法、及び凝集に基づく検出方法が挙げられる。試料中に存在する被分析核酸の濃度は、検出処理の間に生成されたシグナルによって表わされる被分析核酸及び核酸構築物の相対量から計算し得る。例えば構築物の配列を表わすシグナル（Ｑ）と被分析物質の配列を表わすシグナル（Ａ）の比の対数ｌｏｇ（Ｑ/Ａ）は、試料に加えた構築物の量の対数ｌｏｇ（Ｑ-input）の線形関数である。ｌｏｇ（Ｑ/Ａ）をＱ(input)の関数としてプロットすると直線グラフが得られ、該直線とＸ軸との交点から被分析核酸の量が容易に得られる（但し、被分析核酸の量が、添加した核酸構築物の量範囲の近傍にある場合）。本発明の別の実施態様は、一群の試験液において被分析核酸を定量する方法であって、所定量の前記試験液を既知の係数で希釈することを含む方法からなる。試料は、所定範囲内にあると推定される量の被分析核酸を含む前記希釈試験液からとることができる。一群の試験液のそれぞれの被分析核酸の量を決定する場合、全試験液を、所定範囲内にあると推定される濃度に前希釈するとよい。前希釈は、ほとんどの試料が前記範囲内になり、残りの試料は全てが前記範囲より低い濃度を有するかまたは全てが前記範囲より高い濃度を有するように行なうべきである。希釈ステップ後、全試験液に、試料に添加する核酸構築物の量が前記範囲内である前述のごとき本発明の方法を実施する。一群の試験液から得た前記範囲以下（または以上）である残りの試験液は、別の調整希釈または未希釈試料を用いて再度試験し得る。この方法の利点は、増幅反応が前述した高／低域分離より少なくてよいことである。本発明の試料中の被分析核酸を定量する方法の別の実施態様においては、試料中に存在する被分析核酸の推定量と同じ範囲内にあると推定される量の核酸構築物を試料に添加し、試料に、被分析核酸及び核酸構築物の両方と反応し得る増幅試薬を使用して核酸増幅処理を実施し、被分析核酸及び核酸構築物から誘導された増幅物の相対量を検出し、前記相対量から前記試料中に存在する被分析核酸の量を推算することからなる。この推算を行った後、同じ試験液から得た第２試料に、添加する核酸構築物の量が第１試料中に存在する被分析核酸の推算量と同じ範囲にある上述のごとき本発明の方法を実施する。上記方法の利点は、使用する構築物の量範囲をかなり狭く選択することができ、それによって該方法の精度を高めると共に、実施する必要がある増幅反応の数をいっそう少なくすることである。図面の簡単な説明図１Ａ：実施例１に記載の実験１における核酸構築物及び試料（被分析）核酸の投入量及び増幅量を示す。図１Ｂ：実施例１に記載の実験１に使用した、投入構築物コピー量に対して対数尺でプロットした構築物シグナル及び試料シグナルの比を示す。被分析核酸の量はグラフ内の縦線によりＸ軸上に示される。図２Ａ：実施例１に記載の実験２における核酸構築物及び試料（被分析）核酸の投入量及び増幅量を示す。図２Ｂ：実施例１に記載の実験２に使用した、投入構築物コピー量に対して対数尺でプロットした構築物シグナル及び試料シグナルの比を示す。被分析核酸の量はグラフ内の縦線によりＸ軸上に示される。図３Ａ：実施例１に記載の実験３における核酸構築物及び試料（被分析）核酸の投入量及び増幅量を示す。図３Ｂ：実施例１に記載の実験３に使用した、投入構築物コピー量に対して対数尺でプロットした構築物シグナル及び試料シグナルの比を示す。被分析核酸の量はグラフ内の縦線によりＸ軸上に示される。図４Ａ：実施例１に記載の実験４における核酸構築物及び試料（被分析）核酸の投入量及び増幅量を示す。図４Ｂ：実施例１に記載の実験４に使用した、投入構築物コピー量に対して対数尺でプロットした構築物シグナル及び試料シグナルの比を示す。被分析核酸の量はグラフ内の縦線によりＸ軸上に示される。図５Ａ：実施例１に記載の実験５における核酸構築物及び試料（被分析）核酸の投入量及び増幅量を示す。