CN102399882B - 副溶血性弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2；P1探针的序列为SEQ ID NO：3：P2探针的序列为SEQ ID NO：4。同时本发明还提供一种包含上述引物探针序列的，用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的试剂盒，以及应用方法。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计引物和探针，从而保证检测方法的特异性。且具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可。结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。

Description

副溶血性弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种利用切刻内切酶恒温扩增(NEMA)技术进行菌样的快速检测的方试剂盒及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)是一种嗜盐性细菌主要存在于海产品中，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹或海蜇；以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。如果不小心进食了含有该菌的食物，常会引起食物中毒，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌食物中毒病多在夏秋季发生于沿海地区，并经常是集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。因此，有效的检测出副溶血性弧菌对于食品安全是非常重要的。副溶血性弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。上述的方法或是存在耗时长、或是存在应用仪器昂贵，难以推展的问题，因此，需要开发出另一种能够有效的检测副溶血性弧菌的方法及其相应的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理如下：

(1)设计一对5′端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；

(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq PlatinumDNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；

(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切口，暴露其3′端；

(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3′端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；

(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列。

(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测：

核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物10μL加入检测板的样品孔中，再加入100μL缓冲液进行层析，10min左右判读结果。

通用型核酸扩增物快速检测板的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中没有检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。

本发明的一个方面涉及用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1：

5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3；

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3；

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3，5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3，3端标记FITC。

本发明的另一个方面涉及一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分：

(1)模板预处理反应液：

其中包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液、0.1～1.0mmol/L dNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase 2.5U；

所述的10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液成分为：200mM Tris-HCl pH8.8，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂；

(2)NEMA恒温扩增反应液：

包括10×NEBuffer 3反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，5％～30％DMSO，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物和100μg/mL牛血清蛋白(BSA)；

其中所述的10×NEBuffer 3反应缓冲液成分为：100mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L dithiothreitol pH 7.9；

(3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

(4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

(5)5′端标记生物素探针P1和3′端标记FITC的探针P2各10μmol/L

(6)通用型核酸扩增物快速检测板。

其中正向引物序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2；

探针P1的序列为SEQ ID NO：3，P2的序列为SEQ ID NO：4

P1：5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3   5端标记生物素；

P2：5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3    3端标记FITC。

上述试剂盒应用于检测食品中的副溶血性弧菌，其使用方法，依次包括下列步骤(1)-(4)：

(1)待检样品或细菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10ng/μL～100ng/μL范围内；

2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板；

(3)NEMA恒温扩增反应：

在装有46μL NEMA扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min，反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。检测线T和质控线C均显示红色，说明待检样品为阳性。

本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计5′端带切刻内切酶识别序列的引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的切刻内切酶核酸恒温扩增(NEMA)技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1：对副溶血性弧菌标准菌株的检测

按下列配方制作副溶血性弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增试剂盒：

1)模板预处理反应液：

每23μL含有2.5μL 10×Taq Platinum buffer II，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，1.0μL 2.5U/μL Taq Platinum DNAPloymerase和16.5μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3；

反向引物：SEQ ID NO：2：

5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3；

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

2)NEMA恒温扩增反应液：

每46μL含有5μL 10×NEBuffer 3，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，0.5μL 10mg/ml BSA，4μL DMSO和33.5μLddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3；

反向引物：SEQ ID NO：2：

5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3；

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

5)探针P1和P2：10μmol/L；

其中所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：3

P1：5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3  5端标记生物素；

探针P2的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3   3端标记FITC。

6)核酸薄层层析检测板。型号：3号；

按照以下(1)-(4)程序进行检测：

(1)样品(副溶血性弧菌)DNA的提取：

将副溶血性弧菌阳性菌株(ATCC 17802)增菌培养后，提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10ng/μL～100ng/μL范围内。

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。

(3)进行NEMA恒温扩增反应：

将装有46μL NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min。反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物，通用型核酸扩增物快速检测板可选用杭州优思达生物技术有限公司的批号为20101026-2的产品。在质控区C和检测区T均出现红色条带，说明待检样品为副溶血性弧菌，也表明本发明所涉及的引物和探针在对副溶血性弧菌进行检测的时候不会产生假阴性的结果。