図５Ｂ：実施例１に記載の実験５に使用した、投入構築物コピー量に対して対数尺でプロットした構築物シグナル及び試料シグナルの比を示す。被分析核酸の量はグラフ内の縦線によりＸ軸上に示される。図６：１チューブＱ-ＮＡＳＢＡの動的範囲。定量のために１０^1.44、１０^2.8 3、１０^4.23及び１０^4.83in vitro 生成ＷＴ-ＲＮＡ分子を投入した。全てのＷＴ-ＲＮＡ量の定量を８〜１０回実施した。Ｑ_A、Ｑ_B及びＱ_c ＲＮＡはそれぞれ１０⁴、１０³及び１０²ＲＮＡ分子の量で使用した。図７：核酸単離前に溶解緩衝液中にＱ_A、Ｑ_B及びＱ_c内部標準ＲＮＡを添加する１チューブＱ-ＮＡＳＢＡの概略流れ図。以下、実施例によって本発明を更に説明する。実施例：実施例１：本発明の方法に従って実施される定量アッセイ及びその後の検出の理論的実施例を以下に与える。これらの実験から、本発明のアッセイがどのように実施され得るか及び得られるであろう結果が明らかとなろう。本発明の方法により実施し得る５つの実験を以下に略述する。これらの実験は、被分析核酸分子の投入量及び増幅する前に添加する核酸構築物の範囲が異なる。被分析物質及び構築物の投入量を下記の表（表１）に示す。上記表から判るように、最初の３つの理論的実験においては３種の構築物を添加し（それぞれＱＡ、ＱＢ及びＱＣ）、「低域」構築物量及び「高域」構築物量の２種の増幅反応を実施した。かかる実験において低域と高域とは重複していた。これらの２つの範囲の重複点を使用して増幅を比較し得る（増幅が同様に実施されたならば、生成されるシグナルは２つの範囲内にある重複量の構築物に対して同じとなるべきである）。実験４及び５においては２つの範囲の構築物量を使用したが、低域と高域とは重複しなかった。その結果、１つの増幅反応に使用する構築物の量を減らしながら、同じ全量範囲をカバーし得る。Ｑ−ＲＮＡ（構築物）及び野生型ＲＮＡは、２０のランダムなヌクレオチド配列が異なるだけで大きさは同じあり、同じプライマー及び酵素を増幅に使用したので、それらの増幅速度は同じである。従って、各構築物ＲＮＡの量と野生型ＲＮＡの量との初期の比は増幅の間に変化しない。増幅後の検出処理においては、各増幅物混合物を、野生型、ＱＡ、ＱＢまたはＱＣＲＮＡ増幅物を検出するため４つのアッセイに分割する（実験４及び５の増幅物混合物は３つのアッセイに分割しさえすればよい）。構築物シグナルと野生型シグナルの対数比を構築物ＲＮＡの投入量の対数に対して表わすと、直線が期待される。野生型ＲＮＡの量はこの直線から計算し得る。上記実験により得られる結果を図１〜５に示す。各図面の最初のグラフ（ａ）には、増幅の前と後の種々の構築物の量が表わされており、更に被分析核酸の量も示されている。各図面の２番目のグラフ（ｂ）は、推定された構築物のシグナルと被分析物質のシグナル（試料シグナル）との対数比を、構築物の投入量の対数の関数として表わしている。被分析核酸分子の投入量はこれらのグラから誘導し得、比が１である縦軸上の点に従属する（横軸上に示された）投入値の対数に従う。実施例２：まず、それぞれ２００、２０００及び２００００コピーの３種の核酸構築物ＱＡ、ＱＢ及びＱＣを含む定量済の量の構築物ＨＩＶ-１ gag１ＲＮＡ転写物の混合物を作製した。次いで、それそれ２０００００、２００００、２０００、２００、２０コピーの５種の異なる定量済の量の野生型ＨＩＶ-１ gag１転写物及びブランクを前記Ｑ構築物ＲＮＡの混合物と混合した。各量のｗｔ-ＲＮＡに対して１つずつ６つの増幅反応を標準方法（T.Kievitsら）に従って実施した。各増幅物から５μｌをＴＢＥ緩衝液（９０mＭＴｒｉｓ-ホウ酸、１mＭＥＤＴＡｐＨ８．４）で１００μｌに希釈した。各希釈液から５μlを、６．