实施例2：对创伤弧菌标准菌株的检测

1)模板预处理反应液：

每23μL含有2.5μL 10×Taq Platinum buffer II、1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，1.0μL 2.5U/μL Taq Platinum DNAPloymerase和16.5μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3；

反向引物：SEQ ID NO：2：

5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3；

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

2)NEMA恒温扩增反应液：

每46μL含有5μL 10×NEBuffer 3，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，0.5μL 10mg/mL BSA，4μL DMSO和33.5μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3；

反向引物：SEQ ID NO：2：

5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3；

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

5)探针P1和P2：10μmol/L；

其中所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：3

P1：5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3   5端标记生物素；

探针P2的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3    3端标记FITC。

6)核酸薄层层析检测板。型号：3号；

按照以下(1)-(4)程序进行检测：

(1)样品(创伤弧菌ATCC 27562)DNA的提取：

将创伤弧菌阳性菌株(ATCC 27562)增菌培养后，提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。

(3)进行NEMA恒温扩增反应：

将装有46μL NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min。反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。质控区C显示红色条带，检测区T无红色条带出现，说明待检样品不是副溶血性弧菌。这个结果也证实了本发明的引物和检测试剂盒在应用的时候不会产生假阳性。

实施例3：对疑似感染副溶血性弧菌食品样品的检测

将食品样品按照实施例1描述的方法进行DNA的提取和扩增检测，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。结果质控区C显示红色条带，检测区T也有红色条带出现，说明待检样品受到了副溶血性弧菌的感染。

本发明的引物、探针和试剂盒还可以对其它的样品进行副溶血性弧菌的检测。

Claims (6)

1.一种用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的引物及探针，其中：

正向引物序列为SEQ ID NO:1；

反向引物序列为SEQ ID NO:2；

P1探针的序列为SEQ ID NO:3：

P2探针的序列为SEQ ID NO:4。

2.如权利要求1所述的用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的引物及探针，其特征在于所述的P1探针的5′端标记生物素，P2探针的3′端标记FITC。

3.权利要求1所述的引物和探针在检测食品中的副溶血性弧菌中的应用。

4.一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分：

（1）模板预处理反应液：

其中包括10×Taq Platinum buffer Ⅱ反应缓冲液，0.1～1.0 mmol/L dNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0 μmol/L反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase 2.5U；

所述的10×Taq Platinum buffer Ⅱ反应缓冲液成分为：200 mMTris-HCl pH8.8 ，100 mM KCl, 100 mM（NH₄）₂SO₄,20 mM MgCl₂；

（2）NEMA恒温扩增反应液：

包括10×NE Buffer 3反应缓冲液，0.1～1.0 mmol/L dNTP，5%～30% DMSO，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0 μmol/L反向引物和100 μg/mL牛血清蛋白；

其中所述的10×NE Buffer 3反应缓冲液成分为：100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L dithiothreitol pH 7.9；

（3）Nt.BspQI切刻内切酶：4 U/μL；

（4）Bst DNA聚合酶：2 U /μL；

（5）5′端生物素标记探针P1和3′端FITC 标记探针P2各10 μmol/L；

（6）通用型核酸扩增物快速检测板；

其中正向引物、反向引物和探针P1、P2的序列如权利要求1所述。

5.权利要求4所述的试剂盒在检测食品中的副溶血性弧菌中的应用。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其使用方法包括如下的步骤：

（1）待检样品或细菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA  OD₂₆₀/ OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10～100 ng/μL范围内；

（2）模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2 μL 待检模板DNA，于94 ℃水浴7 min后迅速放入60 ℃的水浴中50 s；然后94 ℃水浴20 s和60 ℃水浴50 s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板；

（3）NEMA恒温扩增反应：

在装有46μL NEMA扩增反应液的反应管中加入2μL 预处理过的模板DNA，1.0 μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0 μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57 ℃的水浴中60 min，反应结束后取出；

（4）产物检测:

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5 μL，90 ℃水浴3 min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。