６７×ＳＳＣ緩衝液（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７〜８）中の、全ての増幅物を捕獲するためのビオチン-オリゴ３pmol、各々が野生型ＲＮＡ増幅物または１種の構築物（ＱＡ、ＱＢまたはＱＣ）増幅物に特異的な配列を含む種々のトリス（２，２’ -ピリジン）ルテニウムIIキレート標識オリゴヌクレオチド３pmol、及びストレプトアビジン被覆磁性ジナルビーズＭ２８０２０μｇの混合物１５μｌを含む試験管に添加した。ＷＴ、ＱＡ，ＱＢまたはＱＣ検出のための４種のハイブリダイゼーションアッセイを１種の増幅について実施した。混合物を４１℃で、１０分ごとに混合しながら３０分間ハイブリダイズした。ＩＧＥＮのＯＲＩＧＥＮ１．５検出系を使用する電気化学発光ＥＣＬ検出のためのアッセイ緩衝液３００μｌを添加及び混合した。ＯＲＩＧＥＮ１．５検出系における実際の検出を製造業者指示に従って実施した。実施例３：本実施例においては、３種のＱ-ＲＮＡ内部標準を１０⁴、１０³及び１０²分子の量でＷＴ-ＲＮＡ試料中にスパイクするＱ-ＮＡＳＢＡアッセイを記載する。３種の内部標準ＲＮＡ分子は、各内部標準に特異的な２０ヌクレオチドランダム配列（Van Gemenら，J.Virol.Methods. 43, 177-188,1993）に特異的なＥＣＬ標識プローブを使用して区別し得る。ＮＡＳＢＡ増幅された内部標準及びＷＴ-ＲＮＡの比を、ＥＣＬ検出装置を使用して測定した。ＥＣＬは、電極の表面に光を放射する化学発光標識に基づくものである（Blac kburnら，Clin.Chem.37, 1534-1539,1991）。シグナル検出は、特別に開発された検出装置を使用して５桁にわたる大きさの動的範囲で定量し得る。ＥＣＬ法は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてＥＣＬ標識オリゴヌクレオチドを使用して増幅された核酸を検出するよう適合されている（Kenten,J.H.ら，Clin.Ch em.38,873-879,1992）。ＷＴ、Ｑ_A、Ｑ_B及びＱ_cＥＣＬプローブの比活性は既知であるので、ＷＴ、Ｑ_A、Ｑ_B及びＱ_c ＮＡＳＢＡ増幅されたＲＮＡの比は、それぞれのプローブのシグナル比から決定し得る。ＥＣＬビーズベースアッセイにおいてＱ_A、Ｑ_B及びＱ_cシグナルに対するＷＴシグナルの比から、ＷＴ投入ＲＮＡの初期量を読取った。Ｑ-構築物を調製しアッセイを実施した方法は本実施例の「材料及び方法」セクションに記載する。種々の量のin vitro生成ＷＴ-ＲＮＡを定量するために、ＥＣＬ検出を含む１チューブＱ-ＮＡＳＢＡ法を使用した。それぞれ投入量として１０^1.44、１０^2.83、１０^4.23及び１０^4.83の初期ＷＴ- ＲＮＡ分子を使用し、３種の異なるアッセイを実施した。ＥＣＬビーズベースのアッセイを使用するＱ-ＮＡＳＢＡは、１回のＮＡＳＢＡ増幅において１０⁴Ｑ_A ＲＮＡ分子、１０³Ｑ_BＲＮＡ分子及び１０²Ｑ_cＲＮＡ分子とＷＴ-ＲＮＡを混合することにより定量した各ＷＴ-ＲＮＡ量に対して８〜１０回実施した。実施した定量の結果（平均±標準偏差）は、それぞれ１０^1.44、１０^2.83、１０^4.23及び１０^4.83のＷＴ-ＲＮＡ分子を初期投入すると、１０^1.54±0.23、１０^2.68±0 ^.21 、１０^4.16±0.20及び１０^4.81±0.23であった。実施したアッセイの結果を図６に示す。この図から判るように、１チューブ定量法に使用された最低のＱ-ＲＮＡ量の１／１０まで信頼性をもってＷＴ-ＲＮＡ量を定量し得る。材料及び方法プラスミド及びＲＮＡ合成遺伝子組換えＤＮＡ法は標準方法に従った（Sambrook,J.ら， Molecular clo ning. A laboratory manual, Cold Spr ing Harbor,NY:Cold Spring Harbor Lab., 1989,第２版）。２２ヌクレオチドランダム配列（位置1429-1451 HIV-1pv22配列（Muesing,M.A.ら，Nature 313,450- 458, 1985））を含むプラスミドｐＧＥＭ３ＲＡＮ（Van Gemenら，1993）を使用し、定量的ＮＡＳＢＡ増幅と関連のないことから、多重クローニング部位のＡｃｃＩ部位とＨＩＶ−１クローン化配列（位置1691-2105 HIV-1 pv22）の一部とを欠失させた。このプラスミドにおいて、ランダムな配列を5'ATG.CAA.GGT.CGC.AT A.TGA.GTA.A3'または5'ATA.AGC.ACG.TGA.CTG.AGT.ATG.A3'で置き換え、それぞれｐＧＥＭ３Ｑ_Bδgag３及びｐＧＥＭＱ_cδgag３を生成した。プラスミドｐＧＥＭ３ＲＡＮの呼び名をｐＧＥＭ３Ｑ_Aと変えた。ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（Sambrook, 1989）を使用し、ｐＧＥＭ３ｐ２４（ＷＴ-ＲＮＡ）、ｐＧＥＭ３Ｑ_A（Ｑ_A-ＲＮＡ）、ｐＧＥＭ３Ｑ_Bδ６gag３（Ｑ_B -ＲＮＡ）及びｐＧＥＭ３Ｑ_cδgag３（Ｑ_c-ＲＮＡ）からin vitro ＲＮＡを生成した。ｐＧＥＭ３ｐ２４及びｐＧＥＭ３Ｑ_Aのクローン化挿入物をベクターｐＧＥＭ４中に再クローニングしてｐＧＥＭ４ｐ２４及びｐＧＥＭ４Ｑ_Aを生成した。これらのプラスミドを使用し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Sambrook, 1 989）を用いてin vitro ＲＮＡを作製した。in vitro ＲＮＡの長さは、プラスミドｐＧＥＭｐ２４（ＷＴ-ＲＮＡ）及びｐＧＥＭ３Ｑ_A（Ｑ_A-ＲＮＡ）が１５１４ヌクレオチド、ｐＧＥＭ３Ｑ_Bδgag３（Ｑ_B-ＲＮＡ）及びｐＧＥＭＱ_cδgag ３（Ｑ_c-ＲＮＡ）が１０９０ヌクレオチドであった。ＲＮＡをＤＮaseで処理してプラスミドＤＮＡを除去し、アニオン交換カラム（Qiagen）において精製した。in vitro ＲＮＡを分光光度法により定量し、水で所望の濃度に希釈した。全てのＲＮＡ溶液を−２０℃で保存した。核酸単離 Boomらの方法（Boom,R.ら，J.Clin.Microbiol.28,495-503, 1990;Van Gemenら，1993）に従って血漿から核酸を単離した。最終的に、１００μｌの血漿の核酸を１００μｌの水中に再懸濁させ、−７０℃で保存した。ＮＡＳＢＡＡＭＶ逆転写酵素をSeikagakuから購入したことを除き、全ての酵素はPharmac iaから購入した。ＢＳＡはBoehringer Mannheimから購入した。２３μｌのＮＡＳＢＡ反応混合液（２５μｌ反応混合液中の終濃度：４０mＭＴｒｉｓ，ｐＨ８．５，１２mＭＭｇＣｌ₂，４２mＭＫＣｌ，１５％ｖ／ｖＤＭＳＯ，１mＭ各ｄＮＴＰ，２m Ｍ各ＮＴＰ，０．２μmプライマー１：５’AAT.TCT.AAT.ACG.ACT.CAC.TAT.AGG. GTG.CTA.TGT.CAC.TTC.CCC.TTG.GTT.CTC.TCA, ０．２μmプライマー２：５’AGT. GGG.GGG.ACA.TCA,AGC,AGC.CAT.GCA.AA、０．２〜２μｌ野生型ＲＮＡ及び２μｌ in vitroＱ-ＲＮＡ（Kievits,T.ら，J.Virol.Methods.35,273-286, 1991;VanGe menら，1993））を６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡの２次構造を不安定化し、次いで４１℃に冷却してプライマーをアニーリングした。２μｌの酵素混合物（０．１μｇ／μｌＢＳＡ，０．１単位ＲＮase Ｈ，４０単位Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び８単位ＡＭＶ逆転写酵素）を添加することにより増幅を開始した。４１℃で９０分間反応物をインキュベートした。全ての定量において２つの陰性対照を加えた。酵素ビーズベースの検出前述の定量方法（Van Gemenら，1993）においてＮＡＳＢＡ増幅したＷＴ及びＱ_A ＲＮＡを検出し、その比を決定するため、ビーズベース酵素アッセイを開発した。ストレプトアバジンで被覆した２．８μmポリスチレン常磁性ビーズ（Dynal Inc.,Great Neck, N.Y.,USA）１００μｌを２００μｌ１×ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、１００μｌ１×ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させた。洗浄したビーズを、３００pm olのＨＩＶ−１特異的ビオチニル化捕獲プローブ（５'TGT.TAA.AAG.AGA.CCA.TCA .ATG.AGG.A）と一緒に室温で１時間インキュベートし、まず２００μｌ５×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳで１回、次いで２００μｌ１×ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡで１回洗浄した。ビーズを１００μｌ１×ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させた。５μｌビーズ、５μｌＮＡＳＢＡ反応混合液及び５０μｌハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ，０．１％ブロッキング試薬，１０ μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）を４５℃で３０分間インキュベートした。ビーズを１００μｌ２×ＳＳＣ，０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、次いで、そのうちの１０％をＨＲＰ標識したＷＴまたはＱ検出オリゴヌクレオチドプローブ５×１０−⁷ μmolと一緒に５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中４５℃で３０分間インキュベートした。ビーズ捕獲オリゴヌクレオチド-ＮＡＳＢＡ増幅されたＷＴまたはＱ_AＲＮＡ検出プローブ複合体を、まず１００μ１２×ＳＳＣ，０．１％ＢＳＡで１回、次いで１００μｌＴＢＳＴで１回、更に１００μｌＴＢＳで２回洗浄した。次に、１００μｌの有色基質（ＴＭＢ／ペルオキシド溶液）をビーズに加え、室温で３分間インキュベートした。５０μｌの２５０ｍＭオキサレートを添加することにより呈色反応を停止させた。マイクロプレートリーダー(Micro SLT 510, Organon Teknika, Boxtel，オランダ）において１５０μｌ呈色反応物の４５０nmでの吸収を読み取った。吸収値をバックグラウンドシグナル（即ち陰性対照）に対して補正し、シグナルを、独立に増幅されたＷＴまたはＱ_A ＲＮＡによって得られたシグナルのパーセントとして計算した。ＥＣＬビーズベースの検出水で２０倍に希釈したＮＡＳＢＡ増幅ＲＮＡ（ＷＴ、Ｑ_A、Ｑ_B及びＱ_c）５μ ｌを、ＨＩＶ−１特異的ビオチニル化捕獲プローブ（酵素ビーズベース検出参照）２０μｌ（３．３ｐmol）、ＷＴ、Ｑ_A、Ｑ_BまたはＱ_c ＮＡＳＢＡ増幅ＲＮＡのいずれかに特異的なＥＣＬ（トリス［２，２-ビピリジン］ルテニウム［I I］複合体）標識オリゴヌクレオチドプローブ３．３ｐmol、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ２０μｇ（２μｌ）と一緒に５×ＳＳＣ中４１℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの間、１０分おきに撹拌して試験管を混合した。次いで３００μｌのＴＰＡ溶液（１００mＭトリプロピルアミン，ｐＨ＝７．５）を添加し、ハイブリダイゼーション混合物をＯｒｉｇｅｎ１．５ＥＣＬ検出装置（Organon Teknika, Boxtel，オランダ）に仕込んだ。実施例４核酸単離効率はＷＴ-ＲＮＡ定量結果に影響し得る。単離時の核酸損失の影響を阻止するため、Ｑ_A，Ｑ_B及びＱ_cＲＮＡを第１ステップたる核酸単離（図７）の前または間に添加することができる。このことを、in vitro培養ウイルスストック液から単離したin vitro生成ＷＴ-ＲＮＡ及びＨＩＶ-１ＲＮＡ１０⁴分子を使用して試験した。in vitro生成ＷＴ-ＲＮＡ及びＨＩＶ-１ウイルスストックＲＮＡを、第１ステップたる核酸単離で（即ち溶解緩衝液中に）Ｑ_A，Ｑ_B及びＱ_c ＲＮＡを添加した場合としない場合とで再単離した。使用した方法は実施例３の「材料及び方法」セクションに記載されている。増幅時にＱ_A，Ｑ_B及びＱ_cを添加することにより、もともと単離されているＷＴ-ＲＮＡ及びＨＩＶ−１ウイルスストックＲＮＡを定量すると（即ち対照定量）、in vitro生成ＷＴ-ＲＮＡ及びＨＩＶ-１ウイルスストックＲＮＡについてそれぞれ３．３×１０⁴及び２．１×１０⁴の結果となった。再単離処理前にＱ_A，Ｑ_B及びＱ_c ＲＮＡを添加して再単離したＲＮＡを定量すると、in vitro生成ＷＴ-ＲＮＡ及びＨＩＶ-１ウイルスストックＲＮＡについてそれぞれ２．５×１０⁴ 及び１．５×１０⁴となった。しかしながら、再単離処理後にＱ_A，Ｑ_B及びＱ_c ＲＮＡを添加して再単離されたＲＮＡを定量した場合は、in vitro生成ＷＴ-ＲＮＡ及びＨＩＶ-１ウイルスストックＲＮＡについてそれぞれ４．７×１０³及び２．０×１０³となった。これは、ＲＮＡの再単離効率が約１０％であることを示している。しかしながら、再単離前にＱ_A，Ｑ_B及びＱ_cを添加すると、単離される核酸の絶対量に関係なく比ＷＴ：Ｑ_A：Ｑ_B：Ｑ_cＲＮＡが一定となるため、ＲＮＡ定量は対照定量に等しい結果となる。結果は表２に示す。実施例５本発明の方法を既に記載されているＱ−ＮＡＳＢＡ法（Van Gemenら，1993; J urriaansら，提出，1993）と比較した。Ｑ-ＮＡＳＢＡ法では１種のＱ-ＲＮＡしか使用せず、５対数の動的範囲を得ようとするならば、１臨床（野生型）試料当たり少なくとも６つの増幅反応、即ち内部標準を添加しない陽性ＷＴ対照反応１つと、内部標準ＲＮＡ分子の量を段階的に増量した（１０²〜１０⁶）反応５つとを必要とする。数種の区別可能な内部標準を１つの増幅にスパイクする本発明の方法によれば、増幅反応数を減少し得る。これに対して、ただ１種のＱ-ＲＮＡを酵素標識プローブと組み合わせて使用する場合（Ｑ_A）、別個の増幅において種々の濃度のＱ-ＲＮＡを使用し、ＷＴ- シグナル対Ｑ-シグナルの比から初期ＷＴ-ＲＮＡ濃度を導出する必要がある。これら２つの方法を、モデル系及びＨＩＶ-１感染個体の血漿試料を使用して比較した。３人の無症候ＨＩＶ-１感染個体の血漿試料０．１mlを分析することにより、Ｑ_A、Ｑ_B及びＱ_c ＲＮＡを使用する１チューブＱ-ＮＡＳＢΛを、１回の定量で６つの増幅を使用する既に記載されているＱ-ＮＡＳＢＡ法（Van Gemenら，1993 ）と比較した。同じ実験で、核酸単離の前と後とにＱ_A、Ｑ_B及びＱ_cを添加したときの差も調査した（表３）。ＷＴ-ＲＮＡを１チューブＱ-ＮＡＳＢＡ法によって定量した場合、ＷＴ-ＲＮＡ量は１チューブ定量法に使用された最低Ｑ-ＲＮＡ量の１／１０まで信頼性をもって定量し得る。溶解緩衝液に添加する場合はＱ_A、Ｑ_B及びＱ_Cを（それぞれ６×１０⁵、６×１０⁴及び６×１０³で）０．１mlの血漿に添加すると、信頼定量下限は血漿０．１ ml当たり６×１０²ＲＮＡコピーであった。１μｌ血漿等価物の核酸を増幅に使用する場合は、単離後の核酸にＱ_A、Ｑ_B及びＱ_Cを（それぞれ１０⁴、１０³及び１０²）で添加し、血漿０．１ml当たり１０³ＲＮＡコピーの信頼定量下限が得られた。両ケースで、１チューブ定量法に使用される最低Ｑ-ＲＮＡ量の１／１０まで信頼性をもってＷＴ-ＲＮＡを定量し得る。１μｌ血漿等価物の核酸を増幅に使用する場合で、最低内部標準Ｑ-ＲＮＡ量を１０²として１回の定量で６つの増幅を行う方法によると、血漿０．１ml当たり１０⁴ＲＮＡコピーの信頼定量下限が得られた。この結果は、この特定の実施態様においては核酸単離効率が１００％（患者１）と５０％（患者２）の間で変動したことを示す。患者３は常に信頼定量限界を下回ったが、核酸単離前に溶解緩衝液にＱ_A、Ｑ_B及びＱ_Cを添加する１チューブＱ-ＮＡＳＢＡアッセイにおいてこの限界は最も正確（即ち最低）であった（表３）。実施例６：最後に、核酸単離前にＱ_A、Ｑ_B及びＱ_Cを溶解緩衝液に加える１チューブＱ-ＮＡＳＢＡの再現性を、ウイルス粒子量を電子顕微鏡により定量したin vitro培養ＨＩＶ-１ウイルスストック液（Layne,S.P.ら，Virology.189,695-714,1992）を使用して試験した。２．９×１０¹⁰ウイルス粒子／mlを含むＨＩＶ-１ウイルスストックを水で１０，０００に希釈し、１００μｌの希釈ウイルスストック液にＱ_A、Ｑ_B及びＱ_cを（それぞれ６×１０⁵、６×１０⁴及び６×１０³で）添加し、４．３５×１０¹⁰ＲＮＡ分子／mlの測定値を得た。結果を表４に示す。ＲＮＡ定量の平均±標準偏差は１０^10.64±0.05であり、１チューブＱ-ＮＡＳＢＡの精度は、このin vitro培養ウイルスストック液の定量の場合は０．１対数値内であったことが判る（実施した方法は実施例３の材料及び方法セクションに記載されている）。表４から、本発明の方法によれば、in vitro培養ウイルスストック液中のＨＩＶ-１ＲＮＡを定量する場合には０．１対数値以内のアッセイ精度が得られることが判る。この結果から、０．４対数値以上のＨＩＶ-１ＲＮＡ負荷の差の信頼性のある測定が可能である。Ｑ_A、Ｑ_B及びＱ_C（それぞれ６×１０⁵、６×１０⁴及び６×１０³）を、ウイルスストックを水で１０，０００倍に希釈した溶液１００μｌに添加した。ａ．２つの同一増幅ｂ．３つの同一増幅全ての定量の平均±標準偏差は１０^10.64±0.05（４．３５×１０¹⁰）ＲＮＡ分子／mlであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者ベウメル，トーマス・アウグステイヌス・マリアオランダ国、5345・エス・イツクス・オツス、グラニートストラート・63

Claims

【特許請求の範囲】１．試料中の被分析核酸を定量する方法であって、 −各々が被分析核酸から区別し得るが被分析核酸と同時に増幅され得る種々の核酸構築物をそれぞれ異なる量で試料に添加するステップ； −被分析核酸及び核酸構築物の両方と反応し得る増幅試薬を使用し、試料に核酸増幅処理を実施するステップ； −被分析核酸及び各核酸構築物から誘導された増幅物の相対量を検出するステップ；及び −前記相対量から被分析核酸の量を計算するステップを含む方法。２．前記核酸構築物が、各核酸構築物に固有の区別可能な配列を除き、前記被分析核酸と同じ配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記固有の区別可能な配列が、約２０ヌクレオチドを含むランダムな配列であることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記核酸構築物を、相互に一定係数ずつ異なる一連の量で添加することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。５．前記核酸構築物を、相互に係数１０ずつ異なる一連の量で添加することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。６．核酸単離処理を実施する前に前記核酸構築物を添加した既知量の試験液に核酸単離処理を実施することにより試料を調製することを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記試験液に核酸単離処理を実施することにより調製した試料に既知量の単離対照配列を添加することを特徴とする請求項６に記載の方法。８．試料を１つ以上の反応アリコートに分割し、それぞれに前記核酸構築物を異なる量範囲で添加することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。９．前記各反応アリコートに、同じ核酸構築物を添加することを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．前記量範囲が重複しないことを特徴とする請求項８または９に記載の方法。１１．１つ以上の試料において被分析核酸を定量する方法であって、各試料に請求項１に記載の方法を実施するが、ここで全ての試料に同じ核酸構築物を使用し、それぞれの特定の核酸構築物の量を変える方法。１２．各試料において１種の核酸構築物を量ゼロで使用することを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．一群の試験液において被分析核酸を定量する方法であって、 −ある量の前記試験液を既知の係数ずつ希釈し、所定範囲内にあると推定される量の被分析核酸を含む前記希釈試験液から試料を得るステップ；及び −前記試料に、試料に添加する核酸構築物の量が前記範囲内である請求項１に記載の方法を実施するステップを含む方法。１４．更に −前記量範囲より少ない量の被分析核酸を含む試料を同定するステップ； −前記試料を調製した試験液に、試験液がより低い係数で希釈される請求項１３に記載の方法を実施するステップを含む請求項１３に記載の方法。１５．更に、 −前記量範囲より多い量の被分析核酸を含む試料を同定するステップ； −前記試料を調製した試験液に、試験液がより高い係数で希釈される請求項１３に記載の方法を実施するステップを含む請求項１３に記載の方法。１６．試料中の被分析核酸を定量する方法であって、 −前記試料中に存在する被分析核酸の推定量と同じ範囲内にあると推定される量の核酸構築物を試料に添加するステップ； −前記被分析核酸及び核酸構築物の両方と反応し得る増幅試薬を使用し、前記試料に核酸増幅処理を実施するステップ； −被分析核酸及び核酸構築物から誘導された増幅物の相対量を検出するステップ； −前記相対量から前記試料中に存在する被分析核酸の量を推算するステップ；及び −前記試験液から得た第２試料に、添加する核酸構築物の量が第１試料中に存在した被分析核酸の前記推算量と同じ範囲内にある請求項１に記載の方法を実施するステップを含む方法。１７．実施例１に記載の方法に従って試料中の核酸を定量するためのキットであって、種々の核酸構築物、前記核酸構築物及び被分析核酸と反応し得る増幅試薬、増幅された被分析核酸用の検出プローブ、及び増幅された種々の核酸構築物にそれぞれ特異的な異なる検出プローブを含むキット。